011877 - 1 - Различные жирные кислоты с множественной

011877
Различные жирные кислоты с множественной ненасыщенностью (PUFA, полиненасыщенные жирные кислоты) и, в частности, жирные омега-3-кислоты (жирные n3-кислоты), являются существенными
компонентами питания человека.
Однако, известно, что в большинстве индустриальных наций обеспечение жирными n3-кислотами
является недостаточным. Напротив, общая доля жиров в питании, а также снабжение насыщенными
жирными кислотами и жирными n6-кислотами являются слишком высокими. В основе этого лежит изменение состава питания, которое имеет место прежде всего в последние приблизительно 150 лет и которое коррелирует с возникновением различных хронических болезней цивилизации, таких как, например, сердечно-сосудистые заболевания - основная причина смерти для индустриальных наций (Simopoulos, А.Р., 1999, Am. J. Clin. Nutr. 70, 560-569). Между тем многочисленные исследования показали, что
целевое повышение снабжения жирными n3-кислотами, в частности, эйкозапентаеновой кислотой (ЕРА)
и докозагексаеновой кислотой (DHA), может значимо уменьшать риск сердечно-сосудистых заболеваний
(GISSI-Prevenzione Investigators (Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell'Infarto miocardico),
1999, Dietary suplementation with n-3 polyunsaturated fatty acids and vitamin E after myocardial infarction;
results of the GISSI-prevenzione trial., Lancet 354, 447-455; Burr et al., 1989, Effects of changes in fat, fish, and
fibre intake on death and myocardial reinfarction: diet and reinfarction trial (DART). Lancet 2, 757-761). Соответственно этому, многими различными организациями (WHO (Всемирной Организацией Здравоохранения, ВОЗ), FAO (Продовольственной и сельскохозяйственной организацией Объединенных Наций,
ФАО), AHA (Американской кардиологической Ассоциацией); ISSFAL, British Nutrition Foundation и многими другими) рекомендуется существенное повышение потребления жирных n3-кислот (Kris-Eherton et
al., Fish Consumption, Fish Oil, Omega-3 Fatty Acids, and Cardiovascular Disease, Circulation 2002, 27472757).
Источниками получения PUFA и, в частности, жирных n3-кислот, являются прежде всего морские
холодноводные рыбы и полученные из них масла, но также морские микроорганизмы, которые имеют
преимущество перед рыбами, заключающееся в том, что они могут выращиваться в ферментерах в требующих меньших затрат и контролируемых условиях для получения PUFA. При ферментативном получении отсутствует опасность загрязнений, которые часто описываются для рыб или полученного из них
(жидкого) рыбьего жира (Olsen SF. Int J Epidemiol. 2001: 1279-80). Кроме того, на состав полученных
масел можно положительно воздействовать посредством выбора организма и условий культивирования,
и он не подвергается сезонным колебаниям, как это также описано для рыбы и рыбных продуктов
(Gamez-Meza et al. Lipids 1999:639-42).
Микроорганизмы, которые пригодны для получения n3-PUFA, находятся, например, среди бактерий рода Vibrio (например, Vibrio marinus) или среди динофлагеллят (Dinophyta), в них, в частности, род
Crypthecodinium, например, С. cohnii, или среди Stramenopiles, таких как Pinguiophyceae, таких как, например, Glossomastix, Phaeomonas, Pinguiochrysis, Pinguiococcus и Polydochrysis. Предпочтительные микроорганизмы для ферментативного получения PUFA принадлежат к Stramenopiles (или Labyrinthulomycota) , в частности, к отряду Thraustochytriales (Traustchytriidea) и в нем, в частности, к родам Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Althornia, Labyrinthuloides, Aplanjchytrium и Ulkenia.
Известно, что некоторые из названных микроорганизмов могут применяться для промышленного
производства жирных кислот, были описаны соответствующие способы. Так, международная патентная
заявка WO 91/07498 А1 раскрывает получение PUFA с использованием организмов родов Schizochytrium
и Thraustochytrium. WO 91/11918 A1 описывает получение PUFA с использованием Crypthecodinium cohnii, WO 96/33263 A1 и соответствующая Европейская патентная заявка ЕР 0823475 А1 описывают получение PUFA с использованием микроорганизмов рода Schizochytrium, тогда как патентная заявка WO
98/03671 раскрывает получение PUFA с использованием микроорганизмов рода Ulkenia.
