Î Ã Ë ß Ä È ÁÅËÊÎÂÛÉ ÑÏËÀÉÑÈÍÃ

ÎÃËßÄÈ
ÓÄÊ 577.112.4.
ÁÅËÊÎÂÛÉ ÑÏËÀÉÑÈÍÃ
Ï. Ë. ÑÒÀÐÎÊÀÄÎÌÑÊÈÉ
Èíñòèòóò ìîëåêóëÿðíîé áèîëîãèè è ãåíåòèêè ÍÀÍ Óêðàèíû, Êèåâ;
å-mail: pedro77@ukr.net
²íòå¿íàìè º âíóòð³øí³ ïîë³ïåïòèäí³ ïîñë³äîâíîñò³, çäàòí³ ïîñòòðàíñëÿö³éíî àâòîêàòàë³òè÷íî
âèäàëÿòèñÿ ç ìîëåêóëè á³ëêà-ïîïåðåäíèêà. Ó ñêëàä³ á³ëüøîñò³ ç íèõ âèä³ëÿþòü N- ³ Ñ-ê³íöåâ³ ñïëàéñèíãîâ³ äîìåíè òà öåíòðàëüíèé åíäîíóêëåàçíèé äîìåí. Îñòàíí³é çàáåçïå÷óº ìîá³ëüí³ñòü ³íòå¿íêîäóâàëüíî¿
ïîñë³äîâíîñò³ â ÄÍÊ – òàê çâàíèé õîóì³íã ³íòå¿í³â.  îãëÿä³ íàâåäåíî îñòàíí³ äàí³, îäåðæàí³ ïðè
âèâ÷åíí³ áóäîâè òà ôóíêö³é ³íòå¿í³â. Çíà÷íó óâàãó òàêîæ ïðèä³ëåíî á³îòåõíîëîã³÷íèì ìåòîäàì, ùî
áàçóþòüñÿ íà âèêîðèñòàíí³ á³ëêîâîãî ñïëàéñèíãó, çîêðåìà òàêèì ÿê ³íòå¿íîïîñåðåäêîâàíå î÷èùåííÿ
ðåêîìá³íàíòíèõ á³ëê³â, çøèâàííÿ òà öèêë³çàö³ÿ ¿õ, ñòâîðåííÿ íîâèõ ôîðì á³îñåíñîð³â.
Ê ë þ ÷ î â ³ ñ ë î â à: ³íòå¿í, á³ëêîâèé ñïëàéñèíã, õîóì³íã, î÷èùåííÿ á³ëê³â.
íàñòîÿùåå âðåìÿ ìû ÿâëÿåìñÿ ñâèäåòåëÿìè òîãî, êàê êàðäèíàëüíî èçìåíÿþòñÿ îñíîâíûå âçãëÿäû íà ïðîöåññû, ïðîèñõîäÿùèå â ìèêðîìèðå. Íàïðèìåð, ðàíåå ñ÷èòàëîñü,
÷òî êàæäûé êëàññ ìàêðîìîëåêóë âûïîëíÿåò ñâîè,
ñïåöèôè÷íûå äëÿ åãî êëàññà, ôóíêöèè. Òàê, ÄÍÊ
ðàññìàòðèâàëàñü êàê íîñèòåëü íàñëåäñòâåííîé èíôîðìàöèè, à ÐÍÊ – êàê ïåðåíîñ÷èê åå è âàæíàÿ
ñîñòàâíàÿ äåòàëü áåëîêñèíòåçèðóþùåé ìàøèíû.
Äëÿ áåëêîâ æå áûëè îòâåäåíû ìíîãî÷èñëåííûå
“èñïîëíèòåëüíûå” ôóíêöèè, â ÷àñòíîñòè êàòàëèç õèìè÷åñêèõ ðåàêöèé, êîíòðîëü ýêñïðåññèè
ãåíîâ, ðåöåïòîðíûå, òðàíñïîðòíûå è äðóãèå ôóíêöèè. Îäíàêî íàêîïèâøèåñÿ ôàêòû ñâèäåòåëüñòâóþò î çíà÷èòåëüíî áîëüøåé ìíîãîôóíêöèîíàëüíîñòè êàæäîãî êëàññà ìàêðîìîëåêóë. Îêàçàëîñü,
â ÷àñòíîñòè, ÷òî ÐÍÊ ìîæåò âûïîëíÿòü ðÿä ôóíêöèé, ðàíåå ñ÷èòàâøèõñÿ èñêëþ÷èòåëüíî áåëêîâûìè. Íà ïðîòÿæåíèè ìíîãèõ äåñÿòèëåòèé áèîõèìèêè áûëè óâåðåíû, ÷òî áèîëîãè÷åñêèé êàòàëèç âñåãäà è âñþäó îñóùåñòâëÿåòñÿ áåëêàìè-ôåðìåíòàìè. È âîò â 1982–1983 ãã. áûëî ïîêàçàíî,
÷òî â ïðèðîäå èìåþòñÿ òàêèå ÐÍÊ, êîòîðûå, ïîäîáíî áåëêàì, îáëàäàþò âûñîêîñïåöèôè÷åñêîé
êàòàëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ. Òàêèå ÐÍÊ-êàòàëèçàòîðû áûëè íàçâàíû ðèáîçèìàìè. Ïðåäñòàâëåíèþ îá èñêëþ÷èòåëüíîñòè áåëêîâ â êàòàëèçå
áèîõèìè÷åñêèõ ðåàêöèé ïðèøåë êîíåö. À â ïîñëåäíèå ãîäû ïîêàçàíî, ÷òî ðÿä íèçêîìîëåêóëÿðíûõ ÐÍÊ ñïîñîáíû ðåãóëèðîâàòü è äàæå áëîêèðîâàòü ýêñïðåññèþ ãåíîâ. Ïîñòåïåííî ãðàíü ìåæäó ôóíêöèÿìè, âûïîëíÿåìûìè ÐÍÊ è áåëêàìè,
ñòàíîâèëàñü âñå áîëåå çûáêîé. Ôóíêöèîíàëüíûå
ðàçëè÷èÿ ìåæäó íèìè îêàçàëèñü åùå áîëåå ýôå-
Â
ìåðíûìè ïîñëå òîãî, êàê â 1990 ã. Ò. Ñòèâåíñîì
ñ ñîòð. áûëî îáíàðóæåíî ÿâëåíèå áåëêîâîãî àâòîñïëàéñèíãà [1].
Êàê ýòî ÷àñòî áûâàåò, áåëêîâûé ñïëàéñèíã
áûë îòêðûò ñëó÷àéíî, ïðè èññëåäîâàíèè ýêñïðåññèè äðîææåâîãî ãåíà VMA1, êîäèðóþùåãî
ñóáúåäèíèöó vma1 âàêóîëÿðíîé ATÐ-àçû. Èññëåäîâàíèå ñòåïåíè ãîìîëîãèè äàííîãî ãåíà ó ðàçëè÷íûõ ìèêðîîðãàíèçìîâ íåîæèäàííî ïîêàçàëî,
÷òî ó äðóãèõ âèäîâ ãåí VMA1 êîäèðóåò áåëîê ñ
ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé îêîëî 70 êÄà, â òî âðåìÿ
êàê äðîææåâîé ãåí êîäèðîâàë ïðîäóêò ñ áîëåå
âûñîêîé ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé – 119 êÄà. Ïðè
ýòîì äëÿ êîíöåâûõ ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé äðîææåâîãî ãåíà VMA1 õàðàêòåðíà âûñîêàÿ ñòåïåíü
ãîìîëîãèè ñ àíàëîãè÷íûìè ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿìè äðóãèõ ìèêðîîðãàíèçìîâ, òîãäà êàê â öåíòðàëüíîé ÷àñòè îíà íàðóøàåòñÿ. Îäíàêî ÷àñòè÷íàÿ äåëåöèÿ ýòîãî ãåíà ó äðîææåé ïðèâîäèò ê
ïðåêðàùåíèþ ñèíòåçà ïîëèïåïòèäà ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé 69 êÄà, íî íå 119 êÄà. Áûëî âûäâèíóòî ïðåäïîëîæåíèå î òîì, ÷òî ÷àñòü àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ïðåäøåñòâåííèêà ñ
ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé 119 êÄà îòùåïëÿåòñÿ íà
óðîâíå ñèíòåçèðîâàííîãî ïîëèïåïòèäà. Äàëüíåéøèå èññëåäîâàíèÿ ïîëíîñòüþ ïîäòâåðäèëè ýòó
ãèïîòåçó. Òàê, ñäâèã ðàìêè ñ÷èòûâàíèÿ â ñåãìåíòå ãåíà VMA1, êîäèðóþùåãî öåíòðàëüíóþ
÷àñòü ïîëèïåïòèäà è îòñóòñòâóþùóþ â çðåëîì
áåëêå, ïðèâîäèò ê ïðåêðàùåíèþ ñèíòåçà áåëêà
íà ðèáîñîìàõ èç-çà âîçíèêíîâåíèÿ â ìÐÍÊ íîâûõ òåðìèíèðóþùèõ êîäîíîâ òðàíñëÿöèè. Ïîäîáíîå íå ïðîèñõîäèëî á, åñëè áû öåíòðàëüíàÿ
÷àñòü ïðî-ìÐÍÊ ãåíà VMA1 óäàëÿëàñü âñëåäñòâèå
14
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
Ï. Ë. ÑÒÀÐÎÊÀÄÎÌÑÊÈÉ
ñïëàéñèíãà. Êðîìå òîãî, àíàëèç êëåòî÷íûõ ëèçàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì àíòèòåë ê öåíòðàëüíîé ÷àñòè ïîëèïåïòèäà, îòñóòñòâóþùåé â çðåëîé ñóáúåäèíèöå, ñâèäåòåëüñòâóåò î íàëè÷èè áåëêîâîãî
ïðîäóêòà ñ ïðåäñêàçàííîé ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé
50 êÄà. Îí ïðèñóòñòâóåò â êîëè÷åñòâåííîì ñîîòíîøåíèè 1 : 1 ê ôóíêöèîíàëüíî àêòèâíîìó ïîëèïåïòèäó ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé 69 êÄà. Ýòî
óêàçûâàåò íà òî, ÷òî ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ÐÍÊ â
öåíòðàëüíîé ÷àñòè ãåíà òðàíñëèðóåòñÿ íà ðèáîñîìàõ, è ñîîòâåòñòâóþùàÿ ÷àñòü ïîëèïåïòèäà-ïðåäøåñòâåííèêà óäàëÿåòñÿ óæå ïîñòòðàíñëÿöèîííî [1].
Ýòè, à òàêæå äðóãèå ðåçóëüòàòû, ïîçâîëÿþò
óòâåðæäàòü, ÷òî ïîìèìî àëüòåðíàòèâíîãî ñïëàéñèíãà ÄÍÊ è ñïëàéñèíãà ìÐÍÊ ñóùåñòâóåò òðåòèé âàðèàíò åãî – áåëêîâûé, ïðè êîòîðîì öåíòðàëüíàÿ ÷àñòü àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè óäàëÿåòñÿ, à ôëàíêèðóþùèå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ëèãèðóþòñÿ. Ïðîöåññ ÿâëÿåòñÿ àâòîêàòàëèòè÷åñêèì è íå òðåáóåò ïðèñóòñòâèÿ êàêèõ-ëèáî
êîôàêòîðîâ èëè ôåðìåíòîâ. Ýòî îòëè÷àåò áåëêîâûé ñïëàéñèíã îò ïîñòòðàíñëÿöèîííîãî ïðîöåññèíãà.
Îïðåäåëåíèÿ è òåðìèíû. Â 1994 ã. áûë ïðåäëîæåí ðÿä òåðìèíîâ, ðåêîìåíäóåìûõ äëÿ îïèñàíèÿ ïðîöåññîâ áåëêîâîãî ñïëàéñèíãà [2].
