На правах рукописи Скворцов Евгений Владимирович Биосинтез
реклама
На правах рукописи Скворцов Евгений Владимирович Биосинтез ксиланаз грибами Trichoderma и бактериями p.Bacillus 03.00.07 - микробиология 03.00.04-биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань 2005 Работа выполнена в Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина и в Татарском научно-исследовательском институте сельского хозяйства Научный руководитель: - кандидат биологических наук, доцент Алимова Ф.К. Научный консультант: - доктор сельскохозяйственных наук, Шакиров Ш.К. Официальные оппоненты: - доктор биологических наук профессор Алимов A.M. - доктор ветеринарных наук, профессор Хазипов Н.З. Ведущая организация - Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН Защита состоится .2005 г. в часов на заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при Всероссийском научноисследовательском ветеринарном институте (Россия, Казань, Научный городок-2). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан 2005 г. 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Установление закономерностей биосинтеза ксиланаз грибами и бактериями в настоящее время является широко исследуемой и актуальной проблемой. Все большее применение в процессах переработки сельскохозяйственного сырья находит ферментативный гидролиз. Ксиланы являются компонентами зерновых, гидролиз которыхосуществляют ксиланазы, синтезируемые грибами и бактериями. При исследовании биосинтеза ксиланаз нами использованы культуры известного продуцента целлюлаз и геммицеллюлаз гриба Trichoderma и бактерий p.Bacillus, у которых обнаружена способность к синтезу ксиланаз (Hidenori Т., 2000, Dhillon A, Khanna S, 2000, Sa-Pereira, 2002 и др.). При исследовании синтезированных ксиланаз, нам представлялось важным провести изучение влияния рН и температуры на их каталитические свойства. Цель и задачи исследования Целью работы было установление закономерностей биосинтеза ксиланаз грибами Trichoderma и бактериями p.Bacillus, а также определение их способности увеличивать гидролизуемость питательных веществ при добавке в кормовые рационы. В работе решались следующие задачи: 1. Скрининг представителей рода Trichoderma на наличие способности к биосинтезу секретируемых ксиланаз. 2. Скрининг представителей рода Bacillus на наличие способности к биосинтезу секретируемых ксиланаз. 3. Изучение закономерностей биосинтеза ксиланаз Trichoderma и p.Bacillus. 4. Изучение каталитических свойств ксиланаз Trichoderma и p.Bacillus. 5. Изучение увеличения гидролизуемости питательных веществ кормовых рационов при добавлении ксиланаз Trichoderma и p.Bacillus. Научная новизна работы Установлено принципиальное различие закономерностей биосинтеза ксиланаз у представителей родов Trichoderma и Bacillus. При этом впервые показано, что гриб Trichoderma reesei F-2433 4 обеспечивает максимальный синтез ксиланаз на среде, содержащей только белок. При наличии в среде культивирования ксилана, наряду с белком происходит снижение синтеза ксиланаз, таким образом, показан конститутивный механизм синтеза фермента. Культура Bacillus circulans на средах, содержащих белок и ксилан, показала индуктивный механизм синтеза ксиланаз. При исследовании В. circulans впервые установлено, что при замене белка в культуральной среде его полным гидролизатом, содержащим соответствующие аминокислоты, происходит резкое снижение синтеза протеолитических ферментов. Результаты проведенных исследований впервые показали, что ксилан является лучшим индуктором синтеза целлюлаз, чем целлюлоза, при культивировании В circulans на белоксодержащих средах. Впервые проведено исследование влияние рН и температуры, соответствующее параметрам среды желудка моногастричных, и гидротермической обработки на изменение активности ксиланаз, синтезированных представителями рода Trichoderma и Bacillus. Практическая ценность работы Получены данные о закономерностях биосинтеза ксиланаз Trichoderma и Bacillus, позволяющие