КРЕСТИНИНА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА 03.00.02.- Биофизика Автореферат
advertisement
На правах рукописи КРЕСТИНИНА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ МИТОХОНДРИЙ МОЗГА КРЫСЫ 03.00.02.- Биофизика Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Пущино 2005 Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН Научный руководитель: кандидат биологических наук Азарашвили Т.С. Научный консультант: доктор биологических наук, проф. Евтодиенко Ю.В. Официальные оппоненты: доктор биологических наук Косенко Е.А. доктор биологических наук, проф. Ягужинский Л.С. Ведущая организация: Институт биологии клетки РАН, Пущино. Защита диссертации состоится «__» __________2005 г. в ______ в Часов на заседании Диссертационного совета Д200.22.01 Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по Адресу: 142290, г. Пущино Московской области, ИТЭБ РАН С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН Автореферат разослан «___»___________2005 г. Учёный секретарь Диссертационного совета Кандидат физикоматематических наук Ланина Н.Ф. 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы протеикиназ фосфорилирование Осуществляемое посредством мембранных рецепторов, ионных каналов и других факторов является ключевым событием во внутриклеточной сигнализации, ответственной за регуляцию различных ферментных систем и клеточных функций. Из многих типов посттрансляционных ковалентных модификаций белков, которые происходят в клетках, относительно немногие обратимы в физиологических условиях. Одним из таких типов обратной модификации является фосфорилирование/дефосфорилирование, которое в большинстве случаев осуществляется по аминокислотным остаткам серина, треонина и тирозина. Фосфорилирование/дефосфорилирование является почти универсальным механизмом для регулирования функций белков, которые проявляют ферментативную активность, но также и белков, вовлечённых во многие другие биологические процессы. В настоящее время общепринято, что обратимое фосфорилирование белков, наблюдаемое как в клетках прокариот, так и эукариот, контролирует механизмы, регулирующие ряд таких биохимических функций, как распад гликогена и преобразование веществ в цикле Кребса, транскрипция гена, трансляция белка, мембранный транспорт, передача сигналов в клетке и др. В последнее время регуляция функций митохондрий может осуществляться путём фосфорилирования/дефосфорилирования белков, участвующих в процессах преобразования энергии. За последние 20 лет обнаружены и детально изучены фосфорилирование нескольких дегидрогеназ цикла Кребса, локализованных в митохондриальном матриксе, и соответствующая регуляция активности дегидрогеназ ионами Са2+ как вторичными мессенджерами посредством зависимого от протеинкиназ фосфорилирования (Bradford and Yeaman, 1986; Denton and McCormack, 1990; Hansford, 1994; Nichols and Denton, 1995; Rutter et al., 1998). В митохондриях сердца обнаружены и идентифицированы различные цАМР-зависимые и -независимые протеинкиназы. Эндогенные протеинкиназы могут фосфорилировать ряд мембраносвязанных белков в матриксе митохондрий. За исключением хорошо изученной роли протеинкиназ в регуляции функций митохондрий на уровне пируватдегидрогеназы и дегидрогеназы 2–кетокислот с разветвлённой цепью, роль фосфорилирования белков в митохондриях мало изучена. Тем не менее, показано, что белки, фосфорилируемые протеинкиназами, тесно связаны с комплексами дыхательной цепи. Фосфобелок с молекулярной массой (м.м.) 18 кДа идентифицирован как субъединица комплекса I, фосфобелок с м.м. 17 кДа - как субъединица 3 цитохрома-«с»-оксидазы; показана также ассоциация фосфобелка 42 кДа с митохондриальными ферментными комплексами I, III, IV и V (Sardanelli et al., 1995; Papa et al., 1996; Steenaart and Shore, 1997). Однако остаётся неясным, как осуществляется регуляция фосфорилирования/дефосфорилирования мембрано-связанных митохондриальных белков и каким образом эта регуляция влияет на функции митохондрий. В связи с вышеизложенным, представляется актуальным исследование фосфорилирования митохондриальных белков с целью возможного выявления новых фосфопептидов, выяснения их локализации в митохондриях, транспорта ионов кальция и выяснения, каким образом регулируются функции митохондрий. Цель и основные задачи исследования. Целью данного исследования было выявление новых мембраносвязанных фосфобелков в митохондриях мозга, исследование факторов, регулирующих их фосфорилирование/дефосфорилирование, а также выяснение возможности регуляции функций митохондрий мозга путём фосфорилирования/дефосфорилирования вновь обнаруженных фосфобелков. В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи: 1. Выявление спектра фосфорилированных полипептидов в митохондриях мозга. 2. Демонстрация возможности регуляции фосфорилирования /дефосфорилирования белков митохондрий ионами Са2+ как вторичным мессенджером. 3. Исследование корреляции открывания/закрывания Са2+индуцированной поры с фосфорилированием/дефосфорилированием найденных белков. 4. Выявление видов протеинкиназ, фосфорилирующих белки в митохондриях мозга, с помощью ингибиторного анализа. Доказательство участия ПКА и ПКС в фосфорилирование белков митохондрий. 5. Идентификация как Са и кальмодулин - зависимой протеинфосфатазы РР2В (кальцинейрин) как протеинфосфатазы участвующей в дефосфорилировании белков митохондрий. 6. Исследование возможной регуляции функционирования РТР посредством бензодиазепинового периферического рецептора (ПБР) в фосфорилировании белков в митохондриях мозга, на примере ПБР. 4
