Влияние аминокислотных замен на спектральные свойства флуоресцентных белков на примере mRFP1
advertisement
На правах рукописи Вржещ Евгений Петрович Влияние аминокислотных замен на спектральные свойства флуоресцентных белков на примере mRFP1 03.01.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук МОСКВА 2012 Работа выполнена на кафедре общей физики Физического факультета и Факультете биоинженерии и биоинформатики Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова. Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор Салецкий Александр Михайлович заведующий кафедрой общей физики Физического факультета МГУ Официальные оппоненты: Савицкий Александр Павлович доктор химических наук, профессор руководитель лаборатории физической биохимии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Григоренко Белла Людвиговна доктор физико-математических наук старший научный сотрудник Химического факультета МГУ Ведущая организация: Оренбургский Государственный Университет. Защита состоится 22 марта 2012 года в 14 часов 00 минут на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Россия, г. Москва, Ленинские горы 1/12, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория «Новая». С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова. Автореферат разослан « » февраля 2012 года. Ученый секретарь Диссертационного совета Д 501.001.96 Доктор биологических наук Страховская М.Г. Общая характеристика работы Актуальность темы В современных отраслях науки, изучающих живые организмы, актуальным является получение качественно новых методов и подходов для наблюдения различных процессов в интактных живых организмах. Одним из таких методов стало применение флуоресцентных белков. Флуоресцентные белки активно используются в исследовании прижизненных процессов в живых клетках, тканях и организмах, таких как активность работы промотеров, биохимические взаимодействия, локализации различных структур и др. Ген флуоресцентного белка с помощью стандартных биохимических методов вносится в генетический аппарат исследуемого объекта и дальнейшая экспрессия белка и его свечение не требуют наличия дополнительных кофакторов или специфических реагентов (кроме атмосферного кислорода). Набор существующих на данный момент флуоресцентных белков достаточно разнообразен: максимум эмиссии флуоресценции белков занимает широкую область спектра: от синей (менее 450 нм) до красной (708 нм) частей видимого излучения. Также различным флуоресцентным белкам свойственно большое разнообразие значений таких параметров, как квантовый выход флуоресценции, коэффициент экстинкции, фотостабильность и пр. Обычно новые мутанты флуоресцентных белков получают с помощью случайного или направленного мутагенеза по нескольким ключевым позициям в белке с отбором удовлетворяющих по характеристикам клонов. Такой подход дает мало информации о влиянии каждой замены на свойства белка и не позволяет наперед прогнозировать полученные свойства, так как взаимосвязь между оптическими свойствами флуоресцентных белков и их структурой практически не исследована. Отсутствует методика прогнозирования флуоресцентных свойств того или иного флуоресцентного белка на основании его структуры, т.е. общая задача разработки алгоритма дизайна белков с заранее заданными свойствами не решена. Такая задача может быть решена путем анализа свойств мутантных белков, содержащих единичные точечные аминокислотные замены, с последующим моделированием их структур in silico с помощью методов квантовой химии и молекулярной динамики для поиска корреляций параметров структур с оптическими свойствами. 3 Цели и задачи исследования Целью данного исследования является изучение влияния аминокислотных замен на структуру и свойства мутантов красного флуоресцентного белка mRFP1 in silico и in vitro с использованием методов квантовой химии, молекулярной динамики, генной инженерии и спектрально-люминесцентной спектроскопии. Исходя из этого, были сформулированы следующие задачи исследования: создать топологию хромофора белка mRFP1 как нового аминокислотного остатка в силовом поле и вычислить ее параметры; создать PDB-файлы для мутантов белка mRFP1, отредактировать файлы силового поля и создать топологии, соответствующие хромофорам мутантов; рассчитать равновесные трехмерные структуры мутантов белка mRFP1 и провести анализ влияния замены аминокислотного остатка глутамина по 66 положению на геометрические параметры белка; методом генной инженерии создать плазмиды, содержащие гены 20 мутантных белков на основе белка mRFP1 со всеми вариантами аминокислотных остатков по 66 положению, провести целевую наработку препаратов белка, определить оптические свойства полученных препаратов; провести анализ влияния замены аминокислотного остатка глутамина по 66 положению на оптические свойства белка и сопоставить с изменением геометрических параметров; методами нелинейной лазерной флуориметрии установить истинные фотофизические параметры отдельных молекул белков и концентрации различных форм белка в растворе. Научная новизна результатов и практическая значимость работы Разработан и опробован метод генно-инженерного внесения любых наперед заданных мутаций в ген красного мономерного флуоресцентного белка mRFP1 в области хромофора, позволяющий проводить направленный мутагенез белков с целью скрининга свойств в зависимости от изменения аминокислотной последовательности. С помощью метода впервые получено девятнадцать уникальных новых мутантов белка mRFP1 по 66 положению в виде концентрированных препаратов белка и определены их оптические свойства. Впервые разработан метод описания и параметризации объектов типа красных флуоресцентных белков