Лунина Юлия Николаевна - Диссертация
реклама
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО НАУЧНЫХ ОГРАНИЗАЦИЙ Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук На правах рукописи ЛУНИНА ЮЛИЯ НИКОЛАЕВНА БИОСИНТЕЗ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ МУТАНТНЫМИ ШТАММАМИ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA ИЗ ВОЗОБНОВЛЯЕМОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ Cпециальность: 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Моргунов Игорь Григорьевич Пущино – 2015 г. ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ 4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7 1.1. Перспективы глубокой переработки зерна в России 7 1.2. Перспективы микробиологического получения органических кислот 8 1.3. Лимонная кислота, её характеристика и применение 13 1.4. Продуценты ЛК 17 1.5. Селекция продуцентов 25 1.6. Условия биосинтеза лимонной кислоты у дрожжей Y. lipolytica 31 1.7. Механизм биосинтеза лимонной кислоты у дрожжей Y. lipolytica 35 1.8. Глюкоза - субстрат для микробных трансформаций 38 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 43 2.1. Объекты исследования 43 2.2. Культивирование дрожжей 43 2.2.1. Состав и подготовка основной среды 43 2.2.2. Подготовка посевного материала 44 2.2.3. Методы культивирования дрожжей 44 2.3. Метод получения мутантов – активных продуцентов лимонной кислоты 46 2.3.1. Получение мутантов при облучении ультрафиолетом (УФ) 46 2.3.2. Индукции мутаций нитрозогуанидином (НГ) 46 2.3.3. Состав питательных сред для скрининга мутантов 47 2.4. Аналитические методы 47 2.4.1. Методы контроля роста дрожжей 47 2.4.2. Определение концентрации глюкозы 48 2.4.3. Определение концентрации органических кислот 49 2.4.4. Определение концентрации ЛК химическим методом 49 2.4.5. Определение трео-Ds-изолимонной кислоты энзиматическим методом 50 2.4.6. Анализ содержания азота 51 2.4.7. Определение содержания белка 51 2.5. Методы расчета технологических параметров ферментации 52 2.6. Определение активности ферментов 53 3 2.6.1. Получение бесклеточных экстрактов 53 2.6.2. Методы определения активности ферментов 53 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. 3.2. 3.2.1. 3.2.2. 3.2.3. 55 Отбор продуцента и условий культивирования, оптимальных для получения ЛК из глюкозы Получение мутантных штаммов Y. lipolytica с применением УФоблучения и N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидина Обработка Y. lipolytica ВКМ Y-2373 ультрафиолетовым облучением (УФ) 55 Обработка Y. lipolytica нитрозогуанидином (НГ) Отбор продуцентов 61 ВКМ Y-2373 с N-метил-N’-нитро-N- 60 60 64 3.2.3.1. Селективная работа на средах с ацетатом и цитратом 64 3.2.3.2. Отбор продуцентов на твердой среде с мелом или индикатором бромкрезоловым зеленым 3.2.4. Отбор продуцентов в жидкой среде 65 69 70 3.4. Получение мутантов с применением комбинированного мутагенеза и оценка их кислотообразующей активности Характеристика мутанта Y. lipolytica № 15 3.5. Биосинтез лимонной кислоты у Y.lipolytica №15 из глюкозы в ферментере 77 3.6. 80 3.6.1. Способы культивирования, обеспечивающие продолжительный и стабильный синтез ЛК из глюкозы у мутанта Y.lipolytica № 15 Использование мембранного модуля для биосинтеза ЛК 3.6.2. Отъемно-доливной метод культивирования 84 3.7. Особенности роста мутанта Y. lipolytica № 15 и синтеза ЛК при использовании рапсового масла в качестве источника углерода Проверка синтезирующей активности мутанта Y. lipolytica № 15 на средах с ферментолизатом осины в колбах Аминокислотный состав биомассы продуцента 88 3.3. 3.8. 3.9 76 81 98 101 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 106 ВЫВОДЫ 110 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 111 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 112 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Растительные крахмалсодержащих Земле. Около ресурсы культур, 1/20 (древесина хвойных злаки) являются общей одним продуктивности и лиственных из самых ценных богатств на биосферы пород, составляют ряд продукты сельскохозяйственного производства, которые ежегодно дают 8,7 млрд. тонн органического вещества. Дешевое, а главное, возобновляемое растительное сырье становится важным объектом исследований и разработок комплексных и экологически чистых технологий его переработки в различные продукты, например, белки и липиды, аминокислоты и органические кислоты, которые могут быть использованы в различных производствах (Stephanopoulos, 2007). Среди продуктов, полученных микробиологическим способом, большой интерес представляет лимонная кислота (ЛК). В мире ежегодное производство ЛК составляет 1 млн. 600 тыс. тонн, а годовой прирост – 3-5% от существующего уровня (Soccol et al., 2006). ЛК обычно используется в пищевой, химической и фармацевтической промышленности, однако, в настоящее время направления ее применения расширяются. Например, замена опасных для экологии полифосфатов, входящих в состав синтетических моющих средств (СМС), на цитрат натрия. В патентной и научной литературе имеется мало сведений о биосинтезе ЛК из растительного сырья. В Польше предпринимаются попытки разработать процесс получения ЛК из глюкозо-содержащих гидролизатов древесных отходов c помощью мутантных штаммов Yarrowia lipolytica (Woitatowicz et al., 1991). Эти работы не привели к положительным результатам в связи с тем, что мутанты со временем теряли свою кислотообразующую активность, и биохимический механизм синтеза кислоты до конца не изучен. Имеются единичные сведения о биосинтезе ЛК у Y. lipolytica из растительных масел (Kamzolova et al., 2005). Однако, природные штаммы на маслах продуцируют две кислоты: ЛК и изолимонную (ИЛК), которые являются стереоизомерами. Это снижает выход целевого продукта осложняет процесс выделения продукта литературе имеются данные, что мутант Candida lipolytica при росте и из ферментируемого раствора. Также в на глюкозе или глицерине синтезирует ЛК и ИЛК в соотношении 92:8 (Карклиньш, 1993). Вот почему задача получения мутантных штаммов-продуцентов только одной ЛК является весьма актуальной. Ее решение позволит провести разработку микробиологического способа получения этого продукта из возобновляемого сырья. 5 Цель и задачи исследования В связи с этим, цель настоящей работы заключалась в разработке процессов получения лимонной кислоты из возобновляемых источников углерода с помощью мутантных штаммов дрожжей Yarrowia lipolytica. В число основных задач входило: 1. Получение мутантных дрожжей Y. lipolytica - продуцентов ЛК c применением УФоблучения, N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидина и их комбинированного воздействия; 2. Разработка рациональной схемы отбора мутантов и экспресс-методов выявления активных продуцентов ЛК; 3. Исследование физиолого-биохимических особенностей мутантов-продуцентов ЛК при различных режимах культивирования в среде с глюкозой (периодический с подпиткой, отъемно-доливной, с применением мембранного модуля); 4. Изучение способности мутанта Y. lipolytica №15 синтезировать ЛК при росте в среде с глюкозо-содержащими ферментолизатами древесных отходов. Определение условий культивирования, обеспечивающих направленное образование ЛК; 5. Изучение закономерностей биосинтеза ЛК из растительных масел у мутанта Y. lipolytica №15 и разработка на этой основе эффективного способа получения ЛК. Научная новизна работы В результате обработки ультрафиолетовым облучением комбинированным природного и воздействием, штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидином, а также их селекционированы мутанты, характеризующиеся направленным биосинтезом ЛК в среде с различными возобновляемыми источниками углерода (глюкоза, рапсовое масло и другие). Разработан эффективный метод отбора мутантов – продуцентов ЛК. Для быстрого отбора мутантов предложены селективные среды с ацетатом и цитратом, на первом этапе отбора, а также качественные экспресс-методы оценки кислотообразования по зонам растворения мела и в жидкой среде с дефицитом азота, повышающей частоту выявления мутантов на порядки, на втором этапе отбора. Предположено, что селекция на средах с ацетатом/цитратом дает возможность направленно выявлять мутантов с блокировкой ЦТК и/или глиоксилатного цикла на уровне одного или нескольких ферментов, у которых соотношения цитрата к изоцитрату сдвинуто в сторону преимущественного синтеза ЛК. Методом мутагенеза удалось селекционировать мутанты, у которых преимущественный биосинтез ЛК происходит вследствие высокой активности цитратсинтазы и резко сниженной активности аконитат-гидратазы и НАД-изоцитрат-дегидрогеназы. 6 Практическая значимость работы С применением мутанта Y. lipolytica №15 в условиях периодического культивирования достигнута концентрация ЛК в среде c глюкозой, равная 100 г/л и в среде с рапсовым маслом 175 г/л ЛК, что достаточно для реализации в промышленном масштабе. Показано, что высокопродуктивный мутант Y. lipolytica №15 отличается устойчивостью к синтезу ЛК в течение длительного культивирования в режиме отъемов-доливов (1280 часов), концентрация ЛК составляла 65-70 г/л. И с применением мембранного модуля (480 часов), концентрация ЛК 25-40 г/л. Впервые была показана возможность получения ЛК и биомассы, обогащенной протеином и незаменимыми аминокислотами, из глюкозо-содержащих отходов лесопромышленноно комплекса (ЛПК). Апробация работы Основные результаты работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах следующих симпозиумов и конференций: на 2-ом Конгрессе Федерации европейских микробиологических обществ (Мадрид, Испания, 2006), на международных конференциях «Современное состояние и перспективы развития биотехнологии” (Минск-Раков, Беларусь, 2006, 2008, 2010), Пущинских школах-конференциях Всероссийской конференции для с молодых учёных на микробиологии и Международных (2006, 2007, 2010), на элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2011» (Тула, 2011), на конференции по биоорганической химии и биотехнологии, посвященной памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2011), а также ежегодных стендовых сессиях ИБФМ РАН (2010-2011, 2014). Публикации По теме диссертационной работы опубликовано 16 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК. Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Работа изложена на 127 страницах, содержит 26 таблиц и 21 рисунок. Список литературы включает 203 наименования, из них 129 – публикации в иностранных изданиях. 