К вопросу изучения перекисного окисления липидов

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
природопользования, в т.ч. повышения степени
эксплуатации климатических условий и ресурсов.
За отчётный период подготовлены общие
положения по разделу проекта, включающие:
– формулирование актуальности, цели и задач, выявление объекта и предмета исследования;
– характеристику групп и видов ОМЯ, типичных для РФ и Уральского региона;
– теоретические положения и методические
схемы оценки остроты ОМЯ и частоты (повторяемости) их наступления, а также – модели
пространственного (территориального) распределения и временной (внутригодовой) изменчивости ОМЯ в аридных геосистемах;
– обоснование выбора ОГФ, обусловливающих формирование и динамику ОМЯ на Южном
Урале;
– по результатам анализа ряда литературных
источников [1–11] установлены базовые понятия, термины и определения, характеризующие
основные виды ОМЯ в регионе исследования.
Литература
1. Алексеев Н.А. Стихийные явления в природе: проявление,
эффективность защиты. М.: Мысль, 1988. 254 с.
2. География, общество, окружающая среда. Т. IV: Природноантропогенные процессы и экологический риск / под ред.
проф. Малхазовой и проф. Р.С. Чалова. М.: Издательский
дом «Городец», 2004. 616 с.
3. Исаев А.А. Экологическая климатология. М.: Научный мир,
2001. 458 с.
4. Климат России / под ред. Н.В. Кобышевой. СПб.: Гидрометеоиздат, 2001. 656 с.
5. Кузьмин И.И. и др. Безопасность и риск: экологоэкономические аспекты. СПб.: СПбГУЭФ, 1997. 164 с.
6. Мягков С.Н. География природного риска. М.: Изд-во МГУ,
1995. 222 с.
7. Научно-прикладной справочник по климату СССР. Сер. 3.
Многолетние данные. Ч. 1–6. Л.: Гидрометеоиздат, 1988.
199 с.
8. Природные опасности России. Природа и общество / под
ред. В.И.Осипова, С.К. Шойгу. М.: КРУК, 2002. 316 с.
9. Сазонов В.И. Суровые зимы и засухи. Л.: Гидрометеоиздат,
1991. 235 с.
10. Рычко О.К. Применимость гидрометеорологических показателей для индикации климатического опустынивания
регионов Центральной Азии // Мат-лы междунар. науч.
конф. «Опустынивание и деградация почв». М.: Изд-во
МГУ, 1999. С. 328–330.
11. Справочник по опасным природным явлениям в республиках, краях и областях Российской Федерации / под ред.
К.Ш.Хайруллина. СПб.: Гидрометеоиздат, 1997. 587 с.
К вопросу изучения перекисного
окисления липидов
Р.С. Маханова, соискатель, Оренбургский ГУ
Реакции перекисного окисления липидов
(ПОЛ) являются свободнорадикальными и постоянно происходят в организме. Свободнорадикальное окисление нарушает структуру многих
молекул. В белках окисляются некоторые аминокислоты. В результате разрушается структура
белков, между ними образуются ковалентные
«сшивки». Это активирует протеолитические
ферменты в клетке, гидролизующие повреждённые белки. Активные формы кислорода легко
нарушают и структуру ДНК. Неспецифическое
связывание Fe2+ молекулой ДНК облегчает образование гидроксильных радикалов, которые
разрушают структуру азотистых оснований.
Наиболее подвержены действию активных форм
кислорода жирные кислоты, содержащие двойные связи, расположенные через СН2-группу.
Именно от этой СН2-группы свободный радикал
(инициатор окисления) легко отнимает электрон,
превращая липид, содержащий эту кислоту, в
свободный радикал.
Уровень ПОЛ, например, липидов плазмы
крови определяется, с одной стороны, процессами радикало- и перекисеобразования, а с
другой – состоянием эндогенных систем антиоксидантной защиты, поэтому оценка антиокислительной активности (АОА) этих систем имеет
практическое значение [1, 2, 3, 4].
К ферментам, защищающим клетки от действия активных форм кислорода, относят супероксиддисмутазу, каталазу и глутатионпероксидазу.
Наиболее активны эти ферменты в печени,
надпочечниках и почках, где содержание митохондрий, цитохрома Р45О и пероксисом особенно
велико. Супероксиддисмутаза (СОД) превращает
супероксидные анионы в пероксид водорода:
2О2– + 2Н+  Н2О2 + О2.
Изоферменты СОД находятся и в цитозоле,
и в митохондриях и являются первой линией
защиты, потому что супероксидный анион
образуется обычно первым из активных форм
кислорода при утечке электронов из дыхательной цепи.
СОД – индуцируемый фермент, т.е. синтез
его увеличивается, если в клетках активируется
перекисное окисление.
Пероксид водорода, который может инициировать образование самой активной формы
ОН•, разрушается ферментом каталазой:
(1)
2Н2О2 > 2Н2О + О2.
