Молекулярный дизайн ингибиторов серин

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова
ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
Молекулярный дизайн ингибиторов
серин-треониновых протеинкиназ
Mycobacterium tuberculosis
Михайлова Е.Б., Осолодкин Д.И., Палюлин В.А., Зефиров Н.С.
Статистические данные
В 2011 году 2 млрд. человек являлись носителями Mycobacterium tuberculosis;
14 млн. человек больны туберкулёзом
Динамика развития туберкулёза
с множественной лекарственной
устойчивостью
Уровень заболеваемости туберкулёзом
в мире по данным ВОЗ, 2010 год.
Микрофотография Mycobacterium tuberculosis
Источник Step'n'Run Medics
Цель работы
●
Моделирование по гомологии пространственной структуры
серин-треониновых протеинкиназ Mycobacterium tuberculosis
(Mtb) PknA, PknD, PknE, PknF, PknH, PknI, PknJ, PknK, PknL;
●
Поиск ингибиторов серин-треониновых протеинкиназ Mtb с
помощью виртуального скрининга библиотек низкомолекулярных
органических соединений методом докинга;
●
Валидация системы виртуального скрининга на основе
известных ингибиторов PknB и результатов испытаний in vitro.
●
Структурный анализ областей связывания АТФ моделей и их
сравнение с шаблонными структурами для выявления
структурных особенностей областей связывания, важных для
дизайна селективных ингибиторов.
Шаблонные структуры PknB
Код
доступа в
PDB
Структура
Описание
1O6Y
Активная форма каталитического домена в комплексе
с AMPPCP
3F61
Структура с мутациями Leu33Asp и Val222Asp.
Активная форма домена в комплексе с ADP
3F69
Цепи А, В. Структура с мутациями Leu33Asp,Met145Leu и
Met155Val. Активная форма домена в комплексе с KT5720
2FUM
Цепи A, B, C, D. Активная форма домена в комплексе с
митоксантроном
1MRU
Цепи А, B. Активная форма каталитического домена в
комплексе с аденозин-5'-(3-тиотрифосфатом)
Множественное выравнивание аминокислотных
последовательностей
sp|3F61_A|
sp|2FUM_C|
sp|1O6Y_A|
sp|1MRU_B|
sp|1MRU_A|
sp|3F69_A|
sp|3F69_B|
sp|2FUM_D|
sp|P65726|
MTTPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRDHRDVAVKVLRAD LARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAETP-AGPLPYIVMEYVDGVTLRDIV
- -TPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLHRDVAVKVLRAD LARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAETP-AGPLPYIVMEYVDGVTLRDIV
- -TPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLHRDVAVKVLRAD LARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAETP-AGPLPYIVMEYVDGVTLRDIV
MTTPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLHRDVAVKVLRAD LARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAETP-AGPLPYIVMEYVDGVTLRDIV
- -TPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLHRDVAVKVLRAD LARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAETP-AGPLPYIVMEYVDGVTLRDIV
- -TPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRDHRDVAVKVLRAD LARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAETP-AGPLPYIVMEYVDGVTLRDIV
- TTPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRDHRDVAVKVLRAD LARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAETP-AGPLPYIVMEYVDGVTLRDIV
- -TPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLHRDVAVKVLRAD LARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAETP-AGPLPYIVMEYVDGVTLRDIV
PRVGVTLSGRYRLQRLIATGGMGQVWEAVDNRLGRRVAVKVLKSE FSSDPEFIERFRAEARTTAMLNHPGIASVHDYGESQMNGEGRTAYLVMELVNGEPLNSVL
sp|3F61_A|
sp|2FUM_C|
sp|1O6Y_A|
sp|1MRU_B|
sp|1MRU_A|
sp|3F69_A|
sp|3F69_B|
sp|2FUM_D|
sp|P65726|
HTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQNGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIA---HTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQNGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDF------HTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQNGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIARAIHTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQNGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIARAIT
HTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQNGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIARAIT
HTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQNGIIHRDVKPANILISATNAVKVVDFGIARAIT
HTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQNGIIHRDVKPANILISATNAVKVVDFGIARAIA
HTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQNGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIIG--KRTGRLSLRHALDMLEQTGRALQIAHAAGLVHRDVKPGNILITPTGQVKITDFGIAKAVD
sp|3F61_A|
sp|2FUM_C|
sp|1O6Y_A|
sp|1MRU_B|
sp|1MRU_A|
sp|3F69_A|
sp|3F69_B|
sp|2FUM_D|
sp|P65726|
-------------AQYLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPDSVAY
-------------AQYLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAY
-------------AQYLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAY
-------------AQYLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAY
-------------AQYLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAY
-------------AQYLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAY
DSGNSVX-QTIGTAQYLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAY
------------TAQYLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAY
AAPVTQTGMVMGTAQYIAPEQALGHDASPASDVYSLGVVGYEAVSGKRPFAGDGALTVAM
sp|3F61_A|
sp|2FUM_C|
sp|1O6Y_A|
sp|1MRU_B|
sp|1MRU_A|
sp|3F69_A|
sp|3F69_B|
sp|2FUM_D|
sp|P65726|
QHVREDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEPPEAPK
QHVREDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHN-------QHVREDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHN-------QHVREDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEPPEAPK
QHVREDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEPPEAPK
QHVREDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEPPEAPK
QHVREDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEPPEAPK
QHVREDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVH--------KHIKE---PPPPLPPDLPPNVRELIEITLVKNPAMRYRSGGPFADAVAAVRAGRRPPRPS
Выравнивание выполнялось в программе ClustalW2.
