Получение и свойства химотрипсина и трипсина, меченных

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича
Архив журнала
Вопросы медицинской химии
ISSN 0042-8809
1985
Внимание! Распознавание текста проведено в автоматическом режиме для
облегчения работы поисковых систем. Будьте внимательны при
копировании,
возможны
ошибки
и
неточности.
Используйте
сканированный графический вариант.
Archive of journal
Voprosy meditsinskoi khimii
ISSN 0042-8809
1985
Attention! OCR has been performed automatically for search engines only.
Be careful when copying, errors are possible. Use scanned picture as standard.
http://pbmc.ibmc.msk.ru
(c) Orekhovich Institute of Biomedical Chemistry of the Russian Academy of Medical Sciences
ВОПРОСЫ
ХИМИИ
Медицинской
У/1. К 615.355:577.152.34 1.033.07
В.
/ / . Куликов,
В.
В. Коршунов,
в . / 7 . Сорокин,
Н.
К. Трифоненкова,
Д . /5. С е д о я
П О Л У Ч Е Н И Е И СВОЙСТВА ХИМОТРИПСИНА
М Е Ч Е Н Н Ы Х РАДИОИЗОТОПАМИ
Т.
Л.
Баженова,
И ТРИПСИНА,
ЙОДА
И н с т и т у т б и о ф и з и к и М и н з д р а в а С С С Р , Н И И но б и о л о г и ч е с к и м и с п ы т а н и я м химичес к и х соединений М и н и с т е р с т в а м е д и ц и н с к о й п р о м ы ш л е н н о с т и СССР
98
Удельная радиоактивность.
Бк '.мг • 1 О 7
Чистота, %
(±2%)
Выход, % (±3%)
Соотношение
йод белок
Фермент
Мст о д и к а
Ф е р м е нт и ы е и реп а р ат ы, соде р ж а щи е
протеиназы и, в частности химотрипсии
В работе и с п о л ь з о в а н ы с л е д у ю щ и е преи три пси и, широко применяют в меди- п а р а т ы : т р и п с и н и х и м о т р и п с и и [3], ингибицинской практике для лечения различ- тор п р о т е и п а з т р а з и л о л ( Ф Р Г ) , д е н а т у р и р о ванный г е м о г л о б и н л о ш а д и («Reanal», В Н Р ) .
ных заболеваний 111.
О п т и ч е с к и е и з м е р е н и я п р о в о д и л и с помощьюД л я эффективного использования фер- спектрофотометра P a y U n i c a m SP-1800 (Анментных препаратов необходимо знание г л и я ) в к ю в е т а х т о л щ и н о й 10 мм. Все р е а к осо бе и 11 осте й их фа р м а к о к и и ет и к и п р и тивы имели к в а л и ф и к а ц и ю х. ч. или ч. д. а .
использовали иотеициоразличных способах введения. Наиболее Д л я й о д и р о в а н и я
стат П-5247 М, р Н р а с т в о р о в и з м е р я л и поценную информацию можно получить с т е и ц и о м е т р и ч е с к и с точностью ± 0 , 0 2 . Э л е к помощью ферментов, меченных радио- т р о ф о р е з на бумаге F N - 4 проводили е поизотопом
^-излучателем. Д л я белков м о щ ь ю прибора П В Э Ф - 1 в боратном буфертакими радиоактивными маркерами яв- ном р а с т в о р е р Н 8 , 5 при 250 В в т е ч е н и е
45 мим. Г а з о ж и д к о с т н у ю
хроматографию
ляются радионуклиды ,25 1 и m I . Однако
о с у щ е с т в л я л и на х р о м а т о г р а ф е Р а у - 2 0 4 (Анпроцесс введения радиоизотопов йода в г л и я ) ; н о с и т е л ь - х р о м о с о р б S с 3 % к а р б о белки, в том числе и в ферменты, сопро- р а м о в о г о к а у ч у к а . Т е м п е р а т у р а 170 "С, скорости тока г е л и я 65 м л / м и н .
вождается часто побочными реакциями,
П - и и т р о ф е и и л а ц е т а т -— т. пл. 7 8 , 5 — 7 9 , 5 °С
что выражается в изменении специфиче- (из х л о р о ф о р м а ) . % С - 52,65; % И — 3, 85;
ск и х биологических свойств йодируе- % N — 8 , 3 9 , C 8 H 7 O N Rf 0,74 на с и л у ф о л е ;
мых биополимеров 161.
подвижная
фаза - х л о р о ф о р м — г е к с а и 2:1;
е к у л я р н а я э к с т и н к ц и я при 420 им Ранее 18 101 была отмечена сущест- м17о л000.
В р е м я в ы х о д а пика при г а з о ж и д к о с т венная инактивация химотрипсина и
ном
х р о м а т о г р а ф и р о в а и и и — 4 мин 25 с.