– Áåëêîâûé ñïëàéñèíã, èëè àâòîñïëàéñèíã
áåëêà – àâòîêàòàëèòè÷åñêèé ïðîöåññ óäàëåíèÿ
öåíòðàëüíîé îáëàñòè ïîëèïåïòèäà ñ ïîñëåäóþùèì ëèãèðîâàíèåì ôëàíêèðóþùèõ ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé;
– Èíòåèí – âíóòðåííÿÿ ÷àñòü ïîëèïåïòèäà, óäàëÿåìàÿ â ïðîöåññå áåëêîâîãî ñïëàéñèíãà;
– Áåëîê-ïðåäøåñòâåííèê – áåëîê, ñîäåðæàùèé èíòåèí;
– Ñàéò ñïëàéñèíãà – òî÷êà, â êîòîðîé ïðîèñõîäèò ðàñùåïëåíèå ïåïòèäíîé ñâÿçè;
– N-ýêñòåèí è Ñ-ýêñòåèí – âíåøíèå N- è
C-êîíöåâûå ÷àñòè ïîëèïåïòèäà, ôëàíêèðóþùèå
èíòåèí;
– Çðåëûé áåëîê (ñèíîíèìû – ñëèòûé áåëîê, ëèãèðîâàííûé áåëîê, ñïëàéñèðîâàííûé áåëîê) – ëèãèðîâàííûé N- è Ñ-ýêñòåèí;
– N-êîíöåâîé ñïëàéñèíã, èëè N-ñïëàéñèíã – ðàçðûâ, êîòîðûé ïðîèñõîäèò ìåæäó Ñ-êîíöîì N-ýêñòåèíà è N-êîíöîì èíòåèíà;
– Ñ-êîíöåâîé ñïëàéñèíã èëè Ñ-ñïëàéñèíã –
ðàçðûâ, êîòîðûé ïðîèñõîäèò ìåæäó Ñ-êîíöîì èíòåèíà è N-êîíöîì Ñ-ýêñòåèíà;
– N-ñïëàéñèíãîâûé äîìåí – N-êîíöåâîé
äîìåí èíòåèíà;
– Ñ-ñïëàéñèíãîâûé äîìåí – Ñ-êîíöåâîé
äîìåí èíòåèíà.
Ðàçëè÷íûå èíòåèíû ïîëó÷èëè íàçâàíèÿ, èñõîäÿ èç ñîêðàùåííîãî íàçâàíèÿ âèäà, ó êîòîðîãî
îáíàðóæåí äàííûé áåëîê-ïðåäøåñòâåííèê, è íàçâàíèÿ ãåíà, êîäèðóþùåãî èíòåèíñîäåðæàùèé
áåëîê. Íàïðèìåð, èíòåèí âàêóîëÿðíîé ÀÒÐ-àçû
(vma) äðîææåé (Saccharomyces cerevisiae) ïîëó÷èë íàçâàíèå Sce VMA. Eñëè èíòåèí îáëàäàåò
ýíäîíóêëåàçíîé àêòèâíîñòüþ, òî åãî îáîçíà÷àþò
ïî àíàëîãèè ñ ýíäîíóêëåàçàìè, êîäèðóåìûìè
èíòðîíàìè 1-ãî òèïà: íàïðèìåð PI-PfuI è
PI-PfuII – èíòåèíû ¹ 1 è 2 ðèáîíóêëåîòèäðåäóêòàçû Pyrococcus furiosus, ãäå PI îáîçíà÷àåò
Protein Insert, à I è II – ïîðÿäêîâûé íîìåð èíòåèíà (ïðè óñëîâèè, ÷òî èõ íåñêîëüêî).
Îáùàÿ ñõåìà îðãàíèçàöèè èíòåèíà. Äëèíà
âñåõ èçâåñòíûõ íà ñåãîäíÿ èíòåèíîâ ñîñòàâëÿåò
134–600 àìèíîêèñëîòíûõ îñòàòêîâ (à. î.) [3]. Àíàëèç èõ ñòðóêòóðû ïîêàçàë, ÷òî ìîæíî âûäåëèòü
ðÿä êîíñåðâàòèâíûõ ìîòèâîâ, õàðàêòåðíûõ äëÿ
áîëüøèíñòâà èíòåèíîâ [4–7].  íàñòîÿùåå âðåìÿ îáíàðóæåíî íåñêîëüêî òèïîâ èõ. Ýòî êëàññè÷åñêèå èíòåèíû è ìèíè-èíòåèíû, êîòîðûå îòëè÷àþòñÿ íàëè÷èåì èëè îòñóòñòâèåì öåíòðàëüíîãî
ýíäîíóêëåàçíîãî äîìåíà (ðèñ. 1). Îäíàêî N- è
Ñ-êîíöû ó îáîèõ òèïîâ èíòåèíîâ õàðàêòåðèçóþòñÿ âûñîêîé ãîìîëîãèåé.
 óñðåäíåííîì èíòåèíå ìîæíî âûäåëèòü 10
ïîñëåäîâàòåëüíûõ êîíñåðâàòèâíûõ àìèíîêèñëîòíûõ ìîòèâîâ, îáîçíà÷åííûõ ëàòèíñêèìè áóêâàìè A, N2, B, N4, C, D, E, Í, F, G [5,7]. Îáîáùåííûå ôîðìóëû ìîòèâîâ ïðåäñòàâëåíû â òàáë. 1.
Ìîòèâû À, N2, B, N4, F è G îáåñïå÷èâàþò àâòîñïëàéñèíã èíòåèíà, ìîòèâû C, D, E è Í – åãî
ýíäîíóêëåàçíóþ àêòèâíîñòü.
Ðàññìîòðèì îñíîâíûå õàðàêòåðèñòèêè êàæäîãî ìîòèâà.
A-ìîòèâ. Ýòî êîðîòêèé ìîòèâ íà N-êîíöå
èíòåèíà, êîòîðûé ñîñòîèò èç 13 à.î., äâà èç êîòîðûõ (ïåðâûé è ïîñëåäíèé) ÿâëÿþòñÿ âûñîêîêîíñåðâàòèâíûìè. Ïðàêòè÷åñêè âñåãäà íà N-êîíöå
èíòåèíà (ïîëîæåíèå 1) ðàñïîëîæåí Cys. Î÷åíü
ðåäêî â ýòîì ïîëîæåíèè îáíàðóæèâàþò Ala, Gln
èëè Ser. Â ïîëîæåíèè 13, êðîìå Gly, èíîãäà íàõîäÿòñÿ Ala, Lys, Thr, Arg, Tyr, Asn. Âûñîêàÿ
êîíñåðâàòèâíîñòü àìèíîêèñëîò íà N-êîíöå â
À-ìîòèâå îáúÿñíÿåòñÿ èõ êðèòè÷íîñòüþ äëÿ èíèöèàöèè ñïëàéñèíãà.
Ìîòèâ N2 ñîñòîèò èç 7 à.î., èç êîòîðûõ
îäèí – Asp èëè Glu â ïîëîæåíèè 5 – ÿâëÿåòñÿ
êîíñåðâàòèâíûì. ×àùå âñåãî ýòîìó îñòàòêó ïðåäøåñòâóåò îñòàòîê Gly.
B-ìîòèâ, îòäåëåííûé îò ìîòèâà À ëèíêåðîì, èìåþùèì äëèíó â 50–60 à.î., ñîñòîèò èç
14 à.î., ñðåäè êîòîðûõ His â ïîëîæåíèè 10 ïðèñóòñòâóåò â äàííîé ïîçèöèè âî âñåõ èçâåñòíûõ
íà ñåãîäíÿ èíòåèíàõ. ×àùå âñåãî ðÿäîì ñ íèì, â
ïîëîæåíèè 7, íàõîäèòñÿ àìèíîêèñëîòà Thr, îäíàêî äëÿ íåå íå õàðàêòåðíà 100%-íàÿ êîíñåðâàòèâíîñòü [5]. Â-ìîòèâ ôîðìèðóåò àêòèâíûé
öåíòð, îáëåã÷àþùèé ðàçðûâ ïåïòèäíîé ñâÿçè íà
N-êîíöå èíòåèíà [8].
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
15
ÎÃËßÄÈ
A
Домены
N-сплайсинговый
Интеиновые мотивы A
N-экстеин
Консервативные
аминокислотные
остатки
N2
B
DOD-эндонуклеазный
N4
C
D
С-сплайсинговый
E
Н
F G
С-экстеин
C
S
A
HN C
HQ S
Т Н
T
Интеин (450–600 а.о.)
Б
А
Домены
Интеиновые
мотивы
Интеновые мотивы
N-экстеин
Консервативные
аминокислотные
остатки
N-сплайсинговый
A
N2
B
Линкер
С-сплайсинговый
N4
F G
С-экстеин
C
S
A
HN C
HQ S
Т Н
T
Интеин (134–300 а.о.)
Б
Ðèñ. 1. Ñõåìà ñòðîåíèÿ îñíîâíûõ òèïîâ èíòåèíîâ [8]: À – êëàññè÷åñêèé DOD-ñîäåðæàùèé èíòåèí, Á –
ìèíè-èíòåèí.
Ò à á ë è ö à 1. Îáîáùåííàÿ ôîðìóëà àìèíîêèñëîòíûõ ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé â ðàçëè÷íûõ èíòåèíîâûõ
ìîòèâàõ
Мотив
Аминокислотная
Обозначения
последовательность
A
Ch..Dp.hhh..G
Ν2
…GD..
B
G..h.hT..H.hhh
h - гидрофобные остатки (G,V,L,I,A,M)
Ν4
………GD…..
а – кислые остатки (D,E)
С
LhG..hhaG
r – ароматические остатки (F,Y,W)
D
.K.IP..h
р – полярные остатки (S,T,C)
Е
.L.GhFahDG
. – неконсервативный остаток
+1
Н
p.S..hh..h..LL..hGI
p - +1 остаток С-экстеина (S,T,C)
F
rVYDLpV..a..HNFh
– место разрыва на С-конце интеина
G
NGhhhHN p
+1
Ìîòèâ N4 ñîñòîèò èç 16 à.î., èç êîòîðûõ
îäèí – Asp èëè Glu – â ïîëîæåíèè 11 ÿâëÿåòñÿ
êîíñåðâàòèâíûì. Òàê æå, êàê è ó N2-ìîòèâà, ÷àñòî
â ïîëîæåíèè 10 íàõîäèòñÿ îñòàòîê Gly. Îäíàêî
â îòëè÷èå îò N2-ìîòèâà, N4-ìîòèâ îáíàðóæåí
íå ó âñåõ èíòåèíîâ (îòñóòñòâóåò ó SceVMA,
CtrVMA, CeuClpP è äð.) [7].
Ìîòèâû À, N2, N4 è Â ôîðìèðóþò N-êîí-
16
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
Ï. Ë. ÑÒÀÐÎÊÀÄÎÌÑÊÈÉ
öåâîé ñïëàéñèíãîâûé äîìåí. Îáùàÿ äëèíà åãî
ñîñòàâëÿåò îêîëî 150–200 à.î. [7]. Ìíîãèå èç
óêàçàííûõ êîíñåðâàòèâíûõ àìèíîêèñëîò ÿâëÿþòñÿ
àáñîëþòíî íåîáõîäèìûìè äëÿ ñïëàéñèíãà: àìèíîêèñëîòíûå çàìåíû â óêàçàííûõ âûøå ïîçèöèÿõ ÷àñòî ïîëíîñòüþ áëîêèðóþò èíèöèàöèþ ñïëàéñèíãà èíòåèíà.
C-ìîòèâ è E-ìîòèâ ÿâëÿþòñÿ DOD-ýëåìåíòàìè (dod1 è dod2 ñîîòâåòñòâåííî). Èõ ñòðîåíèå
àíàëîãè÷íî èçâåñòíûì DOD-ýíäîíóêëåàçàì: ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, ñîäåðæàùèå 9 è 10 à.î., ôîðìèðóþò öåíòðû óçíàâàíèÿ äâóõöåïî÷å÷íîé ÄÍÊ
è ðàçäåëåíû ëèíêåðîì, ñîñòîÿùèì èç 90–130 à.î.
