ВЛИЯНИЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ НА СТРУКТУРУ И
реклама
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ На правах рукописи Шеметов Антон Александрович ВЛИЯНИЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ НА СТРУКТУРУ И ШАПЕРОНОПОДОБНУЮ АКТИВНОСТЬ МАЛОГО БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА ЧЕЛОВЕКА Hsp22 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 г. Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова Ломоносова. Научный руководитель: доктор биологических наук профессор Н.Б. Гусев Официальные оппоненты: доктор биологических наук профессор Д.И. Левицкий кандидат биологических наук в.н.с. А.В. Воротников Ведущая организация: Институт экспериментальной кардиологии Федерального государственного учреждения «Российский кардиологический научнонаучно производственный комплекс» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Защита диссертации состоится 6 декабря 2010 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 12, биологический биологический факультет Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова, аудитория ББА. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического иологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова Ломоносова. Автореферат разослан 28 октября 2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.В. Медведева 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Малые белки теплового шока (small heat shock proteins, sHsp) – широко распространенная группа белков с молекулярной массой мономера от 12 до 43 кДа (8, 21). Отличительной чертой всех белков этого семейства является наличие в их структуре так называемого α-кристаллинового домена, состоящего из 80-90 аминокислотных остатков и получившего свое название от белка α-кристаллина, в составе которого он был впервые обнаружен. sHsp склонны к образованию крупных олигомерных комплексов, размер которых может достигать 600-700 кДа (16). Все члены семейства обладают так называемой шапероноподобной активностью, т.е. способны связывать частично денатурированные белки, препятствуя их дальнейшей агрегации (8). Помимо этого малые белки теплового шока могут участвовать в регуляции протеолитической деградации денатурированных белков (7), тем самым защищая клетку от накопления агрегатов поврежденных белков. Кроме того, считается, что sHsp могут участвовать в регуляции сократительного аппарата и цитоскелета, клеточной подвижности, а также в защите клетки от окислительного стресса, регуляции процессов пролиферации и апоптоза (1). Функционирование малых белков теплового шока может регулироваться разными способами, в частности, путем фосфорилирования, катализируемого различными протеинкиназами. Фосфорилирование может влиять на олигомерное состояние sHsp (1), их взаимодействие с белками-партнерами (4) и шапероноподобную активность (8). В настоящее время в геноме человека найдено 10 генов, кодирующих малые белки теплового шока, и свойства некоторых представителей этого семейства белков (αA- и αBкристаллины, Hsp27) достаточно подробно изучены. Сравнительно недавно описанный белок Hsp22 (HspB8, H11 киназа, продукт гена E2IG1) на начальных этапах исследования относили к классу протеинкиназ (19), однако позднее было показано наличие в его структуре αкристаллинового домена (2) и отсутствие протеинкиназной активности (12). Данные двумерного электрофореза свидетельствуют о том, что в клетках млекопитающих Hsp22, который является типичным представителем семейства малых белков теплового шока, может находиться в фосфорилированном состоянии (2). В условиях in vivo в разных тканях фосфорилированию могут подвергаться остатки Ser24 и Thr/Ser87 Hsp22 (3, 6). Список сокращений: цАМФ – циклический аденозинмонофосфат; ГА – глутаровый альдегид; ДМС – диметилсуберимидат; ДСН – додецилсульфат натрия; ДТТ – дитиотрейтол; МЭ – β-меркаптоэтанол; ПААГ – полиакриламидный гель; ПКА – цАМФ-зависимая протеинкиназа; ФМСФ – фенилметилсульфанилфторид; ЭДТА – этилендиаминтетраацетат; ERK1 (Extracellular signal-Regulated Kinase 1) – киназа, активируемая внеклеточными сигналами; TLCK – N-тозил-Lлизин гидрохлорид хлорметилкетона; wt – белок дикого типа. 3 Протеинкиназы, участвующие в фосфорилировании Hsp22, остаются не установленными, однако обнаружено, что несколько протеинкиназ (протеинкиназа C, казеинкиназа второго типа и ERK1 киназа) способны фосфорилировать Hsp22 в условиях in vitro (2). Кроме того, анализ первичной структуры Hsp22, проведенный с использованием программы NetPhos 2.0, свидетельствует о том, что в структуре этого белка есть остатки (Ser24 и Ser57), расположенные в последовательностях, узнаваемых и фосфорилируемых протеинкиназой А. Таким образом, к настоящему моменту накоплено большое количество экспериментальных и теоретических данных, свидетельствующих о том, что Hsp22 может подвергаться фосфорилированию. В то же время в литературе нет данных о том, каким образом фосфорилирование влияет на структуру и свойства этого белка. Цель и задачи работы. Целью данной работы был анализ влияния фосфорилирования и мутаций, имитирующих фосфорилирование, на структуру и свойства Hsp22. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи: 1. Изучить процесс фосфорилирования Hsp22 под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы и протеинкиназы ERK1. 2. При помощи различных методов исследовать влияние фосфорилирования и мутаций, имитирующих фосфорилирование на вторичную, третичную и четвертичную структуру Hsp22. 3. Изучить влияние фосфорилирования на шапероноподобную активность Hsp22. Основные положения, выносимые на защиту. 1. Обнаружено, что в условиях in vitro цАМФ-зависимая протеинкиназа может фосфорилировать Ser57, а протеинкиназа ERK1 способна фосфорилировать Ser24, Ser27 и Thr87 Hsp22. При этом по данным литературы остатки Ser24 и Thr87 могут быть фосфорилированы в условиях in vivo. 2. Фосфорилирование (или точечные мутации, имитирующие фосфорилирование) влияют на различные уровни структурной организации и стабилизируют димеры Hsp22 при низкой концентрации белка. 3. Фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) влияют на шапероноподобную активность Hsp22. Научная новизна и практическая ценность работы. Проанализирован процесс фосфорилирования Hsp22 под действием двух протеинкиназ. Установлено, что цАМФзависимая протеинкиназа в условиях in vitro фосфорилирует Ser57 Hsp22. Протеинкиназа ERK1 в условиях in vitro фосфорилирует остатки Ser24, Ser27 и Thr87, при этом остатки Ser24 и Thr87 могут находиться в фосфорилированном состоянии в условиях in vivo. Данные 4 спектроскопии кругового дихроизма свидетельствуют о том, что значительная часть структуры Hsp22 неупорядочена, при этом разведение приводит к дальнейшему разупорядочиванию структуры белка. Этот эффект может быть связан с происходящей при разведении диссоциацией димеров Hsp22. Используя методы гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования, установили, что фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) увеличивают вероятность образования димеров Hsp22. Фосфорилирование (или расположенных N-концевой в шапероноподобную мутации, активность имитирующее части Hsp22, Hsp22 в то фосфорилирование) (Ser24, время Ser27, как Ser57), остатков, уменьшают фосфорилирование Thr87, расположенного в центральной части белка, приводит к увеличению шапероноподобной активности Hsp22. Таким образом, установлено, что фосфорилирование влияет на структуру и шапероноподобную активность Hsp22. Полученные экспериментальные данные позволяют приблизиться к пониманию молекулярных механизмов функционирования Hsp22, что особенно важно, учитывая существенную роль, которая отводится Hsp22 в регуляции процессов протеолиза, пролиферации и апоптоза, а также тот факт, что точечные мутации Hsp22 коррелируют с развитием некоторых нейродегенеративных заболеваний. Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ; на 33-м и на 35-м Конгрессах Федерации Европейских Биохимических Обществ в Афинах (2008 г.) и в Гетеборге (2010 г.); на 10-м Форуме Молодых Ученых Федерации Европейских Биохимических Обществ в Гетеборге (2010 г.); на Второй международной конференции по стрессу в Будапеште (2007 г.); на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» в 2007 и 2010 годах (Москва). Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, включая 3 статьи и 5 тезисов сообщений. Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 111 страницах печатного текста, иллюстрирована 38 рисунками и 2 таблицами. Список цитированной литературы содержит 171 наименование. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы В обзоре литературы приведены данные о структуре и свойствах малых белков теплового шока и в частности Hsp22. Особое внимание уделено фосфорилированию малых 5 белков теплового шока и его влиянию на структуру, свойства и шапероноподобную активность этих белков. Материалы и методы Рекомбинантный малый белок теплового шока Hsp22 дикого типа (wild type, wt) и его точечные мутанты, имитирующие фосфорилирование (S24D, S27D, S57D, T87D, S24,57D, S24D/T87D), экспрессировали в клетках E.coli штамм BL21(DE3). Плазмиды, содержащие кДНК Hsp22 дикого типа, а также всех мутантных форм, кроме S24D/T87D, были любезно предоставлены к.б.н. А.С. Сейт-Неби. Плазмида pET23b-HSP22S24D/T87D была получена нами путем комбинации фрагментов ДНК, содержащих замены S24D и T87D. Процедура очистки белка включала фракционирование бактериального лизата сульфатом аммония, гидрофобную хроматографию на колонке High-Trap Phenyl-Sepharose и гель-фильтрацию на колонке Sephacryl S100 или Superdex 200. Такая процедура выделения обеспечивает получение высокоочищенных препаратов Hsp22 дикого типа и его точечных мутантов, имитирующих фосфорилирование. Фосфорилирование цАМФ-зависимой протеинкиназой проводили в буфере Ф1 (20 mM фосфат, 20 mM Трис, pH 7.5, 7.5 mM MgCl2, 2 mM ДТТ, 0.1 mM ФМСФ) в присутствии 0.15 mM АТФ, содержащей [γ-32P]-АТФ. В инкубационную среду, содержащую Hsp22 или его точечные мутанты (S24D, S57D или S24,57D) в концентрации 0.7 мг/мл, вносили 2 ед. протеинкиназы А (Sigma) и инкубировали различное время при 37°С. Через определенные промежутки времени аликвоту инкубационной среды наносили на фильтры Whatman 3MM и после отмывания в 10% растворе трихлоруксусной кислоты и высушивания определяли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике RackBeta 1214 (LKB). О кинетике протекания реакции судили по включению радиоактивного фосфата в состав белка. Пробы, отобранные до и после реакции фосфорилирования, подвергали нативному электрофорезу по методу Шауба и Перри (18). Окрашенные гели высушивали, сканировали и подвергали авторадиографии. Фосфорилирование протеинкиназой ERK1 проводили в буфере Ф2 (20 mM HEPES, pH 7.5, 25 mM фосфоглицерата натрия, 20 mM MgCl2, 2 mM ДТТ) в присутствии 0.15 mM АТФ, содержащей [-32P]-АТФ. Препарат ERK1 предварительно активировали, инкубируя его с конститутивно активной киназой МЕК в присутствии 0.15 mM АТФ в течение 60 мин при 37°С. Автор благодарен к.б.н. А.В. Воротникову за любезно предоставленные препараты протеинкиназ. Фосфорилирование Hsp22 и его мутантов (S24D, S27D, T87D, S24D/T87D) 6 начинали путем добавления активированного препарата ERK1. Включение радиоактивного фосфата в препараты белка анализировали так же, как это описано в предыдущем разделе. Химотрипсинолиз Hsp22 и его мутантов проводили в буфере H (20 mM трис/ацетат, pH 7.6, 10 mM NaCl, 30 mM β-МЭ) при 37ºС. Весовое соотношение Hsp22:химотрипсин составляло 2400:1. Реакцию начинали добавлением химотрипсина (TLCK-химотрипсин, Sigma) и останавливали добавлением ФМСФ до конечной концентрации 9 mM через 0, 5, 10, 15, 20, 40 и 60 минут. Состав полученных проб анализировали при помощи электрофореза в 15% ПААГ в присутствии ДСН (13). Электрофореграммы сканировали и определяли зависимость интенсивности полосы интактного белка (вычисленной с помощью программы MatLab) от времени инкубации. Химическое «сшивание» проводили с использованием двух «сшивающих» реагентов – диметилсуберимидата (ДМС) и глутарового альдегида (ГА). Hsp22 и его мутанты, имитирующие фосфорилирование под действием протеинкиназы А, инкубировали в 0.2 M триэтаноламин-HCl, pH 8.0, содержащем 30 mM МЭ и 6 mM ДМС, в течение 60 минут. Реакцию останавливали добавлением 4-кратного ДСН-буфера для образцов. Анализ белкового состава проб проводили методами электрофореза в присутствии ДСН на гомогенном (15%) или градиентом (7-20%) полиакриламидном геле. К белку дикого типа и его мутантам, имитирующим фосфорилирование под действием ERK1, растворенным в буфере Г (15 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM ЭДТА, 0.1 mM ФМСФ, 30 mM ДТТ) добавляли глутаровый альдегид (конечная концентрация которого колебалась в интервале от 0.006% до 0.07%) и инкубировали 15 - 30 минут при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 4-кратного ДСН-буфера для образцов. Анализ белкового состава проб проводили методами электрофореза в присутствии ДСН на гомогенном (12.5%) или градиентном (5-20%) полиакриламидном геле. Спектроскопию кругового дихроизма (КД) в дальней ультрафиолетовой области проводили в интервале 195-260 нм на дихрографе Chirascan (Applied Photophysics Inc.) при различных концентрациях Hsp22 дикого типа, его мутантов, имитирующих фосфорилирование, или Hsp22, фосфорилированного протеинкиназой А или ERK1 киназой. Все измерения проводили в буфере С (50 мМ фосфат, рН 7.5, 150 мМ NaCl, 2 mM ДТТ) при концентрации белка, варьирующей от 0.3 до 2.5 мг/мл, при 25°С в кювете с оптическим путем 0.02 см. Каждый спектр регистрировали пять раз, полученные данные усредняли и вычитали спектр контрольной пробы, не содержащей белка. Автор глубоко благодарен к.б.н. А.В. Пивоваровой за помощь в проведении экспериментов по круговому дихроизму. 