'трипсина после введения в них радиоГ ель-фильтрация.
Х и м о т р и п с и и , трипсин
изотопов йода химическим йодированием и т р а з и л о л , и с п о л ь з о в а н н ы е в работе, были
с использованием в качестве окислите- г о м о г е н н ы , по д а н н ы м г е л ь - ф и л ь т р а ц и и на
с е ф а д е к с е G-50
( г л и ц и н о в ы й буфер р Н 3 , 0
лей монохлористого йода или хлорами- д л я т р и п с и н а и фосфатный буфер р Н 6,9 д л я
на Т. Применение более слабых окислих и м о т р и п с и н а и т р а з и л о л а).
О б р а з ц ы фертелей, например молекулярного йода
Условия йодирования и характеристики химо1101, приводит к меньшей инактивации
трипсина и трипсина, меченных '-'Т
химотрипсина.
Поскольку в кровяном русле указанные ферменты образуют специфические
Способ
комплексы с ингибиторами 151, инактийодировап ии
вация фермента после его йодирования
существенно изменяет его фармакокинети ку. Поэтому получение меченных раХимоIC1
2 : 1 5 1 98
2, 3
диоизотопами йода ферментов без их
трипсии ЭлектрохимическиЙ
8 2 97
3, 7
с у ii ;ест ве и но й и \ i а кт и в а ци и
я в л яетс я
IC1
4 : 1 3 7 90
1 ,0
Электрохимичсважным этапом па пути изучения фарс к И1 i
97
05
2, 7
IC1
8 : 1 35
97 1 , 0
макоки нетики ферментных лекарственЭлектрохимический
6 0 98
2,8
ных средств. Настоящая работа посвя1 G : 1 30
IC1
96
1 .3
щена получению и сравнительному изу1C1
Трипсин
2 : 1 27
97
1 .2
чению трипсина и химотрипсина, меЭлектрохимический
0 0 98
4 . 0'
ченных радиоизотопами йода, реакцией
IC1
96
4 : 1 32
1 ,3
Электрохим ичсйодирования с помощью монохлористого
CK IIII
97
77
3, 7
8 : 1 38
IC1
90
1 ,7
й од а 1121 и э л е кт р о х и м и чес к и в п оте и Электрохимичес
к
и
й
0
2
98
1,5
циостатическом режиме 161.
1С 1
10:1 2 5 9 7
1 . 1
Рис. I. С о п о с т а в л е н и е р е з у л ь т а т о в он редело"
иия р а д и о х и м и ч е с к о г о выхода й о д и р о в а н н ы х
ф е р м е н т о в х и м о т р и п с и н а (Л) и т р и п с и н а (Б)
с п е к т р о ф о т о м е т р и ч е с к и м ( к р у ж о ч к и ) и радиохимическим
(квадратики)
методами.
Пунктирная линия
электрохимическое
йодиро"
мание, с п л о ш н а я
- д е й с т в и е м о н о х л о р и с т о г о йодаЗ д е с ь и на рис. 2 по оси а б с ц и с с
к о л и ч е с т в о йоди"
р у ю щ е г о агента в р е а к ц и о н н о й смеси (в м о л я х на
I м о л ь ф е р м е н т а ) . По оси о р д и н а т • ч и с л о г - а т о м о в
йода, с в я з а в ш е г о с я с м о л е к у л о й ф е р м е н т а .
ментов и ингибиторов с о д е р ж а л и не более
5- 7 % н и з к о м о л е к у л я р н ы х
примесей.
Йодирование
химотрипсина
и
трипсина.
Йодирование
препаратов
проводили с пом о щ ь ю м о и о х л о р и с т о г о йода | 12| и в э л е к т р о химической я ч е й к е [6] при р а з л и ч н ы х соотнош е н и я х й о д / б е л о к . Д л я одного й о д и р о в а н и я
использовали 18,5±3,7 МБк радионуклидов
125
1 или ш 1 . Р а д и о х и м и ч е с к и й выход определ я л и методом э л е к т р о ф о р е з а на бумаге | 4 | ,
химический
выход — спектрофотометрически по р е з у л ь т а т а м о п р е д е л е н и я мопо- и
д и й о д т и р о з и н о в ( М И Т и Д И Т ) в йодированных ф е р м е н т а х [2]. О ч и с т к у от и о н н ы х форм
йода, не с в я з а н н ы х с б е л к о м ,
осуществляли
методом г е л ь - ф и л ь т р а ц и и на с е ф а д е к с е G-15.
Р е з у л ь т а т ы п р е д с т а в л е н ы в т а б л и ц е и на
р и с. 1 и 2.
Титрование
активных
центров
протеипаи.