 àêòèâíîì öåíòðå âûäåëÿþò êîíñåðâàòèâíûå
îñòàòêè Gly (ïîçèöèè 3, 9 è 4, 10 ìîòèâîâ Ñ è Å
ñîîòâåòñòâåííî). Ïðè ýòîì êàæäûé ìîòèâ ñîäåðæèò êàòàëèòè÷åñêè àêòèâíûå Asn è Lis.
D-ìîòèâ (8 à. î.) ÿâëÿåòñÿ ëèíêåðîì, êîòîðûé òàêæå ìîæåò âëèÿòü íà ýíäîíóêëåàçíóþ àêòèâíîñòü ñîñåäíèõ ìîòèâîâ (ïîêàçàíî, ÷òî çàìåíà Lis â ïîëîæåíèè 2 ìîæåò áëîêèðîâàòü ýíäîíóêëåàçíóþ àêòèâíîñòü DOD-äîìåíà [5]).
Í-ìîòèâ ñîäåðæèò 19 à. î., èç êîòîðûõ äîâîëüíî ÷àñòî ïîâòîðÿåòñÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü
Leu-Leu â ïîëîæåíèè 13–14.
Ìîòèâû Ñ, D, E, H ôîðìèðóþò DOD-ýíäîíóêëåàçíûé äîìåí, êîòîðûé ïðèñóòñòâóåò â
êëàññè÷åñêèõ èíòåèíàõ. Îñíîâíàÿ ðîëü ýòîãî äîìåíà – èíäóêöèÿ ìîáèëüíîñòè èíòåèíîâûõ ãåíîâ. Öåëåñîîáðàçíî åùå ðàç ïîä÷åðêíóòü ñëåäóþùåå: âñå ýêñïåðèìåíòàëüíûå äàííûå ñâèäåòåëüñòâóþò, ÷òî íàëè÷èå DOD-äîìåíà íå ÿâëÿåòñÿ
íåîáõîäèìûì äëÿ îñóùåñòâëåíèÿ áåëêîâîãî
ñïëàéñèíãà [4,5,7,9]. Ïîäòâåðæäåíèåì ýòîãî ÿâëÿþòñÿ ìèíè-èíòåèíû, êîòîðûå ëèøåíû åãî, îäíàêî ýôôåêòèâíî ñàìîóäàëÿþòñÿ in vivo è in vitro.
Òàêæå èçó÷åíî íåñêîëüêî èíòåèíîâ (Ssp GyrB,
Ter GyrB), ÿâëÿþùèõñÿ HNH-ýíäîíóêëåàçàìè
ñî ñïåöèôè÷íûì ñòðîåíèåì ýíäîíóêëåàçíîãî äîìåíà, îòëè÷íîãî îò DOD-äîìåíà. Êðîìå òîãî,
ìíîãèå èíòåèíû íåñóò óêîðî÷åííûé íàáîð ìîòèâîâ â ýíäîíóêëåàçíîì äîìåíå – C,D,H
(CeuClpP); C,E,H (CivRIR1, MchRecA, MfaRecA);
D,E,H (MjaHyp-1, MjaRpolA) èëè òîëüêî Í-ìîòèâ (NpuGyrB, SspGyrB, TerGyrB) è äð. [5].
Ìîòèâû F è G ôîðìèðóþò Ñ-êîíöåâîé àâòîêàòàëè÷åñêèé äîìåí, îáùàÿ äëèíà êîòîðîãî ñîñòàâëÿåò îêîëî 25–40 à.î. [7]. Õàðàêòåðíî, ÷òî Fè G-ìîòèâû ðàçäåëåíû î÷åíü íåáîëüøèì ëèíêåðîì, îáû÷íî îò 2 äî 5 à.î.
F-ìîòèâ ñîñòîèò èç 16 à.î., èç êîòîðûõ ïîëîâèíà ÿâëÿåòñÿ âûñîêîêîíñåðâàòèâíûìè (òàáë. 1).
G-ìîòèâ ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé êîðîòêóþ
Ñ-êîíöåâóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü, ñîñòîÿùóþ èç
8 à.î. – 7 àìèíîêèñëîò èíòåèíà è N-êîíöåâîé
àìèíîêèñëîòû Ñ-ýêñòåèíà. Â èíòåèíå ïîñëåäíåé
àìèíîêèñëîòîé ïðàêòè÷åñêè âñåãäà ÿâëÿåòñÿ Asn
(î÷åíü ðåäêî Gln), à ïðåäïîñëåäíåé – His. Ýòè
äâå àìèíîêèñëîòû àáñîëþòíî êðèòè÷íû äëÿ òåðìèíàöèè ñïëàéñèíãà in vivo [5,7], êàê è N-êîíöåâàÿ àìèíîêèñëîòà Ñ-ýêñòåèíà (+1 àìèíîêèñëîòà).  ïîëîæåíèè +1 ó âñåõ èçâåñòíûõ Ñ-ýêñòåèíîâ íàõîäèòñÿ îäíà èç òðåõ àìèíîêèñëîò –
Ser, Thr èëè Cys. Çàìåíà êîíñåðâàòèâíûõ àìèíîêèñëîò, â ÷àñòíîñòè ïîñëåäîâàòåëüíîñòè HisAsn(Gln) è +1 àìèíîêèñëîòû ýêñòåèíà, áëîêèðóåò òåðìèíàöèþ ñïëàéñèíãà èíòåèíà in vivo, ÷òî
ïðèâîäèò ê íàêîïëåíèþ òàê íàçûâàåìûõ ðàçâåòâëåííûõ èíòåðìåäèàòîâ (äàííûå ïðèâîäÿòñÿ
íèæå) [3,8]. Ýòîò ïîäõîä áûë èñïîëüçîâàí ïðè
èññëåäîâàíèè ìåõàíèçìà ñïëàéñèíãà [3].
Ìåõàíèçìû áåëêîâîãî ñïëàéñèíãà. Ìíîãèìè
èññëåäîâàòåëÿìè áûëî ïîêàçàíî, ÷òî áåëêîâûé
ñïëàéñèíã ÿâëÿåòñÿ àóòîêàòàëèòè÷åñêèì ïðîöåññîì è äëÿ ñâîåãî îñóùåñòâëåíèÿ, êðîìå ïîëèïåïòèäà-ïðåäøåñòâåííèêà, íå òðåáóåò ïðèñóòñòâèÿ
äðóãèõ êîôàêòîðîâ [2,3,5,10]. Îäíàêî îïðåäåëèòü
òî÷íûé ìåõàíèçì, ïî êîòîðîìó îñóùåñòâëÿåòñÿ
ñïëàéñèíã áåëêîâ, äîëãîå âðåìÿ íå óäàâàëîñü.
Àâòîñïëàéñèíã ïðîòåêàåò íàñòîëüêî áûñòðî, ÷òî
îáû÷íûìè ìåòîäàìè îáíàðóæèòü ïðîìåæóòî÷íûå
ñîåäèíåíèÿ íå óäàâàëîñü. Ðåøèòü ýòó çàäà÷ó óäàëîñü ãðóïïå Ô. Ïåðëåð. Ïðîèçâîäÿ çàìåíû ðÿäà
êðèòè÷íûõ àìèíîêèñëîò â Ñ-êîíöåâîì äîìåíå
èíòåèíîâ, îíè ñìîãëè äîáèòüñÿ íàêîïëåíèÿ óñòîé÷èâûõ ïðîìåæóòî÷íûõ ñîåäèíåíèé – ðàçâåòâëåííûõ èíòåðìåäèàòîâ [3]. Èññëåäîâàíèå ïîñëåäíèõ ïîçâîëèëî îïðåäåëèòü òî÷íûå ìåõàíèçìû, ïî êîòîðûì ïðîòåêàåò áåëêîâûé ñïëàéñèíã.
Ñîãëàñíî ïðèíÿòîé íà ñåãîäíÿ ìîäåëè, áåëêîâûé ñïëàéñèíã ñîñòîèò èç ñåðèè ñîãëàñîâàííûõ íóêëåîôèëüíûõ ïåðåñòàíîâîê [8]. Ïðîöåññîì, çàïóñêàþùèì åãî, ÿâëÿåòñÿ ñïîíòàííûé
N-O-ñäâèã (åñëè ïåðâàÿ àìèíîêèñëîòà íà N-êîíöå
èíòåèíà – Ser) èëè N-S-ñäâèã (åñëè ïåðâàÿ àìèíîêèñëîòà – Cys) íà N-êîíöåâîì ñàéòå ñïëàéñèíãà (ðèñ. 2, À). Íà âòîðîì ýòàïå ïðîèñõîäèò
íóêëåîôèëüíàÿ àòàêà îáðàçîâàâøåéñÿ ýôèðíîé
ñâÿçè OH- èëè SH-ãðóïïîé +1 àìèíîêèñëîòû
C-ýêñòåèíà ñ ïîñëåäóþùåé òðàíñýòåðèôèêàöèåé
(ðèñ. 2 è 3). Åñëè íà N-êîíöå èíòåèíà íàõîäèòñÿ
Ala, òî èíèöèàöèÿ ñïëàéñèíãà ïðîèñõîäèò ïî àëüòåðíàòèâíîìó ìåõàíèçìó: OH-ãðóïïà êîíñåðâàòèâíîãî îñòàòêà Ser, ðàñïîëîæåííîãî â ïîëîæåíèè +1 C-ýêñòåèíà, íóêëåîôèëüíî àòàêóåò êàðáîíèëüíóþ ãðóïïó ïåïòèäíîé ñâÿçè, ðàñïîëîæåííîé â N-êîíöå èíòåèíà.
Âñëåäñòâèå êàê ñòàíäàðòíîãî, òàê è àëüòåðíàòèâíîãî N-ñïëàéñèíãà, îáðàçóåòñÿ ðàçâåòâëåííîå ïðîìåæóòî÷íîå ñîåäèíåíèå. Íóêëåîôèëüíàÿ
ïåðåñòàíîâêà ïðèâîäèò ê ñìåùåíèþ çàðÿäîâ, ÷òî,
â ñâîþ î÷åðåäü, âûçûâàåò íà Ñ-êîíöå èíòåèíà
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
17
ÎÃËßÄÈ
A
Б
Ser1
Ser +1
Cys
СУУ
Ν-экстеин
Интеин
N-O сдвиг
С-экстеин
Hh-N
Asn
Трансэтерефикация
Трансэтерификация
Hh-C
N-S сдвиг
Связывание холестерола
Холестерин
Трансэтерификация
Трансэтерефикация
(холестероловая атака)
Циклизация Asn
Hh-N-холестерол
Свободный Hh-C
O-N сдвиг
А
Лигированные экстеины
Б
Ðèñ. 2. À – ñõåìà êëàññè÷åñêîãî áåëêîâîãî ñïëàéñèíãà, Á – ñõåìà èíòåèíïîäîáíîãî ñîçðåâàíèÿ áåëêîâ
cåìåéñòâà Hh [5], ÑÓÓ – ñòåðèíóçíàþùèé ó÷àñòîê.
öèêëèçàöèþ áîêîâîé ãðóïïû Asn ñ îáðàçîâàíèåì ñóêöèíèìèäà. Ýòî ïðèâîäèò ê ðàçðûâó ïåïòèäíîé ñâÿçè ìåæäó èíòåèíîì è Ñ-ýêñòåèíîì –
ðàçâåòâëåííàÿ ñòðóêòóðà ðàñïàäàåòñÿ íà ñâîáîäíûé èíòåèí è ëèãèðîâàííûå ýêñòåèíû, ñâÿçàííûå äðóã ñ äðóãîì ñëîæíîýôèðíîé ñâÿçüþ (ðèñ. 2,
À), êîòîðàÿ ñïîíòàííî ïðåîáðàçóåòñÿ â ýíåðãåòè÷åñêè áîëåå âûãîäíóþ ïåïòèäíóþ ñâÿçü ïîñëå
N-O- (ïðè Ser+1) èëè N-S-ñäâèãà (ïðè Cys+1).