в силовом поле OPLS-AA (в частности, хромофора как отдельной 4 уникальной аминокислоты) для проведения молекулярно-динамических расчетов состояния и геометрии белков в растворе in silico. Впервые выявлены эмпирические зависимости оптических свойств флуоресцентных белков от геометрических параметров аминокислот, составляющих и/или окружающих хромофор, что может быть применено при планировании мутагенеза, направленного на получение новых флуоресцентных белков с улучшенными свойствами. Разработан метод, позволяющий определять фотофизические параметры индивидуальных форм хромофоров в составе смеси без ее разделения, что позволит более точно следить за характеристиками как при получении новых вариантов флуоресцентных белков, так и при применении их как маркеров процессов в живых системах. Впервые определенные данным методом фотофизические характеристики белка mRFP1 и некоторых его мутантов показали, что истинный коэффициент экстинкции отдельных форм флуоресцентных белков может значительно превышать 100 000 М-1см-1. Предложено новое направление в получении и исследовании свойств красных флуоресцентных белков, поскольку контроль за степенью созревания и концентрацией нужных форм в растворе позволит увеличить яркость в несколько раз, что может привести к улучшению чувствительности многих методов исследования живых организмов. Положения, выносимые на защиту 1. предложен метод генно-инженерного внесения любых наперед заданных мутаций в ген красного мономерного флуоресцентного белка mRFP1 в области хромофора, позволяющий проводить направленный мутагенез с целью скрининга свойств в зависимости от изменения аминокислотной последовательности; 2. разработан метод описания и параметризации объектов типа красных флуоресцентных белков в силовом поле OPLS-AA, позволяющий проводить молекулярно-динамические расчеты состояния и геометрии белков в растворе in silico; 3. выявлены эмпирические зависимости оптических свойств флуоресцентных белков от геометрических параметров аминокислот, составляющих и/или окружающих хромофор, что может применяться при планировании мутагенеза, направленного на получение новых флуоресцентных белков с улучшенными свойствами; 4. разработан метод, позволяющий определять фотофизические параметры индивидуальных форм хромофоров в составе смеси без ее разделения. 5 Апробация работы Основные результаты работы были доложены на конференции «Альманах клинической медицины» в 2006 году, международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», студенческих конференциях Факультета Биоинженерии и Биоинформатики МГУ в 2006-2007 годах. Публикации По результатам работы опубликовано 9 работ, из них статей в рецензируемых журналах, включенных в список ВАК РФ - 5, тезисов докладов и материалов конференций – 4. Личный вклад автора Все основные результаты работы получены лично диссертантом. Вклад диссертанта в работу является определяющим. Структура диссертации Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Объем диссертации составляет 127 страниц, в том числе 35 рисунков, 21 таблица и 27 формул. Список цитируемой литературы включает 94 наименования. 6 Содержание работы Во введении обоснована актуальность темы диссертации, ее научная новизна и практическая значимость, а также сформулирована цель и поставлены задачи исследования. Первая глава содержит обзор опубликованных данных по теме диссертации. Описана история открытия флуоресцентных белков и основные природные источники. Приведена классификация белков по семействам с указаниями спектральных и структурных свойств. Описывается биологическая роль флуоресцентных белков в различных организмах. Проведен анализ данных о кристаллических структурах белков различных семейств. Описываются механизмы формирования (созревания) хромофоров зеленого GFP и красного DsRed флуоресцентных белков, указывается различие в количестве стадий и промежуточных форм в механизмах хромофора созревания. на механизм Анализируется созревания. влияние Описаны аминокислотного флуоресцентные окружения белки с будущего различными олигомерными состояниями, на примере белка DsRed показаны интерфейсы взаимодействия различных мономеров при образовании тетрамера. Описан механизм мутагенеза, приводящий к образованию красного мономерного флуоресцентного белка mRFP1 из тетрамерного DsRed. Описаны физические и оптические характеристики белков GFP, DsRed и mRFP1. Проведен анализ данных о влиянии замен (как на природные, так и на искусственные аминокислотные остатки) по различным позициям хромофора на флуоресцентные свойства белка. В заключение обзора литературы формулируется важность понимания взаимосвязи между первичной структурой белков и оптическими свойствами. Во второй главе диссертации описываются методы молекулярной динамики (МД), конкретная их реализация для пакета программ GROMACS, синтаксис и параметры силового поля OPLS-AA. Описывается применение метода МД для нахождения равновесных структур флуоресцентных белков в растворе, приведены все параметры для запуска МД-симуляций и анализа полученных траекторий. Использовались программный пакет GROMACS и силовое поле OPLS-AA в виде его модификации OPLS-AA/DsRed, содержащей параметры топологий всевозможных хромофоров красного типа как отдельных уникальных аминокислотных остатков. Указаны все стадии, уравнения и параметры расчета. В третьей главе описывается создание топологий всех вариантов хромофоров для проведения молекулярно-динамических симуляций. Описаны методы и параметры квантовомеханических (КМ) расчетов энергии модельной молекулы, отвечающей основной части хромофора, содержащей π-электроны ароматических колец. Описано получение зарядов, равновесных длин связей и значений валентных и двугранных углов модельной молекулы. 