7 Флуоресцентная спектроскопия. Измерение флуоресценции белковых проб проводили в буфере C (50 mM фосфат, рН 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM ДТТ) на спектрофлуориметре Hitachi F3000 (в случае мутаций, имитирующих фосфорилирование ПКА) или Cary Eclipse (Varian), оснащенном Пельтье-контролируемым кюветодержателем и термодатчиком (в случае мутаций, имитирующих фосфорилирование ERK1). Флуоресценцию белковых образцов (концентрация белка 0.06 мг/мл, определена спектрофотометрически) возбуждали светом с длиной волны 295 нм (ширина щели монохроматора 5 нм для Hitachi, 2.5 нм для Cary Eclipse), регистрацию флуоресценции проводили в интервале длин волн 300-400 нм (ширина щели монохроматора 1.5 нм). Для мутантов, имитирующих фосфорилирование протеинкиназой ERK1, регистрировали температурную зависимость триптофановой флуоресценции. Для этого пробы нагревали с постоянной скоростью 1°С/мин и регистрировали спектр флуоресценции. По полученным данным строили параметрическую кривую (зависимость флуоресценции при 320 нм от флуоресценции при 365 нм, температура в данном случае является варьирующим параметром) для вычисления доли перехода Hsp22 из нативного в денатурированное состояние (17). Четвертичную структуру Hsp22 дикого типа и его мутантов, имитирующих фосфорилирование, анализировали методом гель-фильтрации, проводимой на колонке Superdex 75 HR 10/30 на хроматографе ACTA FPLC (Pharmacia). Хроматографию проводили в 20 mM трис/ацетатном буфере, pH 7.6, содержащем 150 mM NaCl, 0.1 mM ЭДТА, 15 mM МЭ и 0.1 mM ФМСФ. Образец (150 мкл), содержащий разные количества белка (10-200 мкг), наносили на колонку через петлю (500 мкл), и проводили хроматографию при скорости элюции 0.5 мл/мин. Колонку калибровали, используя бычий сывороточный альбумин (68 кДа), овальбумин (43 кДа), химотрипсиноген (25 кДа) и РНКазу (13.7 кДа) в качестве стандартов. Аналитическое ультрацентрифугирование образцов Hsp22 при различной концентрации белка (от 0.2 до 1.0 мг/мл) проводили на ультрацентрифуге Beckman, модель E. После достижения ротором скорости 48000 об/мин каждые 1.5 минуты регистрировали распределение белка (поглощение при 280 нм) по длине ячейки. Эксперименты проводили при фиксированной температуре 22°C. Для расчета коэффициента седиментации использовали уравнение Ламма. Для анализа получаемых седиментограмм использовали программу SEDFIT (www.analyticalultracentrifugation.com). Автор выражает глубокую признательность сотруднику НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского П.В. Калмыкову за неоценимую помощь в проведении экспериментов. 8 Шаперонную активность Hsp22 и его мутантов, имитирующих фосфорилирование, определяли по способности анализируемых белков предотвращать агрегацию модельных белков-субстратов – инсулина и роданазы. В кювете спектрофотометра смешивали растворы инсулина (конечная концентрация 0.2 мг/мл) и Hsp22 (конечная концентрация 0-0.4 мг/мл), пробу преинкубировали 10 мин при 37°С и инициировали агрегацию инсулина добавлением ДТТ до конечной концентрации 20 mM. Агрегацию роданазы инициировали нагреванием пробы до 44°C. В отдельной пробе смешивали роданазу (конечная концентрация 0.15 мг/мл) и Hsp22 (конечная концентрация 0-0.15 мг/мл) и преикубировали 10 мин при 37°С. Затем пробы переносили в кювету спектрофотометра, термостатируемую при 44°С. За агрегацией белка следили по увеличению оптической плотности при 360 нм на спектрофотометре Ultrospec 3100 Pro (Amersham Biosciences). Основные результаты и их обсуждение Фосфорилирование Hsp22 под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы Анализ первичной структуры Hsp22 с помощью программы NetPhos 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos) позволил выявить в структуре белка два участка (Ser24 и Ser57), имеющих консенсусную последовательность RXS, узнаваемую и фосфорилируемую цАМФ-зависимой протеинкиназой. В связи с этим мы предположили, что Hsp22 может выступать в качестве субстрата для цАМФ-зависимой протеинкиназы. Действительно, оказалось, что инкубация Hsp22 дикого типа с каталитической субъединицей цАМФ-зависимой протеинкиназы сопровождается включением около 0.8 моль фосфата на моль белка (рис.1А). Введение точечной мутации S24D, предотвращающей Рис.1. Фосфорилирование Hsp22 и его мутантов цАМФ-зависимой протеинкиназой. А. Кинетика фосфорилирования Hsp22 дикого типа и его S24D, S57D и S24,57D мутантов. Б. Скан геля после нативного электрофореза образцов Hsp22 и его мутантов до (0) и после (40) инкубации в течение 40 мин с цАМФ-зависимой протеинкиназой. Фосфорилирование сопровождается увеличением электрофоретической подвижности. В. Радиоавтограф геля, представленного на панели Б. 9 фосфорилирование Ser24, не сопровождается изменением скорости или степени фосфорилирования Hsp22 (рис.1А). В то же время введение точечной мутации S57D (блокирующей фосфорилирование Ser57) или двойной мутации S24,57D (блокирующей фосфорилирование как по Ser24, так и по Ser57) практически полностью ингибировало фосфорилирование Hsp22 цАМФ-зависимой протеинкиназой (рис.1А). Образцы Hsp22 и его мутантов до и после инкубации с протеинкиназой А подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле в нативных условиях (рис.1Б), и полученные гели подвергали радиоавтографии (рис.1В). Как видно, инкубация в присутствии цАМФ-зависимой протеинкиназы сопровождается связанным с фосфорилированием увеличением электрофоретической подвижности белка дикого типа и его S24D мутанта (рис.1Б). В то же время инкубация мутантов S57D и S24,57D с протеинкиназой A не приводит к изменению электрофоретической подвижности (рис.1Б). Кроме того, данные радиоавтографии (рис.1В) свидетельствуют о том, что цАМФ-зависимая протеинкиназа способна переносить радиоактивный фосфат только на белок дикого типа и его S24D мутант, но практически не способна фосфорилировать мутанты S57D или S24,57D. Представленные данные свидетельствуют о том, что Ser57 является участком, преимущественно фосфорилируемым цАМФ-зависимой протеинкиназой в структуре Hsp22. Фосфорилирование Hsp22 под действием киназы ERK1 Протеинкиназа ERK1 является так называемой Pro-направленной протеинкиназой и преимущественно фосфорилирует остатки серина и треонина в консенсусных последовательностях (S/T)P, PXX(S/T)P и PX(S/T)P (15). В структуре Hsp22 есть несколько участков, с первичной структурой частично или полностью соответствующей консенсусной последовательности, узнаваемой протеинкиназой ERK1. Бенндорф и соавт. (2) постулировали, что остатки Ser27 и Thr87 фосфорилируются протеинкиназой ERK1 in vitro. Действительно, длительная инкубация Hsp22 дикого типа в присутствии протеинкиназы ERK1 сопровождается включением более чем 1.5-1.7 моль фосфата на моль белка дикого типа. Для того, чтобы определить, какие остатки фосфорилируются протеинкиназой ERK1 мы получили точечные мутанты S24D, S27D, T87D, S24D/T87D и S27D/T87D и проанализировали кинетику их фосфорилирования при добавлении протеинкиназы ERK1. Мутации S24D и S27D приводят лишь к сравнительно небольшим изменениям скорости и степени фосфорилирования Hsp22 (рис.2А). Мутация T87D приводит к примерно двукратному уменьшению скорости и степени фосфорилирования (рис.2А). Наконец, двойная мутация S24D/T87D (рис.2А) или двойная мутация S27D/T87D (данные не 10 представлены) приводят к очень значительному, хотя и не совсем полному ингибированию фосфорилирования Hsp22. Представленные данные свидетельствуют о следующем. Во-первых, остаток Thr87 наиболее эффективно фосфорилируется ERK1 в структуре Hsp22. Во-вторых, протеинкиназа ERK1 с меньшей скоростью и эффективностью может фосфорилировать как Ser24, так и Ser27. При этом фосфорилирование любого из этих двух остатков, по всей видимости, ингибирует фосфорилирование второго остатка. Именно поэтому степень фосфорилирования Hsp22, как правило, не превышает 2 моль фосфата на моль белка. Следует заметить, что первичная структура вблизи остатка Ser24 (RDS24P) в Рис.2. Фосфорилирование Hsp22 и его мутантов протеинкиназой ERK1. А. Кинетика фосфорилирования Hsp22 дикого типа и его мутантов S24D, S27D, T87D и S24D,T87D протеинкиназой ERK1. Б. Скан геля после нативного электрофореза препаратов Hsp22 и его мутантов до (0) и после 90-минутной инкубации (90) с ERK1 киназой. В. Радиоавтограф геля, представленного на панели Б. большей степени соответствует консенсусной последовательности, узнаваемой ERK1 киназой, чем первичная структура вблизи остатка Ser27 (PLS27SR). Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что в потенциальных структуре участка, Hsp22 есть которые три могут фосфорилироваться ERK1 киназой in vitro. При этом важно отметить, что два из трех выявленных нами остатков (Ser24 и Thr/Ser87) могут находиться в фосфорилированном состоянии и в условиях in vivo (6, 20). Влияние фосфорилирования и мутаций, имитирующих фосфорилирование, на вторичную структуру Hsp22 Для изучения вторичной структуры Hsp22 использовался метод спектроскопии кругового дихроизма (КД) в дальней ультрафиолетовой области. Спектр КД белка дикого типа имеет отрицательный максимум при 203-205 нм, что характерно для белков, имеющих в своем составе значительную долю -складок и неупорядоченных структур и хорошо 11 согласуется с ранее опубликованными данными, свидетельствующими о том, что Hsp22 относится к группе внутренне неупорядоченных белков (intrinsically disordered proteins) (9, 10). Пытаясь более подробно проанализировать вторичную структуру Hsp22, мы регистрировали спектры КД при различных концентрациях белка. Оказалось, что при высокой концентрации белка дикого типа (2.5 мг/мл) амплитуда отрицательного максимума при 203205 нм составляет около -4000 град*см2/дмоль (рис.3А). Разведение сопровождается сначала довольно незначительным увеличением амплитуды этого максимума до -5000-5500 град*см2/дмоль (концентрация белка 0.7-1.3 мг/мл). В то же время дальнейшее разведение до 0.3 мг/мл приводит к очень значительному увеличению отрицательного максимума до 8000-8500 град*см2/дмоль (рис.3А). Количественный анализ спектров КД белков, содержащих в своем составе значительную долю -складок и неупорядоченных довольно структур, усложнен, качественно но увеличение амплитуды при 203-205 нм, происходящее при разведении Рис. 3 Спектры кругового дихроизма Hsp22 дикого типа (А), его мутантов S24D (Б), T87D (В), Hsp22 дикого типа, фосфорилированного ERK1 (степень фосфорилирования около 2 моль на моль белка) (Г), S57D мутанта (Д), а также Hsp22 дикого типа, фосфорилированного цАМФ-зависимой протеинкиназой (степень фосфорилирования 1 моль фосфата на моль белка) (Е). Концентрация белка составляла 2.5 (сплошная линия), 1.3 (штриховая линия), 0.7 (пунктирная линия) или 0.3 мг/мл (штрих-пунктирная линия). белка дикого типа, может быть связано с уменьшением доли упорядоченных и увеличением доли структур неупорядоченных в Зависимость составе белка. удельной молярной эллиптичности от концентрации белка может свидетельствовать о том, что при разведении происходит диссоциация олигомеров Hsp22 и образующиеся в ходе диссоциации мономеры имеют менее упорядоченную структуру, чем мономеры в составе олигомеров, формирующихся при высокой концентрации белка. 12 Спектры КД S24D и S57D мутантов Hsp22 мало отличаются от спектров КД белка дикого типа (рис.3, Б и Д, соответственно). При высоких концентрациях белка амплитуда отрицательного максимума при 203-205 нм составляет около -4000 град*см2/дмоль и по мере разведения увеличивается до -6500-7000 град*см2/дмоль, что несколько меньше величины 8000-8500 град*см2/дмоль, характерной для белка дикого типа. Спектры КД для мутанта T87D отличаются тем, что разведение от 2.5 до 0.7 мг/мл сопровождается очень незначительным изменением амплитуды максимума при 203-205 нм, в то время как разведение до 0.3 мг/мл приводит к резкому увеличению этого максимума до -10000 град*см2/дмоль, что существенно больше аналогичной величины, полученной для белка дикого типа или его S24D мутанта (рис.3В). Таким образом, при разведении спектры КД мутантов S24D и T87D, имитирующих фосфорилирование, изменяются также как и спектры КД белка дикого типа. Однако при низкой концентрации белка амплитуда отрицательного максимума при 203-205 нм для мутанта S24D меньше, а для мутанта T87D больше, чем для белка дикого типа. Спектры КД Hsp22, фосфорилированного протеинкиназой ERK1 (степень фосфорилирования около 2 моль фосфора на моль белка) мало отличались от спектров КД нефосфорилированного белка дикого типа, как при высокой, так и при низкой концентрации белка (рис.3Г). Это может быть связано с тем, что изменения спектров КД, вызванные фосфорилирование Ser24 противоположны изменениям спектра, вызываемым фосфорилированием Thr87. Спектры КД Hsp22, фосфорилированного цАМФ-зависимой протеинкиназой (степень фосфорилирования ~1 моль фосфора на моль белка), мало отличались от спектров КД белка дикого типа по форме. Однако разведение фосфорилированного белка от 2.5 до 0.7 мг/мл сопровождается очень незначительными изменениями амплитуды отрицательного максимума при 203-205 нм (рис.3Е) и лишь разведение до 0.3 мг/мл приводит к заметному увеличению указанного отрицательного максимума. Суммируя представленные результаты, можно заключить, что фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) приводит к тому, что изменения амплитуды спектра КД при 203-205 нм происходят либо при более низких концентрациях белка (например, мутанты T87D или белок, фосфорилированный цАМФзависимой протеинкиназой), либо к тому, что разведение сопровождается меньшими изменениями амплитуды пика при указанных длинах волн (например, мутанты S24D или S57D). Таким образом, в ходе наших экспериментов было установлено, что в ходе разведения происходит изменение молярной эллиптичности Hsp22, что, по всей видимости, обусловлено диссоциацией олигомеров этого белка. Фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) не влияют на спектры КД при высокой концентрации белка, но могут 13 влиять либо на процесс диссоциации, либо на вторичную структуру мономеров (или малых олигомеров) образующихся в ходе диссоциации крупных олигомеров Hsp22. Влияние фосфорилирования на третичную структуру Hsp22 Hsp22 человека содержит в своей структуре четыре остатка триптофана, три из которых (Trp 48, 51 и 69) расположены в N-концевой части молекулы, в непосредственной близости от потенциально фосфорилируемых участков. По этой причине можно предположить, что фосфорилирование или мутации, имитирующие фосфорилирование, могут влиять на собственную триптофановую флуоресценцию исследуемого белка. Оказалось, что фосфорилирование как цАМФ-зависимой протеинкиназой, так и протеинкиназой ERK1 приводят к изменениям флуоресцентных свойств