Природным местом обитания описанных микроорганизмов и, в частности, Labyrinthulomycota, являются морские места обитания. Таким образом, обычно эти микроорганизмы культивируют в соответственных солесодержащих средах, причем для целей данного изобретения содержание соли морской воды определяется как 32-35 г/л и доля натрия и хлорида определяется как 90-95%. Типичные среды для
культивирования морских микроорганизмов, таких как Thraustochytrium и Schizochytrium, основываются
на морской воде (например, АТСС (Американская Коллекция Типовых Культур) 790 Ву+ Medium
[дрожжевой экстракт 1,0 г, пептон 1,0 г, D+-глюкоза 5,0 г, морская вода 1 л]). Но также известно, что
микроорганизмы отряда Thraustochytriales могут выживать при очень низкой солености в культуральной
среде. Однако их рост ниже предела 7,5-15 г соли/л, соответственно солености 7,5-15%, описывается как
лишь очень небольшой и без промежуточных максимумов в более низкой области солености. Оптимальные скорости роста достигаются только выше указанного предела солености (Fan et al. Botanica Marina
45, 2002, S. 50-57).
Часто возникающей проблемой ферментативных процессов являются сильные колебания рН в ходе
культивирования, как следствие появления продуктов метаболизма и/или потребления отдельных компонентов среды. Это относится, в частности, к богатым солями средам для ферментации морских микроорганизмов. Поэтому такие ферментации часто требуют регулирования рН. Однако регулирование показателя рН приводит при ферментации в крупном масштабе к значительным дополнительным расходам.
-1-
011877
При этом необходимы дополнительные сосуды для подачи кислот и щелочей, которые в противном случае могли бы применяться по-другому для подкормки дополнительными компонентами. Кроме того,
титрование для регулирования показателя рН должно контролироваться технически. В связи с ферментацией Labyrinthulomycota для получения PUFA в производственном масштабе в существующем уровне
техники используются способы культивирования с контролируемым показателем рН.
Однако контроль показателя рН посредством в остальном обычных буферных систем для культуры
клеток обнаруживает недостатки. Так, буферная емкость, например, TRIS, HEPES и MOPS, на основе их
показателей рКа более 7, является недостаточной в необходимой для ферментации PUFA рН-области.
TRIS, кроме того, является плохим буфером в рН-областях ниже 7,5, он является потенциально реакционноспособным первичным амином и может активно участвовать в различных биологических реакциях.
Фосфатный буфер, также часто применяемый буфер, имеет свойство осаждаться из раствора в присутствии двухвалентных катионов и, кроме того, является плохим выбором при ферментативных процессах,
которые нуждаются в фосфате или потребляют фосфат. Ацетатные буферы являются непригодными на
основании их узкой буферной области и вследствие того факта, что они метаболизируются в процессе
ферментации. Кроме того, многие альтернативные буферные системы являются нерентабельными вследствие их высоких стоимостей.
Поэтому с учетом существующего уровня техники, задачей данного изобретения было обеспечение
нового, простого и рентабельного способа культивирования морских микроорганизмов. При этом должно достигаться значительное упрощение проведения процесса. Помимо рентабельности этот способ должен сделать возможным получение высокоочищенных PUFA с высоким выходом.
Эти, а также дополнительные, не указанные явно задачи, которые, однако, являются легко выводимыми и раскрываемыми из вступительного обсуждаемого контекста, решаются посредством объектов,
которые определены в пунктах формулы данного изобретения.
Предпочтительный способ для культивирования микроорганизмов отряда Thraustochytriales обеспечен способом по п.1. Этот способ предусматривает культивирование в среде, рН которой стабилизируется исключительно за счет СаСО3, включающей в себя содержание СаСО3 3-15 г/л, и в случае необходимости выделение этих PUFA из микроорганизмов и/или культуральной среды.
Данное изобретение включает в себя, кроме того, способ получения высокоочищенных PUFA.
Предпочтительными PUFA являются по данному изобретению DHA, DPA и ЕРА.
В частности, культивируемые в вышеуказанном способе микроорганизмы обнаруживают продуцирование более чем 10%, предпочтительно более чем 14%, и особенно предпочтительно более чем 18%
DHA на сухую биомассу.
В частности, культивируемые в вышеуказанном способе микроорганизмы обнаруживают продуцирование более чем 1%, предпочтительно более чем 2%, и особенно предпочтительно более чем 3% DPA
на сухую биомассу.
Посредством выделения PUFA из биомассы микроорганизмов и/или из культуральной среды после
культивирования могут быть получены PUFA с высоким выходом и высокой степенью чистоты.