7 Описано получение профилей энергии валентного и двух двугранных углов вокруг специфического участка -C_N1_CA1, не похожего ни на одну из описанных в поле OPLS-AA молекул и/или частей молекул. Приведены полные таблицы параметров силового поля для описания хромофора для проведения МД-симуляций. Приведено сравнение структур белка DsRed, полученных в результате МД-симуляций и данных рентгено-структурного анализа. Показано, что структуры совпадают с точностью до теплового движения молекул, т.е. топология хромофора верна. Проведен анализ изменения геометрии для всех вариантов мутаций хромофора по первой позиции, проведен поиск корреляций изменений геометрических параметров и оптических свойств. В четвертой главе диссертации описана процедура создания методами генной инженерии двадцати плазмид на основе гена белка mRFP1, содержащих гены всех возможных вариантов флуоресцентных белков с заменами по 66 позиции. Описаны методы наработки и очистки целевого продукта белков. В пятой главе описаны методы оптических исследований флуоресцентных белков. Проведен анализ спектров поглощения, возбуждения и эмиссии флуоресценции. Описано определение оптических характеристик методом нелинейной флуориметрии. Показано что, только с применением методов нелинейной флуориметрии возможно разделить вклады различных форм хромофоров в спектры поглощения и определить истинные фотофизические параметры поглощающих молекул. Вычислены концентрации различных форм белков в растворе. Найдены корреляции между оптическими свойствами белков и геометрическими аминокислотного остатка по 66 положению (в первой позиции хромофора). 8 параметрами Основные результаты работы Расчет параметров топологи хромофоров Хромофор белка DsRed рассматривается как уникальный аминокислотный остаток в составе полипептидной цепи. Хромофор обладает сильной делокализацией электронной плотности, что значительно отличает его от любого соединения, ранее описанного в силовом поле OPLS-AA. Это обусловило необходимость получения оригинальных параметров для описания хромофора. Для проведения ab initio КМ-расчетов использовался программный пакет GAMESS. Процедура геометрической оптимизации структуры молекулы проводилась ab initio с использованием ограниченного метода Хартри-Фока RHF, базисом волновых функций 6-31G**. Расчет проводился с применением теории функционала плотности DFT с использованием трехпараметрического функционала Бека B3LYP. Для нахождения значений эффективных зарядов атомов, образующих хромофор, была использована программа R.E.D. Эта программа позволяет находить такие эффективные значения точечных зарядов атомов молекулы в рамках МД-представлений, что электростатическое поле, порождаемое такими зарядами, аппроксимирует электростатическое поле молекулы, рассчитанное квантово-механически. Строение нейтральной формы хромофора и его связь с белком DsRed показаны на рисунке 1. Каждому атому, входящему в состав хромофора, было присвоено уникальное имя. Имена атомов состоят из символа элемента, а также буквенно-цифрового индекса положения атома в молекуле. В качестве первого приближения использовалась топология хромофора белка DsRed, порождаемая типами атомов, входящих в хромофор. Типы атомов подбирали по аналогии с соединениями, описанными в поле OPLS-AA. 9 Рис. 1. Строение нейтральной формы хромофора DsRed в составе белковой цепи. Хромофор очерчен пунктиром, Nter – N-концевой фрагмент белковой цепи, Cter – С-концевой фрагмент белковой цепи. Указаны имена атомов для создания топологии. Для атомов CZ, OH и HH хромофора (рис. 1) в качестве аналогов для задания типа были выбраны атом углерода C при гидроксильном радикале фенола, а также атомы кислорода и водорода гидроксильного радикала фенола из имеющегося в поле OPLS-AA описания молекулы фенола. Для атомов CE1, CE2, CD1, CD2, CG2, HE1, HE2, HD1, HD2 и атома CB2 хромофора в качестве аналогов были выбраны атомы углерода и водорода из описания молекулы бензола в поле OPLS-AA. Для атомов CA2 и C1, N2, N3 хромофора в качестве аналогов были выбраны, соответственно, атомы C4, N7, N9 из описания аденина в поле OPLS-AA. Атому N1 был приписан тип атома N3 из описания в силовом поле OPLS-AA цитозина. Атомам C2 и O2 были приписаны типы атомов C6 и связанного с ним кислорода O, соответственно, из описания гуанина. Для атомов хромофора, входящих в состав бокового радикала, соответствующего боковому радикалу аминокислотного остатка Gln66 незрелого белка DsRed в качестве аналогов были выбраны соответствующие атомы из описания глутамина в силовом поле OPLS-AA. Для атома CA3 хромофора белка DsRed в качестве аналога был выбран Cα-атом из описания глицина в поле OPLS-AA. Данный набор параметров является первым приближением топологии нейтральной формы хромофора белка DsRed. В конечный вариант топологии хромофора белка DsRed из данного начального набора вошли параметры атомов для расчета потенциала Леннарда-Джонса и жесткости связей, 10 валентных и двугранных углов (за исключением углов -C_N1_CA1, -CA_–C_N1_CA1 и C_N1_CA1_C1, жесткости которых были рассчитаны отдельно). Для уточнения набора параметров, описывающих хромофор, необходимо квантовомеханически рассчитать эффективные заряды атомов, равновесные значения длин связей, валентных и двугранных углов. Для этого была сконструирована модельная молекула A, схожая по строению с хромофором (рис. 2). Рис. 2. Модельная молекула A. Параметры атомов и межатомных взаимодействий бокового радикала хромофора, соответствующего боковому радикалу аминокислотного остатка Gln66 незрелого белка DsRed задавались равными параметрам