На правах рукописи ТУЖИКОВ АЛЕКСАНДР ИВАНОВИЧ
реклама
На правах рукописи ТУЖИКОВ АЛЕКСАНДР ИВАНОВИЧ СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ФИТАСПАЗЫ NICOTIANA TABACUM 03.01.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в отделе химии и биохимии нуклеопротеидов Научно-исследовательского Института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Научные руководители: доктор химических наук, профессор Вартапетян Андрей Борисович кандидат химических наук Чичкова Нина Валентиновна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Рубцов Петр Михайлович доктор химических наук, профессор Филиппова Ирина Юрьевна Ведущая организация: ФГУП Государственный НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов Защита состоится 28 октября 2011 года в 11.00 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, дом 1, строение 40, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова, аудитория 536. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Автореферат разослан __ сентября 2011 года. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А. Крашенинников ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Программированная клеточная смерть (ПКС) является чрезвычайно важным многоклеточных процессом организмов. для Этот нормального процесс развития позволяет и жизнедеятельности организму избавляться от поврежденных или избыточных клеток. Одной из наиболее изученных форм ПКС у животных является апоптоз. Известно, что основными исполнителями апоптоза являются каспазы – белки семейства цистеиновых протеаз. Каспазы активируются в процессе ПКС и осуществляют гидролиз ограниченного числа белков-мишеней после остатка аспарагиновой кислоты в специфическом сайте узнавания. ПКС протекает и в тканях растительных организмов. Морфологические проявления программированной клеточной смерти в тканях животных и растений имеют некоторые общие черты, что может указывать на биохимическое сходство процессов, протекающих в апоптотических клетках животных и растений, и, в частности, на возможное участие каспазоподобных протеаз в программированной смерти растительных клеток. Однако компьютерный поиск генов каспаз, структурно схожих с каспазами животных, в геномах растений не дал результатов. Известно, тем не менее, что в погибающих при ПКС клетках растений регистрируется специфическая каспазоподобная аспартазная активность. Свидетельства участия каспазоподобных ферментов в ПКС у растений в основном основываются на ингибирующих эффектах, наблюдаемых в присутствии специфических белковых и синтетических ингибиторов каспаз животных. Вероятно, некоторые протеазы растений, участвующие в ПКС, структурно не являются каспазами, но функционально обладают сходной субстратной специфичностью. В нашей лаборатории из листьев табака N. tabacum был выделен фермент, обладающий рядом свойств, характерных для каспаз животных: он гидролизовал агробактериальный белок VirD2 после остатка аспарагиновой кислоты, расположенного в специфическом сайте узнавания TATD; мутация аспартата предотвращала гидролиз. Протеолитическая активность каспазоподобного фермента подавлялась ингибитором, созданным на основе сайта узнавания; ингибирование фермента приводило к подавлению ПКС. Найденный фермент получил название «фитаспазы» (phytaspase, phyto – растительный (лат.), asp – специфичный в отношении остатка аспарагиновой кислоты, ase – фермент). Была получена кДНК, предположительно кодирующая фитаспазу табака. Исследование структуры и свойств белка, кодируемого этой кДНК, могло дать принципиально новую информацию об апоптотической протеазе растений, необходимую программированной смерти растительных клеток. 1 для понимания механизмов Цели и задачи исследования. Целью данного исследования являлось проведение структурно-функциональной характеристики фитаспазы табака. Задачи: 1. Доказать, что белок, кодируемый найденной кДНК, соответствует фитаспазе табака, то есть, продуцировать рекомбинантный фермент и показать, что он обладает протеолитической активностью фитаспазы. 2. Определить, к какому классу протеолитических ферментов относится фитаспаза. 3. Идентифицировать функционально значимые домены в структуре фитаспазы. 4. Выяснить особенности процессинга фитаспазы. 5. Исследовать локализацию фитаспазы в нормальных и погибающих при ПКС клетках растений. Решение поставленных задач должно было позволить охарактеризовать апоптотическую протеазу растений и провести ее сравнение с апоптотическими протеазами животных (каспазами). Научная новизна и практическая значимость. В результате проведенной работы путем продукции рекомбинантного белка и изучения его субстратной специфичности доказано, что имеющаяся в нашем распоряжении кДНК кодирует фитаспазу табака. Это позволило определить полную аминокислотную последовательность белка-предшественника фитаспазы и выявить важные особенности его структуры и функционирования. Показано, что фитаспаза является субтилизин-подобной протеазой, то есть сериновой протеазой растений. Таким образом, апоптотические протеазы растений структурно разительно отличаются от апоптотических протеаз животных. Предсказаны каталитические остатки фермента и показано, что мутация с заменой Ser537 на остаток аланина (но не замена другого близлежащего остатка) инактивирует фитаспазу. Выявлены функционально важные участки в молекуле белка-предшественника фитаспазы - N-концевой сигнальный пептид, продомен и протеазный домен - и экспериментально установлены их границы. Продемонстрировано, что отщепление продомена фитаспазы при образовании протеолитически активного фермента происходит автокаталитически и в соответствии с уникальной субстратной специфичностью фитаспазы. Исследование мутантов фитаспазы показало, что отщепление продомена необходимо для образования протеолитически активного фермента и для секреции белка во внеклеточное пространство (апопласт). Выявлено, что в здоровых тканях фитаспаза локализуется в апопласте. 2 Доказано, что за секрецию фитаспазы в апопласт отвечает N-концевой сигнальный пептид белка-предшественника фитаспазы. В отсутствие сигнального пептида в последовательности белка-предшественника фитаспаза накапливается внутри клетки растения. Во внеклеточной жидкости фитаспаза присутствует в протеолитически активном состоянии. Установлено, что при индукции ПКС, вызванной абиотическими и биотическими факторами стресса, происходит возвращение фитаспазы из апопласта в цитозоль умирающей клетки. Релокализация фитаспазы в процессе ПКС продемонстрирована с использованием флуоресцентного белка-таймера. Использование биоинформатического подхода позволило предложить модель пространственной структуры фитаспазы табака, объясняющую аспартатную специфичность фермента. Все перечисленные результаты получены впервые. Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано две статьи в международных научных журналах и глава в книге. Материалы работы были представлены на научных конференциях: IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Международной школе по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки» (Звенигород, 2010), Международной конференции «1st International Plant Protease Conference» (Hemavan, Швеция, 2011) Структура и объем работы. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, экспериментальная иллюстрирован 36 рисунками. часть, выводы Библиографический работ. 