Каталаза находится в основном в пероксисомах, где образуется наибольшее количество
пероксида водорода, а также в лейкоцитах, где
она защищает клетки от последствий «респираторного взрыва».
Глутатионпероксидаза – важнейший фермент, обеспечивающий инактивацию активных
форм кислорода, так как он разрушает и пе-
231
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
роксид водорода, и гидропероксиды липидов.
Он катализирует восстановление пероксидов с
помощью трипептида глутатиона (Y-глутамилцистеинилглицин). Сульфгидрильная группа
глутатиона (GSH) служит донором электронов
и, окисляясь, образует дисульфидную форму
глутатиона, в которой две молекулы глутатиона
связаны через дисульфидную группу:
(2)
Н2О2 + 2GSH > 2Н2О + G-S-S-G.
Окислённый глутатион восстанавливается
глутатионредуктазой:
GS-SG + NADPH +
(3)
+ Н+ > 2GSH + NADP+.
Глутатионпероксидаза, которая восстанавливает гидропероксиды липидов в составе мембран, в качестве кофермента использует селен
(необходимый микроэлемент пищи). При его
недостатке активность антиоксидантной защиты
снижается.
Рассмотрим витамины, обладающие антиоксидантным действием.
Витамин Е (-токоферол) – наиболее распространённый антиоксидант в природе – является
липофильной молекулой, способной инактивировать свободные радикалы непосредственно в
гидрофобном слое мембран и таким образом
предотвращать развитие цепи перекисного
окисления.
Различают восемь типов токоферолов, но
-токоферол наиболее активен. Витамин Е
отдаёт атом водорода свободному радикалу
пероксида липида (LOO•), восстанавливая его
до гидропероксида (LOOH), и таким образом
останавливает развитие ПОЛ (рис. 1).
Свободный радикал витамина Е, образовавшийся в результате реакции, стабилен и не
способен участвовать в развитии цепи. Наоборот,
радикал витамина Е непосредственно взаимодействует с радикалами липидных перекисей,
восстанавливая их, а сам превращается в стабильную окислённую форму – токоферолхинон.
Витамин С (аскорбиновая кислота) также является антиоксидантом и участвует с помощью
двух различных механизмов в ингибировании
ПОЛ. Во-первых, витамин С восстанавливает
окислённую форму витамина Е и поддерживает
необходимую концентрацию этого антиоксиданта непосредственно в мембранах клеток.
Во-вторых, витамин С, будучи водорастворимым
и сильным восстановителем, взаимодействует с
водорастворимыми активными формами кислорода – О2-, Н2О2, ОН• и инактивирует их.
B-каротин, предшественник витамина А,
также обладает антиоксидантным действием и
ингибирует ПОЛ. Показано, что растительная
диета, обогащённая витаминами Е, С, каротиноидами, существенно уменьшает риск развития атеросклероза и заболеваний сердечно-сосудистой
системы, подавляет развитие катаракты – помут-
нения хрусталика глаза, обладает антиканцерогенным действием. Имеется много доказательств
в пользу того, что положительное действие этих
компонентов пищи связано с ингибированием
ПОЛ и других молекул и, следовательно, с поддержанием нормальной структуры компонентов
клеток [2, 3].
Рис. 1 – Механизм антиоксидантного действия витамина
Е : витамин Е (-токоферол) ингибирует свободнорадикальное окисление путём отдачи электрона,
что приводит к инактивации радикала липида;
витамин Е превращается в стабильный, полностью
окислённый токоферолхинон
232
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
Повышенный интерес исследователей к процессу перекисного окисления липидов (ПОЛ),
его повреждающий потенциал и патогенетическая роль при различных заболеваниях требуют
количественных методов, которые имели бы
диагностическую информативность и соответствовали основным аналитическим критериям,
таким, как точность, надёжность (достоверность), чувствительность и специфичность.
Большинство прямых подходов к оценке липидной пероксидации, количественное определение гидроперекисей липидов (первичных продуктов) трудно осуществить практически из-за
их неустойчивой химической природы. Поэтому
оценка липидной пероксидации, главным образом, основана на непрямых методах, с помощью
которых анализируют вторичные или конечные
продукты, образованные при превращении гидроперекисей, их метаболизме и разрушении.
При работе как с химическими системами, так
и с биологическим материалом для определения
гидроперекисей очень широко используется
реакция с тиобарбитуровой кислотой (ТБК).
ТБК-тест основан на способности ТБК реагировать с малоновым диальдегидом (МДА), промежуточным продуктом этапа энзиматического
окисления арахидоновой кислоты и конечным
продуктом окислительной деградации липидов.
Две причины лежат в основе широкого использования этого теста для оценки липидной
пероксидации. Между липидной пероксидацией
и МДА существуют количественные взаимосвязи, и продукты, образованные при проведении
ТБК-теста, свидетельствуют о присутствии и
количестве липидных перекисей.