глутамина из силового поля OPLS-AA. Поэтому, для упрощения расчетов, в модельную молекулу А не были включены атомы: CG1, HG11, HG12, CD3, OE1, NE1, HE11, HE12 (рис. 1), а к атому CB1 для насыщения валентности был добавлен атом водорода HB13 (рис. 2). Дополнительно для расчета параметров валентного и двугранных углов при атоме N1 в модельную молекулу А был включен фрагмент предшествующего хромофору остатка фенилаланина Phe65 (нумерация по аминокислотной последовательности белка DsRed), включающий атомы: -C, -O, -CA и -HA. К атому -CA были добавлены атомы водорода -HA1 и HA2 (рис. 2) для насыщения свободных валентностей. Для определения значений эффективных зарядов атомов, равновесных значений длин связей, валентных и двугранных углов квантово-механически была проведена геометрическая оптимизация структуры модельной молекулы A. В качестве исходной структуры модельной 11 молекулы A была использована структура хромофора в структуре белка DsRed (PDB ID 1GGX). Данная структура модельной молекулы A была названа A1GGX. В результате расчета была получена равновесная структура модельной молекулы А, названная Aeq, отвечающая состоянию молекулы A в энергетическом минимуме. Полученные значения длин связей и углов структуры Aeq, были использованы в качестве значений равновесных длин связей двугранных углов , валентных углов и , в окончательном описании топологии хромофора белка DsRed в поле OPLS-AA. Для структуры Aeq квантово-механически были рассчитаны эффективные значения точечных зарядов на атомах при помощи программы R.E.D. Полученные значения зарядов использовались в качестве уточненных зарядов атомов хромофора и были внесены в окончательный вариант топологии хромофора белка DsRed в поле OPLS-AA. Для расчета параметров валентного угла -C_N1_CA1 была использована структура Aeq. В ней изменяли равновесное значение валентного угла -C_N1_CA1 ( 0 = 123.8°) на величину -5° до +5° с шагом в 1°, оставляя значения всех остальных углов и связей неизменными. Тем самым, был получен набор из десяти неравновесных структур, обозначенных B* (Δ ). Для каждой такой структуры квантово-механически была проведена процедура геометрической оптимизации с фиксированным значением валентного угла . В результате был получен набор из десяти новых равновесных структур, с фиксированным значением валентного угла , обозначенных как Beq (Δ ). Все структуры вместе со структурой Aeq имеют заданное отклонение Δ валентного угла от его равновесного значения в пределах -5° до +5°, включая 0° (равновесное значение для структуры Aeq) и геометрически оптимизированную структуру всех остальных частей молекулы. Для полученных структур была вычислена энергия (рис. 3). Для нахождения параметров потенциалов двугранных углов -CA_-C_N1_CA1 и C_N1_CA1_C1 в качестве исходной структуры модельной молекулы A была использована равновесная структура Aeq, в которой изменяли значение соответствующего угла, в результате чего был получен набор неравновесных структур, в которых углы принимал значения от 0° до 360° с шагом 20°, проведена процедура геометрической КМ-оптимизации с фиксированным значением соответствующего двугранного угла и вычислена энергия (рис. 4). 12 2,5 V(), кДж/моль 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 -6 -4 -2 0 2 4 6 , градусы Рис. 3. Зависимость энергии от значения валентного угла -C_N1_CA1. Квадратами показаны значения энергии, полученной в результате квантово-механического расчета, сплошная линия – аппроксимация гармоническим потенциалом. 60 50 V, кДж/моль 40 30 20 10 0 0 50 100 150 200 250 300 350 угол, градусы Рис. 4. Зависимость энергии от значений валентный углов -CA_-C_N1_CA1 и C_N1_CA1_C1. Квадратами и кругами показаны значения энергии по результатам квантово-механического расчета для структур с фиксацией углов -CA_-C_N1_CA1 и C_N1_CA1_C1, соответственно, сплошная линия – аппроксимация расчетных данных периодическим гармоническим потенциалом. 13 Полученные наборы точек были аппроксимированы кривыми, описывающими периодический потенциал изменения величины двугранного угла. Параметры потенциалов Сn (где n = 1, 2, ..., 6) для углов -CA_-C_N1_CA1 и -C_N1_CA1_C1 вошли в окончательный вариант топологии хромофора белка DsRed. Пользуясь стандартной схемой проведения МД расчета с использованием силового поля OPLS-AA/DsRed, был проведен МД расчет для системы, содержащей тетрамер белка DsRed, 12 510 молекул воды и четыре иона натрия на протяжении 4.2 нс и получена усредненная по траектории структура хромофора, обозначенная QYGMD,Average. Сравнение геометрии хромофора QYGMD,Average со структурами, полученными РСА (PDB ID 1ZGO, 1G7K, 1GGX) показало, что с точностью до теплового движения все структуры идентичны, что подтверждает правильность параметризации хромофора. Создание топологии хромофоров мутантов mRFP1 Поскольку на момент проведения работы отсутствовали данные о расшифровке структур mRFP1 и мутантных белков методами РСА или ЯМР, для проведения молекулярно-динамических расчетов в качестве начальных использовались структуры, построенные на основе структуры ближайшего гомолога, белка DsRed, путем внесения соответствующих аминокислотных замен с помощью программы SwissPDBViewer. Полученные структуры были оптимизированы методом минимизации энергии по алгоритму L-BFGS в программном пакете GROMACS. МД-расчеты проводились на основе силового поля OPLS-AA/DsRed. Для создания описаний хромофоров мутантных модифицированному белков участку требовалось хромофора. внести Параметры изменения, были соответствующие извлечены из записей соответствующих аминокислот. Анализ полученных в результате молекулярно-динамических расчетов траекторий также осуществлялся