3 и список указатель литературы. Материал включает 190 цитируемых СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ На основании масс-спектрометрического и биоинформатического анализа пептидов выделенной фитаспазы табака была клонирована кДНК, предположительно кодирующая фитаспазу. Анализ структуры белка, выведенной из нуклеотидной последовательности этой кДНК, мог дать существенную информацию об изучаемом ферменте при условии, что найденная кДНК действительно соответствовала фитаспазе. Поэтому первоочередными задачами настоящей диссертационной работы являлись биоинформатический анализ белоккодирующей последовательности кДНК и экспериментальное доказательство того, что кодируемый белок является фитаспазой. 1. Биоинформатическая характеристика фитаспазы Мы провели анализ первичной структуры предполагаемой фитаспазы из Nicotiana tabacum с использованием методов биоинформатики. Последовательность фитаспазы насчитывает 763 аминокислотных остатка. Поиск гомологов фитаспазы в базе данных протеаз MEROPS показал, что фермент следует отнести к семейству гомологов субтилизина (семейство S8, подсемейство S8A) – субтилизин-подобным протеазам. Изучение доменной организации и поиск сигнальных последовательностей в структуре позволили выявить ряд структурных элементов, входящих в состав фитаспазы (см. Рисунок 1). 1 25 MANCITLYFLFLAILLTLNPFIMA QSETY... [117] Сайт процессинга ...VKSD TTHTSQFL... [25-117] Субтилазный продомен [1-24] Сигнальный пептид [220] His [149] Asp [537] Ser [118-598] Протеазный домен 763 Профитаспаза Рисунок 1. Схематическое изображение доменной структуры профитаспазы. Красным цветом выделены каталитические остатки и сайт автопроцессинга. Стрелками отмечены места отщепления сигнального пептида и продомена (см. ниже). Судя по всему, фитаспаза должна синтезироваться в виде белка-предшественника (профермента). На N-конце профитаспазы находится N-концевой гидрофобный пептид, напоминающий сигнальные пептиды, отвечающие за секрецию белков. Затем расположен субтилазный продомен, обычно отщепляемый в ходе созревания субтилаз, за которым следует протеазный домен S8, характерный для субтилаз. Границей продомена и протеазного домена является пептидная связь между остатком Asp117 и Thr118. C-концевая область фитаспазы, по всей видимости, не содержит четких доменных структур. Каталитическая активность субтилизин-подобных протеаз обусловлена наличием у данной группы ферментов триады аминокислотных остатков (Asp, His, Ser) в активном 4 центре. Последовательности окружения аминокислотных остатков канонической каталитической триады субтилаз весьма консервативны. С использованием множественного выравнивания мы определили аминокислотные остатки Asp149, His220 и Ser537 в последовательности фитаспазы, занимающие позиции, гомологичные каталитическим остатками известных субтилизин-подобных протеаз. 2. Рекомбинантная фитаспаза протеолитически активна, и ее активность зависит от Ser537 в активном центре Чтобы убедиться, что определенная нами аминокислотная последовательность действительно соответствует фитаспазе, мы использовали имеющуюся кДНК для продукции рекомбинантного фермента в растениях N. benthamiana и исследования его протеолитической активности. Продукция рекомбинантного белка в растительной (то есть, гомологичной) системе имеет то преимущество, что обеспечивает необходимые посттрансляционные модификации белков. Для выделения рекомбинантного белка и отделения его от нативной фитаспазы мы присоединили тэг GST на С-конец рекомбинантной фитаспазы. Параллельно мы получили мутантную кДНК фитаспазы, кодирующую белок с заменой предсказанного каталитического остатка Ser537 на остаток Ala. Мы использовали остаток аланина в качестве аминокислотной замены потому, что его боковой радикал отличается от радикалов серина и цистеина лишь отсутствием β-концевой функциональной группы, и, следовательно, такая замена должна вносить минимальные изменения в геометрию активного центра. В то же время, замена Ser537 должна была, по нашим представлениям, полностью инактивировать фермент. В качестве контроля мы сконструировали еще одного мутанта фитаспазы табака с заменой близлежащего Cys540 на Ala. Полученные кДНК встроили в бинарный вектор под контролем сильного конститутивного промотора 35S, что должно было обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках растений. Полученными плазмидами трансформировали клетки агробактерий A. tumefaciens C58C1 и осуществили заражение листьев растений N. benthamiana трансформированными агробактериями с помощью инфильтрации. Данная процедура обеспечила транзиентную экспрессию целевых генов в растительных клетках и продукцию интересующих нас белков. С помощью иммуно-блота с использованием антител против GST мы детектировали продукцию рекомбинантных белков в инфильтрированных листьях (см. Рисунок 2). Для каждой из трех форм фитаспазы на электрофореграмме наблюдалась одна полоса, соответствующая рекомбинантному белку. Относительные молекулярные массы каждой из трех форм фитаспазы находились примерно в области 110 кДа, что соответствовало ожиданиям. Аналогичная полоса отсутствовала в треке контроля (пустой вектор). 5 1 2 3 Рисунок 2. Продукция фитаспазы-GST дикого типа и мутантных форм в клетках N. benthamiana. Детекция с помощью иммуно-блота с антителами против GST. Треки: 1. Экстракт листьев N. benthamiana, инфильтрированных агробактериями, трансформированными пустым вектором; 2. Фермент дикого типа; 3. Мутант C540A; 4. Мутант S537A 4 170 130 95 Полученные рекомбинантные формы фитаспазы были выделены из экстрактов инфильтрированных листьев N. benthamiana методом аффинной хроматографии с использованием выделению глутатион-сефарозы рекомбинантных в белков, качестве была сорбента. проведена Процедура, для аналогичная экстрактов листьев, инфильтрированных агробактериями с пустым вектором. После уравнивания концентраций выделенных белков мы провели анализ протеолитической активности полученных рекомбинантных форм фитаспазы. В качестве субстрата мы использовали рекомбинантный белок GFP-VirD2Сt, в состав которого входила С-концевая часть белка VirD2, содержащая сайт расщепления фитаспазой TATD. При гидролизе этого белка образуется фрагмент с молекулярной массой 36 кДа. 3 4 5 6 стр ат +н ати вн ая +к фи он тас тро па ль за (пу сто йв ект ор ) 66 2 с уб 1 45 8 9 10 + рекомбинантные формы фитаспазы WT 1 7 0.2 C540A 1 0.2 S537A 1 0.2 GFP-VirD2Сt продукт гидролиза 35 Анализ протеазной активности Рисунок 3. Анализ протеолитической активности рекомбинантной фитаспазы дикого типа и мутантов C540A и S537A по способности фрагментировать GFP-VirD2Ct. Белки разделяли в 15% ПААГ с последующим окрашиванием Coomassie R-250. 1 и 0.2 обозначают относительные количества рекомбинантных ферментов, использованных для анализа активности. рекомбинантной фитаспазы дикого типа (фитаспаза-GST(WT)) показал, что данный белок обладает активностью нативной фитаспазы (Рисунок 3, сравнить треки 3 и 5,6). Рекомбинантный фермент гидролизовал белок GFP-VirD2Ct c образованием того же продукта, что и нативная фитаспаза (то есть выделенная из листьев табака и не содержащая тэга GST). Таким образом, идентификация фермента и соответствующей ему кДНК была осуществлена правильно. Фитаспаза, мутантная по S537A, полностью утратила каталитическую активность (треки 9 и 10 на Рисунке 3). Таким образом, протеолитическая активность фитаспазы, как и предполагалось, зависит от Ser537. Активность фитаспазы, мутантной по С540A, в существенной степени сохранилась. Активности фитаспазы в контроле (пустой вектор) не наблюдалось (см. Рисунок 3, трек 4). Полученные результаты свидетельствуют о том, что имеющаяся кДНК действительно кодирует фитаспазу и что фитаспаза является субтилизин-подобной (то есть сериновой) протеазой. 