Hsp22. При этом интенсивность флуоресценции Hsp22, протеинкиназой, или мутанта примерно на 20% точечного больше фосфорилированного цАМФ-зависимой S57D интенсивности флуоресценции белка дикого типа. Мутации S24D или S24,57D сопровождаются примерно 30% увеличением флуоресценции Hsp22. Это может быть обусловлено изменением микроокружения остатков триптофана в молекуле мутированного или фосфорилированного Hsp22. Рис.4. Спектры флуоресценции Hsp22 В случае фосфорилирования Hsp22 дикого типа (wt), а также его S24D, S27D и T87D мутантов, имитирующих протеинкиназой ERK1 мутации S27D и T87D фосфорилирование. приводят к значительному увеличению интенсивности флуоресценции – до 80% – по сравнению с белком дикого типа (рис.4). Мутация S24D также приводит к росту интенсивности флуоресценции (на 30%). Представленные данные свидетельствуют о том, что мутации, имитирующие фосфорилирование, меняют микроокружение остатков триптофана в молекуле Hsp22. Используя метод флуоресцентной спектроскопии, мы исследовали также процесс тепловой денатурации Hsp22 и влияние фосфорилирования или мутаций, имитирующих фосфорилирование на тепловую денатурацию этого белка. Нагревание от 20°C до 80°C сопровождается уменьшением амплитуды флуоресценции и сдвигом максимума флуоресценции на 10 нм в длинноволновую область спектра. Строя параметрическую зависимость в координатах интенсивность флуоресценции при 320 нм от интенсивности флуоресценции при 365 нм при разной температуре мы могли определить параметр α, 14 характеризующий переход от нативного к денатурированному состоянию белка. Строя зависимость α от температуры, мы смогли определить температуру полуперехода от нативного к денатурированному состоянию. Температура полуперехода составила 54°C и оставалась неизменной как для точечных мутаций, имитирующих фосфорилирование (S24D, T87D, S27D, S27D/T87D) так и для Hsp22, фосфорилированного протеинкиназой ERK1. Таким образом, фосфорилирование не влияет на параметры тепловой денатурации Hsp22. В качестве другого подхода, позволяющего получить сведения о структуре белка, мы использовали метод ограниченного протеолиза. При использовании трипсина в качестве протеазы мы не обнаружили различий в скорости протеолиза белка дикого типа и его мутантов, имитирующих фосфорилирование. Возможно, это связано с тем, что как уже отмечалось, Hsp22 относится к группе внутренне неупорядоченных белков, которые очень чувствительны к протеолизу. В нашем случае даже при соотношении Hsp22/трипсин, равном 12000/1 скорость протеолиза была очень высокой, что не позволяло выявить небольших изменений структуры, вызываемых фосфорилированием, или мутациями, имитирующими фосфорилирование. Скорость протеолиза под действием химотрипсина оказалась ниже, чем в случае трипсина, и это позволило использовать химотрипсин для исследования структуры Hsp22. Химотрипсинолиз Hsp22 сопровождается накоплением пептидов с кажущимися молекулярными массами 24, 23.5, и 21.8 кДа, при этом точечные мутации или фосфорилирование не влияют на состав пептидов, образующихся в ходе ограниченного протеолиза. Мутирование остатков, расположенных в N-концевой части белка (S24D, S27D) не влияло на скорость химотрипсинолиза, в то время как мутирование T87D существенно замедляло процесс химотрипсинолиза. В то же время двойные мутанты Hsp22 (S24,57D и S24D/T87D) так же как белок, фосфорилированный протеинкиназой ERK1, обладали повышенной чувствительностью к химотрипсинолизу. Таким образом, фосфорилирование остатков, расположенных в центральной части белка или комбинированное фосфорилирование остатков, расположенных в N-концевой (Ser24, Ser27) и центральной части (Thr87) влияют на структуру, вследствие чего изменяется устойчивость Hsp22 к ограниченному протеолизу. Влияние фосфорилирования на четвертичную структуру Hsp22 До последнего времени в литературе не было единого мнения о четвертичной структуре Hsp22. Ранние исследования (5, 12) свидетельствовали о том, при гель-фильтрации Hsp22 элюируется с кажущейся молекулярной массой 36-38 кДа, в то время как при 15 ультрацентрифугировании в градиенте плотности молекулярная масса Hsp22 составляет 21.6 кДа, что хорошо согласуется с расчетной молекулярной массой этого белка (5). На основе этих данных было высказано предположение о том, что Hsp22 имеет структуру рыхлого или сильно асимметричного мономера, и это заключение зафиксировано в настоящее время в базе данных Uniprot (Q9UJY1). В то же время при двумерном электрофорезе экстракта клеток удается выявить зоны, соответствующие как мономерам, так и димерам Hsp22 (2), Hsp22 легко подвергается химическому «сшиванию» с образованием димеров и более крупных олигомеров (11), а объем элюции при гель-фильтрации зависит от концентрации наносимого образца белка (9). Представленные данные свидетельствуют о том, что различные условия могут влиять на олигомерное состояние Hsp22. Для анализа олигомерного состояния и исследования влияния использовали методы фосфорилирования гель-фильтрации, на четвертичную химического структуру «сшивания» и Hsp22 мы аналитического ультрацентрифугирования. При гель-фильтрации Hsp22 дикого типа на колонке Superdex 75 объем элюции зависит от количества белка, наносимого на колонку, при этом уменьшение количества белка сопровождается увеличением объема элюции с 11.20 до 11.55 мл, что соответствует уменьшению массы с кажущейся 36-38 кДа до молекулярной 31-33 кДа. Аналогичные изменения объема элюции наблюдались для мутантов Hsp22, имитирующих фосфорилирование, или для препаратов белка, фосфорилированных протеинкиназой ERK1 (рис.5). Уменьшение Рис. 5. Зависимость объемов элюции Hsp22 дикого типа, его мутантов, имитирующих фосфорилирование, и Hsp22, фосфорилированного протеинкиназой ERK1 от количества белка, наносимого на колонку Superdex 75 при гель-фильтрации. Представлены средние значения объемов элюции, полученные не менее чем в двух независимых экспериментах, в которых разброс измеряемых объемов элюции, как правило, не превышает 0.05 мл. кажущейся молекулярной массы, вызванное уменьшением количества белка, нанесенного на колонку, было менее выражено для мутантов, имитирующих фосфорилирование, и для Hsp22, фосфорилированного ERK1 киназой, чем для белка дикого типа. Наибольшие изменения в объеме элюции наблюдались при нанесении минимальных количеств белка, когда разница в объемах элюции для белка дикого типа и его мутантов, имитирующих фосфорилирование, достигала 0.35 мл (рис.5), что соответствует изменению кажущейся молекулярной массы на 3-5 кДа. 16 Представленные данные могут означать, что разведение сопровождается диссоциацией олигомеров Hsp22, при этом фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) либо уменьшают вероятность диссоциации олигомеров Hsp22, либо влияют на структуру и гидродинамические свойства как мономеров, так и олигомеров Hsp22. Для проверки гипотезы о влиянии фосфорилирования и мутаций, имитирующих фосфорилирование, на олигомерное состояние Hsp22 нами был использован метод химического «сшивания». Обработка Hsp22 дикого типа диметилсуберимидатом сопровождается уменьшением интенсивности полосы с кажущейся