СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ БЕЛКОВ

СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ БЕЛКОВ:
МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ
ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ
ПО РЕАКЦИИ С 2,4-ДИНИТРОФЕНИЛГИДРАЗИНОМ
Боев Константин Васильевич
канд. биол. наук, директор по науке
ООО «Медицинский центр «ДиАл-Мед»,
РФ, г. Воронеж
E-mail: [email protected]
Василенко Дмитрий Викторович
канд. мед. наук, доцент,
Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко,
зав. лабораторией ООО «Медицинский центр «ДиАл-Мед»,
РФ, г Воронеж
E-mail: [email protected]
Маслов Алексей Иванович
младший научный сотрудник,
Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко,
генеральный директор ООО Медицинский центр «ДиАл-Мед»,
РФ, г. Воронеж
E-mail: [email protected]
______________________________
Боев К.В., Василенко Д.В., Маслов А.И. Свободно-радикальное окисление белков:
методологические аспекты количественной оценки окислительной модификации по реакции
с 2,4-динитрофенилгидразином // Universum: Химия и биология : электрон. научн. журн.
2014. № 1 (2) . URL: http://7universum.com/ru/nature/archive/search-2/item/839
FREE-RADICAL OXIDATION OF PROTEINS:
METHODOLOGICAL ASPECTS OF QUANTITATIVE EVALUATION
OF OXIDATIVE MODIFICATION BY THE REACTION
OF 2,4- DINITROPHENYLHYDRAZINE
Boev Konstantin
Candidate of Biological Science,
director of science of medical center ”DiAl-Med”, Russia, Voronezh
Vasilenko Dmitry
Candidate of Medical Science, associate professor
of Voronezh State Medical Academy of N.N. Burdenko,
Head of the Laboratory of medical center ”DiAl-Med”, Russia, Voronezh
Maslov Alexey
junior researcher of Voronezh State Medical Academy of N.N. Burdenko,
general manager of medical center ”DiAl-Med”, Russia, Voronezh
АННОТАЦИЯ
Свободно-радикальное
окисление
белков
имеет
важное
значение
для организма, принимает участие в различных патофизиологических процессах.
Методы
их
оценки
различны.
с 2,4-динитрофенилгидразином.
Наиболее
Установлено,
распространена
что
пептиды
реакция
плазмы,
происходящие из окисленных белков, содержат большое количество кетонных
групп.
ABSTRACT
Free-radical protein oxidation has an important value for an organism, takes part
in a varied pathophysiological processes. The reaction with 2,4-dinitrophenylhydrazine
is mostly used. It has been established that plasma peptides, came from already
oxidized proteins, contain a large amount of carbonyl groups.
Ключевые слова: карбонильные группы, 2,4-динитрофенилгидразинпроизводные, белки, пептиды.
Keywords: carbonyl group, 2,4-dinitrophenylhydrazine derivatives, proteins,
peptides.
В настоящее время тема участия свободных радикалов кислородного
происхождения в биохимических и патофизиологических процессах уже
изучается в вузах [11, с. 125]. Тем не менее вопрос не потерял своей
актуальности.
В 1956 г. D. Harman впервые выдвинул теорию старения и развития
патологических состояний с участием свободных радикалов кислородной
природы [24, с. 299]. Свободные радикалы повреждают не только липиды
мембран, но и другие макромолекулы: нуклеиновые кислоты и белки. Причем
повреждению последних уделяется большое внимание. Если липиды мембран
защищены
от
радикальной
атаки
жирорастворимыми
антиоксидантами
(витамины Е, А), то белки, находящиеся в водном окружении, такой защитой
не обладают. Имеются данные, что липиды разрушаются под действием
свободных
радикалов
в
водной
среде
гораздо
быстрее,
чем в гидрофобной [15, с. 75].
Патофизиологический аспект окисления белков свободными радикалами
указан в фундаментальных изданиях [2, с. 316]. Более подробные сведения
можно найти в работах [13, с. 75; 17. с. 74; 19, с. 816]. Авторами приводятся
обзорные и экспериментальные данные относительно первичных механизмов
повреждений молекул белков свободными радикалами. В частности, показано,
что происходит неферментативное дезаминирование боковых радикалов
основных аминокислот с формированием карбонильных групп. Кроме того,
молекула белка фрагментируется, способна к образованию конгломератов
по типу прионовых белков.
Таким образом, процесс свободно-радикального окисления белков имеет
важное значение для жизнедеятельности.
