013237 Настоящее изобретение относится к созреванию сыра.

013237
Настоящее изобретение относится к созреванию сыра.
Аромат пищевых продуктов является одним из ключевых свойств для покупателя. В ферментированных продуктах, т.е. молочных продуктах, ароматы образуются из компонент молока посредством
ферментативных активностей микроорганизмов. Например, для сыра определили, что необходимыми
являются различные соединения, придающие аромат, и многие из них образуются при деградации казеина. Также идут другие ферментативные процессы, такие как липолиз, что в основном касается сыра, где
грибы вовлечены в процесс созревания, например сыров Камамбер и Рокфор. Кроме того, ферментация
лактозы может вызывать образование соединений, придающих аромат, таких как пропионовая кислота
(Smit et al., Food Res. Int. (2000) 33, 153-160).
Протеолиз в сыре во время созревания играет существенную роль в развитии текстуры, а также
аромата и является темой нескольких обзоров (см., например, McSweeney & Sousa, Lait (2000), 80, 293324). Протеолиз способствует изменениям текстуры основы сыра, благодаря разрывам белкового каркаса, снижает Aw связыванием воды свободными карбоксил- и аминогруппами и увеличивает рН, что облегчает высвобождение соединений, придающих вкус при разжевывании (Sousa et al., Int. Dairy Journal
(2001), 11, 327-345). Он обеспечивает непосредственно аромат или неприятный аромат (т.е. горечь) сыра
посредством образования пептидов и свободных аминокислот, а также выделения субстратов (аминокислот) для вторичных катаболических изменений, т.е. трансаминирования, дезаминирования, декарбоксилирования, десульфурации, катаболизма ароматических аминокислот и взаимодействия аминокислот с
другими соединениями. Скорость и паттерн протеолиза могут меняться в зависимости от участка внутри
сыра.
Созревание сыра является длительным процессом, включающим комплекс хорошо сбалансированных взаимодействий гликолиза, протеолиза и липолиза компонент молока. Для большинства сыров главную роль в данном процессе играют бактериальные ферменты. Хорошо известно, что изменение содержания бактериального фермента в сыре влияет непосредственно на скорость созревания и на его конечный аромат (Klein & Lortal, Int. Dairy Journal (1999), 9, 751-762). Увеличение пула бактериального фермента в сырном сгустке добавлением целой молочной кислой бактерии, неспособной расти и продуцировать существенные уровни молочной кислоты, но все еще поставляющей активные ферменты для созревания во время старения сыра, является способом повлиять на созревание сыра. Обычно закваску ослабляют и называют аттенюированной.
Так как процесс созревания сыра является длительным, он также является дорогостоящим. При созревании сыры должны находиться при точно определенных условиях, температуре и влажности в течение недель или месяцев. Время созревания сильно варьируется для различных сыров от 3 недель (например, моцарелла) до более 2 лет (например, пармезан, сверхвыдержанный чеддер). Любой процесс, приводящий к ускорению созревания сыра, интересен с экономической точки зрения: одинаковое количество сыра может быть получено за более короткий промежуток времени.
Протеолиз в сыре является очень сложным процессом, в который вовлечены протеазы различного
происхождения (для получения большей информации см., например, Fox & McSweeney, Food Rev. Int.
(1996), 12, 457-509). Подобные протеазы представляют собой молокосвертывающие ферменты, которые
используют при производстве сыра (например, химозин, пепсин или кислые протеиназы грибов), собственные белки молока (например, плазмин), протеазы, обеспечиваемые бактериями закваски, протеазы
дополнительной микрофлоры, не относящейся к закваске, протеазы из второго инокулума (с некоторыми
вариациями, например, P. roqueforti, P. camemberti, Br. Linens), аттенуированные бактериальные клетки и
экзогенные протеазы. Аттенуированные клетки и экзогенные протеазы представляют собой современные
средства для развития ускорения созревания сыров. Генерирование свободных аминокислот представляет собой важный шаг в ускорении созревания сыров. Хотя свободные аминокислоты способствуют образованию общего аромата сыра, их вклад относительно небольшой. Аминокислоты являются предшественниками, которые в дальнейшем конвертируются микроорганизмами, присутствующими в сыре, до
соединений, придающих аромат. Таким образом, доступность аминокислот важна для образования аромата сыра и, следовательно, для созревания сыра.