получать ксиланазы с заданным спектром сопутствующих активностей. Проведено исследование влияние рН и температуры, соответствующее параметрам среды желудка моногастричных и гидротермической обработки на изменение активности ксиланаз, синтезированных представителями рода Trichoderma и Bacillus. Разработаны методики снижения антипитательного действия пентозанов при помощи ксиланаз, что позволит специалистам сельского хозяйства правильно подбирать дозировки препаратов ксиланаз в зерновые рационы, содержащих пентозаны. • Апробация работы Материалы диссертации доложены на 4-х международных конференциях в Москве в 2001, 2003 и 2-х в 2004 г.; на 3-х конференциях в Казани в 2002, 2004 и 2005 г.; на итоговых научных конференциях в ТатНИИСХ РАСХН 2003 и 2004 г. Публикации По материалам диссертации опубликовано 15 работ. 5 Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста, включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы, литература. Работа содержит 26 таблиц, 47 рисунков. Список литературы включает 129 источников, в том числе 102 иностранных. 1. Материалы и методы исследований Для решения поставленных задач проведены комплексные исследования штаммов бацилл из коллекции музея лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов, лаборатории сельскохозяйственной микробиологии и кафедры микробиологии КГУ: В. cereus, В. megaterium, В. subtilis (штаммы 1,168,20-36, JH 642), В. mesentericus, В. pumilus КМ 62, В. thuringiensis (var. subtoxycus), В. polimyxa, В. circulans, B.ilntermedius (штаммы 7р и 3-19) и штаммы Trichoderma (2,3,10,14,16,18,23), промышленный штамм T.reesei выделенные F-2433 из из почв РТ, Всероссийской а также коллекции микроорганизмов. При культивировании исследуемых продуцентов на агаризованной среде использовали для бактерий Bacillus L- агар, для грибов Trichoderma агаризованную среду Чапека. При культивировании грибов Trichoderma для получения инокулята, агаризованную среду Чапека разливали в чашки Петри. Штаммы засевали «штрихом». Посевы выращивали на агаризованной среде при температуре 28°С, 7 суток. По истечении указанного срока с поверхности колоний водопроводной водой смывали споры грибов. Суспензию спор разбавляли до содержания Ix10 6 спор/мл-и в дальнейшем использовали в качестве инокулята для засева глубинных культур. При культивировании бактерий Bacillus для получения инокулята, штаммы бацилл засевали «штрихом» на поверхность скошенного в пробирках L-arapa. Посевы выращивали при 37°С в течение 24-72 часов. По истечении указанного срока с поверхности споры. Полученную культивировали в дальнейшем при колоний водой смывали бактериальные суспензию 37°С разводили спор в течение таким высевали в L - бульон и ночи. Культуральную жидкость образом, чтобы ее 6 оптическая плотность составляла 0.25±0.05 единиц при λ=590 нм и использовали в качестве инокулята для засева глубинных культур. Культивирование штаммов в глубинной культуре для биосинтеза ферментов проводили в колбах, содержавших 100 мл среды, которые засевали 2% инокулята. Культуры выращивали 24 - 120 часов на лабораторных качалках с интенсивностью качания 200 об./мин. Клетки отделяли центрифугированием. Пробы для определения биомассы и ферментативной активности отбирали каждые 24 часа. Прирост биомассы определяли по количеству высушенной после осаждения центрифугированием биомассы. В работе проведено изучение особенностей биохимического состава зерна сортов ржи, районированных в Республике Татарстан. Определение моносахаридного состава нецеллюлозных полисахаридов зерна ржи проводили методом жидкостной хроматографии их кислотного гидролизата (Bartolome В.,2002). Исходя из моносахаридного состава гидролизата, определяли состав нецеллюлозных углеводов исходного материала (Maes С, 2002). Определение ксиланазной и целлюлазной активности ферментных препаратов, полученных при культивировании продуцентов, проводили (Konig J., 2002) методом исследования увеличения редуцирующих эквивалентов в процессе гидролиза ферментным препаратом, соответственно ксилана (Sigma X0502) и карбоксиметиллцеллюлозы (Fluka, 21901, Analysis no. 365415/1 14398). Активности выражали в международных единицах. Одна единица активности энзима (IU) соответствует количеству фермента, вызывающего выход одного мкМоля восстанавливающих Сахаров в минуту при .