7 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Перспективы глубокой переработки зерна в России В настоящее производства время в планы Минсельхоза России входит увеличение зерна в ближайшие 5 лет до 140-145 млн. тонн в год, а экспортного потенциала – до 40 млн. тонн. Из собранных в прошлом году 108 млн. тонн зерна 70 млн. тонн использовалось для внутреннего потребления, примерно 20 млн. тонн пошло на экспорт. Из оставленных в запас 20 млн тонн зерна по разным оценкам от 5 до 10 млн тонн было потеряно из-за отсутствия мощностей для его хранения и переработки. Оставшееся зерно так и не было реализовано по приемлемым ценам. Ожидается, что при развитии животноводства будут расти внутренние потребности в зерне, и планируется довести его количество примерно до 80 млн. тонн. Поскольку в настоящее время сложно значительно повысить экспорт российского зерна из-за отсутствия развитых перегрузочных мощностей в российских портах, то альтернативой ему может стать глубокая переработка зерна. На нее можно направить до 10 млн. тонн зерна, что позволяет получить продукты, значительная часть которых пока импортируется из-за рубежа. К таким продуктам относятся – крахмал, клейковина (пшеничный глютен), глюкозные и глюкозно-фруктозные сиропы, в которых имеется большая потребность на внутреннем и внешнем рынках для производства биопластика и многих других материалов. Перспективно получение биопродуктов из крахмала зерна: глютамата натрия, биоразлагаемого пластика (полигидроксиалконат), незаменимой аминокислоты - лизина, которая необходима для добавки в корма животных, молочной кислоты для изготовления пленок, пищевой упаковки и т.п. Сейчас производство крахмала в России равно количеству импортируемого продукта, ввозится также 10 тыс. тонн глюкозы, в том числе медицинской – 6 тыс. тонн, хотя собственные возможности страны позволяют производить до 35 млн. тонн крахмала и 38,5 млн. тонн глюкозы в год. В настоящее время имеется особый интерес к развитию индустрии продуктов, в том числе биопластиков, из крахмала и глюкозных сиропов. Производство биопластиков идет по трем направлениям: путем синтеза из мономеров, за счет ферментации микроорганизмами (полилактатов). для защиты и путем полимеризации Использование окружающей среды, полилактатов производных считают так как упаковка из молочной кислоты наиболее перспективным биопластика буквально за две недели разлагается на углекислый газ и воду. А в настоящее время 80 % всех отходов в мире составляют пластики, неподдающиеся разложению длительное время. 1.3 – пропандиол – полимер, применяемый для изготовления ковровых покрытий, внутренней обивки автомобилей. Его производство отличается дешевизной и высокой 8 энергоэффективностью. В США уже произведены образцы ковровых покрытий из пропандиола, который был получен из кукурузы. Из итаконовой кислоты стало возможным получать так называемую нейтронную нить, которая применяется, например, в немнущихся костюмах. Из других биопластиков производят горнолыжные ботинки, каркасы карманных компьютеров, смартфонов, баков радиаторов, пневмопроводов, в т. ч. на Авто ВАЗе. В нашей стране также планируется переход на посуду и упаковки из биопластиков. Их производство требует гораздо меньше энергии и воды по сравнению с традиционными пластиками, но стоят они пока дороже. На многих конференциях мирового уровня рассматриваются вопросы экономики производства крахмала, глюкозы, клейковины, глютена, сиропов, органических кислот и другой продукции из кукурузы, пшеницы, ржи, амаранта, сорго и прочих культур, и обсуждаются возможности снижения издержек при глубокой переработке за счет применения ферментов, биотехнологии, современного оборудования, рациональной логистики, более дешевых кредитных ресурсов. Глюкозный сироп чаще всего производят из кукурузы, но некоторые европейские производители используют в качестве сырья пшеницу и картофельный крахмал. После его отделения от исходного сырья крахмал путем кислотного или ферментного осахаривания превращается в глюкозу. Кислотное осахаривание производится под давлением, а степень осахаривания регулируется путем изменения температуры, продолжительности обработки, рН и давления. В последние годы был разработан другой способ осахаривания, называемый ферментно-ферментативный (enzyme/enzyme conversion). Россия имеет все возможности для развития биотехнологий, повышения рентабельности зернового хозяйства, укрепление экономики села и регионов и увеличения занятости населения (Конференция: «Грэйнтек-2009»). 1.2. Перспективы микробиологического получения органических кислот Современный уровень развития биотехнологии позволяет широко использовать микроорганизмы для синтеза антибиотиков, аминокислот, полисахаридов, витаминов, каротиноидов, органических кислот и других веществ. В настоящее время возрастает интерес к биотехнологическому получению ряда химических продуктов и ожидается, что доля этих процессов возрастет с 5 % до 20 % (Hatti-Kaul et al., 2007). Органические кислоты могут быть получены микробиологическим способом и являются важной группой среди химических продуктов. В пищевой, химической, фармацевтической и других отраслях широко применяются органические кислоты и их соли. Способность ряда органических кислот полимеризоваться дает возможность образовывать многочисленные синтетические материалы, обладающие ценными свойствами и находящие широкое применение. Список наиболее 9 используемых «химических полупродуктов» был предоставлен министерством энергетики США. В него входят строительные блоки для химического синтеза, а также 9 органических кислот (Werpy and Peterson, 2004). Путем микробного синтеза в настоящее время можно было бы получать около 60 органических карбоновых кислот (Таблица 1). Все эти кислоты можно синтезировать химическими методами. Однако, при химическом синтезе используется в качестве исходного сырья нефть, газ и уголь, запасы которых не безграничны, кроме того этот процесс экологически небезопасен. При микробиологическом синтезе могут использоваться (и уже используются) неограниченные, постоянно возобновляемые ресурсы - растительное сырье (Patel et al., 2005; Kamzolova et al., 2005; Kamzolova et al., 2008), отходы лесной и сельскохозяйственной промышленности (Sauer et al., 2008), отходы производства биодизельного топлива (Дебабов, 2008; Камзолова с соавт., 2008; Фатыхова, 2011), стоки очистных сооружений городов (Sauer et al., 2008), этанол (Finogenova et al., 2002). Кроме того, микроорганизмы могут производить оптические изомеры, что очень важно при синтезе физиологически активных веществ для пищевой промышленности и здравоохранения. В нашей стране под руководством А.Б. Лозинова и Т.В Финогеновой в Отделе биоэнергетики Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (ИБФМ АН СССР) были начаты работы по исследованию микробиологического синтеза органичестких кислот. Было обнаружено, что алканассимилирующие дрожжи способны синтезировать ряд органических кислот: лимонную, трео-Ds(+)-изолимонную и -кетоглутаровую кислоты из жидкого парафина в значительных количествах. Эти работы были высоко оценены международным сообществом и являются приоритетными в области синтеза органических кислот (Barth, Gaillardin, 1996). Среди органических кислот наиболее востребованными являются ЛК, уксусная, глюконовая, молочная, итаконовая и янтарная кислоты (ЯК). В таблице 2 представлены данные о мировом производстве этих кислот путем химического синтеза и с помощью микроорганизмов. Мировая потребность в уксусной кислоте 7 000 000 тонн в год, из них с помощью Acetobacter aceti производится 190 000 т. Потребность в ЛК с каждым годом возрастает, и в настоящее время приближается к 1 600 000 тонн в год с ежегодным приростом 3-5 %. Глюконовая кислота активизирует обмен веществ, повышает работоспособность мышц, широко применяется в пищевой промышленности, она зарегистрирована в качестве пищевой добавки E574, как регулятор кислотности и разрыхлитель. В диссертациях (Ермакова, 1971; Финогенова, 1982; Моргунов, 2009) и обзорных статьях сотрудников 10 лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов ИБФМ РАН (Финогенова с соавт., 2005; Anasstasiadis et al.; 2007; Anastassiadis et al., 2008) имеется полная информация о Таблица 1. Основные органические кислоты, продуцируемые микроорганизмами 1 Кислота Аскорбиновая Винная Галловая Глюконовая Изолимонная Итаконовая Кетоглутаровая 2-кетоглюконовая 5-кетоглюконовая Койевая Лимонная Масляная Молочная Пировиноградная Пропионовая Уксусная Фумаровая Щавелевая Яблочная Янтарная Источник углерода Глюкоза Глюкоза Танин Глюкоза Глюкоза н-aлканы Сахароза Глюкоза н-aлканы Глюкоза Глюкоза Глюкоза Меласса н-алканы2 Этанол2 Крахмал Глюкоза Глюкоза Глюкоза Этанол Глюкоза н-aлканы Сахароза Глюкоза н-aлканы Этанол Яблочная кислота н-aлканы 1 - цит. по: Карклиньш, 1993 2 - цит. по: Финогенова и др., 2005 Микроорганизм-продуцент Penicillum notatum Gluconobacter suboxydans Aspergillus niger Aspergillus niger Candida brumpti Candida (Yarrowia) lipolytica Aspergillus terreus Pseudomonas fluorescens Candida lipolytica Pseudomonas fluorescens Gluconbacter suboxydans Aspergillus cryzae Aspergillus niger Candida (Yarrowia) lipolytica Candida (Yarrowia) lipolytica Clostridium butyricum Lactobacillus delbruckii Pseudomonas aeruginosa Propionibacterium shermanii Acetobacter aceti Rhizopus delemar Candida hedrocarbofumarica Aspergillus niger Lactobacillus brevis Candida hedrocarbofumarica Schizophillum commune Bacterium succinicum Candida brumptii Выход, % 45 30 100 95 28 115 65 48 80 90 90 60 90 142 88 50 90 50 60 95 58 84 60 100 72 60 57 72 11 Таблица 2. Мировые объемы производства органических кислот Органическая кислота Уксусная Объём производства путём химического синтеза (т/год) 7 000 000 Объём производства микробиологическим путём (т/год) 190 000 Применение Молочная 150 000 150 000 Производство продуктов питания, напитков, биодеградируемого пластика Итаконовая 15 000 15 000 Производство полимеров, Производство полимеров, растворителей, лекарств; пищевая добавка пластификаторов Лимонная Глюконовая 1 600 000 1 600 000 87 000 87 000 Производство продуктов питания Пищевая добавка Цит. по: Sauer et al., 2008. штаммах-продуцентах и условиях, стимулирующих процесс биосинтеза ЛК и глюконовой кислоты. В настоящее время имеется огромный интерес к молочной, итаконовой