средствами программного пакета GROMACS. Создание генов и наработка целевого продукта мутантов белка mRFP1 В работе использовался ген красного мономерного флуоресцентного белка mRFP1 из плазмидного вектора pMT-mRFP1, любезно предоставленного «Fungal Genetics Stock Center», Университет Миссури, США. Основу олигонуклеотид-направленного сайт-специфического мутагенеза составил метод «ник-трансляции», при котором участок векторной ДНК тем или иным способом получают в однотяжевой форме, связывают его с синтетическим олигонуклеотидом, спланированным так, что 14 он комплементарен выбранному участку ДНК за исключением небольшого фрагмента в области внесения мутации. Полученный комплекс достраивают ДНК-полимеразой и замыкают ДНКлигазой в двутяжевую ковалентно-замкнутую кольцевую векторную ДНК с небольшим некомплементарным участком в районе планируемой мутации. После трансформации подходящих компетентных клеток и клонирования проводят поиск и идентификацию целевых мутантов. Для проведения генно-инженерных модификаций была осуществлена оригинальная реализация метода «ник-трансляции» (рис. 5), для проведения которой недалеко от места введения мутации должен существовать уникальный сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции. сайт рестрикции место мутагенеза рестриктаза SnaBI P P I II P отжиг праймеров OH P P IV экзонуклеаза III P P III Т4 ДНК-лигаза OH OH P 1. фрагмент Кленова 2. T4 ДНК-лигаза ДНК-полимераза I V VI Рис. 5. Схема проведения сайт-специфического мутагенеза с использованием «ник-трансляции». Исходная двутяжевая кольцевая плазмидная ДНК была расщеплена в уникальном сайте эндонуклеазой рестрикции с образованием линеаризованной двутяжевой плазмидной ДНК с короткими однотяжевыми участками на концах («липкими концами») (стадия I на рис. 5). Затем плазмидная ДНК была обработана экзонуклеазой III, которая с обоих концов линеаризованного вектора высвобождает достаточно протяженные однотяжевые участки (стадия II на рис. 5). На освобожденные участки комплементарно были отожжены синтетические олигонуклеотиды: мутаген и адаптер (стадия III на рис. 5). Олигонуклеотид-мутаген имел фосфатную группу на 5’-конце, в то время как синтетический олигонуклеотид-адаптер не имел такой группы. Структура 3’-концевых участков олигонуклеотидов была подобрана таким образом, 15 чтобы после гибридизации и обработки конструкции ДНК-лигазой концы вектора комплементарно соединились с восстановлением исходного базового сайта эндонуклеазы рестрикции (стадия IV на рис. 5). На следующем этапе полученный гибрид был достроен фрагментом Кленова ДНКполимеразы I E.coli в присутствии смеси дезоксирибонуклиозидтрифосфатов и ДНК-лигазы (стадия V на рис. 5). Основной продукт этой реакции – кольцевой гетеродуплекс ДНК с разрывом в одном из тяжей (в области гибридизации с дефосфорилированным адаптером) и нарушением двойной спирали вследствие некомплементарности в области мутагенеза, причем целевая «мутантная» форма гена встроена в ковалентно-замкнутый тяж ДНК, не имеющий разрыва, а исходная структура гена «дикого типа» встроена в тяж с искусственным разрывом, расположенным в направлении 3’ → 5’ на относительно небольшом расстоянии от места мутагенеза. Обработка полученной гетеродуплексной конструкции ДНК-полимеразой I E.coli привела к реакции так называемой «ник-трансляции» (стадия VI на рис. 5). В ходе этой реакции фермент осуществляет деградацию цепи с разрывом с 3’-конца и одновременную достройку с 5’-конца на основе комплементарной цепи. В качестве «затравки» используется нефосфорилированный олигонуклеотид-адаптер. После прохождения полимеразой района некомплементарности образуется ДНК, обе цепи которой в районе мутагенеза будут иметь запланированную структуру. Полученной кольцевой ковалентно-замкнутой молекулой ДНК трансформировали клетки E.coli. Выделенная из полученной культуры клеток плазмидная ДНК была подвергнута рестриктному анализу, структура гена была проверена методом прямого секвенирования. Отбор клонов проводился с использованием анализа методом ПЦР, рестриктного анализа и секвенирования участка, содержащего предполагаемые мутации. Плазмидными ДНК отобранных клонов трансформировали компетентные клетки E.coli, которые инокулировали в питательную среду DYT. Из выросшей биомассы клеток-суперпродуцентов (ночной культуры) после лизиса методом никель-афинной хроматографии были выделены экспрессируемые белки. Пробы белков были подвергнуты диализу для очистки. Концентрации полученных препаратов белков составили от 0.3 до 1.5 мг/мл. Оптические свойства полученных мутантных белков Для всех полученных препаратов белков были измерены спектры поглощения, возбуждения и испускания флуоресценции. Двенадцать из полученных 20 белков (60%) обладают окраской и флуоресценцией (табл. 1). Одиннадцать из них флуоресцируют в красной области, мутант с заменой на глицин обладает 16 только зеленой флуоресценцией, что может свидетельствовать о том, что полного созревания не прошло, а хромофор остался в промежуточной стадии, аналогичной белкам семейства GFP. № Кодовое имя Замена Название Максимум Максимум аминокислоты возбуждения, эмиссии, нм ψ ε, M-1см-1 нм 1 mRFP1-17D+ нет глутамин 584 607 0.27 41 800 2 A5 N аспарагин 570 604 0.17 6 900 3 4i A аланин 578 605 0.19 2 400 4 7D L лейцин 577 613 0.12 3 600 5 11sn C цистеин 568 588 0.21 35 650 6 22ss S серин 561 579 0.21 32 700 7 A8 H гистидин 588 618 0.13 12 700 8 16D G глицин 504 515 0.025 16 200 9 14D E глутамат 577 – 588 610 0.34 9 000 10 13mn M метионин не окрашен не флуоресцирует 11 12mn K лизин не окрашен не флуоресцирует 12 5I I изолейцин не окрашен не флуоресцирует 13 11in T треонин 560 – 570 589 0.024 25 000 