гидролизе соответствующего субстрата. Протеолитическую активность определяли по кинетике гидролиза казеина (Каверзнева, 1971). За одну единицу протеазной активности (U) принимали количество фермента необходимого для образования 1 мМ растворимого эквивалента тирозина за 1 мин в пересчете на 1 мл исследуемого раствора. Специфическую активность рассчитывали как отношение характеризуемой активности фермента к общему количеству биомассы. 1 Изучены свойства полученных препаратов ксиланаз. Влияние рН изучали используя следующие буферные растворы: ацетатный, рН 4,0-6,0; фосфатный рН 6,0-7,0; Tris-HCl рН 7,5-9,0 (Christakopoulos P.,1996). При определении влияния температуры на активность ксиланаз (Cobos A., 2003) образцы исследуемых ферментных препаратов в пробирках помещались в водяную баню при соответствующей температуре и убирались при 37°С каждые 30 минут в течение 10 часов, при 55°С каждые 5 минут в течение 60 минут, каждую минуту в течение 10 минут при 60°С, каждые 0.5 минут в течение 2 минут при 65°С и каждые 15 секунд в течение 1.5 минут при 70°С. После охлаждения при 0°С в течение 10 минут образцы исследовались на ксиланазную активность по методике (Konig J.,2002). В проведении анализа переваримости моногастричных in vitro (Dung N.N.X.,2002) использовалось содержимое кишечника свиньи. Процедура анализа in vitro состояла из четырех этапов. На первом этапе образец помещали в ацетатный буфер и добавляли 0.1 мл термостабильной α-амилазы, инкубировали в водяной бане при 50С в течение 1 часа. На втором этапе в колбу приливали 0.2% пепсина в 0.1Н НС1 затем инкубировали в течение 4 часов в водяной бане с температурой 40°С. На третьем этапе в колбы добавляли инокулюм, содержимого кишечника свиньи и помещали в термостат при 37°С на 36 часов. На последнем этапе образцы инкубировали в изопропаноле при 85°С в течение 8 часов. 2.РЕЗУЛЫАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Скрининг микроорганизмов на способность гидролиза ксиланов При исследовании грибов Tnchoderma изучены 10 штаммов выделенных из местных почв и штамм промышленного продуцента ферментов T.reesei. Скринингp.Bacillus охватил 13 штаммов бацилл из коллекции музея лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии ЮГУ: В. cereus, В. megaterium, В. subtilis (штаммы /, 168, 20-36, JH 642), В. mesentericus, 8 В. pumilus KM 62, В. thuringiensis (var. subtoxycus), B. polimyxa,, B. circulans, B.intermedius штаммы 7р и 3-19). Для грибов проведения скрининга нами проведено культивирование Trichoderma и бактерий Bacillus на средах, содержащих пентозаны ржи. Культуральные среды получали щелочной экстракцией дробленого зерна ржи, с последующим отделением, нейтрализацией и корректировкой рН раствора до оптимальных для продуцентов значений. В ходе культивирования продуцентов проводился анализ уменьшения содержания в среде пентозанов, позволявший судить о скорости и глубине гидролиза этих полисахаридов и их использовании продуцентами в качестве источника углерода. В ходе изучения динамики уменьшения содержания пентозанов при культивировании штаммы исследуемых показали пентозанов из примерно раствора, штаммов грибов одинаковую около 40%. Trichoderma, степень все ассимиляции Максимальную скорость ассимиляции проявил штамм Trichoderma 14. В ходе проведения скрининга бактерий штаммов Bacillus было установлено, что максимальную глубину и скорость ассимиляции пентозанов из раствора штаммы В. cereus, В. circulans, В. intermedius 3 -19 потребляющие около 90% содержащихся в растворе (рис. 1). Полученные в ходе ферментации культуральные среды, очищенные от биомассы продуцента исследовали