Кроме того, данное изобретение обеспечивает также способ получения биомассы, причем эта биомасса обеспечивается способом культивирования по данному изобретению.
Эта биомасса может найти применение для известных видов применения. В частности, эта биомасса, например, в высушенном состоянии (сухая биомасса), может применяться в качестве пищевых продуктов или в качестве кормовых продуктов.
Кроме того, данное изобретение включает в себя также масло, которое получают посредством проведения способа культивирования по данному изобретению, и это масло выделяют из микроорганизмов
и/или культуральной среды.
В частности, речь идет при этом о масле, которое наряду с дополнительными предпочтительными
целями применения может выгодным образом применяться для питания человека.
При этом микроорганизмы при условиях данного изобретения обнаруживают продукцию более чем
30 мас.% масла, предпочтительно более чем 35 мас.% масла на единицу массы сухой биомассы.
Под маслом в соответствии с данным изобретением понимают долю по меньшей мере 70% нейтральных липидов и по меньшей мере 2% фосфолипидов, что соответствует известному специалистам в
данной области спектру жирных кислот Thraustochytriales. Нейтральные липиды состоят при этом по
меньшей мере из 80% триглицеридов и других соединений, таких как, например, диацилглицериды, стерины и т.д. Кроме того, массовая доля триглицеридов состоит из приблизительно 95% жирных кислот и
5% глицерина.
Возможность способности морского микроорганизма ферментироваться для продуцирования PUFA
без наружного регулирования показателя рН, в частности, при условиях, которые делают возможным
быстрый рост при высоком потреблении глюкозы, была совершенно неожиданной. Именно при таких
условиях при ферментации морских микроорганизмов без соответствующего контроля рН очень быстро
возникает подкисление среды, которое приводит к прекращению роста (см. пример 1 и Wen, Z.-Y. и
Chen, F., 2003, Biotechnology Advances 21, 273-294).
Способ данного изобретения обходится неожиданным образом без добавления прежнего стабили-2-
011877
зирующего показатель рН средства. Под средствами, стабилизирующими показатель рН, понимают в
соответствии с данным изобретением как регламентированное в зависимости от установленного во время
культивирования показателя рН добавление кислоты или основания из дополнительных резервуаров, так
и применение буферных систем в самой среде, хотя авторам данного изобретения неизвестны рентабельно пригодные способы культивирования с применением буферных систем, таких как, например, Трисбуфер или фосфатный буфер.
Согласно данному изобретению СаСО3 является важным средством для стабилизации показателя
рН. Несмотря на это, не исключено, что при определенных условиях может быть необходимым добавление кислоты или основания к культуре для установления показателя рН. Такое добавление включено в
данное изобретение, пока СаСО3 остается существенным средством для стабилизации показателя рН.
Если, например, показатель рН во время культивирования на основе особенно быстрого роста микроорганизмов падает ниже определенного желаемого показателя, то этот желаемый показатель может краткосрочно устанавливаться кислотой или основанием, без добавления значительного количества средства
для регулирования показателя рН.
Термины регулирования показателя рН и управления показателем рН или стабилизации показателя
рН используются в данном изобретении взаимозаменяемо.
СаСО3 остается важным средством, если величина различия показателей рН, которые могут быть
измерены с добавлением кислот или без добавления кислот (в каждом случае с добавлением СаСО3 в
соответствии с данным изобретением), меньше 1, предпочтительно меньше 0,75, особенно предпочтительно меньше 0,5, еще более предпочтительно меньше чем 0,2, и наиболее предпочтительно меньше
чем 0,1. Такое добавление кислот и/или оснований считают незначительным добавлением кислот и/или
оснований, которое включено в данное изобретение.
Предпочтительными являются системы культивирования, которые полностью обходятся без применения добавления кислот и/или оснований.
Кроме того, многие альтернативные буферные системы являются нерентабельными в сравнении с
применением карбоната кальция вследствие более высоких затрат.
Высокая эффективность карбоната кальция в качестве буфера для культивирования микроорганизмов рода Thraustochytriales является неожиданной, так как возникающий диоксид углерода имеет лишь
ограниченную растворимость в воде и вследствие этого буферная емкость понижается во время ферментации.
Неожиданным образом не только была возможной ферментация до полного потребления глюкозы,
но, кроме того, значимо повышалась доля PUFA в биомассе при применении стабилизируемой карбонатом кальция среды. Еще более удивительным является то, что утилизация глюкозы и связанное с ней
продуцирование PUFA ускоряется и таким образом приводит к повышенному объемно-временному выходу продукции.
