p53 protein DNA binding domain

реклама
Компьютерный анализ
структуры и эволюции
функциональных сайтов белка
p53
Пинтус С.С.
Руководитель — доцент, к.б.н. В.А. Иванисенко
Цель исследования
Выявление закономерностей структурно-функциональной организации
белка p53 на основе конформационного анализа пространственных структур
мутантных форм белка и определения режимов его эволюции.
Задачи

Разработка метода поиска функциональных сайтов в пространственных структурах
белков

Разработка базы данных пространственных структур функциональных сайтов
белков и их пространственного окружения

Конформационный анализ мутантных форм белка p53, выявление участков белка,
подверженных конформационным изменениям в результате мутаций

Анализ влияния мутаций на структурную организацию функциональных сайтов
белка p53, предсказание вновь возникающих сайтов в мутантных структурах белка

Исследование предрасположенности позиций с различным режимом эволюции к
накоплению мутаций с достоверно различным фенотипическим проявлением

Изучение влияния естественного отбора на эволюционную историю и структуру
белка p53
Повреждение ДНК
Функции p53
+1
апоптоз
Fas, DR5, PERP
+1
p53
Деполяризация
мембран
митохондрий
+1
Waf1, rprm, sfn
gadd45
p53
Цитохром C
APAF-1
p21
остановка
клеточного
цикла
+1
антиангиогенез
tsp1, bai1,
Maspin +1
XPC, DDB2
эксцизионная
репарация
нуклеотидов
P53 и его паралоги
p53
TAD
апоптоз
DBD
OD
остановка
клеточного
цикла
p63
TAD
апоптоз
DBD
OD
SAM
эмбриональное развитие (т.ч. развитие кожи)
p73
TAD
апоптоз
DBD
OD
SAM
гомеостаз, нейрогенез
Белки p63 и p73 способны вызывать остановку клеточного цикла и апоптоз, но
имеют большее значение в эмбриогенезе, чем p53.
P53 и MDM2
Взаимодействия между белком mdm2 (SWIB) и белком p53 (TAD) образуют
отрицательную обратную связь
Связывания ДНК белком p53 (DBD) необходимо для трансактивации его геновмишеней
mdm2
p53
SWIB
TAD
апоптоз
Zn
DBD
остановка
клеточного
цикла
OD
Пространственная
структура мономера
ДНК-связывающего
домена белка
p53
Связывание цинка
необходимо белку
p53 для
связывания ДНК
Мотив связывания ДНК
петля-лист-спираль
Область
связывания
иона цинка
Метод предсказания функциональных сайтов в
пространственных структурах белков
Структурное выравнивание
шаблона с фрагментом белка
шаблон функционального сайта
Потенциальные
функциональные
сайты
(RMSD < 1.8 Å)
База
PDBSite
База
PDB
1
RMSD=
N
∑ 
N
i
2
2
x i −x'i   y i − y'i   z i −z' i 
2
Классификация функциональных сайтов в
базе PDBSite
Группы
функциональных
сайтов
Число специфических
функций в группе
Число сайтов в группе
Каталитические
222
1467
Пострансляционной
модификации
8
55
Связывания ионов
металлов
17
3309
Связывания ионов
неметаллов
9
1716
Связывания
133
органических лигандов
6747
Белок-белковых
взаимодействий
15353
955
Взаимодействий белок- 1324
ДНК
1329
Взаимодействий белок- 752
РНК
755
Связывания
фармацевтических
препаратов
28
Разные
14
–
4481
Алгоритм предсказания новых сайтов в
мутантных формах белка p53
Анализ
молекулярной
динамики
>ID P53_HUMAN
SWISS-MODEL
Предсказание 3D
структур мутантов
PSBSiteScan
Предсказание
функциональных
сайтов, начального
положения лиганда
Предсказанный возникший сайт связывания цинка
в мутантной форме G245C белка p53
Cys 245
Cys 176
Cys 242
Cys 238
His 179
Предсказанный возникший сайт связывания цинка
в мутантной форме G245D белка p53
Asp 245
Cys 176
His 179
Cys 242
Cys 238
Конформационный анализ мутантных форм
белка p53 на основе статистического анализа
траекторий молекулярной динамики
12 траекторий м.д
30 последних
пикосекунд,
Cα атомы
Влияние мутаций на конформационную
подвижность белка p53, свободного от иона
цинка
Замены G245C и G245D
по-разному влияют на
конформацию сайта
связывания ДНК в белке
p53, но одинаково
влияют на ядро белка
LSH, связывание
большой бороздки
ДНК
L3, связывание
малой бороздки ДНК
10
8
6
4
g245c
g245d
2
0
-2
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
Влияние мутаций на конформационную
подвижность комплекса белка p53 с ионом цинка
Связывание иона
цинка частично
компенсирует
влияние замен
G245C и G245D на
сайт связывания
ДНК
Z̃
20
15
10
5
0
-5
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
Различия между долями генеративных и
соматических замен с различным фенотипическим
проявлением, приходящихся на консервативные
кодоны
90
80
70
60
50
генеративные
соматические
40
30
20
10
0
потери
приобретения
доминантно-негативный
Стабилизирующий отбор выраженно действовал против мутантных форм белка
p53 с фенотипическим эффектом приобретения функции
χ2 = 6.17 (p < 0.1, df = 3)
Филогенетическое древо белков p53/p63/p73
p53
p73
p63
Подтвержаются данные, что семейство p53 произошло от общего для группы
семейств предка раньше, чем семейство p73 произошло от предка, общего для
семеиств p63 и p73 (Saccone et al, 2002).
Адаптивная эволюция белка p53
TAD
DBD
6S
35L
38Q
47P
51E
52Q
59G
65R
73V
106S
129A
245G (ω = 0.098)
ω = dN/dS
Адаптивная эволюция белков p63 и p73
p73
p63
Большинство триплетов p63, подверженных движущему отбору, кодируют
аминокислотные остатки, входящие в гибкие линкеры, которые соединяют
более жесткие структурные элементы белка.
Основные результаты
Разработан метод анализа конформационных различий между мутантными и