вязкость ржаных снижения вязкости экстрактов. Было проведено изучение кинетики растворов пентозанов полученными при культивировании 2,3,10,14,16,18,23, на способность уменьшать выделенных из ржи штаммов местных препаратами, Trichoderma почв, а также промышленного продуцента Т. reesei. Результаты показали, что лучше других снижает вязкость ржаного экстракта препарат, полученный с использованием штамма 9 Рис.1. Динамика уменьшения содержания пентоз в культуральной среде Т reesei около 36% вязкости за 2 5 часа Близкие результаты, 25- 30% исходной вязкости, показали препараты грибов, выделенных из почв Tnchoderma 2,18 В ходе проведения скрининга бактерий Bacillus было установлено, что максимальную глубину и скорость ассимиляции пентозанов из раствора проявляют штаммы В cereus, В circulans,, В intermedius 3 -19 потребляющие около 90%, содержащихся в растворе пентозанов Эти же штаммы проявили наибольшую способность к деструкции пентозанов. Самую лучшую способность продемонстрировал препарат В circulans, при применении которого вязкость ржаного экстракта снижалась за 2 часа на 87% Ферменты В cereus также проявили 10 Высокую активность, снизив вязкость раствора пентозанов ржи в тех же условиях на величину около 82%. По результатам проведенного обширного скрининга бактериальных и грибных продуцентов ксиланаз нами для дальнейших исследований по оптимизации культуральных сред были отобраны, проявившие лучшие показатели гидролиза и ассимиляции пентозанов штаммы T.reesei, Trichoderma 2,14,18 и B.cereus, B.circulans, В. intermedius 3 -19. 2.2. Оптимизация состава культуральных сред для индукции биосинтеза ксиланаз продуцентами При исследовании влияния содержания белка и ксилана в культуральной среде на ксиланазную активность, синтезированных препаратов T.reesei, выяснилось, что максимальная активность ксиланаз 6.06 IU/ml, достигается при культивировании T.reesei на среде, содержавшей лишь белок, в количестве 5 г/л. В целом, наблюдается тенденция снижения ксиланазной активности при увеличении содержания в среде ксилана. Такую же тенденцию сохраняет и специфическая ксиланазная активность. Максимадьные уровни специфической ксиланазной активности отмечены при отсутствии ксиланов в растворе. Это вызвано резким снижением роста культуры гриба и интенсификации синтеза ксиланаз и целлюлаз при отсутствии в среде углеводов (рис.2А). T.reesei является известным продуцентом целлюлаз, широко применяемом в промышленном синтезе коммерческих препаратов. Большинство технологий биосинтеза целлюлаз проводятся на природных средах, содержащих целлюлозу, геммицеллюлозу, белок растительного происхождения. Нами были проведены сравнительные исследования целлюлозы и ксилана, в качестве источников углерода, при синтезе целлюлаз T.reesei на средах, содержавших белок, в качестве источника азота. Как показали результаты, проведенных нами исследований синтез как ксиланаз, так и целлюлаз Т. reesei активнее происходит на среде, содержащей белок и ксилан, чем белок и целлюлозу. Целлюлоза вызывает заметную активизацию роста биомассы гриба T.reesei. При культивировании T.reesei на среде, 11 Рис.2. Поверхность уровня ксиланазной активности культуральной жидкости полученной при культивировании T.reesei Аи В circulans Б на синтетических средах, содержавших ксилан и белок. Рядом с диаграммами приведена информация о соответствии цвета поверхностей активности ксиланаз. содержавшей 5 г/л белка и 5 г/л ксилана, за 4 суток, накапливалось биомассы 1.88 мг/мл, а при использовании целлюлозы вместо ксилана, в тех же условиях накапливалось 4.56 мг/мл. Также при использовании целлюлозы проявляется пониженный уровень синтеза ксиланаз- 5.75 IU/ml на ксилане и 3.90 IU/ml на целлюлозе, что вызывает 4-х кратное снижение специфической активности ксиланаз. Целлюлоза является полимером глюкозы, которая при ферментации, вероятно, выделяется в культуральную среду, ингибирует синтез экзоферментов и ускоряет рост биомассы. Ксилан, являясь полимером