Т и т р о в а н и е п р о в о д и л и спектрофотометр и ч е с к и с помощью п - п и т р о ф е п и л а ц е т а т а по
о п и с а н н о й ранее
методике [ I ] .
Результаты
п р е д с т а в л е н ы на рис. 3.
Протео штическая
активность
ферментов. Этот п о к а з а т е л ь о п р е д е л я л и по методу
Анфинсена [7|, и с п о л ь з у я в к а ч е с т в е субстрата
денатурированный
гемоглобин л о щ а д и . Рез у л ь т а т ы п р е д с т а в л е н ы па рис. 4.
2
6
Ю
14
2
6
10
14
Рис. 2. Н а к о п л е н и е М И Т ( к р у ж о ч к и ) и Д И Т
( к в а д р а т и к и ) в процессе й о д и р о в а н и я ферментов х и м о т р и п с и н а (Л) и т р и п с и н а
(В)
электрохимическим
(пунктирная
линия)
и
химическим (сплошная линия)
способами.
Рис. 3. Р е з у л ь т а т ы т и т р о в а н и я а к т и в н ы х центров й о д и р о в а н и я ферментов
химотрипсина (Л), т р и п с и н а ( Б ) , п - п и т р о ф е п и л а ц е т а т о м .
Ферменты п о л у ч е н ы э л е к т р о х и м и ч е с к и м
йодированием (пунктирная линия) и действием
монохлор и с т о г о йода ( с п л о ш н а я л и н и я ) . П о оси а б с ц и с с
с у м м а р н о е с о д е р ж а н и е моно- и д и й о д т и р о з и и о н (в*
м о л я х на I м о л ь ф е р м е н т а ) , по оси о р д и н а т
число»,
т и т р у е м ы х а к т и в н ы х ц е н т р о в ф е р м е н т о в (в % к
числу
активных
центров
иптактиого
фермента)
Р е з у л ь т а т ы и о б с у ж д е и и cv
Как видно из данных, представленных
в таблице и на рис. 1 и 2, электрохимии
ческое йодирование приводило к более
в ы со к и м р ад и ох и м и ческ и м вы х ода м. X бг
рошее совпадение результатов опреде*ления радиохимического выхода радио;химическим и сие ктрофотометр и ческ и м
методами (см. рис. 1) свидетельствует о
том, что йод связывался исключительно
с остатками тирозина. Однако более низг
кие величины радиохимического выхода
при действии монохлористого йода указывают па возможность расходования
этого соединения на окисление белковой
молекулы. Подтверждением этому , мо*
гут служить обнаруженные различия i*
Р и с . 4. З а в и с и м о с т ь п р о т е о л и т и ч е с к о й а к т и в ности й о д и р о в а н н ы х ф е р м е н т о в :
химотрипсина (Л) и т р и п с и н а ( Б ) от к о л и ч е с т в а йодир о в а н н ы х о с т а т к о в т и р о з и н а в ф е р м е н т е при
электрохимическом
(пунктирная
линия)
и
химическом (сплошная линия)
йодировании.
По оси а б с ц и с с — М И Т и Д И Т в й о д и р о в а н н о м ф е р менте (в м о л я х на I моль), по оси о р д и н а т
протеолитическая активность йодированных ферментов
(в % от т а к о в о й и п т а к т и о г о ф е р м е н т а ) .
99
Л И Т Е Р А Т УРА
накоплениях МИТ и Д И Т в процессе
йодирования (см. рис. 2). При электро1. Вольф М.у Рансбергер
К• Л е ч е н и е ферхимическом йодировании преимущестментами. М., 1976.
венно йодировались два тирезиновых
2. Климова Т. П.,
Кулаков В. / / . ,
Станка В. И. и д р . — S t u d . B i o p h y s . , 1973,
остатка; при этом увеличению содержаvol. 38,
p.
235—239.
ния Д И Т соот ветст во в а л о п р о п ор цио3. Машковский
H. Д. Л е к а р с т в е н н ы е среднальное уменьшение содержания МИТ,
ства. М., 1977, т. 2, с. 20 -22.
а при химическом йодировании коли4. Можайский
А. М., Кулаков В. / / . , Станка В. И. — Iso top en p r a x i s , 7, 1971, S. 17
чества МИТ и Д И Т увеличивались про20.
п op I шона л ьно воз р аста 11 и ю ко н цег ггр а5. Мосолов
В. В., П р о т е о л и т и ч е с к и е ферции монохлористого йода.
менты. М., 1971, с. 2 7 6 — 2 0 0 .
Результаты определения ферментатив6. Станко В. /7., Кулаков
В. / / . , Моо/сайский
А. М. — I s o t o p e n p r o x i s , 9, 1973,
ной активности (см. рис. 3 и 4) свидетельS. 260.