Главной альтернативой к использованию натурального сыра в потребительских пищевых продуктах, требующих аромата сыра, подвергнутых технологической обработке, являются концентраты аромата
сыра высокой интенсивности, такие как модифицированный ферментированный сыр (МФСы), порошкообразный сыр и сырный ароматизатор (Kilcawley, Wilkinson & Fox, Int. Dairy Journal (1998), 8, 1-10).
Сырные ароматизаторы не производят для использования в сырах как таковые, но производят для использования в других пищевых продуктах, которые обычно содержат натуральный сыр. Обычно сыр добавляют к продуктам для придания аромата, улучшения внешнего вида и текстуры в виде препарата,
подвергнутого распылительной сушке. Количество используемого сыра варьируется, и общий аромат и
качество продукта зависят от типа используемого сыра. Сыр, обработанный ферментативно для улучшения, или значительная часть профиля данного сыра рассматривается как МФС, и он обеспечивает сильную ноту сыра в той форме, в которой это является экономичным, питательным и натуральным для производителя пищевого продукта (Kilcawley, Wilkinson & Fox, Int. Dairy Journal (1998), 8, 1-10). МФСы обладают профилем аромата, который может совершенно отличаться от такового натурального сыра, и еще
-1-
013237
при разведении подходящей слабо выраженной по вкусу базой, желаемая нота сыра обеспечивается в
конечном продукте. Основа технологии МФС представляет собой применение специфических ферментов для получения типичных ароматов сыра с использованием подходящих субстратов. Протеазы, относящиеся как к эндопротеазам, так и экзопротеазам, являются важными ферментами при производстве
МФС. Их роль подобна таковой при созревании сыров. Протеолиз МФС является экстенсивным и создает как высокие уровни вкуса, так и ноты горчинки, последние могут быть предупреждены, устранены
или замаскированы с помощью контролируемого протеолиза, добавлением специфических экзопептидаз
или включением маскирующих агентов, например созревшего сыра или глутамата натрия (Wilkinson &
Kilcawley, Bulletin of the IDF (2002), 371, 10-15).
В образование ароматов сыра вовлечено множество протеаз. Образование аромата, свойственного
для сыра (или производных сырных продуктов, таких как МФС), требует тонкого баланса протеолитических активностей вовлеченных протеаз. Любое нарушение баланса легко приводит к образованию нежелательных ароматов, таких как развитие горечи. В особенности, было подробно описано и документировано развитие горечи в сыре (или МФС) (см., например, LeMieux & Simard, Lait (1991), 71, 599-636; LeMieux & Simard, Lait (1992), 72, 335-382). Поэтому разработка протеаз для сыра или МФС для улучшения
процессов созревания сыра является очень тонким и сложным процессом. Экзопротеазы являются более
предпочтительными, чем эндопротеазы, так как они имеют более слабую тенденцию к образованию горечи. Известно, что эндопротеазы легко привносят подобную горечь, и поэтому их применение не является предпочтительным. Однако существует очевидная промышленная необходимость в ферментах для
созревания сыра, таких как протеазы, и свыше нескольких лет назад коммерческие препараты протеаз
были введены на рынок. Обзор доступных коммерческих продуктов приведен в нескольких статьях (Wilkinson, van den Berg & Law, Bulletin of the IDF (2002), 371, 16-19; Kilcawley, Wilkinson & Fox, Food Biotechnol (2002), 16, 29-55; Kilcawley, Wilkinson & Fox, Enzyme Microb. Technol. (2002), 31, 310-320). Примеры включают препараты ферментов, произведенные из образцов грибов (включающие, но не ограничивающиеся Bioprotease P Conc и Bioprotease A Conc, выпускаемые Quest, The Netherlands, Protease M &
Protease А и Acid protease А, выпускаемые Amano, Promod 215, выпускаемые Biocatalysts, Sternzyme
B5026, выпускаемые Stern, Flavourzyme MG/A, выпускаемые Novozymes, Denmark), и образцы бактерий
(включающие, но не ограничивающиеся Protamex и Neutrase, выпускаемые Novozymes, Denmark, Protease