До данного изобретения не был известен ферментационный процесс для получения жирных n3кислот в микроорганизмах из отряда Thraustochytriales с использованием рН-стабилизируемой карбонатом кальция среды, посредством которой можно было избежать применения дополнительного средства,
стабилизирующего показатель рН.
PUFA являются в соответствии с данным изобретением многократно ненасыщенными длинноцепочечными жирными кислотами с длиной цепи > С12 с по меньшей мере двумя двойными связями. Получаемые в соответствии с данным изобретением PUFA являются, в частности, жирными n3-кислотами и
жирными n6-кислотами.
Под жирными n3-кислотами (жирными омега-3-кислотами, жирными ω3-кислотами) в контексте
данного изобретения подразумевают многократно ненасыщенные длинноцепочечные жирные кислоты с
длиной цепи > С12 с по меньшей мере двумя или более двойными связями, причем первая из двойных
связей находится между атомами углерода С3 и С4 от алкильного конца.
Для получения PUFA по данному изобретению применяют микроорганизмы из группы рассматриваемых Labyrinthulomycota. Микроорганизмы отряда Thraustochytriales (Thraustochytriidea) являются
предпочтительными (Lewis, T.E., Nichols, P.D., McMeekin, T.A., The Biotechnological Potential of Thraustochrytrids, Marine Biotechnology, 1999, S. 580-587 и Porter, D. Phylum Labyrinthulomycota in Handbook of
protoctista: the structure, cultivation, habitats, and life histories of the eukaryotic microorganisms and their descendans exlusive of animals, plants, and fungi; a guide to the algae, ciliates, foravbnifera, sporozoa, water
molds, and other protoctists. Editors: Margulis, L., Corliss, J.O., Melkonian, M. and Chapman, D.J., editorial
coordinator, McKhann, H.I., Jones and Barlett Publishers, ISBN 0-86720-052-9 1990, S. 388-398). Особенно
предпочтительными являются микроорганизмы родов Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium,
Althornia, Labyrinthuloides, Aplanjchytrium и Ulkenia. Особенно предпочтительными из них являются
Schizochytrium, Thraustochytrium и Ulkenia. В частности, предпочтительными являются: Japonochytrium
sp. ATCC 28207, Thraustochytrium aureum (в частности, ATCC 28211 или ATCC 34304), Thraustochytrium
roseum ATCC 28210, Thraustochytrium sp. ATCC 20890, ATCC 20891, ATCC 20892 и ATCC 26185,
Schizochytrium aggregatum ATCC 28209, Schizochytrium sp. ATCC 20888 и ATCC 20889, Schizochytrium
-3-
011877
SR21, а также Ulkenia spec. SAM 2179 и SAM 2180.
Подходящими микроорганизмами для способа в соответствии с данным изобретением являются как
формы дикого типа, так и мутанты и полученные из них штаммы, а также рекомбинантные штаммы соответствующих организмов. В особой степени, данное изобретение включает в себя мутанты или рекомбинантные штаммы для повышения продуцирования PUFA.
Микроорганизмы по данному изобретению культивируют инокуляцией жидкой или твердой среды
предварительной культурой данного организма.
Подходящие для микроорганизмов отряда Thraustochytriales способы культивирования хорошо известны специалисту. Обычно, но не исключительно, это культивирование проводят с использованием
водной ферментации в соответствующем резервуаре. Примеры типичных резервуаров для подобной
ферментации включают в себя встряхиваемые колбы или биореакторы, такие как, например, STR (перемешиваемый танк-реактор) или барботажные колонны. Культивирование проводят обычно при температурах 10-40°С, предпочтительно при 20-35°С, особенно предпочтительно при 25-30°С, еще более предпочтительно при 27-29°С и, в частности, при 28±0,5°С.
В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения содержание карбоната кальция
среды со стабилизированным рН соответствует величине в диапазоне 3-15 г/л, предпочтительно 4-12 г/л
и особенно предпочтительно 5-10 г/л. Еще более предпочтительно содержание карбоната кальция равно
7,5±0,5 г/л.
Среда со стабилизированным показателем рН включает в себя дополнительно предпочтительно
один или несколько источников углерода, в также один или несколько источников азота. Специалисту в
данной области хорошо известны применимые в качестве источников углерода и азота вещества для
культивирования микроорганизмов отряда Thraustochytriales.
Применимыми источниками углерода являются, например, углеводы, такие как глюкоза, фруктоза,
ксилоза, сахароза, мальтоза, растворимые крахмалы, фукоза, глюкозамин, декстран, глутаминовая кислота, меласса, глицерин или маннит или также жиры и масла или гидролизаты растений.