Оценка степени окисления молекул белка свободными радикалами
осуществляется рядом методов. Первый, исторически более ранний предложен
C.N. Oliver [7, с. 24]. Метод предполагает определение карбонильных групп
в составе белка по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином. В методе
используются реагенты и последовательность их применения, тождественные
тем,
которые
использованы
для количественного
в
определения
методике
Севела-Товарека
пирувата
в
(1959)
лактат-дегидрогеназной
реакции [12, с. 199]. Другие авторы использовали для данной цели определение
концентрации хлор-производных аминокислот, образующихся при воздействии
гипохлорит-анион-радикала [14, с. 633; 25, с. 1739].
Кроме того, в последнее время для оценки окислительной деструкции
белков применятся метод иммуноферментного анализа с использованием
антител,
активных
в
отношении
2,4-динитрофенилгидразонов
белков [20, с. 204; 21, с. 394]. Последний метод малодоступен вследствие своей
высокой стоимости.
В России получил распространение метод химического определения
карбонильных производных белков по реакции с 2,4-динитрофенилгидразинном.
Количественная оценка деструкции белка по данному показателю весьма
вариабельна.
Чаще
всего
результат
выражают
в единицах
оптической
плотности на 1 г (мг) белка [1, с. 152; 3, с. 158; 4, с. 43; 10, с. 23]. Химикоаналитическое выражение результатов (нмоль/мг белка) варьируется в широких
пределах:
от
0,7 [17, с. 74]
до
4,5 [23, с. 108]
и даже
до
35 нмоль
2,4-динитрофенилгидразин-производных / мг белка [5, с. 162]. Причем все
результаты получены при использовании одного и того же базового метода.
Видимо, такой разброс данных способствовал тому, что исследователи стали
использовать
опосредованный
способ
оценки
повреждения
белков
—
по накоплению битирозина [8, с. 416; 22, с. 110].
Тем не менее общеизвестно, что динитрофенилгидразиновый тест является
наиболее чувствительным в отношении карбонильных групп. В условиях
организма
сложно
предположить,
что
альдегидные
группы
вносят
существенный вклад в данную реакцию. Скорее всего, они окисляются
или вступают в реакцию присоединения с подходящим нуклеофилом.
Кетогруппы менее реакционны, поэтому могут накапливаться в белковых
молекулах. Определяемые при 370 нм динитрофенилгидразоны, скорее всего,
ассоциированы именно с кетонными группировками.
В связи с изложенным выше, напрашиваются по крайней мере два вопроса:
1. Адекватность самого метода.
2. Интервал биохимической «нормы» показателя.
Цель нашего исследования — используя модель гипотетического белка,
рассчитать возможное количественное значение «нормы» концентрации
динитрофеилгидразоновых производных белка сыворотки.
Материалы и методы.
Реакцию с 2,4-динитрофенилгидразиом проводили согласно [12, с. 199].
Для оценки спонтанного свободно-радикального окисления белков
использовали сыворотку крови условно здоровых доноров (n=15), для оценки
окислительного повреждения пептидов — плазму (n=10). Оценка повреждения
пептида — инсулина «Novo Nordisk» (Дания) проводилась до и после
облучения УФ-светом. В качестве источника УФ-света использовалась
дейтериевая лампа (спектрофотометр СФ-26, при длине волны 220 нм
и максимальной щели в течение 45 минут). Определение концентрации пептида
в растворе проводили с использованием набора реагентов с пирогаллоловым
красным («Общий белок-03 Витал») на полуавтоматическом биохимическом
анализаторе «Clima MC-15» (Испания).
Регистрация оптической плотности проводилась на спектрофотометре
«СФ-26» (СССР) при длине волны 370 нм. Данный выбор связан с тем, что
динитрофенилгидразоны имеют разный максимум поглощения в зависимости
от среды (364 нм — кислая и нейтральная, 430, 530 — основная).
Соответственно, их обозначают в литературе как производные кислого,
нейтрального или основного характера. При этом коэффициент молярной
экстинкции различен (от 20000 до 22400 M x см-1) [6, с. 39, 50]. После реакции
кислого
раствора
динитрофенилгидразина
с
щелочью
реакция
среды
становится нейтральной. Поэтому мы не проводили регистрацию оптической
плотности при других длинах волн.
Оптическую плотность кетонной группы регистрировали при длине волны
280 нм,
рекомендованную
как
оптимальную
для
данного
было
проведено
хромофора [18, с. 223].
Результаты.
Моделирование
молекулы
гипотетического
белка
с использованием общеизвестных биохимических данных. Для упрощения
предполагали, что белок состоит из одной цепи и содержит равновероятный ряд
чередующихся аминокислотных остатков. При среднем содержании белка
в сыворотке 70 г/л на альбумины приходится 57,5 % (молекулярная масса
60 кДа),
на
глобулины
38 %
(средняя
молекулярная
масс
180 кДа).