ствуют о преимуществе электрохимиче7. Anf insert С. В.} Sela
М.,
Т г itch / / .
ского метода йодирования по сравнению
Arch. B i o c h e m . , 1956, vol. 65, p. 156—167.
с химическим методом (монохлористый
8. Duhe S. /(., R oho It О. Л., Pressman
D.
J . bio I. C h e m . , 1964, vol. 239, p. 1809
йод). Характерно, что йодирование пер1817.
вых двух ти роз и новых остатков не из9. Dube S. /(., Roholt О. A., Pressman
D.
меняло существенно ферментативную акI b i d . , 1966, vol. 241, p. 4 6 6 5 — 4 6 7 3 .
ти в иость фер ментов. Рез кое си и же н и е 10. Glasser A. M . , Sager F.— B i o c h e m . J . ,
1956, vol. 62, p. 135—146.
активности наблюдалось при йодирова11. Hartley B. S.y Kilby B. A.
I b i d . , 1954,
нии третьего и последующих тирозииоvol. 56, p. 288—295.
вых остатков. Последние либо прини12. McFarlane
A. S.
I b i d . , 1956, vol. 62,
мают непосредственное участие в форp. 135—146.
мировании активных центров ферментов
13. Sieiner R. F.
I b i d . , 1966, p. 1964 —1974.
(например, тирозии-94 в молекуле хиПоступила 04.06.84
мотрипсипа), либо их йодирование сопровождалось конформационными изменениями всей белковой молекулы в реISOLATION AND P R O P E R T I E S OP CHYзультате увеличения отрицательного заMOTRYPS1N AND T R Y P S I N
LABELLED
ряда ферментов ( р К а тирозина — 10,12;
WIT H IODINE
R A D I O ! SO T O P E S
МИТ
8,2; Д И Т - 6 , 8 ) .
V. N. Kulakov,
V. B. Korshuncv,
N. K. TrifoТаким образом, сравнительное изуnenkova,
T. L. Bazhenova,
V. P.
Sorokin,
I/. I/. Sedou
чение свойств химотрипсина и трипсина,
меченных радиоизотопами йода, показыI n s t i t u t e of B i o p h y s i c s , M i n i s t r y of P u b l i c
вает, что химический метод йодирования
H e a l t h of t h e U S S R , I n s t i t u t e for B i o l o g i c a l
неприменим дл я п о л у че н и я мечен ы х фе р - T e s t i n g of C h e m i c a l C o m p o u n d s , M i n i s t r y of
Medical I n d u s t r y of the U S S R , Moscow
ментов, а фармакокинетические исследования, выполненные с помощью таких
chymotрадиоизотопных и иди каторов,
нельзя r y p sCi no mapnadr attriyvpes isnt uwd ya s ofc a iror ideidn aot iuotn uof
sing either
считать достоверными.
i o d i n e m o n o c h l o r i d e or t h e e l e c t r o c h e m i c a l
Электрохимическое йодирование в поp r o c e d u r e u n d e r c o n d i t i o n s of c o n t r o l l e d anoтенциостатических условиях позволяло de p o t e n t i a l . It w a s s h o w n t h a t a p a r t of iodine m o n o c h l o r i d e w a s c o n s u m e d for o x i d a t i o n
получать меченные радиоизотопами йода of
p r o t e i n m o l e c u l e s . As a r e s u l t of t h i s process
химотрипсин и трипсин с ферментативной s p e c i f i c a c t i v i t y of t h e e n z y m e s w a s decreased
активностью, не отличающейся практиdown to 50-60% of t h e i n i t i a l a c t i v i t y a f t e r
i n t r o d u c t i o n of 2 a t o m s of i o d i n e per a moleчески от таковой иитактных ферментов.
s i m i l a r degree of i o d i n a t i o n u n d e r
Полученные указанным способом мече- cmuilled. cThe
o n d i t i o n s of e l e c t r o l y s i s in p o t e n t i o s t a ные ферментные препараты могут быть tic e x p e r i m e n t s c a u s e d c o n s e d c r a b l y lower
использованы для различных медикоdecrease in t h e e n z y m a t i c a c t i v i t y , r e a c h i n g
биологических исследований, в том числе 5 - 1 0 % of t h e i n i t i a l a c t i v i t y ( a f t e r i n t r o d u c t i o n
п р и изучен и и с| >а р м а ко ко к и i г ет и к и фер - of I a t o m of i o d i n e per a m o l e c u l e — 2 - 5 % ) ;
l a b e l l i n g of t r y p s i n a n d c h y m o t r y p s i n by meментных препаратов в условиях экспеa n s of i o d i n e r a d i o n u c l i d e s is p r o m i s i n g for
римента.
various medico-biological purposes.