МДА (С3Н4О2) представляет собой низкомолекулярное соединение с ММ 72,07. МДА
поглощает излучение в УФ области в кислой
среде при длине волны 245 нм, в щелочной
среде при длине волны 267 нм и не обладает
собственной флуоресценцией. При нагревании
и низких значениях рН МДА реагирует с нуклеофильными соединениями, давая различные продукты конденсации. Все эти реакции
недостаточно селективны, так как в них могут
вступать и другие низкомолекулярные альдегиды. При взаимодействии МДА с нуклеофилами
образуются окрашенные продукты, имеющие
более высокую молярную абсорбцию в видимой
области спектра, чем имеет сам МДА в УФ. При
этом в реакции МДА с ТБК образуется красный
пигмент с самой высокой молярной абсорбцией,
в 5–10 раз большей, чем МДА в УФ в области
спектра.
Этот продукт, являясь пигментом, также обладает флуоресценцией. В то время как МДА
образует окрашенные продукты при низком рН и
нагревании (80–100 °С), флуоресцентные производные МДА могут возникнуть при нейтральных
рН без интенсивного нагревания (37 °С). Некоторые из них формируются при физиологических
условиях в водной среде. В живых системах
такие флуоресцирующие продукты образуются
при взаимодействии МДА с макромолекулами,
содержащими первичные аминогруппы, например, белков, фосфолипидов и нуклеиновых
кислот. В результате этой реакции образуются
поперечные сшивки между макромолекулами,
что делает их токсичными, а также наделяет
свойствами мутагенов и канцерогенов. Ковалентная модификация липопротеидов с МДА
может играть роль в патогенезе атеросклероза.
Анализ таких продуктов имеет диагностическое
значение.
Существуют два больших класса аналитических методов для определения МДА: прямые
методы, в которых анализируется МДА сам по
себе, и непрямые методы оценки продуктов реакции МДА с другими соединениями, имеющими
флуоресценцию, поглощение и другие свойства,
которые можно зарегистрировать.
Один из основных подходов при прямых методах – ВЭЖХ с УФ-спектрофотометрией. Этот
метод – наиболее привлекательный прямой метод
для анализа МДА с точки зрения специфичности
и чувствительности, но он имеет свои особенности и технические трудности, связанные с
корректной подготовкой проб, необходимостью
постоянного применения свежих стандартов,
наличием специального оборудования. Всё это
ограничивает практическое применение данного
метода.
Из непрямых методов наиболее распространённым стал метод с ТБК. Сложности применения этого метода состоят прежде всего в его
неспецифичности. Даже в идеальных условиях
эксперимента и анализа при образовании МДА
из гидроперекисей липидов использование МДА,
как количественного индекса, ограничено, поскольку его источником могут быть продукты
разложения ДНК при её окислительном повреждении, а возможно, и других нелипидных
молекул.
Тест с ТБК очень чувствителен. С его помощью можно улавливать наномолярные
концентрации чистого МДА-стандарта. Другая
трудность состоит в том, что ТБК реагирует
и с другими соединениями с образованием
красного пигмента при высокой температуре
и низком рН (некоторые альдегиды, дезоксисахара, сиаловые кислоты, гликозилированные
белки). Спектрофотометрически невозможно
определить образование 1 : 2 МДА:ТБК. Возможно, в условиях высокой температуры ТБК
реагирует с МДА, образованным из гидроперекисей в процессе реакции. Это подтверждают
опыты с добавлением в реакционную среду
ионов переменных металлов (меди и железа).
233
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
При этом образование комплекса увеличивается
за счёт разложения гидроперекисей. Аутоокисление липидов можно ограничить, добавляя в
реакционную среду антиоксиданты или проводя реакцию в токе инертного газа. Тест с ТБК
даёт информацию только о наличии веществ,
реагирующих с ТБК, и не информирует об их
составе и природе. Поэтому следует сочетать
данный метод с другими маркерами липидной
пероксидации [5, 6, 7].
Литература
1. Арчаков А.И. Успехи биологической химии. М.: Наука,
1971. 136 с.
234
2. Биохимия / под ред. чл.-корр. РАН, проф. Е.С. Северина.
5-е изд. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. 768 с.
3. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление
липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. 252 с.
4. Родионова Г.Б., Герасименко В.В. Методы физиологобиохимических исследований крови. Оренбург: Издательский центр ГНУ ВНИИМС, РАСХН, 2005. 148 с.
5. Гаврилов В.Б., Гаврилова А.Р., Мажуль Л.М. Анализ методов
определения продуктов ПОЛ в сыворотке крови по тесту
с ТБК // Вопросы медицинской химии. 1987. Т.33. №1.
С. 118–122.
6. Каган В.Е., Орлов В.Г., Прилипко Л.Л. Проблема анализа
эндогенных продуктов перекисного окисления липидов //
Итоги науки и техники. Серия «Биофизика». 1986. Т. 18.
134 с.
7. Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с
тиобарбитуровой кислотой // Лабораторное дело. 1988. №11.
С. 41–43.