6 3. Продомен фитаспазы подвергается автокаталитическому отщеплению (процессингу) Субтилизин-подобные протеазы синтезируются в виде проферментов, имеющих N-концевые продомены, которые утрачиваются в ходе созревания и активации субтилаз (процессинга). N-концевая аминокислотная последовательность нативной фитаспазы, определенная в нашей лаборатории, начиналась с отсутствовали первые 117 аминокислотных профитаспазы. Мотив TTHT растительных субтилаз. У является многих 118 TTHT (см. Рисунок 1), то есть в ней остатков, характерным субтилаз присутствующих местом отщепление в составе процессинга многих продомена происходит автокаталитически, то есть субтилаза отщепляет продомен посредством собственной протеолитической активности. В таком случае утрата автокаталитически процессируемой субтилазой протеолитической активности должна приводить к тому, что фермент остается в форме проэнзима, сохраняя продомен на N-конце. Мы сравнили электрофоретическую подвижность и N-концевую последовательность рекомбинантной фитаспазы дикого типа и ее неактивного мутанта S537A. Для этого мы создали плазмидные конструкции, которые позволили продуцировать химерные белки фитаспазы дикого типа (фитаспаза-EGFP(WT)) и неактивного мутанта фитаспазы (фитаспаза-EGFP(S537A)), имеющие тэг EGFP на С-конце. Через 72 часа после агробактериальной инфильтрации листьев N. benthamiana суммарный экстракт листьев инфильтрированных растений анализировали с помощью иммуно-блота с S5 37 A W T антителами против EGFP. Электрофореграмма представлена на Рисунке 4. (1) с продоменом 170 (2) без продомена 95 Рисунок 4. Фитаспаза дикого типа (WT) существует в форме профермента и в процессированной форме. Неактивный мутант фитаспазы (S537A) находится только в непроцессированном состоянии. Иммуно-блот получен с использованием антител к EGFP. В образце, содержащем фитаспазу-EGFP дикого типа (WT), присутствовало две полосы: (1) - соответствующая более тяжелой, предположительно непроцессированной форме фитаспазы, и (2) - соответствующая более легкой форме, предположительно с отщепленным продоменом. N-концевое секвенирование по методу Эдмана показало, что N-конец более тяжелой формы (1) начинается с последовательности QSETYVIHM, которая соответствует проферменту, с N-конца которого произошло отщепление 24-х аминокислот (см. Рисунок 1). Последовательность N-конца формы (2) имеет вид TTHTSQFL, что соответствует последовательности процессированного (без продомена) фермента. В треке, содержащем мутантную фитаспазу (S537A), наблюдалась только одна полоса, соответствующая по подвижности непроцессированной форме фитаспазы дикого типа (полосе (1)). Секвенирование N-конца показало, что последовательность мутантного белка начинается с QSETYVIHM. Таким образом, у неактивной фитаспазы происходит отщепление лишь N-концевого пептида (в случае 7 сигнальных пептидов обычно осуществляемое сигнальной пептидазой), однако процессинга продомена такой формы фитаспазы не происходит. Полученные результаты указывают на то, что фитаспаза является автокаталитически процессируемым ферментом. В случае неактивного мутанта фитаспазы мы не наблюдали даже частичного перехода профермента в процессированную форму (полосу (2)). Поскольку известно, что в растениях N. benthamiana имеется собственная (эндогенная) фитаспазная активность, этот результат подразумевает, что процессинг фитаспазы может происходить только in cis, то есть фитаспаза может отщеплять только собственный продомен, но не продомен другой молекулы фитаспазы. 4. Автокаталитический процессинг фитаспазы происходит аспартат-специфично Фитаспаза проявляет исключительную каспазоподобную аспартатную специфичность в отношении субстратов. Мы обратили внимание на то, что отщепление продомена фитаспазы также происходит после остатка аспарагиновой кислоты в положении 117 перед последовательностью 118 TTHT (см. Рисунок 1), что полностью согласуется с моделью автокаталитического процессинга. В таком случае замена D117 должна привести к утрате фитаспазой способности автокаталитически процессироваться. Для проверки этой гипотезы мы сконструировали и продуцировали в листьях N. benthamiana химерные белки фитаспаза-EGFP с заменой D117 на остаток глутаминовой кислоты (E) или аланина (A). Через 72 часа после инфильтрации листьев экстракты инфильтрированных растений анализировали с помощью иммуно-блота с антителами против EGFP. Электрофоретическая подвижность фитаспазы-EGFP c заменой D117E (Рисунок 5А) и D117A (Рисунок 5Б) была сравнима с подвижностью профитаспазы-EGFP и неактивного (1) с продоменом (2) без продомена (1) с продоменом D1 17 A T W 170 130 S5 37 A 17 E Б D1 W T A S5 37 A мутанта S537A. 170 130 (2) без продомена Рисунок 5. Мутация D117 в сайте процессинга нарушает отщепление продомена фитаспазы. A. Анализ электрофоретической подвижности фитаспазы-EGFP дикого типа (WT) и мутанта c заменой D117E. Б. Анализ электрофоретической подвижности фитаспазы-EGFP (WT) и мутанта с заменой D117A. Детекция с помощью антител к EGFP. Для сравнения электрофоретических подвижностей нанесен неактивный мутант фитаспазы S537A. Мы не наблюдали образования полосы (2) для мутантных белков, соответствующей процессированной форме фитаспазы-EGFP. Из этого мы сделали заключение, что замены D117 достаточно для того, чтобы процессинг фитаспазы практически полностью нарушился. Таким образом, как гидролиз фитаспазой белков-субстратов, так и ее собственный процессинг зависит от наличия остатка D в месте расщепления. 8 5. Процессинг фитаспазы необходим для протеолитической активности Чтобы установить, обладает ли фитаспаза с неотщепленным продоменом протеолитической активностью в отношении своих субстратов, или же отщепление продомена необходимо для активации фермента, нам было необходимо сравнить активность непроцессированного белка с мутациями в сайте процессинга с активностью фитаспазы дикого типа. Поскольку схема эксперимента должна была включать стадии выделения и инкубации рекомбинантных форм фитаспазы с субстратом, мы дополнительно ввели в состав рекомбинантных белков гексагистидиновый тэг, а также заменили в мутанте сайт процессинга с 117 DTTHT121 на 117 AAAHA121 (мутант фитаспаза-EGFP-[His]6(M4)). Мы продуцировали сконструированного мутанта M4 в клетках N. benthamiana с помощью агробактериальной инфильтрации и убедились, что процессинга такой формы фитаспазы абсолютно не происходит даже в ходе инкубации в течение 24 часов. Продуцированные рекомбинантные фитаспаза-EGFP-[His]6(WT) дикого типа и непроцессированная фитаспаза-EGFP-[His]6(M4) были выделены с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе, и их протеолитическая активность была проанализирована с помощью синтетического флуорогенного субстрата фитаспазы Ac-VEID-AFC. Рисунок 6. Фитаспаза дикого типа (WT, синяя линия) гидролизует флуорогенный субстрат Ac-VEID-AFC, в то время как непроцессированный фермент (M4, красная линия) такой активностью не обладает. Зеленым цветом отмечен график накопления продукта гидролиза в контроле. Количество рекомбинантных ферментов уравнивали перед проведением эксперимента с помощью иммуно-блота с антителами против EGFP. На Рисунке 6 представлен график гидролиза Ac-VEID-AFC рекомбинантной фитаспазой (с тэгом EGFP-[His]6 на С-конце) дикого типа и непроцессированным мутантом M4. Контрольный образец был получен из экстрактов N. benthamiana, инфильтрированных агробактериями, трансформированных пустым вектором, и прошел все стадии выделения параллельно с опытными образцами. Как видно из графика на Рисунке 6, фитаспаза дикого типа (WT) эффективно гидролизовала флуорогенный субстрат. Непроцессированный фермент (M4) такой способностью не обладал (кривая не отличалась от контроля). Полученный результат указывает на то, что непроцессированная фитаспаза не обладает протеолитической активностью, и, следовательно, процессинг продомена необходим для активации и каталитической функции фитаспазы. По аналогии с известными субтилизин-подобными 9 протеазами мы предполагаем, что неотщепленный продомен закрывает активный центр фитаспазы и препятствует связыванию субстрата. 