ксилозы, не ингибирует синтез экзоферментов и поэтому является более эффективным источником углерода. Исследования влияния состава культуральных сред на активность синтеза ксиланаз В circulans показали, что максимальное накопление ксиланаз 4.66 IU/ml происходит на средах содержащих белок, как источник азота и ксилан в качестве индуктора. При отсутствии в среде ксилана резко уменьшается продукция ксиланаз. В качестве оптимального источника азота для продукции ксиланаз определен белок, хотя как показали проведенные исследования, несколько лучшие показатели продемонстрировали культуры на аминокислотах. 12 Наличие больших количеств аминокислот в культуральной среде, как показали результаты эксперимента, снижает синтез протеаз. Нами проведены исследования индукции синтеза целлюлаз B.circulans целлюлозой и ксиланом при культивировании на белоксодержащей среде. При культивировании в течение 48 часов продуцента на среде, содержавшей только белок 5 г/л, получены препараты с активностью целлюлаз 1.28 IU/ml. При добавке в исходную питательную среду целлюлозы активность препаратов снижалась до 0.90 IU/ml. При добавке ксилана целлюлазная активность увеличивалась, в сравнении со средой, содержавшей только белок, до 1.42 IU/ml. Таким образом, показано, что ксилан является более эффективным, чем целлюлоза индуктором синтеза целлюлаз B.circulans. 2.3. Характеристика ксиланаз, полученных на природных средах, содержавших пентозаны В условиях реального промышленного производства ферментов решающее значение приобретает себестоимость производимого препарата, поэтому с целью ее снижения, индустриальные процессы синтеза ферментов ведутся на средах, приготовленных с использованием природных компонентов. Исследования, проведенные с использованием сред, содержавших чистые химические компоненты, позволили сделать вывод, что оптимальным субстратом для синтеза ксиланаз грибами Trichoderma являются белоксодержащие среды с незначительным содержанием ксиланов, а для культивирования бактерий Bacillus содержащие 5 г/л белка и 5 г/л ксиланов в качестве индуктора. Нами были получены щелочные - экстракты зерна ржи для культивирования грибов Trichoderma, содержавших 0.2% пентозанов, а также водо- и щелочерастворимую фракцию белков 0.5% и (NH4)2SO4 0.01%, а также незначительное количество других веществ. Для получения сред, близких к оптимальным, для культивирования бактерий Bacillus использовали ржаные отруби. Среды для продукции ксиланаз при культивировании бактерий Bacillus содержали растворенные пентозаны 0.5%, белок 0.2% и (NH4)2SO4 0.01%. При культивировании грибов на экстракте ржи штаммы Trichoderma 18 и T.reesei показали наибольшую активность синтеза 13 ксиланаз, 2.30 и 3.60 IU/ml соответственно. Целлюлазная активность Ш/ml препаратов Trichoderma была 1.1-1.6 IU/ml, протеолитическая активность 0.02-0.03 U/ml. Результаты проведенных исследований показали, что почвенные штаммь егта являются продуцентами ксиланаз, сопоставимыми и даже происходящими T.reesei (табл.1). Сравнивая продуктивность исследованных штаммов видно, что B.circulans превосходит по продукции ксиланаз B.intermedius и B.cereus. Ферментный комплекс B.circulans имел ксиланазную активность 1.90 IU/ml, целлюлазная активность 1.03 IU/ml, протеазную активность 0.48 U/ml (табл.1). Нами проведены исследования влияния рН и температуры на ксиланазную активность препаратов, полученных на ржаных экстрактах. Результаты показали, что ксиланазная активность ферментных препаратов всех исследованных нами почвенных грибов Trichoderma имеет оптимум рН в районе 5.0-6.0, снижается при приближении к ксиланазная активность резко рН 4 и еще больше снижается при сдвиге рН в щелочном направлении. Культивирование ксиланаз штамма T.reesei в течение 10 часов при рН 2 показало потерю активности всех исследованных образцов около 80%. Таблица 1 Активность ферментов грибов Trichoderma и бактерий p.Bacillus* Штамм Ксиланазная активность, IU/т1 Целлюлазная активность,Ш/т1 