 íàñòîÿùåå âðåìÿ âûäåëÿþò äâà âèäà ñïëàéñèíãà: ñòàíäàðòíûé ïóòü, îïèñàííûé âûøå, à òàêæå èíòåèíïîäîáíûé ïðîöåññèíã ýìáðèîíàëüíûõ
ñèãíàëüíûõ áåëêîâ ñåìåéñòâà Hh (Hedgehog
Protein). Ñèãíàëüíàÿ ñèñòåìà Hh îáíàðóæåíà ó
÷åëîâåêà, ìûøè, êóðèöû, ëÿãóøêè, ðûáû, ìîðñêîãî åæà, ïèÿâêè, íàñåêîìûõ è â äðóãèõ îðãàíèçìàõ. Âî ìíîãèõ ðàáîòàõ ïîêàçàíî èñêëþ÷èòåëüíî âàæíîå âëèÿíèå áåëêîâ ñåìåéñòâà Hh íà
ïðîöåññû ôîðìèðîâàíèÿ ýìáðèîíà [3,11,12]. Â
àñïåêòå æå äàííîãî îáçîðà íàñ èíòåðåñóåò ïðîöåññ äîçðåâàíèÿ ýòèõ áåëêîâ, êîòîðûå ýêñïðåññèðóþòñÿ â âèäå íåàêòèâíûõ ïðåäøåñòâåííèêîâ,
ñîñòîÿùèõ èç äâóõ äîìåíîâ: ñèãíàëüíîãî N-òåðìèíàëüíîãî äîìåíà (Hh-N) è êàòàëèòè÷åñêîãî
Ñ-äîìåíà (Íh-C). Â ñîñòàâå Íh-C îáíàðóæåíû
êîíñåðâàòèâíûå ìîòèâû, àíàëîãè÷íûå ìîòèâàì
À è Â èíòåèíîâ.
Ïåðâîé àìèíîêèñëîòîé Íh-C ÿâëÿåòñÿ Cys,
êîòîðûé àêòèâèðóåòñÿ âñëåäñòâèå ñïîíòàííîé ïåðåñòàíîâêè, àíàëîãè÷íîé ïåðâîìó øàãó ñòàíäàðòíîãî ìåõàíèçìà áåëêîâîãî ñïëàéñèíãà (ðèñ. 2,
Á). Ñëåäóþùèì ïðîöåññîì ÿâëÿåòñÿ ñâÿçûâàíèå
ñòåðèíóçíàþùèì ó÷àñòêîì íà Ñ-êîíöå Íh-C ìîëåêóëû õîëåñòåðîëà. Ãèäðîêñèëüíàÿ ãðóïïà
ïîñëåäíåãî íóêëåîôèëüíî àòàêóåò êàðáîíèëüíóþ
ãðóïïó ïåïòèäíîé ñâÿçè íà Ñ-êîíöå ñèãíàëüíî-
18
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
Ï. Ë. ÑÒÀÐÎÊÀÄÎÌÑÊÈÉ
Ile 156
HO
С-конец интеина
NH
Ser -2
O
O
NH
N
O
H
Gly -1
O
О
O
S
H
Cys 1
HN
Ser 155
Asn 154
HO
Thr 138
H2N
N-конец интеина
O
Ðèñ. 3. Ñõåìà íóêëåîôèëüíîé àòàêè N-êîíöà èíòåèíà áîêîâûì ðàäèêàëîì +1 àìèíîêèñëîòû [8]. Ñòðåëêàìè ïîêàçàíî ñìåùåíèå ýëåêòðîííîé ïëîòíîñòè: Ser-2, Gly-1 – Ñ-êîíöåâûå àìèíîêèñëîòû N-ýêñòåèíà; Cys 1 – ïåðâàÿ àìèíîêèñëîòà èíòåèíà; Thr 138 – àìèíîêèñëîòà â ñåðåäèíå ìîëåêóëû èíòåèíà;
Asn 154 – Ñ-êîíöåâàÿ àìèíîêèñëîòà èíòåèíà; Ser 155, Ile 156 – N-êîíöåâûå àìèíîêèñëîòû Ñ-ýêñòåèíà. Òî÷êîé îòñ÷åòà ïîðÿäêîâûõ íîìåðîâ àìèíîêèñëîò ÿâëÿåòñÿ N-àìèíîêèñëîòà èíòåèíà (Cys 1).
ãî äîìåíà Hh-N, ÷òî âûçûâàåò ðàçðûâ ïåïòèäíîé ñâÿçè ìåæäó Hh-N- è Hh-Ñ-äîìåíàìè è êîâàëåíòíóþ ïðèøèâêó ýòîãî ñïèðòà ê Hh-N. Ìîäèôèêàöèÿ õîëåñòåðîëîì ñèãíàëüíîãî Hh-N-äîìåíà îáåñïå÷èâàåò åãî ìèãðàöèþ è âñòðàèâàíèå
â ïëàçìàòè÷åñêóþ ìåìáðàíó èëè âûõîä áåëêà èç
êëåòêè, ÷òî ïîçâîëÿåò åìó âûïîëíÿòü ñâîè ôóíêöèè [11,12].
Âûøåîïèñàííûå ïðîöåññû ÿâëÿþòñÿ ïðèìåðàìè áåëêîâîãî öèñ-ñïëàéñèíãà, ò.å. àâòîêàòàëèòè÷åñêîãî óäàëåíèÿ èíòåèíà èç áåëêà-ïðåäøåñòâåííèêà. Êðîìå òîãî, ó ìíîãèõ îðãàíèçìîâ îáíàðóæåíî ÿâëåíèå òðàíñ-ñïëàéñèíãà áåëêîâ [13],
âñëåäñòâèå êîòîðîãî ïðîèñõîäèò ëèãèðîâàíèå äâóõ
áåëêîâ, êîäèðóåìûõ äâóìÿ ðàçëè÷íûìè ãåíàìè.
Ýòîò ïðîöåññ îïîñðåäóåòñÿ èíòåèíïîäîáíûìè äîìåíàìè (ÈÏÄ), êîòîðûå íàõîäÿòñÿ íà îïðåäåëåííîì êîíöå êàæäîãî áåëêà. Îíè õàðàêòåðèçóþòñÿ âûñîêèì ñðîäñòâîì äðóã ê äðóãó è ïðè
íåêîâàëåíòíîì ñâÿçûâàíèè îáðàçóþò ïîëíîöåííûé èíòåèí (ðèñ. 4). Äàëåå ñïëàéñèíã îñóùåñòâëÿåòñÿ ïî îïèñàííîìó âûøå ñòàíäàðòíîìó ìåõàíèçìó. Â ðåçóëüòàòå ïîëèïåïòèäíûå öåïè, ïðèëåãàþùèå ê èíòåèíïîäîáíûì äîìåíàì, ëèãèðóþòñÿ. Ïî òàêîé ñõåìå, íàïðèìåð, ôîðìèðóåòñÿ
áåëîê dnaE, ñëèÿíèå ÷àñòåé êîòîðîãî îïîñðåäóåòñÿ àññîöèàöèåé N-ÈÏÄ (123 à.î.) ñ Ñ-ÈÏÄ
(32 à.î.) [13].
Ýíäîíóêëåàçíàÿ àêòèâíîñòü èíòåèíîâ. Ãåíå-
òè÷åñêàÿ ìîáèëüíîñòü ÄÍÊ-ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé,
êîäèðóþùèõ èíòåèíû, áûëî îäíîé èç ñàìûõ
áîëüøèõ íåîæèäàííîñòåé, îáíàðóæåííûõ ïîñëå
îòêðûòèÿ ýòèõ ïîëèïåïòèäîâ [4,14]. Îêàçàëîñü,
÷òî ìíîãèì èíòåèíàì ñâîéñòâåííà ýíäîíóêëåàçíàÿ àêòèâíîñòü, îáåñïå÷èâàþùàÿ íàïðàâëåííûé
ïåðåíîñ ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, êîäèðóþùåé èíòåèí,
èç ãåíà, åå ñîäåðæàùåãî (àëëåëü(+)), â àëëåëüíûé
ãåí, íå ñîäåðæàùèé åå (àëëåëü(-)) [3,14]. Ýòîò ôåíîìåí íàçûâàåòñÿ õîóìèíãîì èíòåèíîâ, ïî àíàëîãèè ñ õîóìèíãîì èíòðîíîâ ìÐÍÊ I ãðóïïû
[15].
Õîóìèíã-ýíäîíóêëåàçû – ýòî áîëüøîé êëàññ
ñàéò-ñïåöèôè÷íûõ ÄÍÊ-àç. Îíè êîäèðóþòñÿ
ìîáèëüíûìè ãåíåòè÷åñêèìè ýëåìåíòàìè, òàêèìè
êàê èíòðîíû ãðóïïû I èëè èíòåèíû. Âñå õîóìèíã-ýíäîíóêëåàçû ïðèíàäëåæàò ê ÷åòûðåì ñåìåéñòâàì â ñîîòâåòñòâèè ñî ñòðîåíèåì èõ àêòèâíîãî öåíòðà: LAGLIDADG (èëè DOD), GIY-YIG,
His-Cys è H-N-H [14]. Íàçâàíèÿ ñåìåéñòâ îòðàæàþò êîíñåðâàòèâíûå àìèíîêèñëîòíûå ìîòèâû
àêòèâíûõ öåíòðîâ ýíäîíóêëåàç. Íàïðèìåð, äëÿ
DOD-ýíäîíóêëåàç õàðàêòåðíî íàëè÷èå â êàòàëèòè÷åñêîì êàðìàíå êîíñåðâàòèâíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè LAGLIDADG. Áîëüøèíñòâî èíòåèíîâ ÿâëÿþòñÿ DOD-ýíäîíóêëåàçàìè. Îíè ñîäåðæàò äâà
DOD-ìîòèâà, êîòîðûå ñîñòàâëÿþò êîð DOD-ýíäîíóêëåàçíîãî äîìåíà (ðèñ. 1). Ïî ïðèíöèïó äåéñòâèÿ DOD-ýíäîíóêëåàçû ÿâëÿþòñÿ ÄÍÊ- è
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
19
ÎÃËßÄÈ
Cys
Ν-экстеин
Cys
ИПД-N
ИПД-С
Ассоциация
С-экстеин
Asn
N-S сдвиг
Трансэтерефикация
Трансэтерификация
Циклизация Asn
Удаленный интеин
S-N сдвиг
Лигированные экстеины
Ðèñ. 4. Ñõåìà òðàíñ-ñïëàéñèíãà äâóõ áåëêîâ [13]. ÈÏÄ – èíòåèíïîäîáíûé äîìåí.
Mg2+-çàâèñèìûìè ÀÒÐ-àçàìè [9]. Ïðèñóòñòâèå
Mg2+ íåîáõîäèìî äëÿ îáåñïå÷åíèÿ ýíäîíóêëåàçíîé àêòèâíîñòè, íî íå èãðàþùåé ñóùåñòâåííîé
ðîëè äëÿ ñïåöèôèêè ñâÿçûâàíèÿ [19,20].
Ìåõàíèçì õîóìèíãà èíòåèíîâ îïèñàí âî
ìíîãèõ ðàáîòàõ è àíàëîãè÷åí õîóìèíãó èíòðîíîâ 1-ãî òèïà (ðèñ. 5). Èíòåèí êàòàëèçèðóåò äâóõöåïî÷íûé ðàçðûâ â ÄÍÊ. Ïðè ýòîì îáðàçóåòñÿ
3′-âûñòóïàþùèå êîíöû äëèíîé â 4 íóêëåîòèäà
(“ëèïêèé” êîíåö) [14,17]. Äàëåå ñ ó÷àñòèåì êëåòî÷íûõ ôåðìåíòîâ äâóõöåïî÷å÷íûé ðàçðûâ ðåïàðèðóåòñÿ ñ èñïîëüçîâàíèåì â êà÷åñòâå ìàòðèöû àëëåëüíîé ÄÍÊ, ñîäåðæàùåé ïîñëåäîâàòåëüíîñòü, êîäèðóþùóþ èíòåèí. Ýòî îáåñïå÷èâàåò
ïåðåíîñ åå â àëëåëü(–). Ïîäîáíûì îáðàçîì ãîìîëîãè÷íûå íóêëåîòèäíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, ïðèñóòñòâóþùèå â âèðóñàõ, ôàãàõ èëè ïëàçìèäàõ,
ìîãóò ïðèîáðåòàòü èíòåèíîâóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü [3]. Ýòî îáúÿñíÿåò íàëè÷èå â âèðóñíûõ
ãåíîìàõ ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé ÄÍÊ, ñîîòâåòñòâóþùèõ èíòåèíàì êëåòîê-õîçÿåâ [3,5].