и янтарной кислотам из-за их способности легко полимеризоваться и образовывать многочисленные синтетические материалы, обладающие ценными свойствами и находящие широкое применение. Основными продуцентами молочной кислоты являются молочнокислые бактерии, такие как Lactobacillus lactis, Lb. delbrukii, Lb. plantarum, Streptococcus lactis, S. cremoris, Leuconostoc lactis, Pediococcus acidilactici и так далее. Также способностью накапливать молочную кислоту в больших количествах обладают мицелиальные грибы Rhyzopus oryzae, которые способны расти на минеральной среде и использовать крахмал и ксилозу в качестве источника углерода (Magnuson and Lasure, 2004; Koutinas et al., 2007; Maas et. al., 2006). По оценкам маркетологов производство молочной кислоты с помощью молочнокислых бактерий составляет 150 000 тонн в год (Hofvendahl and Hahn-Hagerdal, 2000) и ежегодно растет на 5-7% из-за потребности в молочной кислоте при производстве биоразлагаемого пластика – полилактида. Молочную кислоту применяют в пищевой промышленности, а также в технике, при обработке кож, в текстильной индустрии при производстве красителей и получения искусственных материалов. Итаконовая кислота входит в состав нитрилакрилового волокна «нитрол». Она применяется также в производстве высококачественных синтетических смол, поверхностно- 12 активных веществ, моющих средств и при синтезе ряда сложных органических соединений. Мировое производство итаконовой кислоты в последнее время превышает 15 000 т/год (Sauer et al., 2008). Итаконовую кислоту получают глубинным и поверхностным методами ферментации, а продуцентами являются селекционированные штаммы грибов Aspergillus itaconicus, A. terreus (Willke et al., 2001). Процесс получения итаконовой кислоты сходен с используемым в настоящее время процессом получения ЛК. Субстратом является меласса, которая должна присутствовать в достаточных количествах при одновременном дефиците фосфора и железа. Соли цинка, магния и меди обязательно должны присутствовать в среде, т.к. потребность продуцента в них высока. Поскольку итаконовая кислота токсична, то при накоплении ее в среде более 7 % рост продуцента снижается и синтез кислоты ингибируется. Дробные добавки гидроксиаммония позволяют нейтрализовать ее токсичность. ЯК в химической промышленности широко используется как исходное сырье для получения четырехуглеродных соединений, таких как адипиновая кислота, 1,4-бутандиол, тетрагидрофуран, N- метилпироллидон и других. Ароматические и гетероциклические амины янтарной кислоты применяют в производстве некоторых красителей и инсектицидов. Диэтилсукцинат (ароматизатор с цветочным запахом) используется в парфюмерной промышленности. ЯК входит в состав новых видов упаковочного материала, способных разлагаться на нетоксичные продукты (Zeikus et al., 1999; Carole et al., 2004). Отмечается положительное использование сукцината при кормлении животных (Samuelov et al., 1999). Кроме того, в последнее время важными областями применения ЯК стали пищевая промышленность и здравоохранение. Установлено, что ЯК является сигнальным веществом, связывающим энергетическую и гормональную системы организма (Кондрашова, 1991; 2002). ЯК является партнером адреналина в деятельности симпатической нервной системы как активатора физиологических функций. На основании этих исследований предложено использовать ЯК в качестве природного профилактического и лечебного средства (Кондрашова 2002). В промышленности ЯК производится химическим синтезом из бутана через малеиновый ангидрид (Zeikus et al. 1999; Carole et al. 2004). ЯК, которая используется в пищевой промышленности и здравоохранении, получается с помощью химической переработки янтаря (методом сухой перегонки) (Carole et al., 2004). В растворе ЯК может существовать в нескольких конформерных формах и соотношение конформеров и динамика их взаимных переходов может определять их биологическую активность (Kagaki et al., 1964). В последние годы отмечается интерес к производству ЯК микробиологическим путем. Это обусловлено большей экологической безопасностью производства, а также высокой 13 чистотой получаемых препаратов. Стоимость ЯК, производящейся микробиологическим путем с использованием селекционированных мутантных штаммов, намного ниже, чем полученной путем химического синтеза (Zeikus et al., 1999). Известными продуцентами ЯК являются анаэробные бактерии Anaerobiospirillum succiniciproducens (Lee et al., 1999b; Samuelov et al., 1999; Lee et al., 2003), Actinobacillus succinogenes (Guettler et al., 1999) и Escherichia coli (Lin et al., 2005 (a, b); Wu et al., 2007), а в качестве источника углерода используются углеводы. Имеются работы по исследованию принципиальной возможности синтеза ЯК аэробными организмами – дрожжами и грибами. В частности, синтез ЯК обнаружен у грибов Penicillium simplicissimum (Gallmetzer et al., 2002), растущих на глюкозе, дрожжей рода Candida при их культивировании на н-алканах (Sato et al., 1972) или этаноле (Ермакова, Мандева, 1981; Мандева, 1981; Мандева c соавт., 1981) и Saccharomyces cerevisiae при росте в среде c глюкозой (Lupianez et al., 1974; Arikawa et al., 1999). Исследована возможность получения ЯК путем восстановления фумаровой кислоты с использованием грибов и бактерий (Moon et al., 2004). Сравнительно недавно в лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов разработан оригинальный способ получения ЯК, включающий микробиологический синтез α-кетоглутаровой кислоты из этанола с использованием дрожжей Yarrowia lipolytica и ее дальнейшее окисление до ЯК в присутствии H2O2 (Юсупова, 2011; Kamzolova et al., 2009). Данный процесс позволяет получать ЯК в концентрации 63,4 г/л с выходом 58% от потребленного субстрата. Произведенная микробиологическим способом ЯК выделена из фильтрата культуральной жидкости, очищена и охарактеризована. При выделении из фильтрата выход ЯК составлял 82%, чистота получаемого продукта - 100%. Качество получаемого продукта соответствует квалификации "biochemical grade", что подтверждено результатами исследования окисления ЯК митохондриями печени крыс. В настоящее время в России ни одна из названных кислот в промышленном масштабе не производится. Организация микробиологического производства данных органических кислот является одной из приоритетных задач в промышленной микробиологии. 1.3. Лимонная кислота, её характеристика и применение Лимонная кислота (ЛК) - моноокситрикарбоновая кислота, которая кристаллизуется из водных растворов с одной молекулой воды (моногидрат лимонной кислоты) в виде бесцветных кристаллов ромбообразной формы. Молекулярная масса моногидрата ЛК составляет 210, плотность 1,540 г/см3, температура плавления 70-75 оС. При показателях температуры кристаллизации более 36,6 оС выделяется безводная ЛК, имеющая молекулярную массу 192 и температуру плавления до 153 оС. Кислота разлагается при нагревании до 175 оС, 14 хорошо растворима в воде (1460 г/л при 20 оС) и умеренно - в этаноле (620 г/л при 25 оС). Соли лимонной кислоты – цитраты, плохо растворимы в воде (Карклиньш, Лиепиньш, 1993). ЛК широко распространена в природе. Особенно много ее в незрелых фруктах и ягодах (лимоны, клюква, яблоки, виноград, брусника и другие) (до 5%) и в соках (до 9%), где ЛК является естественным консервирующим агентом. Лимоны и содержащуюся в них ЛК люди употребляли издавна. Еще Авиценна упоминал о лечебных свойствах лимонов. В год ЛК получают 1 млн. 600 тыс. тонн, а ее производство увеличивается примерно на 5 % (Berovic and Legisa, 2007; Anastassiadis et al., 2008). В таблице 3 собраны сведения о применении ЛК в различных отраслях промышленности. ЛК необходима в пищевой промышленности для производства алкогольных и безалкогольных напитков, кондитерских изделий, ее используют для осветления вина, придания терпкости и улучшения вкуса, рафинирования растительных масел, а также для производства сгущенного молока. Также при попадании в организм человека с продуктами питания ЛК стимулирует секреторные функции поджелудочной железы, способствует выделению поджелудочного сока и повышению усвояемости пищи. Значительное увеличение потребления ЛК в мире за последние 10-15 лет связано с появлением низкокалорийных безалкогольных напитков на основе аспартама и других подсластителей. Натриевые соли ЛК (цитрат натрия) способны стимулировать пенообразование и поддерживать механическую устойчивость пены, поэтому ЛК используют в кулинарии при изготовлении выпечки, как антиоксидант, консервант, для контроля рН продукта (Bal’A, Marshall, 1998; Christopher et al., 2003). Для человека суточная доза ЛК составляет 50-120 мг/кг. При производстве молочных продуктов: используется в сливках для стабилизации казеина, выступает в качестве эмульгатора для стабилизации фаз (воды и масла) в сыре и улучшает органолептические свойства продукта (Bal’A, Marshall, 1998; Christopher et al., 2003). При изготовлении консервов помогает сохранить естественный цвет, предотвращает обесцвечивание консервированных продуктов, действует как антиоксидант и антимикробный агент. ЛК обладает консервирующими свойствами. С помощью ЛК можно сохранить вкус мяса, рыбы, овощей и фруктов при длительном хранении в холоде. В настоящее время ЛК применяется для консервирования крови, а также при изготовлении косметических средств. ЛК также является хелатирующим (комплексообразующим) агентом, что позволяет широко использовать ее при дублении кож, окраски тканей, очистки паровых котлов, в процессах электрогальванизации, изготовлении чернил. Также ее используют для получения 15 алкидных смол, а при производстве лаков эфиры ЛК являются пластификаторами. В фармакологии ЛК и цитрат натрия используют для консервирования крови. Безводная ЛК – для приготовления витаминов, болеутоляющих порошков и таблеток. Как антикоагулянт, в качестве вкусового и стабилизирующего агента в жидких суспензиях и растворах, входит в состав шипучих растворимых таблеток и маскирует горький вкус некоторых лекарств, цитрат кальция применяется в качестве диетической добавки. В сельском хозяйстве применяется как кормовая добавка, увеличивающая растворимость питательных веществ, усиливающая вкус, используется для контроля рН желудка (Soccol et al., 2006). Также ЛК способствует удалению свинца из загрязненных почв (Dilara, Wayne, 2007). Цитрат аммония также используется для очистки железных и медных окислов в паровых котлах, ядерных реакторах. Как буферный, хелатирующий агент, смягчитель воды для уничтожения водорослей в водохранилищах и природных источниках вод. Защищает древесину от грибков, насекомых, используется для лечения пород древесин. Наряду с традиционным использованием лимонной кислоты рассматриваются новые направления ее применения. В ряде стран, таких как США, Япония, Бельгия, при получении синтетических моющих средств натриевыми солями лимонной кислоты заменяют триполифосфат натрия, который при попадании в водоемы резко ухудшает их экологическую обстановку, вызывая обильное размножение сине-зеленых водороcлей. По расчетам японских экономистов, ежегодная мировая потребность в цитрате натрия для производства детергентов может составить по меньшей мере 400 тыс. тонн в год. Потребность цитрата натрия в России для аналогичных целей оценивается в 20-25 тыс. тонн в год. Также рассматривается применение ЛК в таких областях как нанобиотехнология, тканевая инженерия, так как она может быть использована в составах противоопухолевых препаратов, которые обладают сильной противоопухолевой активностью и не имеют побочных эффектов. Может использоваться в качестве сополимера при производстве наноматериалов, которые используются в нанолекарствах. Группой американских ученых разработан нано-ЛК-полимер для использования в качестве биологически совместимого клеточного материала для культивирования мышечных, хрящевых и костных клеток. 