N, выпускаемые Amano, Promod 24P и 24L, выпускаемые Biocatalysts, Protease B500, выпускаемые DSM,
The Netherlands, Protease 200L, выпускаемые Rhodia Foods, France). Протеазы в композиции варьируются
в значительной степени в отношении присутствия специфических протеаз и/или соотношения, в котором
данные протеазы находятся в конкретном продукте. В статьях Kilcawley, Wilkinson и Fox, ссылки на которые приведены выше, ясно показано, что большинство коммерческих продуктов протеаз представляют
собой смесь активностей эндо- и экзопептидаз. Разработано несколько продуктов, которые содержат
только активность экзопептидазы. Для применений в качестве пищевой добавки таковые всегда представляют собой аминопептидазы, примеры включают DBS50 и DBP20 (выпускаемые Rhodia, France),
Corolase LAP (выпускаемый Rohm, Germany), Flavourzyme MG/A (выпускаемый Novozymes, Denmark),
Accellerzyme АР (выпускаемый DSM, The Netherlands) и Peptidase R (выпускаемый Amano, Japan). Были
разработаны и отобраны аминопептидазы для высвобождения аминокислот, которые являются важными
предшественниками для аромата сыра, таких как лейцин, фенилаланин и валин. В некоторых заявках на
патент (например, WO 96/38549) описан препарат и применение аминопептидаз, которые могут быть
использованы для ускорения созревания сыра, не включающие эндопротеаз. Несмотря на то, что описано
применение одной карбоксипептидазы пшеницы для снижения горечи, обеспечиваемой горькими пептидами из пептидов казеина молока (Umetsu, Matsuoka & Ichishima, J. Agric Food Chem (1983), 31, 50-53),
не встречается описания применения препарата протеазы, содержащего одну карбоксипептидазную активность, который был бы полезен для ускорения созревания сыра. Известны коммерческие препараты
протеаз, содержащие карбоксипептидазную активность (например, FlavorPro 192, выпускаемый Biocatalysts), но они всегда содержат смеси активностей аминопептидазы, эндопротеазы и возможно других активностей протеазы в дополнение к карбоксипептидазной активности.
Протеазы для созревания сыра могут быть добавлены на различных стадиях приготовления сыра.
Предпочтительно ферменты добавляют к молоку для сыроделания перед или непосредственно вместе с
добавлением молокосвертывающего фермента (например, химозин). Добавление в данный момент обеспечивает гомогенное распределение ферментов по сыру. Альтернативно, ферменты могут быть добавлены в более поздней стадии, например, во время стадии соления при изготовлении Чеддера, но оно включает риск негомогенного распределения фермента в сыре и образование так называемых горячих пятен.
По этой причине предпочтительно добавление фермента к молоку для сыроделания. Недостатком является то, что часто большая часть фермента (60-90%) оказывается не включенной в сырный сгусток и выбрасывается в фракции сыворотки молока, где она может вызвать нежелательный протеолиз, который
делает сыворотку менее подходящей или неподходящей для дальнейших применений. Особенно эндопротеазы со значительной активностью при рН 5-7 могут являться причиной подобных нежелательных
побочных эффектов, но также аминопептидаза, которая часто имеет оптимум активности в данном интервале рН, может вызывать образование, например, нежелательных ароматов. Другая потенциальная
-2-
013237
проблема, главным образом, добавления эндопротеаз к молоку для сыроделания заключается в том, что
они препятствуют процессу коагуляции молока, вызывая аспецифический гидролиз, приводящему к
снижению выхода сыра. Также аминопептидазы могут приводить к снижению выхода сыра, так как они
обычно обладают достаточно большой активностью при рН 6-7, обычный интервал для изготовления
сыра. Протеазы, которые неактивны или почти неактивны при величинах рН во время изготовления сыра, но которые становятся активными в сыре, являются предпочтительными, потому что они не препятствуют процессу изготовления сыра и не приводят к нежелательным взаимодействиям в сыворотке.