нормальной формой белка, основанный на методе молекулярной динамики и
статистическом анализе траекторий молекулярной динамики с помощью Zстатистики. Метод позволяет
оценивать
влияние мутаций на
конформацию
отдаленных участков белков.
Предположено возникновение нового потенциального сайта связывания катиона

цинка в мутантной форме белка p53 человека, соответствующей аминокислотной
замене G245С. Связывание иона цинка новым сайтом, обеспечивает уменьшение
конформационных различий ДНК-связывающего мотива в мутантной и нормальной
форме белка p53
Получены свидетельства этапов движущего отбора в эволюционной истории

семейства p53. Установлено выраженное действие стабилизирующего отбора
против мутантных форм белка p53 с фенотипическим эффектом приобретения
функции
Выводы
1.Разработан метод поиска функциональных сайтов в третичных структурах
белков на основе генетического алгоритма и структурного выравнивания сайтов
из базы данных PDBSite, включающих в себя активные центры ферментов, сайты
связывания ионов металлов, низкомолекулярных соединений, белков, РНК, ДНК,
сайты посттрансляционной модификации с исследуемым белком. Разработан метод
автоматической
классификации
функциональных
сайтов,
с
использованием
которого проведена классификация сайтов в базе данных PDBSite.
2.Разработан метод анализа конформационных различий между мутантными и
нормальной формой белка, основанный на методе молекулярной динамики и
статистическом анализе траекторий молекулярной динамики с помощью Zстатистики. Метод позволяет
оценивать
влияние мутаций на
конформацию
отдаленных участков белков.
3.С помощью разработанных методов предсказано возникновение нового сайта
связывания иона цинка в результате мутаций, затрагивающих аминокислоту G245
(G245C, G245D) в белке p53, ассоциируемых с синдромом Ли-Фраумени и рядом
других опухолевых заболеваний. Новый сайт располагается в непосредственной
близости от нормального цинк-связывающего сайта и, предположительно, может
конкурировать с ним за связывание иона цинка — аллостерического регулятора
связывания ДНК белком p53.
Выводы (продолжение)
4.Показано, что наибольшему влиянию замен G245C и G245D подвержена конформация
удаленных участков белка, располагающихся в ядре домена связывания ДНК и таким
образом, существенных для конформационных свойств этого домена в целом. Также
показано,
что
связывание
иона
цинка
новым
сайтом,
обеспечивает
уменьшение
конформационных различий ДНК-связывающего мотива в мутантной и нормальной форме
белка p53, что служит дополнительным свидетельством функциональности нового сайта.
5.Обнаружены события движущего отбора в эволюционной истории родственных семейств
белков p53, p63 и p73, на стадии дивергенции происхождения тетрапод, амниот, синапсид и
высших млекопитающих. Впервые обнаружено, что в белке p53 движущему отбору
подвергались кодоны, соответствующие аминокислотным остаткам S106 и A129, важным для
функциональных перестроек конформации при взаимодействии белка p53 c ДНК.
6.В
результате
сравнительного
анализа
частот
различных
аминокислотных
замен,
приходящихся на кодоны с различными режимами отбора, установлено, что наиболее
жесткий стабилизирующий отбор направлен против мутаций с так называемым доминантнонегативным эффектом.
Публикации по теме диссертации
5 статей в рецензируемых журналах, 4 из них в журналах ВАК, 2 публикации в
монографиях
Ivanisenko V.A., Pintus S.S., Grigorovich D.A., Kolchanov N.A. PDBSiteScan:
a program for search of the active, binding and posttranslational modification sites in
the 3D structures of proteins // Nucleic Acids Research. 2004. V.32. P.W549-W554.
Ivanisenko V.A., Pintus S.S., Grigorovich D.A., Kolchanov N.A. PDBSite: a
database of the 3D structure of protein functional sites // Nucleic Acids Research.
2005. V.33. P.D1-D5.
Пинтус С.С., Фомин Э.С., Иванисенко В.А., Колчанов Н.А.
Филогенетический анализ семейства p53 // Биофизика. 2006. Т.51. С.640-649.
Pintus SS, Fomin ES, Oshurkov I, Ivanisenko VA. Phylogenetic analysis of the
p53 and p63/p73 gene families. In Silico Biology. 2007 7(3):319-332
Пинтус С.С. Коэволюция доменов ключевых белков апоптоза p53 и mdm2
// Информационный вестник ВОГиС. 2009. Т.13. №1 C.128-136.
По результатам работы были сделаны устные доклады на 3-х конференциях:
BGRS (Новосибирск)
Третий съезд биофизиков России (Воронеж)
MCCMB (Москва)
Скачать