16 Таблица 3. Применение ЛК и ее солей Область применения Пищевая Косметическая Фармацевтическая Продукт/процесс Применение Ссылки Напитки/ кондитерские изделия/молочные продукты/консервы/ мясные продукты Подкислитель, усилитель вкуса, аромата, для контроля рН продукта. Цитрат натрия для стабилизации казеина в сливках, как эмульгирующая соль для стабилизации фаз (воды и масла) в сыре. Для сохранения цвета, запаха продуктов, антимикробный агент, антиоксидант. На бойнях – предотвращает свертываемость крови Bal’A, Marshal (1998) Косметика/моющие средства Банк плазмы, крови и др. Как регулятор рН, буферный агент, хелатирующий ионы металла Антикоагулянт, вкусовой и стабилизирующий агент в жидких суспензиях и растворах, входит в состав шипучих растворимых таблеток Сополимер для синтеза наноматериалов, которые используют в нанолекарствах, как биологически совместимый клеточный материал для культивирования различных клеток Soccol et al. (2006) Soccol et al. (2006) Нанолекарства Биомедицина Сельское хозяйство Другие области Защита древесины Christopher et al. (2003) Ashkan et al. (2010), Guillermo et al. (2010) в производстве Тканевая инженерия Используется Yang et al. полиэфирных эластомеров (2004) Для увеличения растворимости Soccol et Кормовая добавка питательных веществ, усиления вкуса, al. (2006) контроля рН желудка Плодородие почв Способствует удалению загрязненных почв свинца из Dilara, Wayne (2007) Dilara, Wayne (2007) Текстиль Регулятор рН, буферный и хелатирующий агент Сигареты Усилитель вкуса Очистка металлов Цитрат аммония используется для очистки железных и медных окислов в паровых котлах, ядерных реакторах Буферный / хелатирующий агент / смягчитель воды Для уничтожения водорослей в водохранилищах и природных источниках вод Другие Для использования в нетоксичных процессах (дубление кожи, переработка отходов, изготовление, клея, цемента) Консервант на водной основе Для защиты древесины от грибков, Yang et насекомых; сложного лечения пород al. (2004) древесин 17 1.4. Продуценты и способы получения ЛК Первоначально ЛК производили путём экстракции продукта из итальянских лимонов. Цитрат калия осаждался из их сока. Однако в дальнейшем её стали получать из углеводов с помощью грибов родов Aspergillus и Penicillum. В.С.Буткевичем было установлено, что в условиях высокой кислотности без присутствия СаСО3 образовывалась практически одна ЛК. Это впоследствии было подтверждено С.П.Костычевым, что оказалось важным для разработки промышленного получения лимонной и глюконовой кислот в нашей стране и за рубежом. (Промышленная микробиология, 1989). В таблице 4 перечислены наиболее активные продуценты ЛК. Таблица 4. Микробиологический синтез ЛК и ИЛК из различных источников углерода Микроорганизмы - продуценты Источник углерода Выход по отношению к источнику углерода, % Лимонная кислота 1. Мицелиальные грибы: сахароза (меласса) Aspergillus niger А.auricomus, A. elegans, Penicillium chermisinum, P. decumdens, 85 парафин 41 глюкоза парафин глицерин 74 140 31 крахмал глюкоза глицерин парафин 90 парафин 46 P. estinogenum 2. Дрожжи: Candida lipolytica (Yarrowia lipolytica) Saccharomycopsis lipolytica 3. Бактерии: Corynebacterium species Изолимонная кислота Дрожжи: Candida brumptii Yarrowia lipolytica Candida ravautii (C. catenulata) цит. по Карклиньш, Лиепиньш, 1993 глюкоза алканы, этанол глюкоза 28 60-70 50 18 Наиболее изучены многочисленные представители аспергиллов, особенно Aspergillus niger, его физиология и механизм биосинтеза ЛК. Это наиболее распространенный в природе микромицет (плесневый грибок), принадлежащий к высшим грибам (эумицетам) представляющий класс аскомицетов, или сумчатых грибов. и A. niger имеет членистое, многоклеточное вегетативное тело, называемое мицелием, или грибницей. В Советском Союзе микромицеты как потенциальные продуценты ЛК были впервые исследованы В. Омелянским, С. Костычевым и С. Буткевичем. Была выявлена определённая взаимосвязь между синтезом цитрата и азотным питанием гриба A. niger, и было показано, что синтез ЛК происходил после полного потребления азота из среды. В дальнейшем установлено, что такие элементы как фосфор, сера, магний и калий, концентрация кислорода в среде и рН также влияют на процесс кислотообразования у A. niger (Буткевич, Тимофеева, Результаты 1935). этих экспериментальных исследований были положены в основу разработки промышленных процессов получения ЛК из углеводных субстратов с помощью грибов. Под руководством С. Костычева и С. Буткевича в 1932 г. была разработана технология производства ЛК из сахарозы с использованием оригинального штамма A.niger, и в 1935 году в Ленинграде был пущен первый в СССР цех по производству ЛК путем трансформации сахаров грибами A. niger. Один из первых в СССР заводов по производству ЛК начал действовать в 1948 году в Риге, где была разработана технология биосинтеза ЛК из сахаров мелассы с использованием гриба A. niger. До настоящего времени пищевую ЛК получают с помощью A. niger из мелассы. Самым крупным производителем ЛК является США, в частности фирмы «Ch. Pfizer» и «Miles Laboratories, Inc», которые производят ее как внутри страны, так и на своих предприятиях во многих других странах. Основными участниками российского рынка ЛК являются производители из Китая, которые контролируют больше половины рынка, и еще около 40% приходится на долю российской компании ОАО «Белгородский завод лимонной кислоты (Цитробел)», которая производителем ЛК после распада СССР осталась практически единственным России. В ближнем зарубежье наиболее крупными производителями ЛК являются ОАО «Смелянский сахарный завод» (Украина) и Скидельский сахарный завод (Республика Беларусь), но их продукции на российском рынке практически нет. Таким образом, на сегодняшний день на отечественном рынке присутствуют два крупные участника — «Цитробел» и китайские производители (Продиндустрия, 2005). Следует отметить трудности технологии получении ЛК с использованием A. niger. Процесс получения ЛК с использованием A. niger является многостадийным и трудоемким. В ходе выделения ЛК из культуральной жидкости после растворения цитрата калия серной кислотой образуется гипс – твердый отход, который никак не утилизируется в дальнейшем и 19 подлежит захоронению. Кроме того, мицелий A. niger придает высокую вязкость культуральной жидкости, что затрудняет аэрацию и перемешивание культуральной жидкости в ферментере, а также делает невозможным осуществление непрерывных процессов (Карклиньш, Лиепиньш, 1993). Альтернативой традиционному грибов является способу получения ЛК с помощью мицелиальных использование в качестве продуцентов этой органической кислоты дрожжевых микроорганизмов. С 60-х годов в качестве перспективного продуцента ЛК рассматриваются дрожжи Candida lipolytica. Изучение этого вида дрожжей началось благодаря их необычным физиологическим характеристикам. В 1939 году советский микробиолог Т.А. Таусон опубликовал данные, свидетельствующие о способности дрожжей рода Candida, использовать в качестве единственного источника углерода н-алканы. По этой причине в период осуществления проектов по получению кормового белка при помощи одноклеточных данные дрожжи были наиболее интересны. Данный род классифицировался как Candida до тех пор, пока у этих дрожжей не было обнаружено полового размножения. Наличие совершенных форм C.lipolytica было обнаружено в конце 60-х годов. Было показано, что культура выделенная из продуктов переработки зерна, будучи перенесена на определенную среду, формирует аски, прикрепленные к элементам гиф. Споры из этих асков могли быть изолированы, но их жизнеспособность при этом была очень низкой. Данная совершенная форма сначала была классифицированна как Endomycopsis lipolytica, затем как Saccharomycopsis lipolytica, и, наконец, как Yarrowia lipolytica (Kubicek et al., 1986). Клетки у Y. lipolytica круглые, грушевидные или яйцевидные. На агаре Сабуро образуют крупные колонии сметанообразной или крошковидной консистенции. Клетки чаще одиночные, беспигментные, иногда имеют слабый желтовато-кремовый оттенок. Размеры одиночных клеток лежат в пределах от 1 до 10 мкм, чаще 3-7 мкм. При образовании мицелия или вытянутых клеток псевдомицелия длина может достигать 20 и даже 50 мкм, а ширина остается постоянной и обычно не превышает 10 мкм (Карклиньш, Лиепиньш, 1993; Barth et al., 1996). Среди физиологических признаков дрожжей Y. lipolytica наиболее значимыми являются: строгая потребность в кислороде; из углеводных субстратов предпочитают утилизировать глюкозу, могут также расти на глицерине, этаноле, растительных маслах, глюконовой и лимонной кислотах; у данных организмов отмечена способность к росту на гидрофобных субстратах, что обусловлено наличием экзоклеточного фермента усваивают азот гетеротрофны. липазы; только в аммонийной форме, способны гидролизовать белки; тиамин- 20 Работы по биосинтезу ЛК в нашей стране были начаты более 40 лет назад в Отделе биоэнергетики Института биохимии и физиологии микроорганизмов под руководством А.