Согласно изобретению ускоренное созревание сыра может быть достигнуто использованием карбоксипептидаз. Препарат карбоксипептидазы не должен содержать эндопептидазной активности и должен, по меньшей мере, осуществлять высвобождение аминокислот, которые являются важными для образования аромата, таких как лейцин, фенилаланин, валин и метионин. Карбоксипептидазу добавляют
при уровнях активности между 1 и 2500 CPG/г субстрата (например, молока для сыроделания), предпочтительно 1-250 CPG/г субстрата или более предпочтительно 1-25 CPG/г субстрата. Единицы CPG определены в примере 1. Протеазную активность измеряли по гидролизу казеина (раствор для анализа 6 г/л)
при рН 6,0, 4°С в течение 1 ч. 1 протеазная единица (1 PU) представляет собой количество фермента,
которое производит за 1 мин (растворимого в ТХУ) такое количество гидролизата, поглощение которого
(280 нм) равно таковому раствора тирозина 1 мкм). Препарат карбоксипептидазы определяется как свободный от эндопротеазной активности, если соотношение эндопротеазной активности и карбоксипептидазной активности (PU/CPG) в препарате менее 0,01, предпочтительно менее 0,001 и наиболее предпочтительно менее 0,0005. Карбоксипептидаза предпочтительно представляет собой широкий спектр карбоксипептидаз, которые могут высвободить основную часть природных аминокислот из пептидов или
белков. Широкий спектр карбоксипептидаз определяется как фермент, способный высвободить по
меньшей мере 80% природных аминокислот в количествах, детектируемых способом, описанным в примере 3 данной заявки. Предпочтительно препарат карбоксипептидазы содержит карбоксипептидазу, в
которой 90% карбоксипептидазной активности, измеренной, как описано в примере 1, обеспечивается
одним ферментом, но также возможны комбинации карбоксипептидаз.
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что применение очищенной карбоксипептидазы
CPD I (PEPG) из штамма Aspergillus способно ускорять созревание сыра. Примерами подходящего Aspergilli являются A. niger, A. oryzae и A. sojae. Предпочтительно использование CPD 1 из A. niger. Фермент был описан (Dal Degan, Ribadeau-dumas & Breddam, Appl. Environ. Microbiol (1992), 58, 2144-2152),
и была определена его аминокислотная последовательность (Svendsen & Dal Degan, Bioch. Biophys. Acta
(1998), 1387, 369-377). Карбоксипептидаза также может быть использована для ускорения развития аромата сыра в МФСах. Другие предпочтительные применения карбоксипептидазы лежат в области развития аромата в ферментированных пищевых продуктах, таких как ферментированная колбаса и пиво, ситуация для которых подобна таковой для сыра, как известно, особенно важна доступность свободных
аминокислот, таких как валин, лейцин, изолейцин и фенилаланин, также как серосодержащих аминокислот, таких как метионин.
На чертеже показан профиль активности в зависимости от рН.
Пример 1. Клонирование CPD-I (PEPG).