6. Автокаталитический процессинг продомена необходим для секреции фитаспазы Существует несколько оснований полагать, что после продукции фитаспаза секретируется во внеклеточное пространство (апопласт): (1) активность фитаспазы регистрируется в среде суспензионной культуры клеток N. benthamiana; (2) выделение рекомбинантной фитаспазы дикого типа из тканей листьев N. benthamiana возможно без разрушения клеток; (3) результаты флуоресцентной конфокальной микроскопии тканей листьев N. benthamiana и N. tabacum указывают на то, что фитаспаза занимает промежуточное пространство между двумя плазматическими мембранами соседствующих клеток (будут подробно представлены ниже); (4) обработка клеток N. tabacum ингибитором секреции брефелдином А ведет к концентрированию продуцированной рекомбинантной фитаспазы внутри клетки. В ходе изучения влияния процессинга на активность фитаспазы мы заметили, что в то время как фитаспаза-EGFP-[His]6 дикого типа (WT) практически количественно находилась в растворимой фракции экстракта (Рисунок 7А), непроцессируемый мутант (M4) практически полностью оставался ассоциированным с нерастворимыми компонентами клеток (Рисунок 7Б). M4+DDM я ак ци кт тв ор и + мая DD ф M р ра с эк ст ра ны й су мм ар ны й эк ст ра ст кт во + ри 50 м 0 ая мМ ф р ра Na ак ст Cl ци во я + ри об м ра а я бо ф тк ра ра а У кц ст З ия во +0 р ,5 им % ая Tw ф ee ра ра n кц с 20 ия + тв 0, ор 5% и м Tw ая ee ф n ра 2 0 кц + ия УЗ В ра су мм ар M4 Б су мм ар WT ны й эк ра ст с ра фр тво кт р ак и ци ма я я A 130 кДа 130 Рисунок 7. Распределение фитаспазы дикого типа (WT, секция А) и непроцессируемой формы (M4, секция Б) между нерастворимой и растворимой фракциями экстракта листьев. Суммарный экстракт был получен кипячением разрушенных тканей продуцирующих листьев в SDS-содержащем буфере. Растворимая фракция получена суспендированием разрушенных тканей в буфере, содержащем 300 мМ NaCl и 0.1% Tween 20, и дополнительной обработкой ультразвуком (УЗ). В. Экстракция разрушенных тканей листьев, продуцирующих непроцессированную фитаспазу-EGFP-[His]6 (М4), в присутствии n-додецил-β-D-мальтозида (DDM). Представлен результат иммуно-блота с антителами против EGFP. Перераспределения непроцессируемой фитаспазы в растворимую фракцию также не происходило ни при суспендировании разрушенных тканей листьев N. benthamiana в буфере с высокой ионной силой (500 мM NaCl), ни при обработке суспензии ультразвуком и/или неионным детергентом Tween 20 (см. Рисунок 7Б). К счастью, оказалось, что обработка n-додецил-β-D-мальтозидом способствует переходу части непроцессированной фитаспазы в растворимую фракцию (Рисунок 7В) и при этом не влияет на активность фитаспазы дикого типа. Поскольку известно, что обработка n-додецил-β-D-мальтозидом приводит к разрушению мембран органелл и клетки, это обстоятельство указывает на то, что фитаспаза 10 до момента процессинга может быть ассоциирована с внутриклеточными мембранами (например, мембраной ЭПР или аппарата Гольджи) за счет продомена. Автокаталитический процессинг продомена ведет к тому, что зрелая форма фитаспазы переходит в растворимую фракцию, однако непроцессируемая форма фитаспазы остается связанной с клеточными мембранными компонентами. Таким образом, процессинг фитаспазы важен не только для протеолитической активности фермента, но и для секреции фитаспазы в апопласт. 7. Сигнальный (лидерный) пептид направляет фитаспазу на путь секреции Согласно оценке программы Signal-P, фитаспаза имеет N-концевой сигнальный пептид, который направляет белок на путь секреции. Секвенирование N-конца непроцессированного мутанта фитаспазы (фитаспаза-EGFP(S537A)) показало, что он не содержит первых 24 аминокислотных остатков, которые, предположительно, и представляют собой сигнальный пептид. Чтобы оценить роль N-концевой гидрофобной последовательности, предшествующей последовательности продомена фитаспазы, мы продуцировали фитаспазу-EGFP-[His]6 дикого типа (полноразмерный белок-предшественник) и сконструированную «безлидерную» форму (профитаспазу без первых 22 аминокислотных остатков) в листьях N. benthamiana и сравнили локализацию обоих белков. С использованием методов флуоресцентной конфокальной микроскопии нам удалось показать, что зрелая фитаспаза-EGFP-[His]6 (NtPhyt-EGFP-[His]6) дикого типа концентрируется в апопласте. Мы использовали флуоресцентный маркер плазматической мембраны - белок LT16-mOrange, чтобы наиболее точно установить локализацию фитаспазы. Листья N. benthamiana были инфильтрированы смесью агробактерий, трансформированных экспрессионными конструкциями pLH7000delta/NtPhyt-EGFP-[His]6 и pROK/LT16-mOrange. Через 72 часа после проведения инфильтрации мы детектировали зеленую флуоресценцию флуоресценцию фитаспазы-EGFP-[His]6 плазматическими мембранами между имеющими соседствующих оранжевую растительных клеток (см. Рисунок 8). Таким образом, синтезируемая фитаспаза дикого типа секретируется из клеток в апопласт. В то же время, «безлидерный» белок локализовался внутри клеток (см. Рисунок 9). 11 фазовый контраст и локализация LT16-mOrange / фитаспаза-EGFP-[His]6 A LT16-mOrange Б NtPhyt-EGFP-[His]6 В совместная локализация LT16-mOrange / фитаспаза-EGFP-[His]6 Г локализация фитаспазы плазматические мембраны двух соседствующих клеток 10 μM Рисунок 8. Локализация фитаспазы-EGFP-[His]6 в листьях N. benthamiana. Микрофотографии получены методами флуоресцентной конфокальной микроскопии. Показан участок соприкосновения двух клеток эпидермиса листьев Nicotiana benthamiana, в которых ко-продуцированы маркер плазматической мембраны LT16-mOrange (оранжевый) и фитаспаза-EGFP-[His]6 (зеленый). А. Наложение обоих флуоресцентных сигналов на микрофотографию с фазовым контрастом. Б. Плазматические мембраны клеток, окрашенные LT16-mOrange. Оранжевыми стрелками отмечены две плазматические мембраны соседних клеток; отчетливо виден микроскопический зазор между двумя плазматическими мембранами, занимаемый апопластом и клеточной стенкой. В. Внеклеточная жидкость, окрашенная флуоресцентным сигналом фитаспазы-EGFP-[His]6, образующим одну непрерывную линию по границе соприкосновения двух растительных клеток. Г. Совмещение флуоресцентных сигналов фитаспазы-EGFP-[His]6 и LT16-mOrange. Оранжевыми стрелками отмечены две плазматические мембраны клеток. Зелеными стрелками отмечен сигнал фитаспазы-EGFP-[His]6, локализующийся между двумя плазматическими мембранами в апопласте. WT A LF Б Рисунок 9. Сравнение локализации фитаспазы-EGFP-[His]6 (WT) и ее безлидерного мутанта (LF, leader free) в листьях N. benthamiana. Микрофотографии получены методами флуоресцентной конфокальной микроскопии. А. Локализация фитаспазы-EGFP-[His]6. В норме фитаспаза локализуется в апопласте; сигнал от EGFP, расположенного на С-конце белка, очерчивает тонкую линию контура соприкосновения двух клеток. Б. Локализация «безлидерного» мутанта фитаспазы. Фитаспаза, не имеющая лидерного пептида, не секретируется, оставаясь в клетке, где она формирует некие характерные точки скопления. Мы убедились также, что наблюдаемый внутри клеток сигнал принадлежит полноразмерной «безлидерной» фитаспазе-EGFP-[His]6, а не продуктам ее деградации, использовав анализ клеточного экстракта инфильтрированных тканей N.benthamiana с помощью иммуно-блота с антителами против EGFP. Таким образом, N-концевой гидрофобный пептид в составе профитаспазы действительно является сигнальным пептидом, направляющим секрецию фитаспазы из клетки. 