Б. Лозинова и Т.В. Финогеновой. На протяжении этого времени сотрудниками отдела проводились детальные исследования процессов получения ЛК у дрожжей Y. lipolytica при росте на разных субстратах: для технических нужд из н-алканов, глицерина и глицеринсодержащих отходов производства биодизельного топлива, а также пищевой ЛК из глюкозы, этанола и растительных масел в условиях периодического и непрерывного культивирования. Изучены механизмы регуляции ключевых ферментов ЦТК, участвующих в процессах сверхсинтеза органических кислот. Процессы получения ЛК из н-алканов, этилового спирта и рапсового масла воспроизведены в полупромышленных масштабах. Работы по изучению биосинтеза ЛК дрожжами Y. lipolytica ведутся также и за рубежом. Описаны процессы получения пищевой ЛК из глюкозы (Aiba and Matsuoka, 1979; Klasson et al., 1989; Wojtatowicz et al., 1991; Rane and Sims, 1993; Anastassiadis, 1994; Moresi, 1994; Grewal and Kalra, 1995; Anastassiadis et al., 2002), глицерина и глицерин-содержащих отходов биодизеля (Papanikolaou et al., 2002; Rymowicz et al., 2010) и растительных масел (Ikeno et al., 1975; Good et al., 1985; Aurich et al., 2003) в условиях периодического и непрерывного культивирования. Как видно из таблицы 5, при культивировании дрожжей рода Candida на среде с глюкозой были достигнуты следующие результаты. При периодическом культивировании в ферментере дрожжей Saccharomycopsis lipolytica NRRL Y7576 концентрация ЛК составила 51,5 г/л, а выход 0,71 г/г (Klasson еt al.,1989). Лучшие результаты были получены при использовании дрожжей Saccharomycopsis lipolytica D1805 и составили 95 г/л ЛК и выход 0,75 г/г соответственно. (Briffaud, Engasser, 1979). При культивировании дрожжей C.lipolytica Y1095 и Y. lipolytica ATCC 20346 в условиях периодического режима с подпиткой в ферментере авторам удалось достичь концентраций 78,5 г/л и 69,0 г/л с выходами по биомассе 0,79 г/г и 0,52 г/г, соответственно (Rane and Sims, 1993; Moresi, 1994), в то время как при использовании биореактора с мембранным модулем синтез ЛК C.lipolytica Y1095 составил 50 г/л и 0,72 г/г (Rane and Sims, 1993). Дрожжи С.oleophila ATCC20177 в условиях периодического режима в ферментере накапливали 79,1 г/л с выходом 0,55 г/ г, а при непрерывном культивировании 57,8 г/л ЛК и 0,40 г/г, соответственно (Anastassiadis et al., 2002; Anastassiadis and Rehm, 2005). Также проводилось культивирование дрожжей Y.lipolytica AWG7 на глюкозном сиропе в условиях непрерывного режима в ферментере с мембранным модулем. Авторами было получено 119 г/л ЛК с выходами по биомассе 0,5 г/г (Rywińska et al., 2009), что является высоким показателем. 21 В 70-90 – х годах в лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов (ЛАММ) ИБФМ РАН проводилась работа по изучению возможности использовать глюкозу в качестве источника углерода для биосинтеза ЛК (Лозинов с соавт., 1974; Глазунова, Финогенова, 1976; Финогенова с соавт., 1979; Финогенова с соавт., 1984; Зякун, 1992). В таблице 6 обобщены данные этих исследований. Т.В. Финогеновой с соавторами (1984) в колбочных экспериментах был проведен сравнительный анализ кислотообразующей активности природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 и его мутантов, полученных в результате обработки нитрозометилмочевиной (НММ) при их культивировании в среде с глюкозой. Было установлено, что все три исследуемых штамма в среде с глюкозой образуют преимущественно ЛК в количестве 5,8-6,5 г/л при рабочей биомассе 2,6-3,1 г/л. В работе А.М. Зякуна с сотрудниками (1992) было показано, что на процесс биосинтеза ЛК из глюкозы существенное влияние оказывает углекислота. Был проведен анализ избыточного содержания изотопа 13С в молекуле ЛК с использованием радиоуглеродного Таблица 5. Синтез ЛК дрожжами из глюкозы при различных типах культивирования Режим культивирования Saccharomycopsis Периодическое, lipolytica D1805 ферментер Штамм Субстрат ЛК (г/л) YЛК (%) Ссылки глюкоза 95,0 75 глюкоза 51,5 71 Briffaud and Engasser, 1979 Klasson et al., 1989 Saccharomycopsis lipolytica NRRL Y7576 C.lipolytica Y1095 Y. lipolytica ATCC 20346 Периодическое, ферментер Непрерывное, глюкоза ферментер Непрерывное глюкоза культивирование, ферментер 13,6-78,5 79 50,0-69,0 52 C.lipolytica Y1095 Непрерывное, глюкоза ферментер с мембранным модулем Нериодическое, глюкоза колбы,ферментер Непрерывное, глюкоза ферментер 40,0-50,0 72 Rane and Sims, 1995 50,1-79,1 55 37,6-57,8 40 Непрерывное, ферментер мембранным модулем 119 50 Anastassiadis et al., 2002 Anastassiadis and Rehm, 2006 Rywińska et al., 2004 С.oleophila ATCC20177 С.oleophila ATCC20177 Y.lipolytica AWG7 Глюкозный с сироп Rane and Sims, 1993 Moresi, 1994 22 метода, и установлено, что рН 4,5 оптимальное для ассимиляции экзогенной углекислоты. При оптимально подобранных условиях авторами вышеприведенной статьи удалось достичь 12-15 г/л ЛК при рабочей биомассе 5 г/л. Как видно из представленных данных в таблицах 5 и 6 результаты исследований биосинтеза ЛК и ее выход были не такими высокими, как разработанные в нашей лаборатории способы получения ЛК на других субстратах. Как видно из таблицы 7 на среде с алканами (гексадекан и н-парафины) при использовании природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 накапливались примерно равные количества ЛК и ИЛК, что составило 102 г/л с выходом 142 % от внесенного парафина, тогда как его мутант №1 синтезировал преимущественно ЛК в количестве 217 г/л с выходом 145 %. При синтезе ЛК на среде с этанолом при непрерывном культивировании была достигнута концентрация 130 г/л (Финогенова и др., 2000), при использовании мембранного модуля 60-70 г/л, методов отъема-долива – 105 г/л (Арзуманов, 1998). А при использовании побочных продуктов или отходов производства этилового спирта 70 г/л ЛК и 94 г/л цитрата натрия (Агаджанян и др., 2000). Как показали ранее полученные результаты, использование мутантных штаммов позволяет резко увеличить выход ЛК при культивировании в средах с возобновляемыми источниками углерода. В работе Фатыховой (2011) (Таблица 7) синтез ЛК проводился на средах с глицерином и глицерин-содержащими отходами в качестве источников углерода и энергии. Так при периодическом культивировании природный штамм Y.lipolytica ВКМ Y-2373 из глицерина синтезировал 110 г/л ЛК, а мутант № 15 – 98 г/л ЛК, с выходом 58,0 и 70,0 % соответственно. А при использовании глицерин-содержащих отходов штамм Y.lipolytica ВКМ Y-2373 синтезировал 61,72 г/л, мутант №15 – 71,0, выход составил - 59,0 и 90,0 % соответственно. Метод отъема-долива на глицерин-содержащих отходах позволил увеличить синтез ЛК до 145 г/л, и выход составил 96 %. Таблица 6. Биосинтез ЛК дрожжами из глюкозы Штамм Режим культивирования Ферментер, периодическое культивирование Колбы Биомасса (г/л) 5,0 ЛК (г/л) 3,1 5,8 1,1 5,3:1 Колбы 2,7 6,5 0,2 32:1 Мутант №2 Колбы 2,6 5,6 3,1 1,8:1 С.lipolytica ИБФМ-Y 160 С.lipolytica ВКМ Y-2373 С.lipolytica ВКМ Y-2373 С.lipolytica (природный) С.lipolytica Колбы - 2,1 0,7 3:1 Финогенова и др. 1984; Finogenova et al, 1986; Финогенова,1982 Финогенова и др. 1984, Finogenova et al, 1986; Финогенова,1982 Финогенова и др., 1984; Finogenova et al, 1986; Финогенова, 1982 Глазунова, Финогенова,1976 Колбы - 2,4 0,6 4:1 Лозинов и др.,1974 Колбы 3,0 5,9 0,9 6,5:1 Финогенова и др., 1979 Колбы 2,4 6,3 0,1 63:1 Финогенова и др., 1979 Колбы - Сумма ЛК, ИЛК 3,0 - - Козлова и др., 1982 С.lipolytica 160 Колбы, ферментер (5л), периодическое культивирование Колбы, ферментер периодическое - Сумма ЛК,ИЛК 10,5 - - Акименко и др., 1979 - Сумма ЛК,ИЛК 1,0 - - Акименко и др., 1979 Ферментер, периодическое Культивирование, (5л) колбы 0,08-0,1 0,5 0,2 2,5:1 Мандева и др., 1981 2,8 6,1 1,8 3,4:1 Финогенова, 1982 Y. lipolytica ВКМ Y-2373 Y. lipolytica ВКМ Y-2373 Мутант №1 С.lipolytica 155 C. guilliermondii var. caprophilia С.lipolytica ВКМ Y-2373 ИЛК (г/л) 12,0-15,0 ЛК:ИЛК - - Ссылка Зякун и др, 1992 23 24 Таблица 7. Синтез ЛК дрожжами из различных субстратов1 Режим культивирования Субстрат непрерывное этанол 130 Мембранный модуль, Отъем-долив этанол, 60-70 Y.lipolytica ВКМ Y-2820 D Отъем-долив; мембр. модуль 70; цитрата натрия - 94 Y.lipolytica Периодическое, ферментер Периодическое, фементер Периодическое, ферментер Периодическое, ферментер Периодическое, ферментер Побочные продукты или отходы произв. этил.спирта парафин 102 142 парафин 217 145 глицерин 110 58,0 Финогенова и др., 2005 Лозинов и др., 1982 Фатыхова, 2011 глицерин 98 70,0 Фатыхова, 2011 Глицеринсодержащие отходы Глицеринсодержащие отходы глицеринсодержащие отходы Рапсовое масло 61,72 59,0 Фатыхова, 2011 Штамм Y.lipolytica ВКМ Y - 2785 D C.lipolytica ИБФМ-У 149(674) ВКМ Y-2373 Мутант №1 (187/1) Y.lipolytica ВКМ Y-2373 Y.lipolytica № 15 Y.lipolytica ВКМ Y-2373 Y.lipolytica № 15 Периодическое, ферментер Y.lipolytica № 15 Отъем-долив Y. lipolytica 187/1 Периодическое, ферментер ЛК YЛК/S (г/л) (%) (г/г) Ссылки Финогенова др., 2000 Арзуманов, 1998 и 105 Агаджанян и др., 2000 (0.59) 71,0 90,0 Фатыхова, 2011 (0,9) 145,0 96.0 Фатыхова, 2011 135 1,55 Kamzolova et al., 2005 (г/г) На среде с рапсовым маслом мутант Y. lipolytica 187/1 накапливал 135 г/л ЛК и выход составил 1,55 г/ г (Kamzolova et al., 2005). Данные о промышленном получении ЛК с использованием дрожжей Y. lipolytica до сих пор отсутствуют. Тем не менее, внедрение технологии получения ЛК с помощью дрожжей может не только сократить расходы на производство, но и существенно повысить чистоту получаемого продукта, тогда как при традиционном производстве ЛК грибами A. niger не всегда удается получить продукт со стабильно высоким качеством. 