Аминокислотная последовательность карбоксипептидазы I (PEPG) A. niger описана в (Svendsen &
Dal Degan, Bioch. Biophys. Acta (1998), 1387, 369-377). Для ПЦР были разработаны вырожденные праймеры для клонирования гена pepG из геномной библиотеки Aspergillus niger N400 (CBS 120,49) с использованием способов, известных специалистам, квалифицированным в данной области. Ген гибридизовали
с 3' конца глюкоамилазного промотора. Были описаны аналогичные примеры гибридизаций структурного гена с глюкоамилазным промотором (ЕР-А-0420358, ЕР-А-0463706 и WO 99/38956). Во-первых,
структурный ген pepG амплифицировали с помощью ПЦР с использованием фрагмента гена, содержащего ген, и очищали. Во-вторых, промоторную область гена glaA амплифицировали с помощью ПЦР с
использованием на 3' конце праймера, который перекрывается с 5' концом структурного гена pepG. Втретьих, два ПЦР-фрагмента соединяли посредством ПЦР-сращивания с олигонуклеотидным праймером
промотора 5' glaA и олигонуклеотидом, перекрывающимся со стоп-кодоном pepG в противоположном
направлении. В-четвертых, полученный гибридный фрагмент клонировали в экспрессионный вектор
pGBTOP7 A niger (WO 99/38956), с получением гибридной плазмиды, содержащей промотор glaA, структурный ген pepG и терминатор glaA. Данную плазмиду расщепляли HindIII и котрансформировали с
pGBBAAS-1, расщепленным Xho I в Aspergillus niger ISO502, главным образом, как описано в WO
99/38956. Трансформанты, отобранные для выращивания на ацетамидных чашках, анализировали с использованием ПЦР колоний для проверки наличия экспрессионной кассеты pepG с использованием известных способов. Определяли последовательность гена, и последовательность геномной ДНК, кодирующая последовательность, и соответствующая аминокислотная последовательность приведены в виде
SEQ ID NO: 1, 2 и 3 соответственно. Трансформанты A. niger pepG культивировали в колбе на качалке с
использованием описанных ранее способов (WO 99/38956). Через 6 дней роста при 34°С супернатанты
анализировали на наличие активности. Активность PEPG определяли добавлением 10 мкл культурального супернатанта к 990 мкл раствора, содержащего 45 мМ Na-ацетат (рН 4,5), 0,95 мМ ЭДТА и 0,2 мМ
-3-
013237
FA-Phe-Ala (выпускаемый Bachem). Происходило изменение оптической плотности при 337 нм. Снижение оптической плотности являлось измеряемой величиной для активности PEPG. Одну единицу фермента (1 CPG) определяли как количество фермента, необходимое для снижения оптической плотности
при 337 нм на 1 единицу поглощения в минуту в условиях тестирования. Трансформант, показавший
самую высокую величину CPG на 1 мл, отбирали для экспрессии PEPG.
Пример 2. Очистка PEPG.
PEPG очищали из культурального бульона Aspergillus niger, в котором экспрессировали фермент
согласно описанному способу (Dal Degan, Ribadeau-dumas & Breddam, Appl. Environ. Microbiol (1992) 58,
2144-2152) за исключением того, что опускали стадию очистки на CABS-сефарозе. Определяли активность конечного в значительной степени очищенного фермента 150 CPG/мл с использованием измерения
активности, как описано в примере 1. Активность эндопептидазы была ниже пределов детектирования
(<0,6 PU/мл). Продуцирование и очистку фермента повторяли с выходом конечного препарата, обладающего карбоксипептидазной активностью 650 CPG/мл и эндопротеазной активностью 2,25 PU/мл. Соотношение PU/CPG для последнего препарата составляло 0,003.
Пример 3. Определение субстратной специфичности PEPG.