12 8. При индукции ПКС фитаспаза обнаруживается внутри клетки Для изучения локализации фитаспазы во время развития программированной смерти мы продуцировали фитаспазу-EGFP-[His]6 в клетках листьев N. benthamiana. Через 72 часа после инфильтрации в апопласте регистрировался высокий уровень флуоресценции этого белка. Полученные ткани листьев затем подвергали солевому стрессу, индуцирующему ПКС. Из инфильтрированных листовых пластин вырезали диски (диаметром 15 мм), которые затем вакуум-инфильтрировали водным раствором 300 мМ NaCl. После этого инфильтрированные диски помещали в раствор 300 мМ NaCl и инкубировали при постоянном покачивании и освещении при температуре 25°С в течение 6 часов. Затем исследовали локализацию фермента с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. В ходе ПКС наблюдались драматические изменения в локализации фитаспазы-EGFP-[His]6. До индукции ПКС мы видели характерную локализацию фитаспазы-EGFP-[His]6 в тонком слое апопластической жидкости, очерчивающей линию соприкосновения соседствующих клеток (см. Рисунок 10A). Через 6 часов обработки NaCl мы наблюдали концентрирование сигнала флуоресценции внутри клеток в некоторых хаотично распределенных точках (см. Рисунок 10Б). Мы также отметили, что параллельно с появлением фитаспазы внутри апоптотической клетки флуоресценция EGFP уменьшалась на периферии клеток. Контроль (нет ПКС) A 300 мМ NaCl (ПКС) 50 мкМ MV (ПКС) В Б 20 μM Рисунок 10. Перераспределение фитаспазы-EGFP-[His]6 внутрь растительной клетки в ходе развития ПКС. А. Локализация фитаспазы-EGFP-[His]6 в клетках N. benthamiana до индукции ПКС. Б. Перелокализация фитаспазы-EGFP-[His]6 из апопласта внутрь клеток при индукции ПКС с помощью обработки клеток 300 мM NaCl. В. Перелокализация фитаспазы-EGFP-[His]6 из апопласта внутрь клеток при индукции ПКС с помощью обработки клеток 50 мкМ MV. Микрофотографии получены с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии. По схеме, аналогичной обработке NaCl, ПКС была индуцирована с помощью 50 мкМ метилвиологена (methyl viologen, MV) – индуктора окислительного стресса. В этом случае для дисков из листовых пластин производилась вакуумная инфильтрация водным раствором 50 мкМ MV, затем диски инкубировали в течение 24 часов при постоянном покачивании и освещении при 25°С. Анализ полученных образцов с использованием методов конфокальной микроскопии показал, что окислительный стресс, вызванный обработкой MV, также ведет к 13 перераспределению фитаспазы-EGFP-[His]6 внутрь клетки и концентрированию сигнала в некоторых скоплениях (Рисунок 10В). Наблюдаемая при этом фенотипическая картина весьма сходна с наблюдаемой при индукции ПКС обработкой NaCl. Представленные выше данные полностью согласуются с результатами, полученными в ходе нашей совместной работы с группой исследователей из Scottish Crop Research Institute (Великобритания, лаборатория профессора М.Э. Тальянского). Было показано, что рекомбинантный белок, состоящий из фитаспазы и флуоресцентного тэга мономерного красного флуоресцентного белка mRFP, фитаспазы-mRFP, продуцированный в клетках N. tabacum, в норме концентрируется в апопласте. Оценка оптической плотности распределения mRFP показала, что через 24 часа после проведения инфильтрации 95% флуоресценции фитаспазы-mRFP было ассоциировано с внеклеточной жидкостью. Кроме того, фракционирование клеточных компонентов показало, что процессированная форма фитаспазы-mRFP находилась в подавляющем количестве во внеклеточной фракции. В то же время, непроцессированная профитаспаза-mRFP была ассоциирована с внутриклеточной фракцией. В последующие 24 часа наблюдался процессинг и накопление зрелой формы фитаспазы-mRFP в апопласте. Эти результаты согласуются с нашими наблюдениями за локализацией непроцессированной фитаспазы-EGFP-[His]6 и подтверждают заключение о том, что для успешной секреции фитаспазе требуется отщепление продомена. обработки клеток ингибитором секреции брефелдином A фитаспаза После сохраняла внутриклеточную локализацию. Следует отметить, что ингибирование секреции, по всей видимости, не оказало влияния на отщепление продомена фитаспазы-mRFP, так как рекомбинантный белок продолжал переходить из состояния профермента в зрелую форму, что указывало на то, что секреция не важна для нормального процессинга. Также в соответствии с описанными выше результатами, программированная клеточная смерть, индуцированная с помощью обработки 10 мкМ MV или заражения вирусом табачной мозаики, приводила к перераспределению фитаспазы-mRFP внутрь клетки (40-70% общего количества фитаспазы-mRFP детектировалось во внутриклеточной фракции). Таким образом, данные микроскопии, полученные с использованием mRFP и EGFP тэгов и на разных растениях (N. benthamiana и N. tabacum) очень сходны. Это говорит о том, что наблюдаемые эффекты перераспределения флуоресценции внутрь клетки обусловлены собственными свойствами фитаспазы и не зависят от специфического тэга (EGFP или mRFP) или особенности конкретного вида растений. Одним из возможных объяснений механизма перемещения фитаспазы в цитоплазму могло быть то, что индукция ПКС приводит к утрате целостности клеточной плазматической мембраной и, как следствие, внеклеточные белки получают возможность попадать внутрь 14 клетки. Такое объяснение, однако, не согласуется с тем, что разрыв протопласта растительных клеток происходит на конечных стадиях развития ПКС, в то время как фитаспазная активность детектируется внутри клеток уже через один час после индукции ПКС. Кроме того, если бы перемещение фитаспазы было опосредовано неспецифическим смешением внеклеточных и внутриклеточных компонентов, аналогичная морфологическая картина должна была бы наблюдаться при использовании других апопластных белков. Однако было показано, что растительная протеаза катепсин B, также имеющая в норме апопластную локализацию, не перемещается внутрь клетки при индукции ПКС. Поэтому мы рассмотрели два Регистрируемый в других объяснения цитоплазме синтезированному de novo, сигнал наблюдаемой мог фенотипической принадлежать белку картины. фитаспаза-EGFP, но не успевшему переместиться в апопласт вследствие нарушения секреции в ходе развития ПКС. Этому объяснению, однако, противоречит тот факт, что остановка трансляции с помощью циклогексимида не препятствовала накоплению фитаспазы внутри клетки при ПКС. Вторым вариантом объяснения могло быть то, что фитаспаза-EGFP-[His]6, существующая в апопласте в предсинтезированном состоянии, возвращается в клетку во время индукции ПКС. 9. Использование мономерного белка-таймера для наблюдения за перемещением фитаспазы во время ПКС Для того чтобы проверить, способна ли фитаспаза физически перемещаться из апопласта внутрь клетки во время ПКС, мы использовали в виде тэга, присоединенного