14 5F F фенилаланин 595 624 0.03 24 350 15 10V,8D V валин не окрашен не флуоресцирует 16 39R R аргинин не окрашен не флуоресцирует 17 13P P пролин не окрашен не флуоресцирует 18 19Y Y тирозин 19 11D D аспартат не окрашен не флуоресцирует 20 31W W триптофан не окрашен не флуоресцирует 595 624 0.04 2 430 Таблица 1. Оптические характеристики mRFP и мутантных белков с заменами в 66 положении аминокислотной последовательности. Приведены кодовые имена мутантов и соответствующие им замены, ψ – квантовый выход флуоресценции, ε – эффективный коэффициент экстинкции. Анализ спектров поглощения и возбуждения У белка mRFP1 и его мутантов с аминокислотными заменами Q66A, Q66L, Q66S, Q66H, Q66C, Q66N в спектрах поглощения присутствуют две полосы поглощения: зеленая и красная 17 (табл. 2). Для всех белков, кроме белка Q66N, значения длин волн, соответствующих максимумам зеленой полосы, лежат в диапазоне 500-509 нм, в то время как для белка Q66N максимум поглощения зеленой полосы находится при 525 нм. Эту полосу можно отнести к поглощению не полностью созревшей зеленой формы хромофора. Значения длин волн, соответствующих максимумам красной полосы, лежат в диапазоне 561-598 нм и различны для различных замен в 66 положении. Зеленая форма Белок Красная форма Максимум ε, Максимум ε, Максимум Максимум поглощения, M-1см-1 поглощения, M-1см-1 возбуждения, эмиссии, нм нм нм нм ψ mRFP1 503 34 600 584 41 800 584 607 0.27 Q66N 525 13 700 570 6 900 570 604 0.17 Q66H 504 35 600 588 12 700 588 618 0.13 Q66L 500 64 000 582 3 600 577 613 0.12 Q66C 505 36 400 568 35 650 568 588 0.21 Q66A 500 29 600 582 2 400 578 605 0.19 Q66S 506 24 900 562 32 700 561 579 0.21 Q66F 508 26 600 593 8 000 593 617 0.03 Q66T 509 плечо 561 25 000 560 – 570 589 0.024 Q66Y 508 1 200 592 2 400 595 624 0.04 Q66E 503 57 000 588 9000 577 – 588 610 0.34 Таблица 2. Оптические свойства зеленых и красных форм хромофоров белка mRFP1 и мутантных белков. ε – эффективный коэффициент экстинкции в максимуме поглощения, ψ – квантовый выход флуоресценции. Определены эффективные коэффициенты экстинкции и квантовые выходы флуоресценции при длинах волн, соответствующих максимумам зеленых и красных полос (табл. 2). Положение максимумов поглощения зеленой полосы мутантов практически не зависит от заменяемого остатка, напротив, положения максимумов поглощения красной полосы мутантов, а также максимумов возбуждения и эмиссии флуоресценции зависит от заменяемого остатка. Экспериментальные данные не противоречат представлениям, согласно которым в полученных препаратах имеется две формы созревших флуоресцентных белков – красная и зеленая. Если предположить, что зеленая форма хромофора отличается от красной отсутствием 18 двойной связи между Cα и N атомами 66 аминокислотного остатка, то собственно система сопряженных π-связей зеленой формы хромофора не будет в себя включать 66 аминокислотный остаток и можно предположить, что его замена не должна значительно влиять на спектральные свойства. В случае же «красного» хромофора мутантов дегидрирование связи между Cα и N атомами вовлекает углеродный скелет 66 аминокислотного остатка в систему сопряжения и изменения в боковом радикале этого остатка могут приводить к «тонкой» настройке спектров поглощения и флуоресценции. Выявлены корреляции между спектральными свойствами полученных белков (длинами волн максимумов возбуждения и эмиссии флуоресценции) и геометрическими параметрами мутируемых аминокислотных остатков (площадь и объем). С увеличением размеров остатка сдвигаются в более красную область положения максимумов возбуждения и эмиссии флуоресценции (рис. 6). Для набора мутантов Q66A, Q66L, Q66S, Q66H, Q66C, Q66N, Q66T, Q66Y, Q66F, Q66E положения максимумов возбуждения флуоресценции коррелируют с объемом остатка по 66 положению с коэффициентом корреляции 0.66, положения максимумов эмиссии коррелируют с объемом со значением 0.63. Однако если из набора мутантов исключить неполярные аминокислотные остатки (аланин, лейцин, тирозин и фенилаланин), то в оставшемся ряду полярных аминокислотных остатков степени корреляций возрастают до 0.92 и 0.83, соответственно Примечательно, что в ряду неполярных замен коэффициенты корреляции низки – 0.28 и 0.69, соответственно. Данное расщепление можно объяснить наличием двух факторов, оказывающих влияние на спектральные свойства: 1. геометрический размер заменяемой аминокислоты (приводящий к отдалению от хромофора части аминокислот окружения с увеличением размера остатка) 2. в зависимости от типа аминокислоты по 66 положению возможно образование водородных связей полярными аминокислотами с остатком Glu215, а так же изменение энергии системы в случае замены на алифатические аминокислотные остатки за счет гидрофобных взаимодействий. Интересно, что для мутантов зеленого флуоресцентного белка GFP наблюдается такая же картина (рис. 7). Исходный GFP дикого типа содержит серин, также были получены мутанты, содержащие вместо серина аланин, цистеин и лейцин, и опять прослеживается корреляция объема с максимумами возбуждения и эмиссии. 19 His 620 Glu 610 Gln Asn длина волны, нм 600 590 Cys Thr Glu 580 Gln His Ser Cys 570 Asn Thr Ser 560 80 90 100 110 120 130 о 140 150 160 объем, А 3 Рис. 6. Зависимости положений максимумов возбуждения и эмиссии флуоресценции от объемов боковых радикалов аминокислотных остатков, находящихся в первом положении хромофора для белка mRFP1 и его мутантов с заменами в 66 положении. Квадратами обозначены значения максимума возбуждения, кругами – максимума эмиссии. 