Применимыми источниками азота являются, например, пептон, дрожжевой экстракт, солодовый
экстракт, мясной экстракт, казаминокислоты, кукурузный экстракт или соевые бобы, применимыми органическими источниками азота являются, например, глутамат и мочевина, но также и неорганические
источники азота, такие как, например, ацетат аммония, гидрокарбонат аммония, сульфат аммония или
нитрат аммония, могут применяться в качестве источников азота.
Среда со стабилизированным показателем рН может, наряду с карбонатом кальция, содержать все
дополнительные, известные специалисту, требуемые для культивирования микроорганизмов отряда
Thraustochytriales компоненты, в частности, неорганические соли, например соли Са, Mg, Na, К, Fe, Ni,
Co, Cu, Mn, Mo ИЛИ Zn. В качестве примеров могли бы быть названы фосфаты, такие как гидрофосфат
калия, или хлориды, такие как хлорид магния, сульфаты, такие как сульфат аммония, сульфат магния,
сульфат железа или сульфат натрия. Дополнительными применимыми неорганическими солями являются, например, галогениды, такие как бромид калия или иодид калия, а также другие карбонаты, такие как,
например, гидрокарбонат натрия.
В случае необходимости эта среда может включать в себя дополнительные макро- или микроэлементы пищи, такие как аминокислоты, пурины, пиримидины, жидкий кукурузный экстракт (кукурузный
экстракт), гидролизаты белков, витамины (водорастворимые и/или водонерастворимые) и другие хорошо
известные специалисту компоненты сред. Если необходимо, могут быть добавлены антивспенивающие
средства. Эта среда может содержать комплексные компоненты или иметь химически определенный состав.
Количество отдельных компонентов может варьироваться, пока отсутствует негативное действие на
рост или продуктивность микроорганизмов. Специалист может легко определить состав в соответствии с
потребностями микроорганизма в каждом отдельном случае. Обычно источник углерода добавляют в
концентрации до 300 г/л, а источник азота в концентрации 1-30 г/л. Предпочтительно содержание азота
устанавливают в зависимости от содержания углерода среды.
Особенно предпочтительная среда со стабилизированным показателем рН включает в себя глюкозу,
дрожжевой экстракт, жидкий кукурузный экстракт (Corn Steep Liqour [CSL]), хлорид магния, карбонат
кальция, хлорид кальция, сульфат натрия и фосфат калия.
Показатель рН этой среды устанавливают перед началом ферментации в диапазоне 3-10, предпочтительно 4-8, особенно предпочтительно 5-7 и еще более предпочтительно приблизительно 6 добавлением соответствующей кислоты или щелочи.
Затем среду стерилизуют. Способы стерилизации сред хорошо известны специалисту, например,
могли бы быть названы автоклавирование и стерильное фильтрование.
Культивирование может происходить периодическим, периодическим с подпиткой или непрерывным образом, как это обычно известно специалисту в данной области.
Периодическое культивирование или периодическое культивирование с подпиткой происходит
обычно на протяжении 1-12 дней, предпочтительно 2-10 дней, особенно предпочтительно 3-9 дней.
-4-
011877
Компоненты сред могут добавляться по отдельности или в смешанном виде, допустимо также
предварительное смешивание. Эти компоненты, в частности, источник (источники) углерода и азота или
определенные добавки к среде, могут добавляться до или во время культивирования. Добавление может
повторяться один или несколько раз или происходить непрерывно.
Продуцируемые PUFA существуют обычно в форме нейтральных жиров, например в виде триглицеридов или полярных липидов, таких как, например, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин или
фосфатидилинозит.
Для целей данного изобретения под терминами PUFA жирные n3-кислоты или активные n3вещества подразумеваются все возможные формы, в которых могут находиться соответствующие жирные кислоты, т.е. как свободные жирные кислоты, так и сложные эфиры, триглицериды, фосфолипиды
или другие производные. Все эти вещества в дальнейшем описании объединяются, и эти термины используются как синонимы. В дальнейшем эти PUFA могут быть преобразованы химической или биокаталитической переэтерификацией, например с использованием подходящих ферментов (липаз) и обогащены до или после выделения из культуры.
Выделение PUFA из ферментируемых микроорганизмов или из среды и анализ спектра жирных кислот происходит в соответствии с известными для специалиста и общепринятыми способами (Wanasundra, U.N., Wanasundra, J., Shahidi, F., Omega-3 fatty acid concentrates: a review of production technologies,
Seafoods - Quality, Technology and Nutraceutical Applications, 2002, S. 157-174).