Субстратную специфичность очищенной PEPG определяли с использованием субстратов Z-Ala-X, в
которых Z представляет собой бензилоксикарбонил и X представляет собой любую аминокислоту (однобуквенный код) A, D, E, F, G, Н, I, К, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W, Y. Все субстраты были выпущены
Bachem, за исключением X=Q или Т, субстраты для которых были выпущены PEPSCAN (The Netherlands). Специфичность фермента определяли при рН 4,0 и 40°С в растворах, которые содержали пептидные субстраты 3 мМ. Реакцию начинали добавлением 5 мкл раствора фермента (440 единиц/мл) к 95 мкл
реакционных смесей. Сразу отбирали образцы для каждого субстрата при t=0 мин и наносили на ТСХпластины (Merck HPTLC [пластины 20×10 силикагель 60]), другой образец отбирали через 45 мин инкубирования и также наносили на ту же пластину. В качестве контроля на ту же самую пластину наносили
раствор субстрата без фермента. Пластину проявляли распылением готового к применению нингидрин
спрея (ACROS) при взаимодействии нингидрина со свободными аминогруппами. Активность фермента
оценивали: - (нет активности), +/- (низкая активность), до + (невысокая активность), до +++++ (очень
высокая активность). Очень высокую активность (+++++) для конкретного субстрата отмечали, если весь
субстрат в образце был конвертирован уже при t=0. Результаты следующие:
нт: не подвергнуто тестированию.
Ссылка: данные, полученные из Dal Degan, Ribadeau-dumas & Breddam, Appl. Environ. Microbiol (1992), 58, 2144-2152. Цифры показывают значения величин kcat/kM в мин-1мМ-1.
Данные в таблице показывают, что клонированная и очищенная PEPG подобна таковой, описанной
Dal Degan в 1992, но также есть некоторые неожиданные отличия. Фермент предпочтительно высвобождает гидрофобные аминокислоты F, I, L, М и V. Предпочтение для клонированного гена, однако, отличается от такового, описанного Dal Degan и др., который проявляет наибольшее предпочтение к I, хотя
клонированный фермент проявляет самую высокую активность по отношению к L, М и V. Также очищенный фермент достаточно активен по отношению к K, более активен, чем, например, по отношению к
А и D, что отличается от данных, описываемых Dal Degan и др. Понятно, что карбоксипептидаза обладает очень широкой субстратной специфичностью и способна работать со всеми аминокислотами, возможно, исключая С, которую не тестировали.
Пример 4. Демонстрация для PEPG ускоренного созревания сыра для мини-сыра (тип Чеддер).
Миниатюрные сыры получали, как описано Shakeel-Ur-Rehman и др. (Protocol for the manufacture of
miniature cheeses in Lait, 78 (1998), 607-620). Сырое коровье молоко пастеризовали нагреванием в течение
30 мин при 63°С. Пастеризованное молоко переносили в пластиковые стаканы для центрифугирования с
широким горлом (200 мл на стакан) и охлаждали до 31°С. Затем, 0,72 мл заквасочной культуры DS 5LT1
(DSM Gist B.V., Delft, The Netherlands) добавляли к каждой порции 200 мл пастеризованного молока в
стаканах для центрифугирования, и молоко созревало в течение 20 мин. Затем добавляли раствор CaCl2
(132 мкл 1 моль⋅л-1 раствора на 200 мл созревшего молока), затем добавляли молокосвертывающий фер-4-
013237
мент (0,04 IMCU на мл). В случае использования PEPG при проведении эксперимента, данный фермент
добавляли вместе с молокосвертывающим ферментом. Растворы молока выдерживали в течение 40-50
мин при 31°С до образования сгустка. Сгусток разрезали вручную с помощью устройства для нарезания
с натянутой проволокой, находящейся на расстоянии 1 см от корпуса. Порезы смыкались в течение 2
мин, и затем следовало перемешивание с невысокой интенсивностью в течение 10 мин. После этого температуру постепенно увеличивали до 39°С в течение 30 мин при непрерывном перемешивании смеси
сгусток/сыворотка. После достижения рН 6,2 смесь сгусток/сыворотка центрифугировали при комнатной
температуре в течение 60 мин при 1700 G. Сыворотку сливали и сгустки выдерживали на водяной бане
при 36°С. Сыры переворачивали каждые 15 мин, пока рН не снизился до 5,2-5,3, и затем центрифугировали при комнатной температуре при 1700 G в течение 20 мин. После изготовления сыры созревали при
12°С и органолептический анализ проводили через 3 и 6 недель созревания с помощью группы обученных дегустаторов минимум из трех человек.