Протеолитическая активность, U/ml T.reesei 3.60±0.25 1.58+0.16 0.03+0.01 Trichoderma 2 1.67+0.21 1.31±0.15 0.03±0.01 Trichoderma 14 1.33±0.20 1.11+0.14 0.02±0.01 Trichoderma 18 2.30±0.22 1.37+0.13 0.02±0.01 B.circulans 1.90+0.2 1.03+0.2 0.48+0.02 B.intermedius 1.20+0.1 1.26+0.2 0.49±0.03 B.cereus 1.80±0.2 1.2110.2 0.5310.03 14 Ксиланазная активность ферментов, исследованных нами штаммов Bacillus, имеет оптимум рН в районе 8.0, и резко снижается при повышении кислотности среды. При сдвиге рН в щелочную сторону от 8.0 до 9.0 не вызывает значительного снижения активности ксиланаз. Культивирование ксиланаз штаммов Bacillus в течение 10 часов при рН 2 показало потерю активности всех исследованных препаратов около 95%. Результаты продемонстрировали нестабильность бактериальных ксиланаз в сильнокислой среде. При инкубировании препаратов Trichoderma при 65°С кривые зависимости ксиланазной активности препаратов имеют резкое снижение активности после минутной выдержки, а через 2 минуты препараты теряют 80% активности. А при проведении процесса при 70°С аналогичная потеря активности наблюдается уже через 1 минуту после начала инкубации. При 65 °С препараты синтезированные штаммами B.cereus, B.circulans, сохранили в течение 2 минут 85-95% активности. При проведении процесса при 70°С за 90 секунд инкубации ксиланазы, синтезированные штаммами B.cereus, В circulans сохранили 75-90% активности. Такая повышенная термостойкость ксиланаз B.cereus, B.circulans делает перспективным их применение в процессах предварительной обработки зерновых рационов, содержащих рожь, предусматривающих тепловую обработку. 2.4. Применение ксиланаз в кормовых рационах Исходя из бактериальных исследовать, исследованных -препаратов добавки свойств, полученных грибных и -ксиланаз,. -нами .принято .решение препаратов T.reesei, проявивших большую устойчивость при рН=2, в модельных экспериментах по переваримости in vitro зерновых рационов. Основными зерновыми злаковыми культурами, выращиваемыми сельским хозяйством РТ являются пшеница, рожь и ячмень. Для оценки кормовых характеристик было проведено исследование 4-х районированных в Татарстане сортов ржи: «Эстафета Татарстана», «Радонь», «Татарская» и «Огонек», а также фуражных образцов ржи, пшеницы и ячменя. Нами проведены исследования, 15 Таблица 2 Моделирование переваримости in vitro рационов, содержащих 50% ржи с добавками ксиланаз Trichoderma, % ВСВ* Состав рациона Содержание ксиланаз ,Ш/г 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 Рожь фуражная 53.4 55.6 57.0 58.9 59.7 60.3 60.5 + Пшеница ±0.8 ±0.7 ±0.7 ±0.7 ±0.7 ±0.7 ±0.7 Рожь фуражная + 53.4 55.8 58.0 59.3 60.0 61.7 61.9 Пшеница +0.8 ±0.7 ±0.7 ±0.8 ±0.7 ±0.6 ±0.8 Рожь фуражная + 50.5 52.6 53.5 54.9 55.1 56.6 56.8 Ячмень ±0.6 ±0.6 ±0.6 ±0.6 ±0.6 ±0.6 ±0.7 Рожь фуражная + 50.5 53.7 55.9 56.9 57.1 58.1 58.1 Ячмень ±0.6 ±0.6 ±0.6 ±0.6 ±0.5 ±0.5 ±0.8 фуражная +Т. reesei фуражная +Т. 18 фуражный + Т. reesei фуражный+T.18 включавшие показатели полного зоотехнического анализа и состав углеводной фракции зерна злаков. Результаты показали, что все зерновые содержат крупную фракцию крахмала, являющегося важнейшим источником глюкозы, необходимой для энергетического обмена сельскохозяйственных животных. Однако переваривание питательных веществ, содержащихся в составе зерновых, затрудняется наличием некрахмалистых углеводов, и прежде всего пентозанов. Результаты анализов показали, что в составе зерна всех злаков содержится значительное количество пентозанов. Наибольшее их количество 9.9-11.1 % содержит рожь, именно это обстоятельство не позволяет использовать ее в качестве основы кормовых рационов. Меньше пентозанов содержат пшеница до 6.8% и ячмень до 7.2%. 