к С-концу фитаспазы, мономерный флуоресцентный белок-таймер (monomeric fluorescent protein timer, FT). Данный тэг представляет собой флуоресцентный белок, измененный таким образом, что непосредственно после синтеза он флуоресцирует в синем спектре, однако, по прошествии характеристического времени «созревания», спектр его флуоресценции меняется на красный. Схема эксперимента включала несколько стадий: после продукции фитаспазы-FT в клетках N. benthamiana синяя флуоресценция синтезированного de novo фитаспазы-FT должна была локализоваться в апопласте инфильтрированных тканей листьев; по прошествии характеристического времени созревания тэга-таймера в апопласте должен регистрироваться флуоресцентный сигнал в красном спектре, указывающий на то, что во внеклеточной жидкости присутствует часть фитаспазы-FT, которая была синтезирована достаточно давно для того, чтобы успело произойти созревание FT; до индукции ПКС красный сигнал не должен регистрироваться внутри клеток; после индукции ПКС красный флуоресцентный сигнал фитаспазы-FT должен убывать с периферии и перемещаться внутрь клеток. Перемещение красного флуоресцентного сигнала свидетельствовало бы о том, что предсинтезированная фитаспаза, существовавшая в течение характеристического времени созревания таймера, перемещается в клетку из апопласта. При этом наблюдаемый сигнал в 15 красном спектре не будет являться следствием нарушения секреции или транспорта, которое могло произойти в ходе ПКС. Предложенная схема эксперимента имеет ряд ограничений по времени: 1. Промежуток времени между синтезом фитаспазы-FT и ее секрецией в апопласт должен быть существенно меньше, чем характеристическое время созревания FT; в противном случае, красный сигнал FT будет регистрироваться внутри клеток до индукции ПКС и сделает невозможной интерпретацию картины, полученной после индукции ПКС. 2. Время развития признаков ПКС должно быть меньше, чем характеристическое время созревания FT; в противном случае, остановка секреции, которая, возможно, имеет место в ходе ПКС, приведет к тому, что тэг-таймер фитаспазы-FT, остановленной на промежуточных стадиях секреции, созреет и будет регистрироваться как красный флуоресцентный сигнал внутри клеток, и будет не отличим от фитаспазы, переместившейся из апопласта. Мы оценили характеристические временные параметры используемой нами экспериментальной системы с помощью методов флуоресцентной микроскопии. Через 24 часа после инфильтрации листьев N.benthamiana мы наблюдали локализацию фитаспазы-FT в апопласте (синяя форма). Таким образом, секреция фитаспазы-FT занимает меньше 24 часов. Оказалось также, что синяя форма переходит в апопласте в красную форму через 72 часа после инфильтрации. Согласно результатам предыдущих опытов, перемещение фитаспазы-EGFP-[His]6 внутрь погибающих от ПКС клеток происходит уже через 24 часа после обработки 50 мкМ MV, что значительно меньше, чем 72 часа созревания фитаспазы-FT. Таким образом, мы пришли к выводу, что используемая нами система удовлетворяет требованиям, сформулированным выше, и может быть использована для анализа направления перемещения фитаспазы-FT в ходе ПКС. Теперь мы могли исследовать изменения локализации фитаспазы-FT в листьях, происходящие при индукции ПКС. Через 72 часа после инфильтрации, когда мы зарегистрировали переход части фитаспазы-FT в красную форму, из листовых пластин инфильтрированных растений были высечены диски диаметром 15 мм, которые затем были вакуум-инфильтрированы раствором 50 мкМ MV. Через 24 часа мы наблюдали осветление дисков (свидетельство развития ПКС) и провели анализ локализации фитаспазы с помощью методов флуоресцентной микроскопии. Микрофотографии, полученные через 24 часа после индукции программированной смерти клеток инфильтрированных дисков, представлены на Рисунке 11. До индукции ПКС внутри клетки не наблюдалось областей концентрирования красного сигнала. Однако после индукции ПКС происходило перераспределение красного флуоресцентного сигнала из апопласта внутрь погибающей клетки и концентрирование его в некоторых точках. Наблюдаемая картина схожа с морфологическими изменениями в локализации фитаспазы-mRFP и -EGFP при индукции ПКС. Усиление сигнала в красном 16 спектре внутри клетки происходило параллельно с его ослаблением во внеклеточном пространстве, что указывало на то, что происходит перемещение фитаспазы-FT из апопласта в ходе ПКС. Исходя из временных параметров нашей модели, появление участков скопления «красной» формы фитаспазы-FT внутри клетки в ходе ПКС может объясняться только перемещением фитаспазы-FT из апопласта. До индукци ПКС Спустя 24 часа после индукции ПКС A Б Рисунок 11. Белок фитаспаза-FT перемещается из апопласта внутрь погибающей при ПКС клетки N. benthamiana. Микрофотографии, полученные с использованием методов флуоресцентной микроскопии. A. Локализация фитаспазы-FT до индукции ПКС. Б. Перемещение «красной формы» фитаспазы-FT внутрь клетки, погибающей от ПКС, индуцированной обработкой 50 мкМ MV. Пунктиром обозначены границы соприкосновения двух клеток; стрелками обозначено направление сжатия протопласта погибающей клетки. Таким образом, мы получили прямое подтверждение того, что в ходе ПКС происходит перемещение фитаспазы внутрь погибающих клеток. Следует отметить, что из всех использованных методов предложенный вариант с применением флуоресцентного тэга-таймера являлся наиболее «щадящим», так как при этом мы не прибегли к ингибированию фундаментальных физиологических клеточных процессов, таких, как трансляция и секреция. 10. Фитаспаза находится в апопласте в активном состоянии Поскольку в апопласт попадает только процессированная форма фитаспазы, то логично предположить, что во внеклеточной среде фермент находится в активном состоянии. Однако существует возможность, что активность фитаспазы в апопласте подавлена (например, в результате взаимодействия с ингибитором) до индукции ПКС. Чтобы выяснить, активна ли фитаспаза в апопласте, мы использовали необратимый пептидный ингибитор фитаспазы bio-YVAD-CMK (биотинилированный с N-конца тетрапептид YVAD c С-концевой хлорметилкетонной группой), связывающийся с активным центром фермента и модифицирующий каталитический остаток Ser. Если инфильтрированный в листья ингибитор присоединится к ферменту, то это будет означать, что фермент находится в активном состоянии. Мы продуцировали фитаспазу-EGFP-[His]6 в клетках N. benthamiana c помощью агробактериальной инфильтрации. Через 48 часов после проведения инфильтрации, листья 17 были повторно инфильтрированы: в опытном образце – раствором 10 мкМ bio-YVAD-CMK, 300 мМ NaCl; в контрольном образце – раствором 10 мкМ bio-YVAD-CMK. Таким образом, параллельно с обработкой bio-YVAD-CMK в опыте мы индуцировали ПКС с помощью солевого стресса, в то время как в контроле ПКС не была индуцирована. Через 6 часов после индукции ПКС мы наблюдали в опыте характерное для ПКС перемещение фитаспазы-EGFP-[His]6 внутрь клеток. Затем белки из этих листьев были экстрагированы путем кипячения в 6% SDS, фракционированы с помощью электрофореза и исследованы на способность связывать авидин-пероксидазу (то есть на присутствие биотина в составе белка). Поскольку растения обладают широким набором протеаз, некоторые из которых, возможно, также могут связывать bio-YVAD-CMK, мы параллельно провели иммуно-блот со специфическими антителами против EGFP, что позволило нам идентифицировать полосу, соответствующую фитаспазе-EGFP-[His]6. Рисунок 12. Электрофореграмма белков