Ïðîñòðàíñòâåííàÿ îðãàíèçàöèÿ èíòåèíà. Â
ìîëåêóëå èíòåèíà ýíäîíóêëåàçíûé è ñïëàéñèíãîâûå ó÷àñòêè ïðîñòðàíñòâåííî ðàçäåëåíû íà îòäåëüíûå äîìåíû.
N- è Ñ-ñïëàéñèíãîâûå äîìåíû îáðàçóþò
ïîäêîâîîáðàçíóþ ñòðóêòóðó (ðèñ. 6) [8,13]. Ïðîñòðàíñòâåííîå ðàñïîëîæåíèå êîíöîâ ôèêñèðóåòñÿ ìíîãî÷èñëåííûìè âîäîðîäíûìè ñâÿçÿìè, ýëåêòðîñòàòè÷åñêèìè è ãèäðîôîáíûìè âçàèìîäåéñòâèÿìè, ÷òî îáåñïå÷èâàåò îïòèìàëüíîå ñáëèæåíèå N- è Ñ-êîíöîâ èíòåèíà äî ðàññòîÿíèé, ñîîòíîñèìûõ ñ äëèíîé êîâàëåíòíûõ ñâÿçåé ìåæäó
àòîìàìè (ðèñ. 3). N- è Ñ- ñïëàéñèíãîâûå äîìå-
20
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
Ï. Ë. ÑÒÀÐÎÊÀÄÎÌÑÊÈÉ
Экстеин
Интеин
Экстеин
Гомологичная аллель без интеиновой последовательности
(+)
(-)
I
I
Хромосомная ДНК
Транскрипция
Хромосомная ДНК
Эндонуклеазное
расщепление ДНК
мРНК
Трансляция
Интеин
Эндонуклеазный домен
Белковый сплайсинг
Интеин
Репарация двухцепочечного разрыва клеточными
ферментами с использованием в качестве
(+)
матрицы I -аллели
Активный белок
(+)
Гомологичная аллель с интеиновой последовательностью I
Ðèñ. 5. Ìåõàíèçì õîóìèíãà èíòåèíîâ.
íû ôîðìèðóþòñÿ â îñíîâíîì èç β-ñêëàäîê, óëîæåííûõ â òàê íàçûâàåìûå Hint-äîìåíû (àááðåâèàòóðà îò Hedgehog è intein) [8,13]. Îáà ñàéòà ñïëàéñèíãà íàõîäÿòñÿ â öåíòðå Hint-äîìåíà íà êîíöàõ
äâóõ àíòèïàðàëëåëüíûõ β-öåïåé (ðèñ. 6).
Ñàéò ñïëàéñèíãà èíòåèíà ïî ñòðóêòóðå àíàëîãè÷åí àêòèâíîìó öåíòðó ñåðèíîâûõ ïðîòåàç [3].
Òàê, ñåðèíîâûå ïðîòåàçû êàòàëèçèðóþò ðàçðûâ
ïåïòèäíûõ ñâÿçåé ñóáñòðàòà ñ ïîìîùüþ âûñîêîêîíñåðâàòèâíûõ îñòàòêîâ Ser, His è Asp. Àíàëîãè÷íî àâòîñïëàéñèíã èíòåèíà êàòàëèçèðóåòñÿ âûñîêîêîíñåðâàòèâíûìè îñòàòêàìè Ser, Thr èëè Cys
íà N-êîíöå èíòåèíà è His-Asn-Ser èëè His-AsnCys íà Ñ-êîíöå ìîëåêóëû (ðèñ. 2).  îáîèõ ñëó÷àÿõ áîêîâàÿ ãðóïïà His àêòèâèðóåò ãèäðîêñèëüíóþ ãðóïïó Ser, êîòîðàÿ íåïîñðåäñòâåííî êîîðäèíèðóåò ãèäðîëèç ïåïòèäíîé ñâÿçè ïðè ó÷àñòèè ìîëåêóë âîäû [3,8].
Ñòðóêòóðà áîëüøèíñòâà DOD-äîìåíîâ ïîäîáíà [17]. Ðàññìîòðèì ñòðîåíèå DOD-äîìåíà
íà ïðèìåðå PI-SceI – ýíäîíóêëåàçû èíòåèíà
Sce VMA, îäíîãî èç ïåðâûõ èíòåèíîâûõ ýíäîíóêëåàçíûõ äîìåíîâ, ÷üÿ ñòðóêòóðà áûëà îïðåäåëåíà ñ ïîìîùüþ ðåíòãåíîñòðóêòóðíîãî àíàëèçà (ðèñ. 7).  ñåðåäèíå ýíäîíóêëåàçíîãî äîìåíà
äâå àíòèïàðàëëåëüíûå α-ñïèðàëè (α4 è α7) ôîðìèðóþò àêòèâíûé öåíòð, ñîäåðæàùèé äâà
LAGLIDADG-ìîòèâà – ïî îäíîìó íà êàæäîé
α-ñïèðàëè. Íåïîñðåäñòâåííî ñ ÄÍÊ ñâÿçûâàþòñÿ ïî 6 àìèíîêèñëîòíûõ îñòàòêîâ êàæäîãî DOD-ìî-
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
21
Ðèñ. 6. Ëåíòî÷íàÿ ìîäåëü N- è Ñ-ñïëàéñèíãîâûõ
äîìåíîâ èíòåèíà Ssp Dna B [8]. Êâàäðàòîì îáîçíà÷åí N-êîíöåâîé ñàéò ñïëàéñèíãà, êðóæêîì –
Ñ-êîíöåâîé. Öåíòðàëüíàÿ ÷àñòü èíòåèíà (óñëîâíî îáîçíà÷åíà ïóíêòèðîì) íå ïîêàçàíà.
ÎÃËßÄÈ
α6
β17
K301
β18
β16
β14
α5
β15
N218
α4
α7
N326
β19
β22
β21
N-сплайсинговый домен
K403
С-сплайсинговый домен
α8
β20
α9
Ðèñ. 7. Ñòðóêòóðà ýíäîíóêëåàçíîãî äîìåíà PI-SceI (èíòåèí SceVMA) [19]. Êîíñåðâàòèâíûå àìèíîêèñëîòíûå îñòàòêè îáîçíà÷åíû îäíîáóêâåííûìè ñèìâîëàìè.
òèâà [14]. Íà Ñ-êîíöàõ ýòèõ ñïèðàëåé íàõîäÿòñÿ
äâà âûñîêîêîíñåðâàòèâíûõ Asn218 è Asn326. Îíè
àáñîëþòíî íåîáõîäèìû äëÿ îáåñïå÷åíèÿ ýíäîíóêëåàçíîé àêòèâíîñòè. Òðåòüÿ íåîáõîäèìàÿ àìèíîêèñëîòà – Lis301. Asn218, Asn326 è Lis301
ôîðìèðóþò êàòàëèòè÷åñêóþ òðèàäó àêòèâíîãî
öåíòðà [18]. Â ðÿäå ðàáîò ïîêàçàíà òàêæå âàæíàÿ
ðîëü ñèììåòðè÷íîé Lis301 àìèíîêèñëîòû Lis403
[19].
Êðîìå DOD-äîìåíà, â îáåñïå÷åíèè ýíäîíóêëåàçíîé àêòèâíîñòè ïðèíèìàåò ó÷àñòèå
N-ñïëàéñèíãîâûé äîìåí, ãäå íàõîäèòñÿ ÄÍÊóçíàþùèé ó÷àñòîê (DRR – recognition region,
ðèñ. 8). Çíà÷åíèå N-êîíöà èíòåèíà äëÿ îáåñïå÷åíèÿ ýíäîíóêëåàçíîé àêòèâíîñòè áûëî ïîêàçàíî ñ ïîìîùüþ ñàéòíàïðàâëåííîãî ìóòàãåíåçà. Çàìåíû îïðåäåëåííûõ àìèíîêèñëîò â N-ñïëàéñèíãîâîì ó÷àñòêå ðåçêî ñíèæàþò ýíäîíóêëåàçíóþ
ñïåöèôè÷íîñòü è àêòèâíîñòü èíòåèíîâ [17].
DOD-ìîòèâû èíòåèíà êàòàëèçèðóþò ýíäîíóêëåàçíûé ðàçðûâ îáåèõ öåïåé ÄÍÊ, íå ñîäåðæàùåé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, êîäèðóþùåé èíòåèí.
DOD-äîìåíû âûñîêîñïåöèôè÷íû è, êàê ïðàâèëî, óçíàþò íåïàëèíäðîìíûå ÄÍÊ-ïîñëåäîâàòåëüíîñòè äëèíîé îêîëî 14–40 íóêëåîòèäíûõ ïàð
[9,17]. Ïðè ýòîì èíòåèíû óçíàþò äâà ñïåöèôè÷íûõ ó÷àñòêà ÄÍÊ: ñàéò ðåñòðèêöèè, ñ êîòîðûì
ñâÿçûâàåòñÿ DOD-äîìåí, è äèñòàëüíóþ îáëàñòü
öåëåâîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, êîòîðàÿ óçíàåòñÿ
DRR-ó÷àñòêîì èíòåèíà [21]. Ïîñëåäíÿÿ ñîñòîèò
èç 15–17 íóêëåîòèäîâ è ÿâëÿåòñÿ ñóùåñòâåííîé
äëÿ âûñîêîàôôèííîãî ñâÿçûâàíèÿ è óçíàâàíèÿ
èíòåèíîì òî÷êè ðåñòðèêöèè [19].
Îñíîâíûå ñâîéñòâà èíòåèíîâ. Â íàñòîÿùåå
âðåìÿ âûäåëÿþò ÷åòûðå îñíîâíûõ ïðèçíàêà, îäíîâðåìåííîå ïðèñóòñòâèå êîòîðûõ â áåëêîâîé
ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ñâèäåòåëüñòâóåò îá åå èíòåèíîâûõ ñâîéñòâàõ:
– â ãåíå ïðèñóòñòâóåò ïîñëåäîâàòåëüíîñòü,
êîòîðîé íåò â àíàëîãè÷íûõ ãåíàõ äðóãèõ îðãàíèçìîâ;
– ðàçìåðû çðåëîãî áåëêà îòëè÷àþòñÿ îò
ïðåäïîëàãàåìûõ ïðè àíàëèçå åãî êîäèðóþùåé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè;
– ïðèñóòñòâèå ñïåöèôè÷åñêèõ èíòåèíñïëàéñèíãîâûõ ìîòèâîâ À, Â, F, G, òîãäà êàê íàëè÷èå
èëè îòñóòñòâèå DOD-ýíäîíóêëåàçíîãî äîìåíà íå
ÿâëÿåòñÿ õàðàêòåðíûì ïðèçíàêîì;
– íàëè÷èå ÷åòûðåõ êîíñåðâàòèâíûõ àìèíîêèñëîòíûõ îñòàòêîâ íà N-êîíöå èíòåèíà – Ser,
Thr èëè Cys (èñêëþ÷èòåëüíî ðåäêî – Ala), íà
Ñ-êîíöå – His-Asn èëè His-Gln, íà N-êîíöå
Ñ-ýêñòåèíà – Ser, Thr èëè Cys [5].
Èñïîëüçîâàíèå áåëêîâîãî ñïëàéñèíãà â áèî-
22
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
Ï. Ë. ÑÒÀÐÎÊÀÄÎÌÑÊÈÉ
С-конец
Ν-конец
Ðèñ. 8. Ìîäåëü èíòåèíà PI-SceI: DRR – ÄÍÊ-óçíàþùèé ó÷àñòîê, HINT – Hint-äîìåí, DOD-äîìåí –
ýíäîíóêëåàçíûé äîìåí, LAGLIDADG – êàòàëèòè÷åñêèé êàðìàí [17].