Тогда средняя молекулярная масса = 103 кДа. Средняя молярная масса
аминокислотного остатка в белке составляет 120 г/моль. Имеем в итоге
858 остатков в полипептидной цепи. С учетом числа Авогадро в 1 г
гипотетического белка содержится 5,02 х 1021 аминокислотных остатков.
Если считать нормальной величиной спонтанного радикального окисления
белка 1 нмоль 2,4-динитрофенилгидразиновых производных / мг белка,
то число
динитрофенилгидразонов
в
полипептидной
цепи
составляет
7,405х1020. Соответственно, после деления получаем 10 % окисленных
остатков. При больших значениях, видимо, белок уже теряет функции
и фрагментируется.
Данная модель является приближенной и не отражает структуру
и аминокислотный состав конкретной макромолекулы. Тем не менее реальная
величина не должна превышать 1 нМ/мг белка. Расчеты согласуются
с данными [17, с. 74]. Существенное завышение результатов определения
у других авторов мы связываем с тем, что осадок белка промывался
этилацетатом (ацетоуксусным эфиром). Данное вещество представляет собой
смесь находящихся в равновесии форм: кетонной (93 %) и енольной
(7 %) [16, с. 118]. Понятно, что следы кетонного таутомера в осадке белка дадут
положительный тест с 2,4-динитрофенилгидразином.
Изучение
спонтанного
свободно-радикального
окисления
белков
сыворотки (волна 370 нм) показало величину 1,15±0,17 нмоль/мг белка,
что близко к расчетным данным.
Исследование кислоторастворимого супернатанта плазмы дало высокие
цифры: 38,7±2,6 нмоль/мг белка. Следовательно, пептидная фракция оказалась
наиболее
поврежденной
свободными
радикалами.
Это
согласуется
с литературными данными о фрагментации молекул белков с образованием
дополнительных карбонильных групп. Подобного рода превращения белков
под действием жесткого УФ-облучения приводят к образованию радикалов
пептидной группы [9, с. 15].
Мы
предполагаем,
что
некорректная
препаративная
обработка
биоматериала может привести к адсорбции окисленных пептидов на молекулы
денатурированного белка и дать дополнительную величину экстинкции после
проведения реакции.
Концентрация коммерческого препарата инсулина в пересчете на белок
составила
9,075 мг/мл.
Величина
спонтанного
свободно-радикального
окисления 1,179±0,014 нмоль/мг. После воздействия УФ-света показатель
составил 1,35±0,01 нмоль/мг (p<0,01).
Первичная структура инсулина давно изучена. Используя описанные выше
подходы, мы рассчитали, что нативный препарат инсулина содержит
1 окисленный аминокислотный остаток на 143 молекулы пептида (с учетом
двух цепей). После облучения 1 окисленный остаток приходился уже
на 126 молекул. Степень повреждения молекул выросла на 13,5 %. Таким
образом, изолированные от макромолекул пептиды оказываются весьма
лабильными к внешним воздействиям.
Выводы.
1. Метод оценки свободно-радикального окисления белков с помощью
реакции с 2,4-динитрофенилгидразином чувствителен.
2. Использование этилацетата может существенно завышать показатель
окисления белков.
3. Изолированные
пептиды
плазмы
весьма
лабильны
к
действию
свободных радикалов и происходят из окисленных белков.
4. Наличие пептидов в составе осадка денатурированного белка может
существенно исказить реальную величину показателя свободно-радикального
окисления полипептидной цепи.
Список литературы:
1.
Баврина А.П.,
Монич В.А.,
Малиновская С.Л.
и
др.
Влияние
низкоинтенсивного красного света на свободнорадикальное окисление
после облучения мощным лазером // Естественные и математические
науки в современном мире. — 2013. — № 12. — с. 149—158.
2.
Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. — М.: Мед, 1998. —
с. 314—316.
3.
Болотских В.И., Черных Ю.Н., Макеева А.В., Цветикова Л.Н. Динамика
показателей оксидативного стресса у больных ХОБЛ с сопутствующей
ИБС на фоне комплексного лечения с применением низкоинтенсивного
лазерного излучения и триметазидина // Международный журнал
прикладных и фундаментальных исследований. — 2013. — № 10-2. —
с. 157—160.
4.
Вьюшина А.В., Герасимова И.Г., Флеров М.А. Перекисное окисление
белков в сыворотке крови у перинатально стрессированных крыс //
Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2004. — Т. 138. —
№ 7. — с. 41—44.
5.