молекулярной массой 2527 кДа, соответствующей мономеру Hsp22, и появлению новой полосы с кажущейся молекулярной массой около 50 кДа, соответствующей димеру Hsp22. Мы проводили «сшивание» диметилсуберимидатом при разных концентрациях белка. Оказалось, что при высоких концентрациях белка (0.4-1.6 мг/мл) эффективность «сшивания» белка дикого типа, его мутантов, имитирующих фосфорилирование под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы (S24D, S57D, S24,57D), была практически одинаковой. В то же время при низких концентрациях белка (0.08 мг/мл) вероятность «сшивания» псевдофосфорилированных мутантов была выше эффективности «сшивания» белка дикого типа. Представленные данные свидетельствуют в пользу того, что фосфорилирование или мутации, имитирующие фосфорилирование, препятствуют диссоциации димеров при низкой концентрации белка и поэтому увеличивают вероятность «сшивания» Hsp22 под действием диметилсуберимидата. Помимо диметилсуберимидата мы использовали глутаровый альдегид в качестве «сшивающего» химического реагента для исследования влияния фосфорилирования на четвертичную структуру Hsp22. При использовании сравнительно высокой концентрации глутарового альдегида (0.07%) мы не выявили существенных изменений в вероятности «сшивания» мономеров как белка дикого типа, так и его мутантов, имитирующих фосфорилирование под действием ERK1 киназы (S24D, S27D, T87D или S24D/T87D) ни при высокой (1.12 мг/мл), ни при низкой (0.14 мг/мл) концентрации белка. В то же время при использовании низких концентраций глутарового альдегида (0.006-0.012%) оказалось, что мутация T87D, а также двойная мутация S24D/T87D или фосфорилирование под действием ERK1 киназы значительно уменьшают вероятность образования внутримолекулярных «сшивок» Hsp22. Кроме того, двойная мутация S24D/T87D или фосфорилирование ERK1 киназой уменьшают вероятность образования «сшитых» димеров Hsp22. Полученные методом химического «сшивания» данные убедительно свидетельствуют о том, что фосфорилирование (или мутации, имитирующие 17 фосфорилирование) оказывают существенное влияние на структуру как димеров, так и мономеров Hsp22. К сожалению, вероятность «сшивания» зависит от большого количества различных факторов, таких как реакционная способность и взаимное расположение «сшиваемых» остатков, размер и гибкость «сшивающего» агента, а также его способность проникать вглубь структуры белка. Все это затрудняет однозначную интерпретацию результатов, получаемых методом химического «сшивания». В поисках более прямого подхода для исследования четвертичной структуры Hsp22 мы обратились к методу аналитического ультрацентрифугирования. Оказалось, что при низкой и средней концентрации (0.2-0.5 мг/мл) белок дикого типа осаждается с коэффициентом седиментации 1.61.8 s. Эта величина существенно меньше максимально возможной величины 2.62 s, характерной для мономера Hsp22 с молекулярной массой 21.6 кДа. максимально Рис.6. Аналитическое ультрацентрифугирование препаратов Hsp22 дикого типа (А), его мутантов, имитирующих фосфорилирование S24D (Б), T87D (В), S24D,T87D (Г) и Hsp22, фосфорилированного протеинкиназой ERK1 (степень фосфорилирования ~2 моль фосфата на моль белка) (Д). Опыты проводили при концентрациях белка, равных 0.2 мг/мл (сплошная линия), 0.5 мг/мл (штриховая линия) или 1.0 мг/мл (штрих-пунктирная линия) Соотношение возможного измеренного и коэффициентов седиментации (2.62/1.6=1.6) значение дает фрикционного соотношения. Принимая внимание, в что фрикционное во вычисленное отношение входит член, зависящий от гидратации и член, определяющий форму молекулы (14), можно определить фрикционное отношение, отражающее форму молекулы и равное в данном случае 1.45, что соответствует асимметричной молекуле в форме эллипсоида вращения с соотношением осей a/b, равным 5. Таким образом, при ультрацентрифугировании при низкой концентрации белка дикого типа Hsp22 преимущественно представлен в виде мономера с коэффициентом седиментации около 1.7 s и фрикционным отношением около 1.6, что соответствует частице с молекулярной массой 21.6 кДа, хорошо согласующееся с 18 теоретически рассчитанной молекулярной массой мономера Hsp22. Повышение концентрации белка дикого типа сопровождается появлением частиц с коэффициентом седиментации около 3 s, а также появлением небольшого количества частиц с коэффициентами седиментации более 6 s. Частицы с коэффициентом седиментации 3 s, по всей видимости, соответствуют димерам, а частицы с коэффициентами седиментации более 6 s - олигомерам Hsp22 (рис.6А). Седиментационный анализ препаратов белка, имитирующих фосфорилирование, а также препаратов Hsp22, фосфорилированных протеинкиназой ERK1, показал, что в этом случае удается обнаружить частицы с коэффициентами седиментации, равными 1.5-1.7 s, 2.52.7 s и более 4 s, т.е. частицы, существенно не отличающиеся по коэффициентам седиментации от соответствующих компонентов, выявленных при седиментации белка дикого типа. Однако, если в случае белка дикого типа при всех исследованных концентрациях большая часть белка седиментировалась с коэффициентом седиментации меньше 2 s и только незначительная часть белка имела коэффициент седиментации около 3 s, то в случае мутантов, имитирующих фосфорилирование, или Hsp22, фосфорилированного протеинкиназой ERK1, повышение концентрации белка от 0.2 до 0.5 мг/мл сопровождалось появлением пика с коэффициентом седиментации более 2.5 s, а при концентрации белка 1.0 мг/мл пик с коэффициентом седиментации менее 2 s почти полностью исчезал, и появлялся пик (или пики) с коэффициентом седиментации более 2.5 s (рис.6). Эти результаты хорошо согласуются с данными, полученными методами гель-фильтрации, и свидетельствуют о том, что мутации, имитирующие фосфорилирование, или фосфорилирование под действием протеинкиназы ERK1 способствуют сдвигу равновесия между мономерами и димерами в сторону формирования димеров Hsp22. Влияние фосфорилирования на шапероноподобную активность Hsp22 Способность предотвращать агрегацию денатурированных белков (так называемая шапероноподобная активность) является одной из наиболее важных характеристик малых белков теплового шока. В связи с этим представлялось целесообразным исследовать влияние фосфорилирования или мутаций, имитирующих фосфорилирование, на шапероноподобную активность Hsp22. Мы использовали два модельных белка-субстрата – инсулин и роданазу – для измерения шапероноподобной активности Hsp22. Восстановление дисульфидных связей в молекуле инсулина приводит к агрегации B-цепи, что после небольшого лаг-периода сопровождается увеличением светорассеяния или увеличением оптической плотности инкубируемой пробы. Добавление Hsp22 замедляет или предотвращает агрегацию В-цепи инсулина и таким образом уменьшает светорассеяние или оптическую плотность при 360 нм. 19 При весовом отношении инсулин/Hsp22, равном 2/1, белок дикого типа удлиняет лагпериод и замедляет агрегацию инсулина (рис.7А, кривая 2). фосфорилированный Hsp22, цАМФ-зависимой протеинкиназой обладает менее выраженной шапероноподобной активностью и кривая агрегации в присутствии фосфорилированного Hsp22, цАМФ-зависимой