25 1.5. Селекция продуцентов Для использования микроорганизмов в промышленных масштабах необходимо проводить отбор и селекцию наиболее продуктивных штаммов. Существует ряд требований, которым должен соответствовать промышленный продуцент: 1) рост и синтез целевого продукта на дешевых и доступных субстратах; 2) cкорость роста биомассы и продуктивность целевого продукта должны быть экономически оправданы при потреблении субстрата (коэффициент конверсии основного сырья должен быть высок); 3) биосинтетическая активность должна иметь четкую направленность, то есть не иметь побочных продуктов, либо их количество должно быть минимальным; 4) иметь генетическую однородность и сохранять стабильность по отношению к продуктивности, питательному субстрату и условиям культивирования; 5) иметь устойчивость к посторонней микрофлоре; 6) не быть патогенным для людей и окружающей среды; 7) желательно, чтобы продуцент был кислотоустойчив. Это обеспечивает предохранение ферментируемого субстрата от инвазий посторонней микрофлоры (Карклиньш, Лиепиньш, 1993). Как правило, природные штаммы микроорганизмов не всегда обладают высокой способностью синтезировать необходимый продукт в оптимальном количестве и без сопутствующего образования побочных продуктов. В связи с этим наряду с исследованиями по усилению природной активности микроорганизма-продуцента большое внимание уделяется селекционной работе по повышению продуктивности штамма. В настоящее время показано, что перспективен метод получения активных продуцентов ЛК с применением метода мутагенеза – искусственного отбора измененных форм, индуцированных мутагенами (Щербакова, 1971; Авчиева, Винаров, 1993; Sanjay and Sharma, 1995). Для индукции мутаций селекционеры чаще всего применяют мутагенные факторы физической и химической природы. В таблице 8 приведены сведения о влиянии различных мутагенов на клетку. Варианты с повышенной способностью к биосинтезу ЛК были обнаружены в 1928 году при обработке культуры гриба A.niger ультрафиолетовыми лучами и радием, но эти мутанты оказались нестабильными и быстро теряли приобретенные свойства. В 1935 году появились первые сообщения о получении искусственных положительных мутантов A.niger c повышенной способностью продуцировать ЛК, которые также впоследствии оказались неустойчивыми и потеряли свои свойства. В 1955 году австралийские ученые Д. Гарднер, Л. Джеймс и С. Руббо получили первые стабильные мутанты A.niger промышленного значения с помощью рентгеновских и ультрафиолетовых лучей. 26 В Советском союзе до 1962 года ЛК производили с помощью природных штаммов A.niger, которые были получены либо из отечественных музейных культур, либо из зарубежных лабораторий. Однако природные штаммы кроме ЛК синтезируют достаточное побочных количество кислот, таких как глюконовую, щавелевую, яблочную, сахарную, янтарную, малоновую, адипиновую, аконитовую. Общая сумма которых составляет около 20-25% общей кислоты ферментируемого субстрата. Также происходит нерациональный расход сырья, поскольку побочные кислоты затрудняют фракционирование ЛК в чистом виде (Карклиньш, Лиепиньш, 1993). В Санкт-Петербургском ВНИИПАК под руководством Щербаковой Е.Я. путем направленного мутагенеза был получен первый в России устойчивый мутант A. niger 288. Таблица 8. Влияние химических мутагенов на споры микромицета Aspergillus niger1 Химические мутанты Фактор воздействия Ингибиторы предшественников нуклеиновых кислот: изогуанин,кофеин, теобромин Аналоги азотистых соединений: 5-бромурацил, 5хлорурацил, 2аминопурин Алкилирующие соединения: диметилсульфат, диэтилсульфат, окись пропилена Присоединяются к активным Повышение активности центрам ферментов, мутантов на 30 %, но они не нарушается синтез ДНК устойчивы Включаются в аминокислоты вместо пуриновых и пиримидиновых соединений Группы –СН3 или –С2Н5 присоединяются к азотному основанию ДНК, из него выпадает то или иное основание Окислители: азотная Окисляют NH2 до N и кислота, перекись водорода, превращают одно азотное кислород основание в другое Изменяется строение вновь синтезированной ДНК Супермутанты: Вызывают мутации N-нитрозосоединения, посредством алкилирования нитрозометилмочевина, и окисления оснований нитрозоалкилмочевина, нуклеотидов нитрозоалкилуретаны, нитрозоалкиламиды, нитрозоалкиламины, диазометан, этиленимин, производные этиленимина 1 - цит. по: Карклиньш, Лиепиньш, 1993 Результат воздействия Повышение активности мутантов, но они не устойчивы Активность мутантов, как у исходного штамма Повышение активности на 5 %, которое падает при пересевах Комбинированное воздействие с УФ-лучами приводит к стабильному повышению активности мутантов на 50-70 % 27 В последующем, на основе этого мутанта получен ряд более активных штаммов (Щербакова, 1971). Огромная работа по получению мутантов была проведена сотрудниками экспериментального завода биохимических препаратов Академии наук Латвии. В качестве продуцента был отобран родительский штамм A.niger 5/6 из Института сельскохозяйственной микробиологии ВАСХНИЛ. Было селекционировано несколько промышленных мутантов с умеренной активностью путем многократного отбора активных естественных мутаций для синтетических сахарозных сред. Один из мутантов штамм R-3 на основе A. niger характеризовался увеличением выхода ЛК по сравнению с природным штаммом в 1,6 раза (Карклиньш, Лиепиньш, 1993). Для мелассных сред был получен мутант ЭУ-1 путем обработки естественного мутанта A.niger № 90 с завода г. Казнеева (Чехословакия) этиленимином с последующим воздействием на него УФ –лучами (Карклиньш, Лиепиньш, 1993). В дальнейшем была получена серия искусcтвенных мутантов, подвергнутых обработке нитрозометилмочевиной, нитрозометилгуанином, диазоацетилбутаном, диэтилсульфатом, УФлучами и гамма-лучами. После ступенчатого отбора для использования в промышленности рекомендованы высокопродуктивные мутанты A.niger Р-1, Р-2, Р-3, которые при поверхностном культивировании на мелассных средах обеспечивают конверсию сахарозы до 85%, с накоплением побочных продуктов не более 4%. Для осуществления глубинного метода биосинтеза ЛК в промышленном масштабе был получен штамм A.niger 288/9. Для сред с сахарозой и глюкозой тоже были получены подходящие штаммы. Селективная работа проводилась также биотехнологами из Бангладеш, которые путем воздействия гамма-лучей на дикую культуру A. niger получили мутанты, обеспечивающие в условиях поверхностного культивирования биоконверсию сахаров тростниковой мелассы в ЛК с коэффициентом 0,50-0,51 (Islam et al, 1988). Интерес к дрожжам Y. lipolytica как к объекту для генных трансформаций в последнее время постоянно возрастает, что связано с уникальным клеточным строением данного вида дрожжей (Barth and Gaillardin, 1996; 1997). Однако, работ касающихся возможности получения практически ценных мутантов на основе дрожжей Y. lipolytica, пока немного. В 1970 году Табучи с соавторами (Tabuchi et al., 1970) получили первый УФ-мутант N 6-20 С. lipolytica, у которого был подавлен синтез ИЛК. В дальнейших публикациях японских исследователей этот мутант не упоминался. В результате обработки природного штамма N 228 (=АТСС 20114) химическим мутагеном N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидин (НГ) и последующей селекции Акияма и соавторами (Akiyama et al., 1973 a, b) отобраны два мутанта К-20 и S-22. Использование 28 мутанта S-22 позволило фирме Такеда разработать практический способ производства ЛК из н-алканов. Известно, что штамм и соответствующая документация были переданы этой японской фирмой американской компании Пфайзер и итальянской фирме Ликвихимика (Гордон с соавт., 1979). Последние в своих странах освоили микробиологическое производство цитрата натрия и ЛК из парафина (Гордон с соавт., 1979). Известны еще два мутанта – продуценты ЛК. Один из них Candida (Yarrowia) lipolytica, полученный Икено с соавторами (Ikeno et al., 1975) обработкой дикого штамма НГ, второй мутант – C.lipolytica, полученный Фурукава с соавторами (Furukawa et al., 1977) с помощью УФ-облучения. В 1972 году в Отделе биоэнергетики ИБФМ РАН были начаты работы по получению мутантов дрожжей на основе природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373, способных продуцировать ЛК и ИЛК в виде монопродукта при росте на парафине. Шишкановой Н.В. было установлено, что природный штамм Y. lipolytica ВКМ Y-2373 является гаплоидным и может быть использован для получения необходимых мутантов. Мутанты получали обработкой родительского штамма УФ-лучами и нитрозометилмочевиной. В итоге было получено большое количество новых форм. В результате удалось отобрать 12 мутантов, которые отличались от родительского не только способностью продуцировать одну кислоту, но одновременно более высокой активностью кислотообразования (Шишканова, 1979; Финогенова, 1982). Из них для последующей работы отобраны два мутанта – мутант №1 – продуцирующий практически одну ЛК и мутант №2 – синтезирующий преимущественно изоцитрат. Закономерности сверхсинтеза ЛК и ИЛК для родительского и мутантных штаммов были общими, но наблюдались изменения в ферментной системе, так активность цитрат-синтазы в период активного синтеза кислот у полученных мутантов значительно превышала активность у родительского штамма (Финогенова, 1982). Последующее наблюдения за этими культурами показали, что большинство мутантных штаммов оказались нестабильными и, в процессе пересевов и хранения, потеряли способность преимущественного синтеза одной кислоты. Наиболее стабильной оказалась культура Y. lipolytica НММ-187 (мутант №1), которая до сих пор не утратила основного признака – преимущественного синтеза ЛК из н-парафинов, который достигал 217 г/л, а выход составил 145 %. В то время как практически все мутантные штаммы – продуценты ИЛК потеряли первоначальные свойства. Известно, что возможность получения устойчивых биохимических мутантов дрожжей в значительной мере определяется плоидностью исследуемой культуры. Такие мутанты достаточно легко получаются при работе с гаплоидными клетками, в то время как у диплоидных и полиплоидных клеток получить мутанты очень трудно или практически невозможно (Шишканова, 1979; Финогенова, 1982; Barth and Weber, 1984). В качестве 29 критерия плоидности дрожжевых клеток может служить легкость получения ауксотрофных мутантов (Фостер, 1950). Другим критерием плоидности является характер кривой выживаемости в зависимости от дозы облучения УФ-лучами (Шишканова, 1979, Akiyama et al., 1973b). В результате воздействия, как физических, так и химических мутагенов выжившие конидии грибов A. niger и клеток дрожжей Y. lipolytica характеризуются различными, как физиологическими, так и морфологическими особенностями. Так мутантные штаммы гриба A. niger отличались от исходного размером и строением конидиальных головок и окраской колоний. Величина колоний варьировала в широких пределах – от колоний гигантской величены до очень мелких колоний, подобных колониям бактериальных культур. Окрашивание морфологически измененных форм гриба A. niger менялось от желтоватобежевого до коричневого цвета различной интенсивности. Наблюдались черного цвета (Щербакова, 1971). Имеются данные