Далее, лежащая в основе способа данного изобретения ферментационная среда со стабилизированным рН описывается при помощи нескольких примеров. Однако эта ферментационная среда, а также
данное изобретение не ограничиваются этими примерами.
Пример 1. Ферментация штамма Ulkenia spec. Sam 2179 для получения PUFA в различных культуральных средах, показатель рН которых стабилизируется исключительно различными количествами
CaCO3.
Штамм Ulkenia spec. Sam 2179 культивировали в колбах Эрленмейера на 300 мл с дефлектором в 50
мл среды.
Состав среды:
Ферментационная среда:
Добавление СаСО3 на каждую колбу на 50 мл:
Показатель рН доводили до 6,0 при помощи NaOH и автоклавировали.
Условия культивирования:
Сбор клеток происходил после 96 ч культивирования посредством центрифугирования. Затем клетки лиофилизировали и определяли сухую биомассу. Расщепление клеток и определение жирных кислот
происходило обработкой нагреванием в течение 2 ч в 10%-ном метанольном растворе хлористоводородной кислоты при 60°С (при перемешивании). Затем сложные эфиры анализировали в газовом
хроматографе для определения состава жирных кислот.
-5-
011877
Таблица 1. Параметры ферментации в зависимости от концентрации карбоната кальция
ВТМ: сухая биомасса; DHA/BTM: мас.% DHA (докозагексаеновой кислоты) на единицу массы
ВТМ; г/л×д; объемно-временной выход в граммах на литр в день; площадь DHA (%): доля DHA в спектре жирных кислот.
Ферментация Ulkenia spec. Sam 2179 в ферментационной среде без достаточной стабилизации рН
приводит в ходе ферментации к замедлению потребления глюкозы и к прекращению роста вследствие
сильного понижения показателя рН (см. среда 1.1-1.3). Лишь более высокие количества СаСО3-буфера
приводят к стабилизации показателя рН во время культивирования (среда 1.4 и 1.5). При этом с увеличением концентрации СаСО3 происходит также повышенное потребление глюкозы во время культивирования. Вследствие стабилизации показателя рН и зависящего от этого повышенного потребления глюкозы
достигаются более высокие показатели биомассы и происходящие вследствие этого более высокие объемно-временные выходы, которые при вышеуказанных экспериментальных условиях находятся при приблизительно 2 г/л в день.
Пример 2. Ферментация штамма Ulkenia spec. Sam 2179 для получения PUFA в различных культуральных средах, показатель рН которых стабилизируется исключительно различными количествами СаСО3, до лимитирования глюкозы
Штамм Ulkenia spec. Sam 2179 культивировали в колбах Эрленмейера на 300 мл с дефлектором в 50
мл среды до полного потребления глюкозы.
Состав среды:
Ферментационная среда:
Добавление СаСО3 на каждую колбу на 50 мл:
Показатель рН доводили до 6,0 с помощью NaOH и автоклавировали.
Условия культивирования:
Сбор клеток происходил после 144,5 ч культивирования посредством центрифугирования. Затем
клетки лиофилизировали и определяли сухую биомассу. Расщепление клеток и определение жирных кислот происходило обработкой нагреванием в течение 2 ч в 10%-ном метанольном растворе хлористоводородной кислоты при 60°С (при перемешивании). Затем сложные эфиры анализировали в газовом
хроматографе для определения состава жирных кислот.
Таблица 2. Параметры ферментации после лимитирования глюкозы
Ферментация Ulkenia spec. Sam 2179 в забуференной 5 г/л или 10 г/л СаСО3 среде делает возможным культивирование до лимитирования глюкозы без сильного понижения показателя рН. Достигаемая
при этом биомасса и доля DHA на биомассу, с приблизительно 58-64 г/л биомассой и 20-22% DHA/BTM,
-6-
011877
являются в соответствии с полным потреблением глюкозы очень высокими. При этом оказывается, что
более высокая концентрация СаСО3 (10 г/л) приводит к более высокой биомассе, однако доля важной
DHA PUFA в расчете на биомассу несколько снижается. Однако полученный при этом объемновременной выход DHA остается приблизительно одинаковым при обеих концентрациях.