Давыдов В.В., Захарченко И.В., Овсянников В.Г. Особенности свободнорадикальных процессов в печени взрослых и старых крыс при стрессе //
Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2004. — Т. 137. —
№ 2. — с. 160—163.
6.
Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. — М.:
Мир, 1991. — с. 39—50.
7.
Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А., Поротов И.Г. Окислительная
модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения //
Вопросы медицинской химии. — 1995. — № 1. — с. 24—26.
8.
Дубинина Е.Е., Гавронская С.В., Кузьмин Е.В. И др. Окислительная
модификация белков: окисление триптофана и образование битирозина
в очищенных белках с использованием системы Фентона // Биохимия. —
2002. — Т. 67. — № 3. — с. 413—421.
9.
Ильясова В.Б., Азизова О.А., Каюшин Л.П. Фотосенсибилизированное
образование свободных радикалов в пептидной группе // Биофизика. —
1971. — Т. 16. — Вып. 1. — с. 11—18.
10. Коробейникова Э.Н.,
Кудревич Ю.В.,
Яшина Л.М.
Окислительная
модификация белков сыворотки крови у больных ишемической болезнью
сердца и гипертонической болезнью с диспротеинемией и без нее //
Клиническая лабораторная диагностика. — 2006. — № 4. — с. 22—24.
11. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека в двух
томах. Т. 1. — М.: Мир, 1993. — с. 118—126.
12. Меньшиков В.В..
Делекторская Н.Н.,
Золотницкая О.П.
и
др.
Лабораторные методы исследования в клинике. — М.: Медицина, 1987. —
с. 198—199.
13. Муравлева Л.Е. Молотов-Лучанский В.Б. Клюев Д.А. и др. Окислительная
модификация
белков:
проблемы
и
перспективы
исследования
//
Фундаментальные исследования. — 2010. — № 1. — с. 74—78.
14. Мурика М.А., Чудина Н.А., Рощупкин Д.Н. и др. Зависимость действия
хлораминовых
производных
аминокислот
от
их
структуры
и окислительной способности на агрегацию тромбоцитов // Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины. — 2004. — Т. 138. — № 12. —
с. 632—364.
15. Перевозкина М.Г. Кинетические модели для тестирования антиоксидантов
// Естественные и математические науки в современном мире. — 2013. —
№ 9. — с. 75—101.
16. Потапов В.М., Чертков И.Н. Строение и свойства органических веществ. —
М.: Просвещение, 1972. — с. 118.
17. Рябов Г.А., Азизов Ю.М., Дорохов С.И. и др. Окислительная модификация
белков
плазмы
крови
у
больных
в
критических
состояниях
//
Анестезиология и реаниматология. — 2000. — № 2. — с. 72—75.
18. Чанг Р. Физическая химия с приложениями к биологическим системам. —
М.: Мир, 1980. — с. 223.
19. Шаронов Б.П., Говорова Н.Ю., Лызлова С.Н. Антиокислительные свойства
и
деградация
белков
сыворотки
активными
формами
кислорода,
генерируемыми стимулированными нейтрофилами // Биохимия. — 1988. —
Т. 53. — Вып. 5. — с. 816—824.
20. Alexandre T. Rotta, Bjorn Gunnarsson, Lynn J. Hernan et al. Partial liquid
ventilation with perflubron attenuates in vivo oxidative damage to proteins
and lipids // Critical care medicine. — 2000. — Vol. 28, № 1. — P. 202—209.
21. Chi Ming Wong, Lucia Marcocci, Lingling Liu, Y.J. Suzuki Cell signaling
by protein carbonylation and decarbonylation // Antioxidants and redox
signaling. — 2010. — Vol. 12, № 3. — P. 393—404.
22. DiMarco T., Giulivi C. Current
analytical
methods
for the detection
of dityrosine, a biomarker of oxidative stress, in biological samples. // Mass
Spectrom. Rev. — 2007. — Vol. 26, № 1. — P. 108—120.
23. Fagan J.M., Ganguly M., Stockman H. et al. Posttranslational modifications
of cardiac and skeletal muscle proteins by reactive oxygen species after burn
injury in the rat // Ann. Surg. — 1999. — Vol. 229, № 1. — P. 106—114.
24. Harman D. Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry /
D. Harman // J. Gerontol. — 1956. — N 11. — P. 298—300.
25. Lamb N.J.,
Gutteridge J.M.,
Baker C.
Oxidative
damage
to
proteins
of bronchoalveolar lavage fluide in patients with acute respiratory distress
syndrome:
Evidance
for
neutrophil-mediated
hydroxylation,
nitration
and chlorination // Critical care medicine. — 1999. — Vol. 27, № 9. —
P. 1738—1745.