протеинкиназой, практически не отличается от кривой агрегации изолированного инсулина (рис.7А, Рис.7. Шапероноподобная активность Hsp22 с инсулином в качестве модельного субстрата. Агрегацию изолированного инсулина (0.2 мг/мл) (кривая 1) или инсулина в присутствии нефосфорилированного Hsp22 (кривая 2); Hsp22, фосфорилированного цАМФ-зависимой протеинкиназой (степень фосфорилирования ~1 моль фосфата на моль белка) (кривая 3); Hsp22, фосфорилированного протеинкиназой ERK1 (степень фосфорилирования ~1.5 моль фосфата на моль белка) (кривая 4) и T87D мутанта Hsp22 (кривая 5) индуцировали добавлением избытка дитиотрейтола и регистрировали по увеличению оптической плотности при 360 нм. Концентрация Hsp22 составляла 0.1 мг/мл (панель А) или 0.2 мг/мл (панель Б). кривая активность 3), белка, протеинкиназой а шапероноподобная фосфорилированного ERK1, практически не отличается от соответствующей активности нефосфорилированного белка дикого типа (рис.7А, кривая 4). Любопытно отметить, что наибольшей шапероноподобной активностью обладал мутант T87D, который даже при малых концентрациях эффективно ингибировал агрегацию инсулина (рис.7А, кривая 5). Отмеченные закономерности становятся более наглядными при повышении концентрации Hsp22 в пробе. При весовом соотношении инсулин/Hsp22, равном 1/1, все исследуемые препараты Hsp22 ингибируют агрегацию инсулина, при этом эффективность шапероноподобной активности увеличивается в ряду Hsp22, фосфорилированный цАМФзависимой протеинкиназой (фосфорилированный по остатку Ser57) < Hsp22, фосфорилированный ERK1 < нефосфорилированный белок дикого типа < мутант T87D, имитирующий фосфорилирование под действием ERK1 протеинкиназы (рис.7Б). В отдельных экспериментах мы исследовали шапероноподобную активность S57D мутанта, и показали, что его эффективность сопоставима с активностью Hsp22, фосфорилированного цАМФзависимой протеинкиназой, и меньше соответствующей активности нефосфорилированного 20 белка дикого типа. Таким образом, мутация или фосфорилирование Ser57 приводит к уменьшению шаперонной активности Hsp22. Интерпретация результатов, полученных при анализе влияния фосфорилирования Hsp22 под действием ERK1 киназы, оказывается более сложной. Мутанты S24D и S27D обладают шапероноподобной активностью меньшей, чем соответствующая активность нефосфорилированного белка дикого типа (данные не представлены), в то время как мутант T87D обладает шапероноподобной активностью большей, чем нефосфорилированный белок дикого типа (рис.7). Вероятно, именно вследствие этого шапероноподобная активность белка, фосфорилированного ERK1 по остаткам Ser24, Ser27 и Thr87 оказывается сопоставимой или меньшей, чем соответствующая активность нефосфорилированного белка дикого типа. В качестве второго модельного белка-субстрата для измерения шапероноподобной активности была использована роданаза, фермент, отличающийся термолабильностью и высокой начинающий денатурировать и агрегировать при 44°С. При весовом соотношении роданаза/Hsp22, равном 2/1, нефосфорилированный белок дикого типа практически полностью предотвращает агрегацию субстрата (рис.8А, кривая 2). Столь же эффективен в ингибировании агрегации роданазы мутант T87D, имитирующий фосфорилирование по одному из участков, узнаваемых ERK1 киназой (рис.8А, кривая 5). В тоже время мутант S57D, имитирующий фосфорилирование под действием цАМФРис.8. Шапероноподобная активность Hsp22 с роданазой в качестве модельного субстрата. Термоиндуцированную агрегацию изолированной роданазы (0.15 мг/мл) (кривая 1) или агрегацию роданазы в присутствии нефосфорилированного Hsp22 (кривая 2); Hsp22, фосфорилированного протеинкиназой ERK1 (степень фосфорилирования ~1.5 моль фосфата на моль белка) (кривая 3); S57D (кривая 4) и T87D (кривая 5) мутантов Hsp22 регистрировали по увеличению оптической плотности при 340 нм. Концентрация Hsp22, составляла 0.075 мг/мл (панель А) или 0.150 мг/мл (панель Б). зависимой протеинкиназы (рис.8А, кривая 4), и Hsp22, фосфорилированный цАМФ-зависимой протеинкиназой (данные не представлены) обладают наименьшей активностью. Низкая шапероноподобной шапероноподобная активность, сопоставимая с активностью S57D мутанта, была характерной и для точечных мутантов S24D представлены). 21 и Hsp22, S27D (данные не фосфорилированный ERK1 киназой, обладал шаперонной активностью, большей, чем мутанты S57D или S24D (S27D), но меньшей, чем нефосфорилированный Hsp22 дикого типа (рис.8А, кривая 3). При весовом соотношении роданаза/Hsp22, равном 1/1 (рис.8Б), были выявлены аналогичные закономерности. Шапероноподобная активность возрастала в ряду S57D мутант < Hsp22, фосфорилированный протеинкиназой ERK1 < нефосфорилированный белок дикого типа = мутант T87D. Эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными с использованием инсулина в качестве субстрата, и свидетельствуют о том, что фосфорилирование под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы или мутация S57D уменьшают шапероноподобную активность Hsp22. Фосфорилирование Ser24/Ser27 (или мутации S24D и S27D) также уменьшают шапероноподобную активность Hsp22. В то же время мутация T87D приводит к увеличению шапероноподобной активности. Вследствие этого фосфорилирование под действием протеинкиназы ERK1, когда модификации могут подвергаться как остатки Ser24/Ser27, так и Thr87 незначительно уменьшает шапероноподобную активность Hsp22. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Установлено, что цАМФ-зависимая протеинкиназа фосфорилирует Ser57, а протеинкиназа ERK1 – Ser24, Ser27 и Thr87 в структуре Hsp22. Белок дикого типа представлен в виде равновесной смеси мономеров и димеров и вследствие этого разведение сопровождается смещением равновесия в сторону мономеров, обладающих менее упорядоченной вторичной структурой. Фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) влияют на равновесие между димерами и мономерами Hsp22. Использование методов флуоресцентной спектроскопии, ограниченного протеолиза, химического «сшивания», гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования позволило показать, что мутации, имитирующие фосфорилирование, или фосфорилирование под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы или киназы ERK1 сопровождаются изменениями третичной и четвертичной структуры Hsp22. Мутации, имитирующие фосфорилирование остатков, расположенных в N-концевой части белка (Ser24, Ser27 или Ser57) приводят к уменьшению шапероноподобной активности Hsp22. В то время как мутация (и возможно, фосфорилирование) Thr87, расположенного в центральной части, сопровождается значительными изменениями структуры и увеличением шапероноподобной активности Hsp22. Таким образом, фосфорилирование влияет на структуру Hsp22 и его способность взаимодействовать с различными белками-субстратами. 22 ВЫВОДЫ 1. Обнаружено, что в условиях in vitro цАМФ-зависимая протеинкиназа способна фосфорилировать Ser57 Hsp22. 2. Установлено, что протеинкиназа ERK1 способна фосфорилировать Ser24, Ser27 и Thr87 Hsp22 in vitro, поэтому ERK1 может быть тем ферментом, который фосфорилирует Hsp22 в условиях in vivo. 3. Выявлено изменение спектров кругового дихроизма, происходящее при уменьшении концентрации белка, что может быть связано с диссоциацией олигомеров и дестабилизацией структуры освобождающихся мономеров. 