Выход 3. Культивирование штамма Ulkenia spec. Sam 2179 для получения PUFA при оптимизированных условиях ферментации
Штамм Ulkenia spec. Sam 2179 культивировали в колбах Эрленмейера на 300 мл с дефлектором в 50
мл среды до полного потребления глюкозы. Оптимизирование ферментации происходило из концентрации СаСО3 7,5 г/л и измененной предварительной культуры. Для предварительной культуры применяли
вместо стационарной культуры в DH1-среде встряхиваемую культуру с той же самой средой (48 ч, 150
об./мин и 28°С).
Состав среды:
Среда предварительной культуры:
Среда DH1
рН доводили до 6,0 при помощи HCl.
Ферментационная среда:
Добавление СаСО3 на каждую колбу на 50 мл:
Показатель рН доводили до 6,0 с помощью NaOH и автоклавировали.
Условия культивирования:
Сбор клеток происходил после 99,75 ч культивирования посредством центрифугирования. Затем
клетки лиофилизировали и определяли сухую биомассу. Расщепление клеток и определение жирных кислот происходило обработкой нагреванием в течение 2 ч в 10%-ном метанольном растворе хлористоводородной кислоты при 60°С (при перемешивании). Затем сложные эфиры анализировали в газовом
хроматографе для определения состава жирных кислот.
Таблица 3. Параметры ферментации при оптимизированных буферных условиях
Посредством применения оптимизированных условий ферментации, при которых Ulkenia spec. Sam
2179 сначала культивировали 48 ч при 28°С и 150 об./мин в среде DH1, удалось значительно улучшить
объемно-временной выход на более, чем 3,5 г/л×д. Это достигается прежде всего за счет более быстрого
роста, посредством чего лимитирование глюкозы достигалось за менее чем 100 ч. Применение 7,5 г/л
СаСО3 в ферментационной среде позволяет достигать стабилизации рН, необходимой для оптимизированного культивирования. Применение 7,5 г/л СаСО3 вытекало из результатов примера 2, в которых 10
г/л СаСО3 давало более высокие показатели биомассы, а 5 г/л, напротив, приводили к лучшим показателям DHA. Таким образом, предполагалось, что оптимальная для получения DHA концентрация СаСО3
(т.е. для получения наивысшей возможной биомассы при наивысшем возможном содержании DHA) находится между 5 и 10 г/л СаСО3. Наряду со стабилизацией показателя рН применение ферментационной
среды в соответствии с данным изобретением приводит к удивительно высокому объемно-временному
выходу DHA более 3 г/л×д к моменту ограничения по глюкозе. При этом достигались показатели биомассы, какие были получены в примере 2, но, кроме того, доля DHA на сухую биомассу и достигаемые
количества DHA (более 10%) были более высокими.
-7-
011877
Пример 4. Ферментация штамма Ulkenia spec. Sam 2179 для получения PUFA в культуральной среде с стабилизацией рН или без стабилизации рН с использованием СаСО3
Штамм Ulkenia spec. Sam 2179 культивировали в каждом случае в 5-литровом ферментере до полного потребления глюкозы.
Состав среды:
Ферментационная среда:
Для ферментации с регулированием рН: показатель рН доводили до 4,0 при помощи Н3РО4 и автоклавировали.
Для ферментации без регулирования рН: показатель рН доводили до 6,0 при помощи NaOH и автоклавировали, как и добавку 7,5 г/л СаСО3.
Условия культивирования:
Таблица 4. Параметры ферментации с регулированием и без регулирования рН
Применение стабилизированной при помощи СаСО3 ферментационной среды данного изобретения
делает возможным также культивирование Ulkenia spec. Sam 2179 в 5-литровом ферментере до лимитирования глюкозы, без регулирования рН. Применение СаСО3 в достаточном количестве приводит к более
быстрому росту вследствие ускоренного потребления глюкозы. Кроме того, достигаются более высокие
биомассы. Далее, в этой связи во время ферментации достигаются более высокая доля DHA на биомассу
и более высокие количества DНА. Это приводит к существенному повышению объемно-временного выхода DHA при СаСО3-забуференной в отношении ферментации рН более чем на 15%.
Пример 5. Ферментация Schizochytrium spec. SR21 для получения PUFA в ферментационной среде
1.6, стабилизированной 7,5 г/л СаСО3
Штамм Schizochytrium spec. SR21 культивировали в колбах Эрленмейера на 300 мл с дефлектором в
50 мл среды до полного потребления глюкозы.
Состав среды:
рН доводили до 6,0 при помощи HCl.
Ферментационная среда:
-8-
011877
Добавление СаСО3 на каждую колбу на 50 мл:
Показатель рН доводили до 6,0 при помощи NaOH и автоклавировали.