òåõíîëîãèè. Îòêðûòèå ÿâëåíèÿ áåëêîâîãî ñïëàéñèíãà, ïîìèìî íåîñïîðèìîãî âêëàäà â ïðåäñòàâëåíèå î ìîëåêóëÿðíûõ îñíîâàõ æèçíè, ïîçâîëèëî ïî-íîâîìó ïîäîéòè ê ðåøåíèþ ðÿäà áèîòåõíîëîãè÷åñêèõ çàäà÷. Íèæå ìû ðàññìîòðèì îñíîâíûå áèîòåõíîëîãè÷åñêèå ìåòîäû, îñíîâàííûå
íà èñïîëüçîâàíèè èíòåèíîâ.
Ñèñòåìû î÷èñòêè ðåêîìáèíàíòíûõ áåëêîâ íà
îñíîâå èíòåèíîâ.  áèîëîãèè ñ 70-õ ãîäîâ ïðîøëîãî âåêà äëÿ î÷èñòêè áåëêîâ ÷àñòî èñïîëüçîâàëè ðàçëè÷íûå àôôèííûå ñèñòåìû. Îäíàêî ðÿä
ñóùåñòâåííûõ îãðàíè÷åíèé íå ïîçâîëèëî ýòîìó
ìåòîäó ñòàòü óíèâåðñàëüíûì è êîììåð÷åñêè âûãîäíûì. Îäèí èç ïîïóëÿðíûõ ñïîñîáîâ ïðåäïîëàãàåò ýêñïðåññèþ õèìåðíîãî öåëåâîãî áåëêà, ñëèòîãî ñ àôôèííîé ìåòêîé, â ÷àñòíîñòè ñ ãëóòàòèîí-S-òðàíñôåðàçîé (GST) èëè ìàëüòîçîñâÿçûâàþùèì áåëêîì E.coli (MBP) [22].  ýòîì ñëó÷àå
äëÿ ôàðìàöåâòè÷åñêîãî ïðèìåíåíèÿ î÷èùåííûé
ðåêîìáèíàíòíûé ïðîäóêò íåîáõîäèìî áûëî îáðàáàòûâàòü ïðîòåàçàìè äëÿ îòùåïëåíèÿ àôôèííîé ìåòêè îò öåëåâîãî áåëêà. Îäíàêî äåéñòâèå
ïðîòåàç íå âñåãäà îêàçûâàåòñÿ òî÷íûì è ñïåöèôè÷åñêèì. Êðîìå òîãî, ýòî âûíóæäàåò ïðîâîäèòü äîïîëíèòåëüíûå ïðîöåäóðû î÷èñòêè áåëêà
îò îòùåïëåííîé àôôèííîé ãðóïïû.
Îòêðûòèå èíòåèíîâ ïîçâîëèëî ïî-íîâîìó
ïîäîéòè ê ïðîáëåìå àôôèííûõ ìåòîê. Èñïîëüçóÿ èíòåèí â êà÷åñòâå ëèíêåðà ìåæäó öåëåâûì
áåëêîì è ìåòêîé, ìîæíî äîáèòüñÿ òîãî, ÷òî ïîñëå î÷èñòêè àôôèííàÿ ìåòêà áóäåò îòùåïëÿòüñÿ
îò öåëåâîãî áåëêà âñëåäñòâèå àâòîñïëàéñèíãà èíòåèíà. ßâíûì ïðåèìóùåñòâîì òàêîãî ìåòîäà ÿâëÿåòñÿ òî, ÷òî áåëêîâûé ñïëàéñèíã íå òðåáóåò
äîïîëíèòåëüíûõ êîôàêòîðîâ èëè ñëîæíîãî îáîðóäîâàíèÿ. Ìíîãèå àâòîðû ïîêàçàëè, ÷òî èíäóöèðîâàòü ñïëàéñèíã èíòåèíà ìîæíî íåïîñðåäñòâåííî íà àôôèííîì ñîðáåíòå, íà êîòîðîì ïðîâîäèëàñü î÷èñòêà áåëêà.
Ïåðâûå ðàáîòû ïî ñîçäàíèþ âåêòîðîâ äëÿ
î÷èñòêè áåëêîâ ñâèäåòåëüñòâóþò, ÷òî ñëèÿíèå èíòàêòíîãî èíòåèíà ñ áåëêîì íå äàåò íóæíîãî ýôôåêòà, ïîñêîëüêó ñïëàéñèíã ïðîõîäèò âíóòðè êëåòêè-ïðîäóöåíòà [22,23]. Ïîýòîìó äëÿ ñîçäàíèÿ èíòåèíîïîñðåäîâàííîé ñèñòåìû î÷èñòêè áûëî ïðåäëîæåíî èñïîëüçîâàòü èíòåèíû ñ àìèíîêèñëîòíûìè çàìåíàìè [3,23]. Çàìåíà îäíîé èëè äâóõ
êðèòè÷åñêèõ äëÿ ñïëàéñèíãà àìèíîêèñëîò ïîçâîëÿåò äîáèòüñÿ òîãî, ÷òî in vivo àâòîñïëàéñèíã
îñóùåñòâëÿòüñÿ íå áóäåò. Â òî æå âðåìÿ in vitro
ñïëàéñèíã ìîæíî èíäóöèðîâàòü òèîëüíûìè ñîåäèíåíèÿìè, òàêèìè êàê äèòèîòðèèòîë (ÄÒÒ),
β-ìåðêàïòîýòàíîë èëè öèñòåèí. Íà îñíîâå ýòîãî
ïðèíöèïà áûëà ñîçäàíà òåõíîëîãèÿ àôôèííîé
î÷èñòêè áåëêà, íàçâàííàÿ IMPACT-ñèñòåìîé
(Intein Mediated Purification with Affinity Chitinbinding Tag).
 IMPACT-ñèñòåìå ýêñïðåññèðóåòñÿ õèìåðíûé áåëîê, ñõåìàòè÷åñêè ïðåäñòàâëåííûé íà
ðèñ. 9, À. Öåëåâîé áåëîê ïðèñîåäèíÿåòñÿ ê
N-êîíöó ìîäèôèöèðîâàííîãî èíòåèíà Sce VMA,
ñ Ñ-êîíöîì êîòîðîãî ñâÿçàíà àôôèííàÿ ìåòêà –
õèòèíñâÿçûâàþùèé äîìåí (ÑÂD) èç Bacillus
circulans. Î÷èñòêà öåëåâîãî áåëêà ïðîâîäèòñÿ ñ
ïîìîùüþ àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè íà õèòèíñåôàðîçå. Îòùåïëåíèå åãî ïðè N-ñïëàéñèíãå
èíäóöèðóåòñÿ ÄÒÒ èëè ìåðêàïòîýòàíîëîì. Äëÿ
ïðåäîòâðàùåíèÿ àâòîñïëàéñèíãà in vivo Asn454 â
Ñ-ñïëàéñèíãîâîì äîìåíå çàìåùàþò íà Ala (çàìåíà Asn454Ala). Ýòî äàåò âîçìîæíîñòü ïðîâîäèòü òîëüêî N-êîíöåâîé ñïëàéñèíã ïóòåì àòàêè
òèîëîâûìè ñîåäèíåíèÿìè, à òàêæå íå äîïóñêàåò
ñëèÿíèÿ öåëåâîãî áåëêà ñ àôôèííîé ìåòêîé.
Äâîéíàÿ çàìåíà Íis453Leu/Ñys455Ser òàêæå áëîêèðóåò àâòîñïëàéñèíã in vivo è ïîçâîëÿåò èíäóöèðîâàòü åãî in vitro ñ ïîìîùüþ ÄÒÒ [23].
Òàêèì áûë ïåðâûé ìåòîä èñïîëüçîâàíèÿ èí-
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
23
ÎÃËßÄÈ
À
NН2
Целевой белок
Интеин
CBD
Á
СООН
NН2
N-кэп
Интеин
CBD
Целевой белок
Ðèñ. 9. Ñõåìàòè÷åñêîå èçîáðàæåíèå õèìåðíûõ áåëêîâ, èñïîëüçóåìûõ â IMPACT (À)
IMPACT-ÑN (Á) -ñèñòåìàõ.
è
òåèí-ñèñòåì äëÿ àôôèííîé î÷èñòêè áåëêîâ. Îäíàêî ïîñëå ðåàëèçàöèè åãî íà ïðàêòèêå áûë îáíàðóæåí ðÿä íåäîñòàòêîâ âûøåîïèñàííîé î÷èñòêè. Âîò îñíîâíûå èç íèõ:
– N-êîíöåâàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü îïðåäåëÿåò óðîâåíü ýêñïðåññèè õèìåðíîãî áåëêà [22].
Ïîìåùàÿ öåëåâîé áåëîê íà N-êîíåö âåêòîðà, ìû
íå ìîæåì ìîäèôèöèðîâàòü åãî äëÿ óñèëåíèÿ ýêñïðåññèè ãåíà.
– Âêëþ÷åíèå ïðîêàðèîò ïðè ýêñïðåññèè ãåíîâ â êëåòêàõ â ñîñòàâ áåëêà N-êîíöåâîãî ôîðìèëìåòèîíèíà, êîòîðûé íåîáõîäèìî îòäåëèòü äëÿ
èñïîëüçîâàíèÿ öåëåâîãî áåëêà â ôàðìàêîëîãèè.
– Ïðè èíäóêöèè N-ñïëàéñèíãà èíòåèíà òèîëüíûé àãåíò êîâàëåíòíî ñâÿçûâàåòñÿ ñ Ñ-êîíöîì öåëåâîãî áåëêà, ìîäèôèöèðóÿ åãî (ðèñ. 10)
[24–26]. Íà ôèçèêî-õèìè÷åñêèå ñâîéñòâà áåëêà
ýòî ìîæåò è íå âëèÿòü, ÷òî ïîçâîëÿåò èñïîëüçîâàòü î÷èùåííûå òàêèì îáðàçîì áåëêè â ëàáîðàòîðíîé ïðàêòèêå [24,26]. Îäíàêî â ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ öåëÿõ èõ ïðèìåíåíèå íåäîïóñòèìî.
Îäíàêî èäåÿ ñîçäàòü ñàìîóäàëÿþùóþñÿ àôôèííóþ ìåòêó áûëà íàñòîëüêî çàìàí÷èâîé, ÷òî
ðàáîòû â ýòîé îáëàñòè íå ïðåêðàùàëèñü. Â êîíöå
1990-õ ãîäîâ áûëà ðàçðàáîòàíà IMPACT-ÑN-ñèñòåìà. Ïðè èñïîëüçîâàíèè IMPACT-ÑN-ñèñòåìû öåëåâîé áåëîê ñîåäèíÿåòñÿ ñ Ñ-êîíöîì ìîäèôèöèðîâàííîãî èíòåèíà Sce VMA. Àôôèííàÿ
ìåòêà (ÑÂD) íàõîäèòñÿ ïðè ýòîì â öåíòðàëüíîé
îáëàñòè èíòåèíà íà ìåñòå ýíäîíóêëåàçíîãî äîìåíà (ðèñ. 9, Á). Ê N-êîíöó èíòåèíà äîáàâëÿëè
N-êýï: 10 N-êîíöåâûõ àìèíîêèñëîò ìàëüòîçîñâÿçûâàþùåãî áåëêà (ÌÂÐ) èëè GST äëÿ óñèëåíèÿ ýêñïðåññèè õèìåðíîãî áåëêà [22]. Ýòî ïîâûøàåò åå ýôôåêòèâíîñòü â IMPACT-ÑN-êîíñòðóêòàõ ïî ñðàâíåíèþ ñ ýêñïðåññèåé IMPACT-êîíñòðóêòîâ (òàáë. 2). Äëÿ ïðåäîòâðàùåíèÿ ñïëàéñèíãà in vivo â ìîëåêóëå èíòåèíà áûëè ïðîâåäåíû
çàìåíû Íis453Gln/Cys455Ala. Îäíàêî îíè íå ïðåïÿòñòâîâàëè èíäóêöèè ñïëàéñèíãà ÄÒÒ èëè öèñ-
òåèíîì è íå âëèÿëè íà ýôôåêòèâíîñòü Ñ-ñïëàéñèíãà [3,22,23].