Для молока для сыроделания использовали несколько доз PEPG: 0 (=контроль), 5, 50 и 500 CPG/200
мл молока для сыроделания. Ясно, что добавление PEPG приводит к общему увеличению интенсивности
аромата, приводя к более зрелому вкусу по сравнению с контрольным образцом сыра. Это произошло в
случае добавления всех уровней PEPG, даже при добавлении самого низкого уровня PEPG (5 CPG/200
мл) потребовалось 6 недель созревания для обеспечения четкого эффекта. Для всех остальных доз (50 и
500 CPG/мл) воздействие на вкус было очевидно уже через 3 недели созревания. Результаты ясно показали, что PEPG ускоряет развитие аромата сыра, и что эффект зависит от дозы, и что не наблюдалось
развития неприятного аромата.
Пример 5. Демонстрация для PEPG ускоренного созревания сыра типа Гауда.
Сыры Гауда получали в 200 л цистернах с использованием заквасочной культуры DelvoTec®DX31D (выпускаемая DSM) и Maxiren600 (выпускаемая DSM; 55 IMCU/л молока; DSM) в качестве молокосвертывающего фермента, с использованием стандартного протокола производства сыра
Гауда, известного специалистам, квалифицированным в данной области. Молоко для сыроделания стандартизовали для получения отношения казеин/жир около 0,9 и пастеризовали в течение 15 с при 12°С
PEPG добавляли с уровнем 25 CPG/л непосредственно перед добавлением Maxiren. Контрольный образец сыра получали из того же количества молока с использованием того же процесса производства, но
без добавления PEPG. После коагуляции молока сгусток нарезали и перемешивали с низкой скоростью в
течение 20 мин. Затем эту половину сыворотки заменяли теплой водой (40% начального объема) для
увеличения температуры от 31 до 36°С. После этого смесь сгусток/сыворотка перемешивали при увеличивающейся скорости в течение еще 30-40 мин, пока сгусток не стал достаточно крепким для обсушки.
Сгусток стягивали и оставляли на полчаса перед помещением в 5 кг формы. Сыры спрессовывали с использованием увеличивающегося давления в течение приблизительно 4 ч, затем сыры оставляли на ночь.
На следующее утро их помещали в солевой раствор на 24 ч. После высыхания сыра его покрывали защитным покрытием, и начинался период созревания сыра. Во время этого периода их хранили при 15°С,
относительной влажности 80%. Сыры регулярно переворачивали и покрывали покрытием во время периода созревания. Сыры оценивали органолептически через 6 недель и 3 месяца созревания с использованием группы обученных дегустаторов минимум из 8 человек. Через 6 недель сыр, содержащий PEPG,
обладал значительно более высокими уровнями сладости по сравнению с контрольным образцом сыра.
Через 3 месяца созревания сыр, содержащий PEPG, четко отличался от контрольного образца сыра, показывая значительно более интенсивный аромат (и также четко отличался кремообразной текстурой). Аромат сыра, содержащего PEPG, был приятным и более зрелым по сравнению с контрольным образцом
сыра. Эксперимент ясно показал, что PEPG ускоряет развитие аромата сыра и отсутствие развития неприятного аромата.
Пример 6. Демонстрация рН профиля PEPG.
Ферментативную реакцию проводили в буферах с различным рН. Буфер с рН 2,3 и 4 содержал 0,1М
фосфата натрия, 0,05М лимонной кислоты и 0,05М уксусной кислоты; буфер с рН 4,5 и 6 содержал
0,05М фосфата натрия, 0,05М уксусной кислоты и 0,05М трис. рН доводили до соответствующей величины с использованием 4М HCl или 4М NaOH. Раствор субстрата содержал 8 мМ FA-Phe-Ala в метаноле. Раствор для анализа содержал 965 мкл буфера, 25 мкл раствора субстрата и 10 мкл очищенного фермента. Реакции проводили при 25°С и следили за изменением поглощения при 337 нм в течение 10 мин.