экстракта листьев N. benthamiana, продуцирующих фитаспазу-EGFP-[His]6 и инфильтрированных bio-YVAD-CMK. А. Мембрана окрашена авидинпероксидазой. Полоса, соответствующая фитаспазе-EGFP-[His]6 отмечена красной стрелкой; серой стрелкой обозначена полоса, которой ПКС соответствует клеточный белок, 130 кДа «неспецифически» связывающий авидин-пероксидазу. Б. Мембрана окрашена антителами Авидин-пероксидаза против EGFP. Наложение сигналов от авидин-пероксидазы (панель А) и Б сигнала от специфических антител 130 кДа против EGFP (панель Б) позволяет выявить полосу, соответствующую фитаспазе-EGFP-[His]6, связанную с Anti-EGFP bio-YVAD-CMK. Треки: 1. Экстракт листьев; 2. Экстракт листьев, в которых была индуцирована ПКС посредством обработки 300 мМ NaCl; 3. Экстракт листьев, обработанных bio-YVAD-CMK; 4. Экстракт листьев, обработанных bio-YVAD-CMK, в которых была индуцирована ПКС посредством обработки 300 мМ NaCl. - + 4 -C M +N K +b aC io l -Y VA DCM K 3 -Y VA D 2 +b io +H 2O 1 +N aC l A - + Полученные результаты (Рисунок 12) указывают на то, что, как минимум, часть фитаспазы находится в составе апопласта в активированном состоянии. В треках 3 и 4 на Рисунке 12А наблюдается сильный сигнал от меченной bio-YVAD-CMK фитаспазы-EGFP-[His]6. Это указывает на тот факт, что активный центр фитаспазы доступен для связывания с ингибитором. Количественная оценка степени активности фитаспазы до и после индукции ПКС в настоящее время затруднена по техническим причинам. Однако очевидно, что до индукции ПКС по крайней мере некоторое количество фитаспазы находится в активированном состоянии в апопласте. Это, в свою очередь, позволяет сделать предположение о том, что фитаспаза может также выполнять некоторые физиологические функции в составе апопласта и в отсутствии ПКС. 18 11. Биоинформатический подход к изучению специфичности фитаспазы Подобно каспазам животных, фитаспаза проявляет абсолютную специфичность в отношении остатка аспарагиновой кислоты в положении P1 субстрата (с С-конца которого происходит гидролиз пептидной связи). Для данного утверждения существует несколько оснований, полученных как в этой работе, так и в других работах, выполненных в нашей лаборатории ранее. Во-первых, замена D39A в составе белка GFP-VirD2Ct предотвращает гидролиз фитаспазой. Во-вторых, замены D117A/E в сайте процессинга подавляют автокаталитическое отщепление фитаспазой собственного продомена. Наконец, сравнение синтетических флуорогенных пептидов Ac-VAD-AFC и Ac-VAE-AFC в качестве субстратов показало, что Ac-VAD-AFC является одним из самых удачных субстратов, а Ac-VAE-AFC фитаспазой не гидролизуется. Замена остатка аспарагиновой кислоты на остаток глутаминовой кислоты не меняет заряд в положении P1 и вносит лишь незначительные изменения в геометрию (один атом углерода в цепи бокового радикала). Данное наблюдение позволяет предположить, что активный центр фитаспазы должен иметь определенные строгие структурные элементы, обуславливающие абсолютную аспартатную специфичность фитаспазы. Субстратная специфичность каспаз животных объясняется наличием двух остатков аргинина и остатка глутамина в специфических положениях в полости активного центра, фиксирующей β-карбоксил бокового радикала P1-аспарагиновой кислоты субстрата. Логично было бы предположить, что, по аналогии с каспазами, структура активного центра фитаспазы содержит один или несколько положительно заряженных аминокислотных остатков, которые специфически взаимодействуют с β-карбоксилом аспарагиновой кислоты в положении P1 и позволяют зафиксировать гидролизуемую пептидную связь в идеальной доступности для каталитического Ser537. Недавно группой исследователей из Германии была установлена пространственная структура субтилазы SBT3 томата Solanum lycopersicum (LeSBT3). И, хотя SBT3 не имеет аспартатной специфичности, сравнение аминокислотных последовательностей LeSBT3 и фитаспазы табака показало, что последовательности этих двух белков весьма схожи: глобальное выравнивание их аминокислотных последовательностей имеет параметр идентичности 48.8%. Поскольку фитаспаза табака и LeSBT3 имеют множественные относительно продолжительные консервативные участки гомологии, и, с учетом того, что общее сходство их последовательностей весьма высоко, мы попытались на основании данных о пространственной структуре LeSBT3 создать модель пространственной структуры фитаспазы. Для построения такой модели мы использовали программу MODELLER 9.7. Поскольку мы предполагали использовать полученную модель для поиска отдельных аминокислотных остатков, контактирующих с P1-аспартатом в составе субстрата, нам было 19 необходимо проверить полученную модель на соответствие экспериментальным данным. С помощью программных средств Docking Server мы провели молекулярный докинг двух пептид-альдегидов - Ac-VAD-CHO и Ac-VAE-CHO - в боксе, включающем активный центр фитаспазы. Мы наблюдали, что в результате проведенного докинга пептид-альдегид Ac-VAD-CHO занимает положение в активном центре фермента в конформации, при которой альдегидная группа находится непосредственно напротив каталитического Ser537 (кислород –OH группы радикала серина находится на расстоянии 3.4Å от углерода –СHO группы ингибитора, см. Рисунок 13). В то же время, расположение Ac-VAE-CHO существенно отличается от расположения Ac-VAD-CHO, и альдегидная группа этого соединения находится на значительном расстоянии 11.4Å от гидроксила каталитического остатка серина. Ввиду того, что использованные нами два пептид-альдегида имеют минимальные отличия в структуре, но, тем не менее, только истинный ингибитор располагается в активном центре правильным для ингибирования фермента образом, мы заключили, что полученная нами модель фитаспазы табака описывает структуру активного центра фитаспазы табака достаточно точно для целей дальнейшего анализа. A Б Ac-VAD-CHO ингибитор Asn322 Asn322 Ser537 Ser537 His331 His331 Asp P 1 His220 Asp P 1 Asp149 His220 Asp149 Рисунок 13. Модель молекулы фитаспазы табака с ингибитором Ac-VAD-CHO. A, Б. Проекции модели под двумя углами. Овал акцентирует внимание на области контакта остатка аспарагиновой кислоты в положении P1 ингибитора. Красным шрифтом подписан остаток His331, предположительно принимающий участие в фиксации остатка аспарагиновой кислоты, после которой происходит разрыв пептидной связи в молекуле субстрата. Оранжевым цветом выделены каталитические аминокислотные остатки активного центра фитаспазы, а также His331. Зеленым цветом отмечен ингибитор Ac-VAD-CHO. Синим цветом обозначены атомы азота. Красным цветом обозначены атомы кислорода. 20 На основании результатов докинга Ac-VAD-CHO, мы провели поиск аминокислотных остатков в структуре фитаспазы, контактирующих с β-карбоксилом остатка аспарагиновой кислоты в положении P1. Мы обнаружили, что таким остатком является остаток His331 в составе фитаспазы (см. Рисунок 13). Docking Server предсказывает наличие сильного полярного взаимодействия между β-карбоксилом остатка аспарагиновой кислоты и имидазольным кольцом His331. Участие His331 в узнавании остатка аспарагиновой кислоты в положении P1 субстрата безусловно требует экспериментальной проверки. Проведение такой проверки представляется оправданным, так как остаток гистидина в гомологичном положении встречается в последовательностях как фитаспазы табака, так и фитаспазы риса. В то же время, субтилазы, не обладающие аспартатной специфичностью (например, LeSBT3), имеют иные аминокислотные остатки в гомологичном положении. 