PknA
Модели серин-треониновых протеинкиназ Mtb
- выполнено моделирование по гомологии в программе Modeller9.11;
- для каждой протеинкиназы построено 100 моделей
PknA
PknD
PknE
PknF
PknH
PknI
PknJ
PknK
PknL
Оценка качества моделей
Структура
Длина
последователь
ности
z-score
1O6Y
256
-7,38
-25555,193
1MRU A/B
269/271
-7,09/-6,71
-6,95
-26769,912
3F69 A/B
274/283
-7.41/-7,09
PknI
-5,23
-25229,514
PknJ
-5,49
-26335,998
2FUM C/D
254/258
-6.83/-7.26
PknK
-6,75
-27422,223
PknL
-6,32
-26613,566
3F61
267
-6,98
Модель
z-score
DOPE
PknA
-5,88
-25034,211
PknD
-6,83
-26162,984
PknE
-6,78
-26008,609
PknF
-6,67
PknH
Анализ стереохимической корректности моделей:
ψ
-180
PknE
φ
180
ψ
-180
PknI
φ
180
-180
PknL
φ
180
Виртуальный скрининг
- библиотека ИОГен РАН: 594 соединения;
- библиотека лаб. органического синтеза ХФ МГУ: 72 соединения;
- библиотека ИОХ: 150 000 соединений;
- библиотека Kinase SARfari compound data (ChEMBL)
- проведен докинг потенциальных ингибиторов PknB и PknG в программе
FRED 2.2.5;
Подготовка: генерация конформеров и энантиомеров
в OMEGA, протонирование и таутомеризация в QUACPAC
Кристаллические структуры PDB: 1O6Y (PknB) и 2PZI (PknG)
Ограничение на связь с Val95 в качестве акцептора
- проведен виртуальный скрининг потенциальных ингибиторов PknA, PknD, PknE,
PknF, PknH, PknI, PknJ, PknK, PknL в программе FRED 3.2;
- отбор оптимальных структур проводился на основе значений оценочных
функций и визуального анализа в программе VIDA 4.2.1;
- проведены биологические испытания потенциальных ингибиторов PknB и PknG
Тестирование in vitro ингибиторов PknB
Отобрано для испытаний in vitro:
Библиотека ИОГен: 26 соединений
Библиотека лаб. OC ХФ МГУ: 15 соединений
Библиотека ИОХ: 35 соединений
Glu93
Tyr94
Val95
А4402/0187911
Chemgauss3
-78.2013
Glu93
IC50 = (55 ± 1.8) мкМ
Tyr94
Val95
A4304/0183694
Chemgauss3
-80.1253
IC50 = (50 ± 1.2) мкМ
Glu93
Стандарт: Митоксантрон
IC50 = (27 ± 2.0) мкМ
Tyr94
Val95
Валидация системы виртуального
скрининга ингибиторов PknB
●
Построение ROC-кривых в программе StAR.
- 44 истинных лиганда
- 472 ложных лигандов
Функция
Oechemscore
Chemscore
Chemgauss3
PLP
Screenscore
Shapegauss
AUC
0,7172
0,6866
0,6866
0,6423
0,6115
0,5476
Потенциальные ингибиторы PknG
Отобранo для испытаний in vitro:
Библиотека ИОГен: 14 соединений
Библиотека лаб. OC ХФ МГУ: 13 соединений
Библиотека ИОХ: 26 соединений
ИОХ: А1253/0057275
Chemgauss3: -83,6567
Библиотека лаб. ОС ХФ МГУ: 151
Chemgauss3: -62,9403
Chemscore: -17,1880
ИОГен: K-4
Chemgauss3: -68,4762
Kinase SARfari compound database (ChEMBL)
53 966
структур
Фильтрация (Sybyl-X)
11 676
Докинг (FRED 3.2)
структур
45 потенциальных ингибиторов
всех киназ
Хит-лист 1000
для каждой киназы
Потенциальные селективные
ингибиторы
Киназа
Кол-во
структ.
PknA
2
PknD
7
PknE
8
PknF
3
PknH
2
PknI
2
PknJ
2
PknK
9
PknL
3
Lys93
Ингибитор PknK: 1275913
Glu92
Ингибитор PknL: 253856
Выводы
●
Смоделированы по гомологии и оптимизированы пространственные
структуры серин-треониновых протеинкиназ Mtb PknA, PknD, PknE, PknF,
PknH, PknI, PknJ, PknK и PknL;
●
Доказана стереохимическая корректность построенных моделей;
●
С помощью виртуального скрининга и результатов биологических
испытаний обнаружен новых класс соединений - ингибиторов PknB;
●
На основе структурного анализа АТФ-связывающих областей найдены
структуры селективных и общих потенциальных ингибиторов
смоделированных киназ;
●
Проведена валидация системы виртуального скрининга на основе
известных ингибиторов PknB.
Благодарность
●
●
●
Жуковой Ю.Н., Беккер О.Б., Тютюнник Л.Л. и
Даниленко В.Н. из Института общей генетики им. Н.И.
Вавилова РАН за предоставленные соединения и
проведение биологических испытаний;
Институту органической химии им. Н.Д. Зелинского за
предоставленные соединения;
Мочалову С.С. из лаборатории органического синтеза ХФ
МГУ имени М.В. Ломоносова за предоставленные
соединения.