4. Мутации, имитирующие фосфорилирование, а также фосфорилирование влияют на вторичную и третичную структуру Hsp22, что отражается в изменении собственной триптофановой флуоресценции и чувствительности к протеолизу. 5. Данные гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования свидетельствуют о том, что фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) способствует ассоциации мономеров Hsp22. 6. Фосфорилирование (или мутирование) расположенных в N-конце остатков Ser24, Ser27 и Ser57 уменьшает шапероноподобную активность Hsp22, в то время как мутирование расположенного в центральной части молекулы Thr87 увеличивает шапероноподобную активность Hsp22. Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах Шеметов, А.А., Сейт-Неби, А.С., Букач, О.В., Гусев, Н.Б. (2008) «Фосфорилирование сАМР-зависимой протеинкиназой влияет на структуру и ингибирует шапероноподобную активность малого белка теплового шока Hsp22 человека». Биохимия, 73(2): 247-257 Shemetov, A. A., Seit-Nebi, A.S., Gusev, N.B. (2008). "Structure, properties, and functions of the human small heat-shock protein HSP22 (HspB8, H11, E2IG1): a critical review." J. Neurosci. Res. 86(2): 264-269. Статья в коллективной могографии Shemetov, A.A., Mymrikov, E.V., Seit-Nebi, A.S., Gusev, N.B. (2010) “Structure, properties and miltiple functions of human small heat shock protien HspB8 (Hsp22, H11 protein kinase or E2IG1)”. In “Handbook of Molecular Chaperones: Roles, Structures and Mechanisms” (Durante, P. and Colucci L. Eds.). Nova Science Publishers, NY, pp. 333-352. 23 Тезисы докладов Шеметов, А.А. (2007) «Фосфорилирование малого белка теплового шока Hsp22 человека (HspB8, H11, E2IG1) сАМР-зависимой протеинкиназой». Тезисы докладов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007», с.39, Москва. Шеметов, А.А. (2010) «Фосфорилирование малого белка теплового шока человека HspB8 влияет на его структуру и шапероноподобную активность». Тезисы докладов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», с.68-69, Москва. Shemetov, A.A., Chernik, I.S., Seit-Nebi, A.S., Gusev, N.B. (2007) “Phosphorylation of human small heat shock protein HSP22 by cAMP-dependent protein kinase” Book of Abstracts of 2nd World conference of Stress, pp22-23, Budapest. Shemetov, A.A., Seit-Nebi, A.S., Bukach, O.V., Gusev, N.B. (2008) “Phosphorylation of human small heat shock protein HSP22 by cAMP-dependent protein kinase in vitro”. FEBS J., 275 (s1), p. 196, Book of Abstracts of 33rd FEBS Congress & 11th IUBMB Conference, Athens. Shemetov, A.A., Seit-Nebi, A.S., Gusev, N.B. (2010) “Phosphorylation of human small heat shock protein HspB8 by ERK1 affects its structure and chaperone-like activity”. FEBS J., 277 (s1), p. 300, Book of Abstracts of 35th FEBS Congress, Gothenburg. Данное исследование проводилось при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Arrigo AP, Simon S, Gibert B, Kretz-Remy C, Nivon M, Czekalla A, Guillet D, Moulin M, Diaz-Latoud C, and Vicart P. Hsp27 (HspB1) and alphaB-crystallin (HspB5) as therapeutic targets. FEBS Lett 581: 3665-3674, 2007. 2. Benndorf R, Sun X, Gilmont RR, Biederman KJ, Molloy MP, Goodmurphy CW, Cheng H, Andrews PC, and Welsh MJ. HSP22, a new member of the small heat shock protein superfamily, interacts with mimic of phosphorylated HSP27 ((3D)HSP27). J Biol Chem 276: 2675326761, 2001. 24 3. Cantin GT, Yi W, Lu B, Park SK, Xu T, Lee JD, and Yates JR, 3rd. Combining proteinbased IMAC, peptide-based IMAC, and MudPIT for efficient phosphoproteomic analysis. J Proteome Res 7: 1346-1351, 2008. 4. Chernik IS, Seit-Nebi AS, Marston SB, and Gusev NB. Small heat shock protein Hsp20 (HspB6) as a partner of 14-3-3gamma. Mol Cell Biochem 295: 9-17, 2007. 5. Chowdary TK, Raman B, Ramakrishna T, and Rao CM. Mammalian Hsp22 is a heatinducible small heat-shock protein with chaperone-like activity. Biochem J 381: 379-387, 2004. 6. Dephoure N, Zhou C, Villen J, Beausoleil SA, Bakalarski CE, Elledge SJ, and Gygi SP. A quantitative atlas of mitotic phosphorylation. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 10762-10767, 2008. 7. Fuchs M, Poirier DJ, Seguin SJ, Lambert H, Carra S, Charette SJ, and Landry J. Identification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction. Biochem J 425: 245-255, 2010. 8. Haslbeck M, Franzmann T, Weinfurtner D, and Buchner J. Some like it hot: the structure and function of small heat-shock proteins. Nat Struct Mol Biol 12: 842-846, 2005. 9. Kasakov AS, Bukach OV, Seit-Nebi AS, Marston SB, and Gusev NB. Effect of mutations in the beta5-beta7 loop on the structure and properties of human small heat shock protein HSP22 (HspB8, H11). Febs J 274: 5628-5642, 2007. 10. Kazakov AS, Markov DI, Gusev NB, and Levitsky DI. Thermally induced structural changes of intrinsically disordered small heat shock protein Hsp22. Biophys Chem 145: 79-85, 2009. 11. Kim MV, Kasakov AS, Seit-Nebi AS, Marston SB, and Gusev NB. Structure and properties of K141E mutant of small heat shock protein HSP22 (HspB8, H11) that is expressed in human neuromuscular disorders. Arch Biochem Biophys 454: 32-41, 2006. 12. Kim MV, Seit-Nebi AS, Marston SB, and Gusev NB. Some properties of human small heat shock protein Hsp22 (H11 or HspB8). Biochem Biophys Res Commun 315: 796-801, 2004. 13. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685, 1970. 14. Lebowitz J, Lewis MS, and Schuck P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci 11: 2067-2079, 2002. 15. Lehr S, Kotzka J, Avci H, Sickmann A, Meyer HE, Herkner A, and Muller-Wieland D. Identification of major ERK-related phosphorylation sites in Gab1. Biochemistry 43: 12133-12140, 2004. 16. McHaourab HS, Godar JA, and Stewart PL. Structure and mechanism of protein stability sensors: chaperone activity of small heat shock proteins. Biochemistry 48: 3828-3837, 2009. 17. Permyakov EA, and Burstein EA. Some aspects of studies of thermal transitions in proteins by means of their intrinsic fluorescence. Biophys Chem 19: 265-271, 1984. 18. Schaub MC, and Perry SV. The relaxing protein system of striated muscle. Resolution of the troponin complex into inhibitory and calcium ion-sensitizing factors and their relationship to tropomyosin. Biochem J 115: 993-1004, 1969. 19. Smith CC, Yu YX, Kulka M, and Aurelian L. A novel human gene similar to the protein kinase (PK) coding domain of the large subunit of herpes simplex virus type 2 ribonucleotide reductase (ICP10) codes for a serine-threonine PK and is expressed in melanoma cells. J Biol Chem 275: 25690-25699, 2000. 20. Villen J, Beausoleil SA, Gerber SA, and Gygi SP. Large-scale phosphorylation analysis of mouse liver. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 1488-1493, 2007. 21. Vos MJ, Hageman J, Carra S, and Kampinga HH. Structural and functional diversities between members of the human HSPB, HSPH, HSPA, and DNAJ chaperone families. Biochemistry 47: 7001-7011, 2008. 25 Для заметок 26