12. Модель функционирования фитаспазы в растительной клетке Исходя из полученных нами экспериментальных данных, мы полагаем, что фитаспаза является функциональным аналогом каспаз животных в растениях. Она проявляет строгую аспартатную специфичность, свойственную каспазам, хотя структурно сильно отличается от каспаз. Протеолитическая активность фитаспазы необходима для осуществления ПКС. В ходе совместной работы, проведенной с группой исследователей из Scottish Crop Research Institute, были созданы трансгенные растения N. tabacum, в которых экспрессия фитаспазы в одном случае была повышена за счет введения дополнительных копий гена, а в другом понижена за счет специфической РНК-интерференции гена фитаспазы. Было продемонстрировано, что ПКС, вызванная как биотическими (заражение ВТМ), так и абиотическими (окислительный и осмотический стресс) факторами стресса, значительно усилена в растениях с повышенной активностью фитаспазы (по сравнению с растениями дикого типа) и понижена в сайленсированных растениях. Существенным является тот факт, что продукция рекомбинантной фитаспазы риса восстанавливала дефект в осуществлении ПКС у растений табака с сайленсированным геном фитаспазы. Эти результаты еще раз указывают на участие фитаспазы в осуществлении ПКС, вызванной биотическим и абиотическим стрессами. Перечисленные выше свойства фитаспазы, включая ее уникальную субстратную специфичность и участие в ПКС, вызванной биотическими и абиотическими факторами различной природы, также характерны для каспаз животных. Однако, несмотря на многие общие черты, функционирование фитаспазы в растительных клетках имеет ряд существенных отличий по сравнению с действием каспаз в клетках животных. Каспазы существуют в цитозоле в состоянии предсинтезированных, но неактивных проферментов, и их активация происходит лишь в определенные моменты при условии достаточно сильного и 21 продолжительного проапоптотического сигнала. Таким образом, каспазы находятся в одном и том же клеточном компартменте, что и узнаваемые ими белки-субстраты, но специфический гидролиз субстратов происходит только после индукции апоптоза. В этом отношении растения, по всей видимости, используют несколько иной механизм. Согласно нашим данным, фитаспаза также синтезируется в виде неактивного профермента, однако ее протеолитическая активация происходит конститутивно и не требует индукции ПКС. Несмотря на это, активированная фитаспаза не оказывается в цитозоле, а изолируется от клеточных белков, будучи секретированной во внеклеточную среду апопласта. Таким образом, растительные клетки, вероятно, одновременно решают несколько задач. Во-первых, клетки растений получают возможность постоянно иметь активную форму фитаспазы, готовую к выполнению функций, связанных с развитием ПКС, но изолированную от внутриклеточных субстратов. При абиотическом стрессе или заражении растительные клетки дают возможность фитаспазе проникнуть внутрь клеток и способствовать развитию ПКС (см. Рисунок 14). Клетка растений фитаспаза находится во внеклеточном пространстве (апопласте) фитаспаза пермещается в цитоплазму ткань листа Индукция ПКС Аппарат Гольджи продомен процессированная фитаспаза ядро профитаспаза эндоплазматический рибосома ретикулум Рисунок 14. Транспорт фитаспазы в тканях растения. Во-вторых, возможно, что функция фитаспазы в апопласте не ограничивается лишь проапоптотической. Поскольку фитаспаза является чрезвычайно высоко специфичной «процессирующей» субтилизин-подобной протеазой, в ее отношении разумно провести аналогию с пропротеин конвертазами животных, осуществляющими процессинг пептидных гормонов, и предположить некоторую аналогичную функцию для фитаспазы. В-третьих, 22 растения получают возможность использовать активность фитаспазы для перманентной защиты от патогенного заражения, что чрезвычайно важно для растений, не имеющих клеточной системы иммунитета. Подтверждением этого является тот факт, что мутантный по сайту гидролиза фитаспазой белок VirD2 агробактерии A. tumefaciens способен более эффективно доставлять Т-ДНК в ядро растительных клеток. Таким образом, можно предположить, что фитаспаза является плейотропным растительным ферментом, который обладает при этом функциональными свойствами каспаз животных. Можно ожидать, что дальнейшее изучение фитаспазы позволит уточнить эту модель после того, как будут более подробно изучены механизмы возвращения фитаспазы в клетку в ходе развития ПКС, а также будут найдены новые внеклеточные и внутриклеточные белки-субстраты этого фермента. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 1. Доказано, что кДНК табака N. tabacum, найденная с помощью масс- спектрометрической характеристики фитаспазы табака, кодирует фермент со свойствами и специфичностью фитаспазы табака. 2. Фитаспаза является субтилизин-подобной протеазой растений и обладает характерными особенностями структуры, присущими этому семейству ферментов. 3. Фитаспаза синтезируется в виде белка-предшественника, содержащего продомен. Отщепление продомена при процессинге происходит автокаталитически и в соответствии с аспартатной специфичностью фитаспазы. 4. Отщепление продомена фитаспазы необходимо как для образования протеолитически активного фермента, так и для секреции фитаспазы во внеклеточную среду (апопласт). 5. Фитаспаза локализована в апопласте в здоровых тканях листьев N. tabacum. Секрецию в апопласт направляет N-концевой сигнальный пептид белка-предшественника фитаспазы. Фитаспаза находится в апопласте в активном состоянии. 6. При индукции программированной клеточной смерти, вызванной биотическими и абиотическими стрессами, происходит перемещение фитаспазы внутрь умирающей клетки. 7. Предложена модель активного центра фитаспазы, объясняющая строгую аспартатную специфичность этого фермента. 23 ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ 1. Chichkova N.V., Shaw J., Galiullina R.A., Drury G.E., Tuzhikov A.I., Kim S.H., Kalkum M., Hong T.B., Gorshkova E.N., Torrance L., Vartapetian A.B., Taliansky M. Phytaspase, a relocalisable cell death promoting plant protease with caspase specificity. // The EMBO Journal. – 2010 – V. 29. – P. 1149-1161. 2. Vartapetian A.B., Tuzhikov A.I., Chichkova N.V., Taliansky M., Wolpert T.J. A plant alternative to animal caspases: subtilisin-like proteases. // Cell Death Differentiation. – 2011 – V. 19. – P. 1289-1297. 3. Tuzhikov A.I., Vartapetian B.B., Vartapetian A.B., Chichkova N.V. Abiotic stress-induced programmed cell death in plants: a phytaspase connection. // In: Abiotic Stress Response in Plants - Physiological, Biochemical and Genetic Perspectives, InTech. – 2011 – Ch. 7. – P. 183196. – ISBN: 978-953-307-672-0. 4. Вартапетян А.Б., Галиуллина Р.А., Kim S.H., Тужиков А.И., Тальянский М.Э., Чичкова Н.В. Апоптоз и механизм устойчивости растений к агробактериальной трансформации. // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Россия, Новосибирск. – Сборник тезисов – 2008 –11-15 мая, С. 333. 5. Тужиков А.И., Чичкова Н.В., Вартапетян А.Б. Анализ процессинга фитаспазы – апоптотической протеазы растений. // IV Международная школа по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки». Россия, Звенигород. – Сборник тезисов – 2010 – 29 ноября – 3 декабря, С. 26-27. 6. Chichkova N.V., Tuzhikov A.I., Galiullina R.A., Vartapetian A.B. Proteolytic processing of a phytaspase precursor. // Materials of the 1st International Plant Protease Conference. Sweden, Hemavan. – Abstracts – 2011 – 10-14 April, P. 9. 24