о возможности колоний мутантных штаммов также колонии изменения цвета дрожжей Y. lipolytica на зеленый, коричневый или красный (Bassel and Mоrtimer, 1982; Barth and Weber, 1984). Авторы многих работ отмечают, что многие мутантные штаммы дрожжей Y. lipolytica проявляют ауксотрофность, главным образом, по отношению к аминокислотам, аденину, урацилу, таким витаминам как биотин, никотиновая кислота, пантотеновая кислота, рибофлавин и тиамин (Gaillardin, Heslot, 1988; Bassel and Mortimer, 1982; Barth and Weber, 1984; Heslot, 1990). Данные по поводу требования к тиамину противоречивы. Если все природные штаммы дрожжей Y. lipolytica являются тиамин-зависимыми, то при выращивании мутантных штаммов в среде полностью лишенной этого витамина, некоторые штаммы начинают синтезировать тиамин в незначительных количествах (Barth and Weber, 1984). Определяющим и одновременно самым трудоемким этапом в процессе мутагенеза микроорганизмов является отбор положительных мутантов (Рисунок 1). Из тысяч клеток, подвергнутых мутагенному воздействию, следует отобрать несколько клеток с индуцированными положительными свойствами. Для этих целей разработано несколько экспресс методов. Наиболее простые – это диагностические методы, основанные на применении определенных индикаторов. Индикаторные чашки дают возможность различать мутанты по цвету колоний и проводить тестирование разнообразных фенотипов в больших популяциях. Так для обнаружения активных продуцентов ЛК применяют селективные чашки с индикатором бромкрезоловым зеленым (Щербакова, 1971; Kirimura et al., 1987). Об активности биосинтеза ЛК при этом судят по размерам и окраске зон вокруг колоний. Иногда вносят субстраты, 30 изменяющие прозрачность сред, и наблюдают образование вокруг колоний зон просветления. Так выращивают колонии на агаровых пластинках с добавлением мела. По величине прозрачного пятна, образовавшегося в результате растворения мела синтезированной ЛК, судят о биосинтетической активности колонии (Фаусек, 1991; Карклиньш, Лиепиньш, 1993). Как правило, все методы отбора положительных мутантов основываются на учете ауксотрофности, оценке активности отдельных ферментов и сводятся к выбору среды для отбора необходимых вариантов. Некоторые мутанты дрожжей Y. lipolytica характеризуются резистентностью по отношению к антимикробным агентам, например антибиотикам. (Barth and Weber, 1984; Gaillardin, Heslot, 1988). На этой особенности основан ряд методов отбора необходимых мутантов; так метод с использованием нистатина применяется для отбора ауксотрофных мутантов и мутантов не способных ассимилировать цитрат (Barth and Weber, 1984; Wojtatowicz et al., 1993). В литературе имеются данные, касающиеся частоты реверсии мутантных штаммов дрожжей. У большинства полученных мутантов Y. lipolytica частота реверсии колеблется в пределах 10-7 - 10-8 или ниже (Barth and Weber, 1984; Kujay et al., 1992). Однако у некоторых штаммов реверсия происходит с более высокой частотой. Причины такой нестабильности пока не известны. Выбор объекта селекции. Наследственная изменчивость ↓ Мутагенез спонтанный или индуцированный физическими, химическими или биологическими воздействиями; методы получения мутантов определенного класса ↓ Отбор естественный или искусственный ↓ Стабилизация свойств штаммов, полученных в результате селекции Рисунок 1. Схема селекции микроорганизмов1 1 - цит. по: Карклиньш, Лиепиньш, 1993 31 Таким образом, разработка современных методов получения мутантов и отбор активных продуцентов ЛК – одна из основных задач в условиях постоянно возрастающей потребности в этой кислоте. Исходя из литературных данных, наиболее ценные результаты получены при использовании для мутагенной обработки комбинаций из различных мутагенов, либо в результате многократной обработки и путем многоступенчатого отбора. 1.6. Условия биосинтеза лимонной кислоты у дрожжей Y. lipolytica В условиях периодического культивирования микробная культура постоянно подвержена влиянию многочисленных, постоянно изменяющихся факторов, связанных с изменением состава среды – потреблением питательных компонентов, накоплением продуктов обмена. Это прежде всего выражается в изменении скорости роста микробной популяции, а следовательно, и динамики развития культуры. Кривая роста, отражающая процесс нарастания биомассы в условиях периодического культивирования делится обычно на несколько фаз. Эта классическая концепция описана в многочисленных обзорах и монографиях (Monod, 1949; Иерусалимский, 1965; Перт, 1978; Работнова, Иванова, 1971; Работнова, 1972; Работнова, 1975), поэтому здесь целесообразно ограничиться только их краткой характеристикой: 1. Лаг-фаза – состояние культуры после внесения посевного материала, когда скорость роста равна нулю. В этот период происходит синтез адаптивных ферментов, нуклеиновых кислот, белков, увеличивается размер клеток. Происходит их активная подготовка к размножению. 2. Фаза экспоненциального роста характеризуется постоянной максимальной для данных условий удельной скоростью роста, когда зависимость логарифма биомассы от времени линейна. В этот период культура обеспечена всеми питательными веществами, необходимыми для синтеза клеточных компонентов. 3. Фаза замедления роста следует за экспоненциальной фазой и переход в нее обусловлен, как правило, либо исчерпанием одного из источников питания, либо накоплением продуктов обмена, ингибирующих рост. При этом снижается скорость синтеза клеточных компонентов, которые обеспечивают процесс размножения, но при избытке источника углерода интенсифицируются процессы синтеза резервных полимеров, а также первичных и вторичных метаболитов. 4. Стационарная фаза завершает фазу замедления и характеризуется постоянным уровнем биомассы, где количество отмирающих и вновь образующихся клеток уравновешено. Метаболизм неразмножающихся клеток в этих условиях резко изменяется – полностью 32 прекращаются реакции, связанные с конструктивным обменом, но активно осуществляются реакции окислительного обмена, необходимые для обеспечения выживаемости клетки. 5. Фаза отмирания наступает при исчерпании целого ряда питательных элементов и сопровождается автолизом клеток под действием собственных гидролитических ферментов или при отравлении собственными метаболитами. В работах многих авторов отмечено, что рост микроорганизмов в экспоненциальной фазе характеризуется постоянной удельной скоростью μ, являющейся максимальной для данных условий культивирования. В этот период внешние культуру, так как все необходимые питательные вещества условия еще не влияют на находятся в достаточном количестве, и продукты обмена не накапливаются. Во время экспоненциальной фазы размеры и состав клеток, концентрация в них метаболитов, а также активность ферментов постоянны, и нет преимущественного синтеза каких-либо компонентов. Такой рост называют сбалансированным. Однако исследования, проведенные под руководством И.Л. Работновой, показали, что и в этот период протекание биосинтетических процессов подвержено значительным колебаниям. В средах с различными источниками углерода в экспоненциальной фазе было отмечено несколько периодов ускорения и замедления роста, которые трудно выявить на кривой роста, построенной в полулогарифмической системе координат, но совершенно отчетливо прослеживались на кривой удельной скорости роста (Работнова, 1972). Из литературных данных известно, что условием сверхсинтеза ЛК является лимитирование роста культуры одним из компонентов среды (N, P, S, Mg2+) при одновременном избыточном содержании источника углерода (Лозинов с соавт., 1974; Akiyama, 1974; Lokwood, 1975; Финогенова, 1982). Как правило, рост клеток лимитируют азотом, поскольку он требуется клеткам в значительно больших концентрациях, чем другие элементы, и проще создать ситуацию лимитирования одним из компонентов при избытке всех других компонентов питательной среды. После засева продуцента в свежую питательную среду происходит активный рост культуры и потребление лимитирующего компонента среды (Behrens et al., 1978; Anastassiadis et al., 2002). Исчерпание азота из питательной среды не является достаточным условием для начала экскреции ЛК. Понижение внутриклеточного азота инициирует начало экскреции ЛК (Shimizu et al., 1973; Anastassiadis et al., 2001; Anastassiadis, Rehm, 2005; 2006). При переходе культуры в фазу замедленного роста начинается интенсивный синтез кислот, который продолжается в стационарной фазе роста. Синтез кислот продолжается пока в среде присутствует источник углерода и пока клетки продуцента остаются достаточно активными. Активность клеток определяется условиями культивирования, которые поддерживаются на заданном уровне. Основные факторы, регулирующие биосинтез ЛК, представлены ниже. 33 Из литературных данных известно влияние рН среды на физиолого-бихимические особенности микроорганизмов (Лирова с соавт., 1978), а также на содержание белка, РНК и ДНК (Андреева с соавт., 1975; Сахарова, Работнова, 1977; Смирнова с соавт., 1982). Дрожжи Y. lipolytica способны расти в широком диапазоне рН 2,5-8,0 (Финогенова с соавт., 1979; Камзолова, 1995). При этом оптимальная активная кислотность среды для роста биомассы не совпадает с оптимальными условиями биосинтеза. Максимальная активность кислотообразования наблюдается при рН 5,0-6,0 (Лозинов с соавт., 1974; Илларионова с соавт., 1975; Финогенова с соавт., 1973). При более низких значениях рН происходит образование полиолов, главным образом, эритритола и маннитола (Tabuchi, Hara, 1970). Изменение рН среды в пределах, обеспечивающих нормальный рост дрожжей, сказывается и на качественном составе лимонных кислот (Фаусек, 1991; Камзолова с соавт., 2007). В условиях лимитирования роста азотом в среде с рапсовым маслом при pH=6,0 наблюдался преимущественный синтез ИЛК, в то время как при pH=4,5 накапливались примерно равные количества ЛК и ИЛК (Камзолова с соавт., 2007). Поддержание рН на необходимом уровне осуществляется внесением в среду различных титрантов: NaOH, NH4OH, KOH, а также CaCO3, карбоната бария, оксида кальция или оксида бария и других. Температура является важным параметром при биосинтезе ЛК, хотя это мало изученная тема. Известно, что культивирование микроорганизмов при низких температурах неблагоприятно влияет на рост и приводит к снижению метаболической активности клеток, в то время как культивирование при высоких температурах приводит к денатурации