Îáðàáîòêà õèìåðíîãî áåëêà òèîëüíûìè àãåíòàìè ñðàçó èíäóöèðóåò îòäåëåíèå N-êîíöåâîãî
êåïà (ðèñ. 10). Ýòî, â ñâîþ î÷åðåäü, âûçûâàåò
îòùåïëåíèå öåëåâîãî áåëêà îò Ñ-êîíöà èíòåèíà.
Âñå ïîëó÷åííûå äàííûå ñâèäåòåëüñòâóþò î òîì,
÷òî îòäåëåíèå N-ýêñòåèíà èíäóöèðóåò îòùåïëåíèå Ñ-ýêñòåèíà [3,22,23]. Âåðîÿòíî, òèîëèíäóöèðîâàííîå îòñîåäèíåíèå N-ýêñòåèíà íàðóøàåò
êîíôîðìàöèþ èíòåèíà, ÷òî ñòèìóëèðóåò öèêëèçàöèþ Asn454 è âûçûâàåò ðàñùåïëåíèå ñâÿçè
ìåæäó èíòåèíîì è öåëåâûì áåëêîì (ðèñ. 10).
Îäíàêî IMPACT-CN-ñèñòåìà î÷èñòêè áåëêîâ òàêæå èìååò íåäîñòàòêè:
– íåîáõîäèìîñòü âòîðîãî ýòàïà î÷èñòêè äëÿ
îòäåëåíèÿ N-êîíöåâîãî ïåïòèäà,
– äëèòåëüíîñòü ïðîöåññà – èíêóáàöèÿ ñ òèîëüíûìè àãåíòàìè â òå÷åíèè äâóõ äíåé ïîçâîëÿåò ïîëó÷èòü âñåãî îêîëî 50% î÷èùåííîãî öåëåâîãî áåëêà.
Êðîìå òîãî, äëÿ îáåèõ ñèñòåì ýêñïðåññèè
õàðàêòåðíû òàêèå îáùèå íåäîñòàòêè, êàê íåîáõîäèìîñòü èñïîëüçîâàíèÿ ÄÒÒ èëè ìåðêàïòîýòàíîëà, ÷òî âûçûâàåò äîïîëíèòåëüíûå òðóäíîñòè
ïðè î÷èñòêå ôàðìàöåâòè÷åñêèõ ïðîäóêòîâ, à áîëüøîé ðàçìåð Sce VMA (îêîëî 50 êÄà) çíà÷èòåëüíî ñíèæàåò ïðîäóêòèâíîñòü ïðîêàðèîòè÷åñêèõ
ñèñòåì ñèíòåçà áåëêà. Ïîýòîìó ñåé÷àñ âåäåòñÿ
ïîèñê íîâûõ ñèñòåì î÷èñòêè öåëåâûõ áåëêîâ íà
îñíîâå èíòåèíîâ [8].
Ïîëèïåïòèäëèãèðóþùèå ñèñòåìû íà îñíîâå
èíòåèíîâ. Îäíîé èç èíòåðåñíûõ âîçìîæíîñòåé
èñïîëüçîâàíèÿ èíòåèíîâ ÿâëÿåòñÿ ðàçðàáîòêà ïîëèïåïòèäëèãèðóþùèõ ñèñòåì. Íàïðàâëåííîå ïðèìåíåíèå òðàíñ-ñïëàéñèíãà îòêðûëî íåáûâàëûå
ïåðñïåêòèâû â ðàçðàáîòêå íîâûõ âèäîâ ïðåïàðàòîâ, áèîñåíñîðîâ è áèîìàòåðèàëîâ. Èíòåèíîïîñðåäîâàííîå ëèãèðîâàíèå áåëêîâ ïîçâîëÿåò ïðîâîäèòü áèîëîãè÷åñêè ïðèåìëåìîå ñøèâàíèå ðàç-
24
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
Ï. Ë. ÑÒÀÐÎÊÀÄÎÌÑÊÈÉ
Ò à á ë è ö à 2. Óðîâåíü ýêñïðåññèè õèìåðíûõ áåëêîâ â IMPACT- è IMPACT-ÑN- ñêîíñòðóèðîâàííûõ
áåëêàõ [22]
Целевой белок
IMPACT- белок, мг/л
IMPACT- СN- белок, мг/л
Активность
Т4 ДНК- лигаза
Т4 продукт гена 32
Fse1
GFR
РРI
8,0
<0 , 1
<0,5
<0,5
0,6
8,4
6,0
2,0
1,9
1,9
+
+
+
+
+
CamKII
0,8
2,2
−
−
1,7
−
Инвертаза
ëè÷íûõ ïîëèïåïòèäíûõ öåïåé.  ÷àñòíîñòè, èñïîëüçîâàíèå òðàíñ-ñïëàéñèíãà ïîçâîëÿåò ðåøèòü
îäíó èç àêòóàëüíåéøèõ çàäà÷ – èììîáèëèçàöèþ
ôåðìåíòîâ íà íîñèòåëå áåç ïîòåðè èõ àêòèâíîñòè. Íàïðèìåð, â ðàáîòå [27] ñ ïîìîùüþ àêòèâàöèè ïåïòèäîâ, âûçâàííîé N- è Ñ-êîíöåâûì îòùåïëåíèåì èíòåèíà Sce VMA, óäàëîñü ëèãèðîâàòü ìàëüòîçîñâÿçûâàþùèé áåëîê (ÌÂÐ) è Ò4
ÄÍÊ-ëèãàçó (ðèñ. 11). Â ýòèõ èññëåäîâàíèÿõ ïîêàçàíî, ÷òî ïðè ýòîì àêòèâíîñòü Ò4-ëèãàçû íå
èñ÷åçàåò.  îáçîðå [3] òàêæå îïèñàí ïðèìåð ñîçäàíèÿ áèîñåíñîðà ñ ïîìîùüþ èíòåèíîïîñðåäî-
Сys1
âàííîãî ëèãèðîâàíèÿ áåëêîâ (ðèñ. 12). Ñ ïîìîùüþ èíòåèíîïîñðåäîâàííîé òåõíîëîãèè ìåæäó
SH2- è SH3-äîìåíàìè áåëêà àbl ââîäÿò ôëóîðîôîð Dns (5-äèìåòèëàìèíî-íàôòàëåí-1-ñóëüôîíàìèä). Ïîëó÷åííûé ïîëóñèíòåòè÷åñêèé ïðîòåèí
ñïîñîáåí ñâÿçûâàòü ñïåöèôè÷åñêèå ëèãàíäû (â
ò.÷. ôîñôîòèðîçèí), è ñ ïîìîùüþ ôëóîðîôîðà
âèçóàëèçèðîâàòü èõ ïðèñóòñòâèå [3].
Êðîìå îïèñàííûõ âûøå ñâîéñòâ, èñïîëüçîâàíèå èíòåèíîâ ïîçâîëÿåò òàêæå îñóùåñòâëÿòü
öèêëèçàöèþ ïåïòèäîâ è áåëêîâ. Ñ ïîìîùüþ èíòåèíîâ âîçìîæíî ïðîâåñòè öèêëèçàöèþ áåëêà ïî
Gln453
Ala455
Пдт
Ν-экстеин
С-экстеин
Интеин Sce VMA
Asn454
N-S сдвиг
ДТТ-индуцированный
N-сплайсинг
ДТТ-модифицированный
N-экстеин
С-концевой сплайсинг
(циклизация Asn)
Удаленный интеин
С-экстеин
Ðèñ. 10. Ñõåìà ÄÒÒ-èíäóöèðîâàííîãî ñïëàéñèíãà ìîäèôèöèðîâàííîãî èíòåèíà SceVMA [23].
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
25
ÎÃËßÄÈ
N-концевой сплайсинг
H2N-- MBP
С-концевой сплайсинг
Интеин
CBD --COOH
H2N-- CBD
Интеин
Т4 лигаза --COOH
Иммобилизация конструктов на хитин-сефарозе
Хитинсефароза
H2N--
MBP
Интеин
CBD
CBD
Интеин Т4 лигаза --COOH
4оС
ДТТ или β-меркаптоэтанол
H2N-- Интеин
Инкубация при комнатной
температуре, рН 7,0
CBD
CBD
МВР
Интеин --COOH
Т4 лигаза
Стандартное химическое лигирование
очищенных белков
МВР
Т4 лигаза
Ðèñ. 11. Ñõåìà ëèãèðîâàíèÿ äâóõ ïåïòèäîâ ñ ïîìîùüþ èíòåèíîâ [27]: MBP – ìàëüòîçîñâÿçûâàþùèé
áåëîê E. coli, CBD – õèòèíñâÿçûâàþùèé äîìåí B. circulans, èíòåèí – èíòåèí Sce VMA.
ïðèíöèïó “ãîëîâà – õâîñò”. Ìåòîä, ñ ïîìîùüþ
êîòîðîãî ìîæíî öèêëèçèðîâàòü áåëêè, ïîëó÷èë
íàçâàíèå SICLOPPS (Split Intein-mediated Circular
Ligation Of Peptide and ProteinS) [28]. Ñõåìà ïðîöåññà ñîçäàíèÿ öèêëè÷åñêîãî áåëêà ïðåäñòàâëåíà
íà ðèñ. 13. Ñóòü ìåòîäà çàêëþ÷àåòñÿ â ñëåäóþùåì – ýêñïðåññèðóþò õèìåðíûé áåëîê In-ÄÃÔÐIc (In-äèãèäðîôîëàòðåäóêòàçà-Ic), ãäå In è Ic ÿâëÿþòñÿ N- è Ñ-êîíöåâûìè ÷àñòÿìè èíòåèíà ñîîòâåòñòâåííî, à ÄÃÔÐ – ôåðìåíòîì E. coli. Ïðîöåññ öèêëèçàöèè ïðîèñõîäèò ïî ìåõàíèçìó òðàíññïëàéñèíãà: In è Ic àññîöèèðóþò äðóã ñ äðóãîì ñ
îáðàçîâàíèåì àêòèâíîãî èíòåèíà. Ïîñëå ýòîãî ïî
ñòàíäàðòíîìó ìåõàíèçìó, îïèñàííîìó âûøå, ïðî-
èñõîäèò ñïëàéñèíã ñ ïîñëåäóþùèì ëèãèðîâàíèåì N- è Ñ-êîíöà ÄÃÔÐ.  ðåçóëüòàòå ôåðìåíòàòèâíàÿ àêòèâíîñòü “öèêëî”-ÄÃÔÐ íå èç÷åçàåò,
çàòî ñóùåñòâåííî ïîâûøàåòñÿ ïåðèîä ïîëóæèçíè è òåðìîñòàáèëüíîñòè áåëêà [28].
Ýêñïðåññèÿ òîêñè÷íûõ äëÿ êëåòêè ïðîäóêòîâ.
×àñòî ýóêàðèîòè÷åñêèå áåëêè, ýêñïðåññèðóåìûå
â êëåòêàõ ïðîêàðèîò, ÿâëÿþòñÿ òîêñè÷íûìè äëÿ
êëåòêè-ïðîäóöåíòà. Ýòî íå ïîçâîëÿåò íàðàáàòûâàòü íåîáõîäèìûå áåëêè â äîñòàòî÷íîì êîëè÷åñòâå. Èñïîëüçîâàíèå ñèñòåì ýêñïðåññèè íà îñíîâå èíòåèíîâ ìîæåò ðåøèòü ýòó ïðîáëåìó. Òîêñè÷íûå äëÿ êëåòêè áåëêè ìîæíî íàðàáàòûâàòü â
âèäå íåàêòèâíûõ õèìåðíûõ ïðåäøåñòâåííèêîâ.