510 Leu Cys Ser 505 Ala длина волны, нм 500 495 490 485 Leu 480 Cys Ser 475 Ala 470 80 100 120 140 o 160 180 3 объем, А Рис. 7. Зависимость положений максимумов возбуждения (квадраты) и эмиссии (круги) флуоресценции от объемов боковых радикалов аминокислотных остатков для белка GFP и его мутантов с заменами в 65 положении. 20 Анализ МД-структур мутантных белков и mRFP1 Структуры, полученные в результате молекулярно-динамических расчетов, сохранили общую форму, характерную для флуоресцентных белков (β-бочонок, внутри которого проходит αспираль с хромофором в ее центральной части). Хромофоры остались плоскими и при наложении хорошо совмещаются (см. рис. 8). Рис. 8. Сравнение 5 Å окружения хромофоров белков mRFP1, Q66N, Q66C Q66A и Q66S. Анализ полученных в результате молекулярно-динамических симуляций средних по траектории структур белков показывает, что полярные боковые радикалы аминокислот в 66 положении могут образовывать водородные связи с глутамином 215. Образование выгодной по энергии водородной связи требует сближения соответствующих атомов. Однако такое сближение не может происходить за счет изменения положения Glu215, т.к. он является частью жесткого βбочонка, а нарушение конфигурации бочонка требует больших энергетических затрат. Хромофор является гораздо более подвижной структурой, поэтому осуществить образование необходимой водородной связи за счет изменения конформации хромофора энергетически выгоднее. Как показали результаты молекулярно-динамических расчетов, у разных мутантных белков 21 действительно наблюдается существенное изменение значений торсионных углов в хромофоре. Энергетические изменения в результате образования новой водородной связи приводят к изменению геометрии бокового остатка и подвижности хромофора в целом и, как следствие, спектральных свойств соответствующих белков. Определение оптических характеристик методом нелинейной флуориметрии Нелинейная лазерная флуориметрия позволяет определять все три молекулярных фотофизических параметра – сечение поглощения хромофора , время жизни флуоресценции 3 и константу синглет-триплетной конверсии K32. Однако для практической реализации этой возможности необходим специальный подбор параметров импульса лазерного излучения, возбуждающего флуоресценцию, при которых обеспечивается достаточно высокая практическая устойчивость решения обратной задачи. В данной работе задача была редуцированна до двухпараметрической, в которой для каждого из белков определяемыми параметрами были и K32, а их полные времена жизни флуоресценции 3 были определены независимо на пикосекундном лазерном флуорометре. Измеренные кривые затухания флуоресценции всех трех препаратов оказались одноэкспоненциальными, восстановленные времена 3 (время жизни флуоресценции) приведены в таблице 3. Определение соотношения концентраций между зеленой и красной формами белков Используя совместно метод нелинейной флуориметрии и классические методы, можно определить соотношение концентраций между флуоресцирующим и нефлуоресцирующим хромопротеинами красного флуоресцентного белка в растворе, решая следующую систему уравнений: 22 индексы 532, 570 и red, green обозначают значения длины волны возбуждающего излучения и формы белка, соответственно; где nred, ngreen – концентрации красной и зеленой форм белка в растворе [см-3], n0 – общая концентрация молекул белка, – сечение поглощения хромофора, RS – сечение комбинационного рассеяния (КР) воды, D – оптическая плотность раствора белка, Ф0 – флуоресцентный параметр в отсутствии насыщения флуоресценции, l – толщина слоя раствора при абсорбционных измерениях, также предполагается, что квантовый выход η не зависит от длины волны возбуждения. Значение длины волны возбуждения 570 нм было выбрано так, чтобы оптическая плотность D, измеренная с помощью спектрофотометра, определялась поглощением только флуоресцирующей красной формой белка, т.е. чтобы для всех образцов было выполнено D = Dred. Полученное значение сечения позволяет определить индивидуальные значения сечения поглощения [см2] и коэффициента экстинкции = 2.6·1020· [М-1см-1] хромофора в области длин волн, где измеренные величины оптической плотности D определяются только поглощением красной формы белка, в частности, коэффициент экстинкции в максимуме полосы поглощения (см. таблицу 3). Метод был опробован на примере трех белков, имеющих явно выраженные красную и зеленую полосы в спектрах поглощения: mRFP1, Q66S и Q66C (см. таблицу 3). mRFP1 Q66C Q66S , 10-16см2 3.40.6 30.5 2.20.5 , 10-17см2 2.40.4 1.60.4 2.30.4 , 10-16см2 6.51.1 5.10.8 30.5 , мМ-1см-1 21540 13520 8513 nred / n0 0.260.06 0.170.06 0.340.06 ngreen / n0 0.740.06 0.830.06 0.660.06 nred / ngreen 1:3 1:5 1:2 3, нс 30.15 2.80.14 2.90.14 T 00.02 00.02 0.050.02 0.240.03 0.190.04 0.200.04 Таблица 3. Индивидуальные оптические характеристики белков mRFP1, Q66C и Q66S. 23 В максимуме полосы поглощения красной формы белка mRFP1 ( = 584 нм): сечение составляет (8.21.5)·10-16 [см2], что соответствует коэффициенту поглощения хромофора , равному 21540 [мМ-1см-1]. Полученное значение в 4 раза выше определенного экстинкции ранее другими авторами. Такое различие связанно с тем, что в этих работах при расчете использовали суммарную концентрацию белка (и поэтому определяли интегральный коэффициент экстинкции), а не парциальную. Как следствие, определение парциальной концентрации хромофоров позволило найти индивидуальные коэффициенты экстинкции двух форм белков. В общем случае, определение оптических характеристик ФБ на основе интегральных характеристик препарата является некорректным. Предложенный метод позволяет определять истинные характеристики флуоресцентных белков. Как было указано ранее, положение максимумов поглощения зеленой полосы мутантов практически не зависит от типа заменяемого остатка. Напротив, положения максимумов поглощения красной полосы мутантов, а также максимумов возбуждения и эмиссии флуоресценции зависят от заменяемого остатка и хорошо коррелируют с объемом бокового радикала 66-ого аминокислотного остатка (рис. 6), причем с увеличением объема положения максимумов сдвигаются в длинноволновую область спектра. Аналогичная корреляция была выявлена и для истинных коэффициентов экстинкции (рис. 9). 