16 Таблица 3 Моделирование переваримости in vitro рационов, содержавших рожь, с добавками ксиланаз B.circulans, % ВСВ* Состав Содержание ржи в рационе, % рациона 0 10 20- 30 40, 50 60 70 Рожь фуражная + Пшеница фуражная без обработки 85.0 ±4.2 84.1 ±4.6 84.0 ±4.2 74.9 ±4.6 62.0 ±4.0 53.4 ±4.8 52.5 ±4.8 50.0 ±4.8 Рожь фуражная + Пшеница фуражная с обработкой Рожь фуражная + Ячмень фуражный без обработки Рожь фуражная + Ячмень фуражный с обработкой 85.0 ±3.2 85.1 ±4.6 85.2 ±3.2 84.0 ±3.6 82.0 ±4.0 83.0 ±3.8 82.0 80.2 ±4.8 ±3.8 80.0 ±4.9 79.1 ±4.6 78.5 ±4.2 66.9 ±4.0 52.1 ±4.0 50.5 ±4.8 48.0 ±4.7 48.0 ±4.9 80.0 ±4.9 79.2 ±3.6 78.4 ±3.2 76.9 ±3.0 72.2 ±4.0 70.2 ±3.8 70.0 ±4.7 70.3 ±3.9 Исследование влияния добавок ксиланаз Trichoderma на гидролизуемость зерновых .кормовых рационов, содержащих 50% ржи установлено повышение переваримости в модельных экспериментах in vitro на 4.4-5.2%, по сравнению с контролем без ксиланаз (табл.2). В исследованиях определены оптимальные нормы ввода ксиланаз. Выявлено, что для кормовых рационов из зерносмесей, содержащих 50% ржи оптимальная дозировка ксиланаз- 0.20-0.25 Ш/г. Нами проведены исследования применения термостойких препаратов ксиланаз, полученных при культивировании B.circulans при предварительной тепловой обработке зерновых рационов, содержащих рожь. Результаты проведенных исследований моделирования переваримости in vitro показали (табл.3), что внесение ксиланаз B.circulans при гидротермической обработке обеспечивает повышение, на 22-30% гидролизуемости зерносмесей. 17 Заключение Представители бактерий рода Bacillus и грибы рода Trichoderma являются продуцентами ксиланаз. Нами установлена роль углеводных и азотсодержащих компонентов культуральной среды в индукции синтеза ксиланаз грибами рода Trichoderma и бактериями рода Bacillus. Исследована динамика снижения активности ксиланаз бактерий рода Bacillus и грибов рода Trichoderma в диапазоне рН 2-9 и температуры 37-70°С. Проведены модельные эксперименты по исследованию переваримости in vitro зерновых рационов, содержащих рожь, с добавками ксиланаз. Исследованиями определены оптимальные нормы ввода ксиланаз в зерновые рационы. Исследована тепловая обработка зерновых рационов с применением ксиланаз. ВЫВОДЫ 1. Исследования показали, что максимальная активность ксиланаз получена при культивировании гриба T.reesei на среде, содержавшей только белок. 2. При наличии в среде культивирования T.reesei ксилана, наряду с белком, происходит снижение активности ксиланаз, таким образом, показан конститутивный механизм синтеза ксиланаз грибом T.reesei. 3. Культура бактерий B.circulans на средах, содержащих белок и ксилан показала индуктивный механизм биосинтеза ксиланаз. 4. Установлено, что при замене белка в культуральной среде B.circulans его полным гидролизатом происходит резкое снижение активности протеолитических ферментов. 5. Показано, что ксилан является лучшим индуктором биосинтеза целлюлаз, чем целлюлоза, при культивировании B.circulans на белоксодержащих средах. 6. Установлена высокая стабильность ксиланаз Trichoderma в кислой среде рН 2, соответствующей среде желудка моногастричных животных. 18 7. При рН 7 и температуре 60-70°С, что соответствует параметрам гидротермической обработки кормов высокую стабильность проявили ксиланазы p.Bacillus. 8. Установлена оптимальная доза ксиланаз Trichoderma 0.20-0.25 Ш/г, обеспечивающая, при добавке к зерносмесям, содержащим рожь, повышение их гидролизуемости на 4.5-5.2%. 9. Внесение 0.75 IU/г ксиланаз В. circulans при гидротермической обработке зеносмесей, содержащих рожь, обеспечивает повышение их гидролизуемости на 22-30%. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ l.Ha основании результатов проведенных нами исследований считаем возможным рекомендовать при использовании грибов Trichoderma при производстве ксиланаз применять среды с низким содержанием растворенных углеводов и содержанием белка не ниже 5 г/л, что обеспечит активизацию синтеза ксиланаз и замедление роста биомассы грибов. 2.Результаты проведенных нами исследований позволяют рекомендовать организацию производства ксиланаз В.circulans. 3.