Условия культивирования:
Сбор клеток происходил после 96 ч культивирования посредством центрифугирования. Затем клетки лиофилизировали и определяли сухую биомассу. Расщепление клеток и определение жирных кислот
происходило обработкой нагреванием в течение 2 ч в 10%-ном метанольном растворе хлористоводородной кислоты при 60°С (при перемешивании). Затем сложные эфиры анализировали в газовом
хроматографе для определения состава жирных кислот.
Таблица 5. Параметры ферментации при оптимизированных буферных условиях
Описанная в данном изобретении среда со стабилизированным при помощи СаСО3 рН приводит к
оптимизации получения PUFA также и у других организмов Labyrinthulomycota. Так, например, микроорганизм, являющийся штаммом Schizochytrium spec. SR21, мог ферментироваться в среде, лежащей в
основе данного изобретения. Объемно-временной выход важной PUFA, DHA, в штамме SR21 является
несколько более низким, чем в Ulkenia spec. Sam 2179 (см. пример 3), однако в расчете на важную n-3
PUFA, DHA он равен более 15% (мас./мас.) всей сухой биомассы. Этот пример показывает, что лежащая
в основе данного изобретения оптимизированная среда со стабилизированным рН делает возможной
ферментацию без регулирования рН для получения PUFA также и в других членах Labyrinthulomycota.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ культивирования микроорганизмов отряда Thraustochytriales в ферментационной среде с
добавлением 3-15 г/л СаСО3 для стабилизации показателя рН между 3 и 10, при температуре между 10 и
40°С в течение 1-10 дней, где микроорганизмы способны продуцировать масло, содержащее более чем
10 мас.% докозагексаеновой кислоты (DHA) и более чем 1% докозапентаеновой кислоты (DPA).
2. Способ по п.1, в котором микроорганизмы продуцируют более чем 25, предпочтительно более
чем 35 и особенно предпочтительно более чем 45 мас.% масла на единицу массы сухой биомассы.
3. Способ по п.1, в котором микроорганизмы продуцируют предпочтительно более чем 14 и особенно предпочтительно более чем 18 мас.% и еще более предпочтительно более чем 22 мас.% докозагексаеновой кислоты (DHA) на единицу массы сухой биомассы.
4. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором микроорганизмы продуцируют предпочтительно более чем 2%, особенно предпочтительно более чем 3% и еще более предпочтительно более
чем 4% докозапентаеновой кислоты (DPA) на сухую биомассу.
5. Способ по п.1 или 2, в котором к среде добавлено предпочтительно 4-12 г/л, особенно предпочтительно 5-10 г/л и еще более предпочтительно 7,5±0,5 г/л СаСО3.
6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что среда включает глюкозу, кукурузный экстракт, хлорид магния, хлорид кальция, карбонат кальция, сульфат натрия, сульфат аммония и гидрофосфат калия.
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что среда имеет показатель рН
предпочтительно между 5 и 7.
8. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что культивирование происходит предпочтительно между 25 и 35°С.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что культивирование происходит предпочтительно в течение 3-9 дней.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что микроорганизм принадлежит к роду Schizochytrium, Thraustochytrium или Ulkenia.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что этим микроорганизмом является Ulkenia spec. Sam 2179.
12. Способ по п.10, отличающийся тем, что микроорганизмом является Schizochytrium spec. SR 21.
13. Масло с содержанием по меньшей мере 20% DHA, предпочтительно по меньшей мере 30% DHA
и особенно предпочтительно по меньшей мере 40% DHA от общего содержания полиненасыщенных
жирных кислот, полученное с применением способа культивирования микроорганизмов отряда Thraustochytriales по любому из пп.1-12 и последующего выделения этого масла из культурального бульона
и/или находящейся в нем биомассы.
14. Масло с содержанием по меньшей мере 3% DPA, предпочтительно по меньшей мере 6% DPA и
особенно предпочтительно по меньшей мере 9% DPA от общего содержания полиненасыщенных жир-9-
011877
ных кислот, полученное с применением способа культивирования микроорганизмов отряда Thraustochytriales по любому из пп.1-12 и последующего выделения этого масла из культурального бульона и/или
находящейся в нем биомассы.
15. Биомасса, полученная с использованием способа культивирования микроорганизмов отряда
Thraustochytriales по любому из пп.1-12 и последующего отделения этой биомассы из культурального
бульона.
16. Кормовой продукт, включающий биомассу по п.15.
17. Пищевой продукт для питания человека, включающий биомассу по п.15.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 10 -