26
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
Ï. Ë. ÑÒÀÐÎÊÀÄÎÌÑÊÈÉ
Ха – Cys— -—CO—SR + Cys —--
SH2
Лигирование 1
Dns
Xa —Cys—
SH2
Протеолиз
(+ фактор Ха*)
SH3 - —CO—SR + Cys—
SH2
Лигирование 2
SH3
SH2
Ðèñ. 12. Áèîñåíñîð íà îñíîâå èíòåèíîïîñðåäîâàííîãî ìåòîäà. Ñ ïîìîùüþ ïîñëåäîâàòåëüíûõ ëèãèðîâàíèé ôðàãìåíòîâ áåëêîâ ôëóîðîôîð (Dns) àññîöèèðóþò ñ SH2- è SH3-äîìåíàìè áåëêà abl. Ïîñëå êîíäåíñàöèè ñèíòåòè÷åñêîãî ïåïòèäà ñ Ñ-òåðìèíàëüíûì SH2-äîìåíîì êîíüþãàò îáðàáàòûâàþò ôàêòîðîì Õà
c îáðàçîâàíèåì àêòèâèðîâàííîãî N-êîíöåâîãî öèñòåèíà, ïî êîòîðîìó ïðîâîäÿò ëèãèðîâàíèå õèìåðíîãî
áåëêà ñ SH3-äîìåíîì Abl [3]. *Õà – ïåïòèä, îòùåïëÿåìûé ïîä äåéñòâèåì ôàêòîðà Õà.
Òàêîé ïîäõîä îïèñàí â ëèòåðàòóðå. Èíòåèí
Psp-GBD Pol ÄÍÊ-ïîëèìåðàçû áûë âêëþ÷åí â
îäíó ðàìêó ñ÷èòûâàíèÿ ìåæäó ãåíîì ìàëüòîçîñâÿçûâàþùåãî áåëêà è ãåíîì ïàðàìèîçèíà Dirofilaria immitis.  ðåçóëüòàòå îáðàçîâûâàëñÿ íåòîêñè÷íûé ïðåäøåñòâåííèê, êîòîðûé ïðè òåìïåðàòóðå 12–20 °Ñ íå âêëþ÷àëñÿ â àâòîñïëàéñèíã.
Íåàêòèâíûé ïðåäøåñòâåííèê ïàðàìèîçèíà èçîëèðîâàëè îò áåëêîâ êëåòî÷íîãî ëèçàòà ñ ïîìîùüþ àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè. Ïîâûøåíèå òåìïåðàòóðû äî 37–65 °Ñ èíäóöèðîâàëî ñïëàéñèíã,
÷òî ñïîñîáñòâîâàëî ýëþèðîâàíèþ ñ êîëîíêè àêòèâíîãî î÷èùåííîãî áåëêà [3]. Òàêîé ïîäõîä ïîçâîëÿåò íàðàáàòûâàòü òîêñè÷íûå äëÿ êëåòêè áåëêè â âèäå íåàêòèâíûõ õèìåðíûõ ïðåäøåñòâåííèêîâ, êîòîðûå ïðè ïîâûøåíèè òåìïåðàòóðû ïðåâðàùàþòñÿ â ïîëåçíûå áåëêîâûå ïðîäóêòû. Áåëêîâûé ñïëàéñèíã òàêæå ìîæíî èíäóöèðîâàòü è
âíåøíèìè àãåíòàìè, â ÷àñòíîñòè îïèñàíà àêòèâàöèÿ ðåêîìáèíàíòíûõ ìàðêåðíûõ áåëêîâ ïðè
äåéñòâèè èçëó÷åíèÿ â âèäèìîé èëè óëüòðàôèîëåòîâîé ÷àñòè ñïåêòðà [3]. Òàêèì îáðàçîì, ìîæíî ñèíõðîíèçèðîâàòü ñïëàéñèíã áåëêîâûõ ïðå-
ïàðàòîâ, íàïðèìåð äëÿ àêòèâàöèÿ áåëêîâîãî ïðåïàðàòà â ìîìåíò âñêðûòèÿ ñâåòîíåïðîíèöàåìîé
óïàêîâêè.
Òàêèì îáðàçîì, ìû ïîïûòàëèñü îáîáùèòü â
ýòîì îáçîðå îñíîâíûå äàííûå, èìåþùèåñÿ â ëèòåðàòóðå. Ñî âðåìåíè îòêðûòèÿ èíòåèíîâ ïðîøëî 15 ëåò. Çà ýòî âðåìÿ áåëêîâûé ñïëàéñèíã èç
î÷åðåäíîé çàãàäêè ïðèðîäû ïðåâðàòèëñÿ â õîðîøî èçó÷åííûé ïðîöåññ, íà îñíîâå êîòîðîãî ðàçðàáîòàíû ðàçëè÷íûå áèîòåõíîëîãè÷åñêèå ìåòîäû. Îäíàêî äî ñèõ ïîð áèîëîãè÷åñêèå ôóíêöèè
èíòåèíîâ íå îïðåäåëåíû. Ãëàâíûé âîïðîñ, êîòîðûé “âèñèò â âîçäóõå”, – ýòî êàêîâà áèîëîãè÷åñêàÿ öåëåñîîáðàçíîñòü áåëêîâîãî ñïëàéñèíãà è
÷òî îí äàåò êëåòêå. Íåêîòîðûå àâòîðû ñ÷èòàþò
ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, êîäèðóþùèå èíòåèí, îäíèì
èç ïðîÿâëåíèé “ýãîèñòè÷åñêîé” ÄÍÊ. Äðóãèå
ïîëàãàþò, ÷òî îíè ñïîñîáíû ðåãóëèðîâàòü ýêñïðåññèþ áëèçëåæàùèõ ãåíîâ [29,30]. Èçâåñòíî
òàêæå ìíåíèå, ÷òî èíòåèíû èãðàëè îïðåäåëåííóþ ðîëü â ðàííèõ ýâîëþöèîííûõ ïðîöåññàõ
[3,30]. Ýòî êîñâåííî ïîäòâåðæäàåòñÿ èõ ðàñïðîñòðàíåííîñòüþ â ïðèðîäå: îíè îáíàðóæåíû ó ïðåä-
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
27
ÎÃËßÄÈ
In
ДГФР
Ic
Ser
Cys
Asn
Активный интеин
S-N ацильный сдвиг
Ν-сплайсинг
С-сплайсинг
(циклизация Asn)
S-N-ацильный сдвиг
Циклический предшественник
Циклический белок
Интеин
Ðèñ. 13. Ñõåìà ìåõàíèçìà öèêëèçàöèè áåëêà ìåòîäîì SICLOPPS [28]. ÄÒÔÐ – äèãèäðîôîëàòðåäóêòàçà.
ñòàâèòåëåé âñåõ òðåõ âåòâåé æèçíè, â ò.÷. ó ýóêàðèîò, ýóáàêòåðèé è àðõåáàêòåðèé [31]. Íî íàøèõ
çíàíèé ïîêà íåäîñòàòî÷íî äëÿ òîãî, ÷òîáû ïîëó÷èòü îäíîçíà÷íûå îòâåòû íà ýòè è åùå ìíîãèå äðóãèå âîïðîñû.
Àâòîð âûðàæàåò áëàãîäàðíîñòü Ëüâó Àëåêñååâè÷ó Ñòàðîêàäîìñêîìó çà êðèòè÷åñêèå çàìå÷àíèÿ è ïîìîùü ïðè îôîðìëåíèè ñòàòüè.
PROTEIN SPLICING
P. L. Starokadomskij
Most of inteins consist of N- and C-terminal protein splicing domain and central endonuclease domain. The endonuclease domain can initiate mobility
of the intein gene, this process being named intein
homing. This review is focused on the recent data
about the structure and function of inteins. Main
intein-mediated protein-engineering applications, such
as protein purification, ligation and cyclization, new
forms of biosensors, are presented.
K e y w o r d s: intein, protein splicing, homing, protein purification.
Inteins are internal polypeptide sequences that
are posttranslationally excised from a protein precursor by a self-catalyzed protein-splicing reaction.
1. Kane P. M., Yamashiro C. T., Wolczyk D. F. et
al. // Science. 1990. 250, N 4981. P. 651–657.
2. Perler F., Davis E., Dean G. et al. // Nucl. Acids
Research. 1994. 22, N 7. P. 1125–1127.
3. Noren C., Wang J., Perler F. // Angew. Chem.
Int. Ed. engl. 2000. 39, N 3. P. 450–466.
4. Pietrokovski S. // Protein Science. 1994. N 3.
P. 2340–2350.
28
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
Institute of Molecular Biology and Genetics, National
Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv;
e-mail: pedro77@ukr.net
Summary
Ï. Ë. ÑÒÀÐÎÊÀÄÎÌÑÊÈÉ
5. Perler F. // Nucl. Acids Research. 2002. 30,
N 2. P. 383–384.
6. Perler F., Olsen G., Adam E. // Ibid. 1997. 25,
N 6. P. 1087–1093.
7. Pietrokovski S. // Protein Science. 1998. N 7.
P. 64–71.
8. Ding Y., Xu M., Ghosh I. et al. // J. Biol. Chem.
2003. 278, N 40. P. 39133–3914.
9. Guhan N., Muniyappa K. // Nucleic Acids
Research. 2003. 31, N 14. P. 4184–4191.
10. Clarke N. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
Biochemistry. 1994. 91. P. 11084–11088.
11. Ingham P. W., McMahon A. P. // Genes and
Devel. 2001. 15. P. 3059–3087.
12. Roessler E., Belloni E., Gaudenz K. et al. //
Hum. Molec. Genet. 1997. 6, N 11, P. 1847–
1853.
13. Ghosh I., Sun L., Xu M. // J. Biol. Chem. 2001.
276, N 26. P. 24051–24058.
14. Lykke A., Garrett R., Kjems J. // Nucl. Acids
Research. 1996. 24, N 20. P. 3982–3989.
15. Flick K. E., Jurica M. S., Monnat P. G., Stoddard B. L. // Nature. 1998. 394, N 2. P. 96–
101.
16. Chong S., Xu M. // J. Biol. Chem. 1997. 272,
N 25. P. 15587–15590.
17. Bakhrat A., Jurica M., Stoddard B., Raveh D. //
Genetics. 2004. 166. P. 721–728.
18. He Z., Crist M., Yen H. et al. // J. Biol. Chem.
1998. 273, N 8. P. 4607–4615.
19. Gimble F., Duan X., Hu D., Quiocho F. // J.
Biol. Chem. 1998. 273, N 46. P. 30524–30529.
20. Dalgaard J., Klar A., Moser M. et al. // Nucl.
Acids Research. 1997. 25, N 22. P. 4626–4638.
21. Hu D., Crist M., Duan X. et al. // J. Biol.
Chem. 2000. 275, N 4. P. 2705–2712.
22. Chong S., Montello G., Zhang A. et al. // Nucl.
Asids Research. 1988. 26, N 22. P. 5109–5115.
23. Chong S., Williams K., Wotkowicz C., Xu M. //
J. Biol. Chem. 1998. 273, N 17. P. 10567–
10577.
24. Noue K., Demel R., de Kruijff B., Keegstra K. //
Eur. J. Biochem. 2001. N 268. P. 4036–4043.
25. Wood D. // J. Chem. Techn. and Biotechn.
2003. N 78. P. 103–110.
26. Yu R., Hong A., Dai Y., Gao Y. // Acta Biochim.
et Biophys. Sinica. 2004. 36, N 11. P. 759–
766.
27. Evans T., Benner J., Xu M. // J. Biol. Chem.
1999. 274, N 7. P. 3923–3926.
28. Scott Ch., Wall M., Wahnon D. et al. // PNAS.
1999. 96, N 24. P. 13638–13643.
29. Perler F. B. // Trends Biochem Sci. 1999. 24,
N 6. P. 209–211.
30. Porter J. A., Ekker S. C., Park W. J. et al. //
Cell. 1996. 86, N 1. P. 21–34.
31. Komori K., Fujita N., Ichiyanagi K. et al. //
Nucl. Acids Research. 1999. 27, N 21. P. 4167–
4182.
Ïîëó÷åíî 18.03.2005
ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2005, ò. 77, ¹ 4
29