Исследования показали возможность гидролиза 70% АСВ зерна ржи при применении ксиланаз бактерий В.circulans при тепловой обработке, что позволяет рекомендовать их к применению в кормовой и пищевой промышленности. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1.Скворцов Е.В., Соснина Н.А., Лапин А.А., Минзанова СТ., Миронов В.Ф., Коновалов А.И. Новые подходы к процессу извлечения белковых фракций из фитомассы амаранта// Материалы международной научной конференции «От фундаментальной науки к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии».-Москва,Тверь.-2001.С.67. 19 2.Скворцов Е.В., Соснина Н.А., Лапин А.А., Минзанова СТ., Миронов В.Ф., Коновалов А.И., Барбю У.Е. Новые подходы к процессу извлечения белка из высушенной фитомассы амаранта// В сб."Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты", М.: РАЕН, 2001, вып.5., С.28-36. 3.Скворцов Е.В., Выштыкалюк А.Б., Миронов В.Ф. Оценка питательной ценности растительного белкового концентрата, полученного из зеленой массы амаранта// Материалы научной конференции «Химия и технология растительного сырья».-Казань.-2002.-С.22-23. 4.Скворцов Е.В., Алимова Ф.К., Соснина Н.А., Миронов В.Ф. Культивирование гриба p. Trichoderma на растительном сырье// Химия и компьютерное моделирование, №7.-2002.- С.57-60. 5.Skvortsov E.V. Extraction and isolation of rye pentosanes// Тезисы международной конференции «Актуальные проблемы иноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов».- Москва, РАЕН.-2003.-С.187 б.Скворцов Е.В. Экстракция и выделение концентратов пентозанов ржи// В сб. "Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты", М.:РАЕН,2003, вып. 9, С. 14 -18. 7.Скворцов Е.В. Исследование методов получения концентратов белка ржи. Химия и компьютерное моделирование, №1.- 2004.- С.36-38. 8.Скворцов Е.В. Абузярова Д.М.,Халилуллина А.К.,Турбатова Р.И.,Салем М., Алимова Ф.К. Использование грибов рода Trichoderma для гидролиза пентозанов зерновых культур// Тезисы докладов И международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004».-Москва,МГУ.-2004.-С4 9.Скворцов Е.В., Алимова Ф.К., Абузярова Д.М. Исследование изменения состава культуральной среды при биосинтезе ксиланаз грибом Trichoderma reeseill Тезисы докладов конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии».- Казань, КГУ.-2004.-С.78 20 10. Скворцов Е.В., Алимова Ф.К., Захарова Н.Г., Егоров С.Ю., Гарусов А.В., Абузярова Д.М., Халиллулина А.К., Тухбатова Р.И. Использование триходермина в сельском хозяйстве республики Татарстан// Тезисы докладов конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии».Казань,КГУ.-2004.-С.94 ll.Skvortsov E.V. HPLC application for technology and feed characteristics of rye// Тезисы международной конференции «Актуальные проблемы иноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов».- Москва, РАЕН.- 2004,- С.184 12.Скворцов Е.В. Применение методов ВЭЖХ для оценки кормовых и технологических качеств ржи// В сб."Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты", М.:РАЕН, 2004, вып. 11, часть 2.С. 52-56. 13.Скворцов Е.В., Алимова Ф.К., Абузярова Д.М. Исследование ферментных препаратов грибов Trichoderma, гидролизующих пентозаны ржи//Вестник Татарстанского отделения Российской Экологической Академии, 2 (20).2004.-С.14-18 14. Скворцов Е.В., Алимова Ф.К., Вершинина В.И., Халилуллина А.К., Абузярова Д.М. Исследование ферментных препаратов грибов Trichoderma и бактерий Bacillus, деградирующих трудногидролизуемые компоненты растительной биомассы. Материалы научной коференции «Проблемы биотехнологии в сельском хозяйстве».- Казань, КГСХА.-2005.-С.31-32 15.Тухбатова Р.И., Абузярова Д.М., Халиллулина А.К., Скворцов Е.В., Алимова Ф.К. Изучение ферментативной активности гриба Trichoderma. Тезисы -докладов XIII .международной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функция, применение».- Казань, КГУ.-2005.С.210 Подписано к печати 30 05 05. Формат 60x90 V16 Печать на RISO. Уел печ. л 1,25. Тираж 100 Договор № 2 Лаборатория оперативной печати ТГТИ 420036, г. Казань, ул Побежимова, 47а, тел. 711429