Относительную активность рассчитывали согласно изменению поглощения. Усредняли результаты двух
отдельных измерений, исключая измерение при рН 4, которое проводили дважды в двух различных буферах. Результаты приведены на чертеже.
Профиль на чертеже показывает, что фермент обладает оптимумом рН при рН 4. Оптимум очевидно намного выше, чем оптимум рН 3,1-3,4 карбоксипептидазы, описанной Dal Degan (Dal Degan, Ribadeau-dumas & Breddam, Appl. Environ. Microbiol (1992) 58, 2144-2152 и приведенных здесь ссылках).
Пример 7. Применение карбоксипептидазы для получения модифицированного ферментированного
сыра.
Сырную массу получали из смеси 90% сыра Гауда возрастом 5 недель и 10% зрелого сыра Гауда, в
основном, как описано Smith и др. ((1995) Cheasy model: a cheese-based model to study cheese ripening. In
-5-
013237
P. Etievant, Bioflavours. (pp.185-190).
Препарат МФС с использованием карбоксипептидазы.
Незрелый сыр Гауда (приблизительно 6 недель созревания) покупали в супермаркете и натирали на
мелкой терке. Воду MilliQ добавляли к натертому сыру до достижения конечного содержания воды приблизительно 50% и после перемешивания сырную пасту разделяли на порции по 200 г и помещали в отдельные контейнеры. Смесь нагревали в течение 5 мин при 80°С для предотвращения роста микроорганизмов. Содержимое одного из контейнеров анализировали для подтверждения отсутствия роста микроорганизмов определением количества бактерий, дрожжей и грибов путем посева на чашках Петри. Другие контейнеры хранили при 4°С и использовали в дальнейшем. Если определение количества микроорганизмов путем посева на чашках Петри подтверждало отсутствие роста микроорганизмов, использовали
сырные пасты из оставшихся контейнеров. Перед добавлениями сырную пасту нагревали до 55°С и медленно охлаждали до 30°С. Растворы PEPG, содержащие 1,6, 0,16 и 0,016 CPG/мл готовили в воде MilliQ.
Затем 2 мл каждого раствора PEPG добавляли в отдельные контейнеры, содержащие 200 г сырной пасты,
и смесь перемешивали мешалкой, контрольный образец пасты содержал только MilliQ и не содержал
PEPG. Затем контейнеры хранили при 17°С. Через 4 недели аромат паст определяли органолептически с
помощью группы обученных дегустаторов. Увеличение концентраций PEPG приводило к четкому увеличению интенсивности аромата сырных паст. PEPG очевидно является полезной в процессах МФС для
образования аромата сыра.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ развития аромата в сыре или продуктах, получаемых из сыра, включающий добавление
препарата карбоксипептидазы, представляющего собой одну карбоксипептидазу или комбинации карбоксипептидаз, в котором соотношение эндопротеазной активности (PU) и карбоксипептидазной активности (CPG) составляет менее 0,01, к (i) молоку для сыроделия перед или непосредственно вместе с добавлением коагулянта, или (ii) во время стадии соления, или (iii) в сырную пасту.
2. Способ по п.1, в котором карбоксипептидазная активность препарата карбоксипептидазы по
меньшей мере на 90% обеспечивается одним ферментом карбоксипептидазой.
3. Способ по одному из пп.1 или 2, в котором соотношение эндопротеазной активности (PU) и карбоксипептидазной активности (CPG) в упомянутом препарате карбоксипептидазы составляет менее
0,001.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором карбоксипептидаза представляет собой CPD-1, предпочтительно CPD-1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.
5. Способ по любому из пп.1-4, в котором продукт, получаемый из сыра, является модифицированным ферментированным сыром.
6. Применение препарата карбоксипептидазы, представляющего собой одну карбоксипептидазу или
комбинации карбоксипептидаз, имеющего соотношение эндопротеазной активности (PU) и карбоксипептидазной активности (CPG), составляющее менее 0,01, для развития аромата в ферментированном пищевом продукте, где ферментированным продуктом является пиво или колбаса.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
-6-