220 -1 коэффициент экстинкции, мМ см -1 Gln 200 180 160 140 Cys 120 100 Ser 80 80 90 100 110 120 o 130 140 150 3 объем, А Рис. 9. Зависимость истинного коэффициента экстинкции от объемов аминокислотного остатка по 66 положению. 24 Результаты и выводы 1. Методами квантовой химии и молекулярной динамики в силовом поле OPLS-AA создана топология хромофора белка mRFP1 как нового аминокислотного остатка и рассчитаны ее параметры. Проведенное молекулярно-динамическое моделирование структуры белка DsRed (с аналогичным хромофором) и сравнение с имеющимися рентгено-структурными данными показало правильность созданной топологии. 2. Методами квантовой химии и молекулярной динамики в силовом поле OPLS-AA созданы топологии и рассчитаны параметры для всех 20 возможных хромофоров с заменами по 66 позиции. 3. Созданы PDB-файлы структур белка mRFP1 и его мутантов. 4. Проведено молекулярно-динамическое моделирование пространственных структур белков в растворе. Рассчитаны равновесные структуры белков. Наложение средних по траектории структур показало, что значительных изменений в конформации хромофора и его окружения не произошло, однако имеются некоторые геометрические отличия, которые, видимо, отвечают за сдвиги в спектрах поглощения и флуоресценции у мутантов. В результате анализа структур хромофоров мутантов выяснено, что наиболее вариабельными участками являются область соединения фенольного и имидозалидонового колец хромофора, а также зона присоединения мутированного радикала. 5. Методом олигонуклеотид-направленного сайт-специфического мутагенеза гена мономерного красного флуоресцентного белка (mRFP1), клонированного в модифицированной плазмиде pQEM, получен набор мутантных генов с заменами кодона Gln66. Экспрессия в E.coli и последующая аффинная очистка позволили получить серию препаратов из 20 мутантных белков mRFP1. Проведена наработка и выделение целевого белка. Проведенный электрофорез проб показал наличие во всех белка с массой 26 кДа, что соответствует целевому продукту. Измерены оптические свойства препаратов. Из 20 белков окраской и способностью флуоресцировать в видимой области обладают 12. Выявлена корреляция между объемом бокового радикала а.о. по 66 положению и оптическими свойствами полученного белка. 6. Определены индивидуальные оптические характеристики белка mRFP1 и его мутантов (Q66C и Q66S), что позволило определить концентрации «зеленой» и «красной» форм хромофоров в растворе. Выявлена зависимость индивидуального коэффициента экстинкции красной формы белка (в максимуме полосы поглощения) от объема аминокислоты по 66 положению, что может быть применено для прогнозирования свойств новых мутантов флуоресцентных белков и синтеза белков с наперед заданными свойствами. 25 Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи 1. Банишев АА, Маслов ДВ, Ширшин ЕА, Фадеев ВВ, Вржещ ЕП, Дмитриенко ДВ, Друца ВЛ, Вржещ ПВ, Пащенко ВЗ. Метод определения индивидуальных оптических характеристик посттрансляционных флуоресцентных форм флуоресцентных белков с использованием нелинейной лазерной флуориметрии. Биофизика, 2007, 52(5), 792-798. 2. Khrameeva EE, Drutsa VL, Vrzheshch EP, Dmitrienko DV, Vrzheshch PV. Mutants of monomeric red fluorescent protein mRFP1 at residue 66: structure modeling by molecular dynamics and search for correlations with spectral properties Biochemistry, 2008, 73(10), 1085-1095. 3. Dmitrienko DV, Vrzheshch EP, Drutsa VL, Vrzheshch PV. Red fluorescent protein DsRed: parametrization of its chromophore as an amino acid residue for computer modeling in the OPLS-AA force field. Biochemistry, 2006, 71(10), 1133-1152. 4. Вржещ ЕП, Дмитриенко ДВ, Руданов ГС, Загидуллин ВЭ, Пащенко ВЗ, Разживин АП, Салецкий АМ, Вржещ ПВ. Оптические свойства мономерного красного флуоресцентного белка mRFP1. Вестник Московского Университета, серия биология, 2008, 3, 21-24. 5. Banishev AA, Vrzheshch EP, Shirshin EA. Application of laser fluorimetry for determining the influence of a single amino-acid substitution on the individual photophysical parameters of a fluorescent form of a fluorescent protein mRFP1. Quantum Electronics, 2009, 39(3), 273-278. 26 Тезисы докладов на конференциях 1. Ширшин ЕА, Банишев АА, Вржещ ЕП. Фотофизические параметры и механизмы флуоресценции белка. Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006», секция «Физика», Москва, 2006, Тезисы докладов, с. 157. 2. Фадеев ВВ, Вржещ ПВ, Маслов ДВ, Банишев АА, Вржещ ЕП, Дмитриенко ДВ, Ширшин ЕА. Флуоресцентные характеристики и молекулярные фотофизические параметры красного флуоресцентного белка mRFP1. Труды конференции «Альманах клинической медицины», издается МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, Москва, 2006. Том ХII, с. 42. 3. Вржещ ЕП, Дмитриенко ДВ, Вржещ ПВ. Компьютерное моделирование трехмерных структур флуоресцентных белков. Труды конференции «Альманах клинической медицины», издается МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, Москва, 2006. Том ХII, с. 51. 4. Цой О, Вржещ ЕП. Изучение физико-химических свойств мутантов красного флуоресцентного белка mRFP1. XIII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006», Секция «Биоинженерия и биоинформатика», Москва, 2006, Тезисы докладов, с. 10. 27