и ингибированию ферментов, избыточной потери влаги и угнетению роста (Chang, Chung, 1990; Anastassiadis, 1994). Дрожжи Y. lipolytica являются мезофильными микроорганизмами и активно развиваются в интервале 20-37°С. Камзоловой с соавторами (1996) в режиме pH-ауксостата изучено влияние температуры на максимальную удельную скорость роста дрожжей (μ max) Y. lipolytica, растущих на этаноле. Оптимальной для роста дрожжей является температура 2728°С. При понижении температуры происходило постепенное снижение скорости роста, а при повышении температуры биомасса продуцента характеризовалась повышенным содержанием цинка, железа и кальция, которые оказывали опосредованное влияние на синтез ЛК. Оптимальная концентрация азота и соотношение С:N являются важным критерием процесса биосинтеза ЛК. У дрожжей Y. lipolytica концентрация (NH4)2SO4 при росте на гексадекане составляла 0,3 г/л (N = 63%, C:N = 100:1) (Илларионова, 1977). Концентрация фосфора в среде оказывает существенное влияние на процессы размножения клеток и синтеза метаболитов. Фосфор играет также важную роль в 34 энергетическом обмене, являясь необходимым компонентом макроэргических связей в молекуле АТФ. Соли KH2PO4 и К2НРО4 для образования являются лучшими источниками фосфора для биосинтеза ЛК. Ионы Mg2+ играют важную роль в клетках микроорганизмов. Дефицит Mg2 в среде приводит к снижению удельной скорости роста, и даже полному прекращению роста (Fujitani, 1965; Anastassiadis et al., 1994; 2001). Количество магния в клетке находится в сложной взаимосвязи с внутриклеточным содержанием целого ряда элементов. У дрожжей C. gilliermondii при росте на парафине уменьшение исходного количества приводит к падению в клетке содержания магния в среде Mg, N, P, K, но при этом более активно поглощается Na (Вислоух c соавт., 1972). Кроме того, в условиях дефицита магния у той же культуры значительно возрастает скорость потребления микроэлементов – Mn2+, Fe2+,Zn2+ (Коротченко, Самохина, 1975). Источник серы требуется для биосинтеза аминокислот – L-цистеина и L-метионина, для образования сульфогрупп некоторых ферментов, таких как коэнзим А. Лимитирование роста клеток серой может вызвать уменьшение синтеза этих компонентов и повлиять на их функции в клетке (Мандева, 1981). Тиамин необходим для роста Y. lipolytica, так как эти дрожжи не способны синтезировать пиримидиновую часть молекулы тиамина. При ограничении роста дрожжей тиамином происходит преимущественное накопление кетокислот вследствие лимитирования этапов окислительного декарбоксилирования (Ермакова с соавт., 1986). Кислород является одним из важнейших факторов внешней среды, влияющих на физиологическое состояние культуры (Лозинов, Финогенова, 1972). Исследования, проводимые сотрудниками лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов ИБФМ РАН (Камзолова, 1995; Ильченко с соавт., 1998; Ильченко c соавт., 2001; Kamzolova et al., 2003) показали, что требования клеток к кислороду зависят от природы источника углерода. Так, при росте дрожжей Y. lipolytica на н-парафинах максимальный достигался при выход кислоты высокой концентрации кислорода в среде – 80-90% от насыщения (Финогенова, 1982), а оптимальный режим аэрации для биосинтеза ЛК на глюкозе составляет 50-60% (Матяшова, 1978; Sаto, 1990; Rymowicz, Sobieszczanski, 1990). Для дрожжей, растущих на этаноле, показано, что оптимальное рО2 среды в условиях сверхсинтеза ЛК лежит в пределах 20-60% от насыщения (Kamzolova et al., 2003). Для преимущественного синтеза ИЛК в среде с этанолом рО2 поддерживается на уровне 60-95% от насыщения (Фаусек, 1991; Finogenova et. al., 1991). Синтез кислоты прекращается при снижении рО2 ниже 30%. Авторы вышеприведенных работ отмечают, что одной из причин прекращения экскреции кислот в условиях низкой аэрации является резкое снижение активностей ряда 35 митохондриальных ферментов: цитратсинтазы, аконитат-гидратазы, малатдегидрогеназы и НАДФ-изоцитратдегидрогеназы. Кроме того, показано, что оптимальное значение pO2 для роста дрожжей и синтеза ЛК зависит и от обеспеченности клеток ионами железа (Камзолова, 1995; Kamzolova et al., 2003). Процесс биосинтеза ЛК в значительной степени зависит от использования того или иного вида источника углерода. Дрожжи Y. lipolytica хорошо растут на н-алканах, глюкозе, этаноле, растительные маслах, глицерине. На н-алканах природные штаммы Y. lipolytica образуют одновременно две кислоты: ЛК и ИЛК в соотношении 2:3 (Лозинов с соавт., 1974). Использование мутантных штаммов позволило добиться преимущественного синтеза ЛК (217 г/л), соотношение ЛК к ИЛК составляло 36,2:1. При росте на глюкозе природные штаммы Y. lipolytica синтезируют практически одну ЛК (Финогенова с соавт., 1969; Ермакова,1985). А.М. Зякун с соавторами (1992) провели анализ избыточного содержания изотопа 13 С с использованием радиоуглеродного метода. Было установлено, что в биосинтезе ЛК у дрожжей Y. lipolytica может участвовать экзогенная углекислота, доля которой существенно зависит от рН среды: при значении рН 4,5 относительное ее количество выше, чем при более высоком его значении. В литературе отмечается, что дрожжи вида Y. lipolytica не продуцируют этанол, но способны усваивать его в концентрациях до 3% (Barth, Gaillardin, 1997). Содержание этанола в среде выше 2,64 г/л вызывало снижение скорости роста в два раза, определенная графическим методом константа ингибирования для этанола составляет 11 г/л для мутанта Y. lipolytica N 1 (Камзолова, 1995). При росте дрожжей на растительных маслах образование ЛК к ИЛК зависят от штамма и от состава среды. Показано, что природный штамм Y. lipolytica ВКМ Y-2373 в среде с рапсовым маслом при рН=4,5 синтезировал примерно равные количества ЛК и ИЛК, тогда как при рН=6 накапливается преимущественно ИЛК (Камзолова с соавт., 2007), а мутант Y. lipolytica N 1 синтезировал практически одну ЛК. 1.7. Механизм биосинтеза лимонной кислоты у дрожжей Y. lipolytica Введение источника углерода в центральный метаболизм начинается с цитратсинтазной реакции. Многие авторы считают, что благодаря высокой активности цитратсинтазы и осносительно низким активностям последующих ферментов ЦТК, дрожжи Y. lipolytica могут продуцировать ЛК и ИЛК (Лозинов с соавт.,1974; Илларионова с соавт., 1975; Финогенова, 1982; Ermakova et al., 1986; Finogenova et al., 1986; Kamzolova et al., 2003). Высокая цитратсинтазная активность по сравнению с другими ферментами может объясняться тем, что 36 в условиях дефицита азота процессы биосинтеза снижены, тормозится расщепление цитрата и цитрат экскретируется из клетки. Это происходит из-за сравнительно низких активностей последующих ферментов цикла (аконитат-гидратазы НАД+ и (НАДФ+) - изоцитратдегидрогеназ) (Лозинов с соавт., 1976). Тогда как в нормальных условиях повышенная активность цитратсинтазы в экспоненциальной фазе роста компенсируется необходимостью использования клетками ацетила-КоА для биосинтетических реакций. При культивировании дрожжей на различных субстратах активность α-кетоглутаратдегидрогеназы снижена сильнее, чем у предшествующих ферментов цикла. Вероятно, это можно объяснить тем, что часть α-кетоглутаратдегидрогеназы расходуется на синтез глутамата, и поэтому меньшее количество фермента необходимо для дегидрирования той его части, которая подвергается дальнейшему метаболизму в ЦТК (Моргунов, 2009). В литературе имеются данные о регуляции ферментов ЦТК (Marchal et al., 1977). Предполагают, что в образовании блока при потреблении углеродного субстрата, а также, накоплении дрожжами ЛК в среде культивирования участвует НАД +-зависимая изоцитратдегидрогеназа. Сотрудниками лаборатории аэробного метаболизма микроорганизов ИБФМ РАН было показано, что активность НАД-изоцитратдегидрогеназы в клетках Y. lipolytica очень низкая, и также она влияет на протекание реакций в ЦТК (Ermakova et al., 1986; Солодовникова, 1998; Morgunov et al., 2004). Сверхсинтез ЛК на уровне фермента НАДизоцитратдегидрогеназы можно объяснить с точки зрения тонкой регуляции (Моргунов, 2009). Исследовано влияние адениловых нуклеотидов, играющих роль модуляторов активности большого числа ферментов. В литературе имеются данные, что АТФ, НАДН, глутамат, 2оксоглутарат, цитрат могут интибировать НАД-изоцитратдегидрогеназу. Показано, что к снижению активности фермента в дрожжах Y. lipolytica приводит снижение уровня аллостерического активатора АМФ. В период замедления роста НАД-изоцитратдегидрогеназа имеет к АМФ низкое сродство (Солодовникова, 1998). Также НАДН влияет на регуляцию активности НАД-изоцитратдегидрогеназы, уменьшая сродство фермента к НАД+, действует как конкурентный ингибитор (Соколов с соавт., 1995). Изменением соотношения НАДН/ НАД+ также регулируется НАД-изоцитратдегидрогеназа в клетках дрожжей, к полному ингибированию фермента приводило увеличение соотношения НАДН/ НАД+ in vitro. Также отмечено, что в условиях сверхсинтеза ЛК цитрат способен ингибировать НАДизоцитратдегидрогеназу на более поздних стадиях культивирования. 40 мМ цитрата подавляло активность фермента на 80% (Соколов и др., 1995), в то время как в работе Солодовниковой Н.В. отмечалось слабое влияние цитрата на НАД-изоцитратдегидрогеназную активность (Солодовникова, 1998). Участие цитрата в регуляции изоцитратдегидрогеназы дрожжей Y. lipolytica требует дальнейших исследований. НАД- 37 Ранее отмечалось, что при лимитирующей концентрации азота дрожжи Y. lipolytica синтезируют одновременно две кислоты – ЛК и ИЛК. На соотношение этих кислот влияет соотношение активностей аконитазы, изоцитрат-дегидрогеназы, а также активность изоцитрат-лиазы. К преимущественному накоплению ЛК приводит снижение активности аконитат-гидратазы и повышение активности изоцитрат-лиазы в дрожжевой клетке, а накопление ЛК и ИЛК происходит при одновременном снижении активностей изоцитратлиазы и изоцитрат-дегидрогеназы. (Финогенова с соавт., 1982). Таким образом, причиной сверхсинтеза ЛК и прекращение оттока метаболитов на клеточные синтезы является действие цитратного и глиоксилатного циклов в дрожжевых клетках (Глазунова с соавт., 1976). При сверхсинтезе ЛК должен активно функционировать анаплеротический путь для пополнения предшественника цитрата – оксалоацетата. Пируваткарбоксилазная реакция (превращение пирувата под действием фермента пируваткарбоксилазы) при росте Y. lipolytica на глюкозе и глицерине обеспечивает синтез оксалоацетата. А при использовании этанола и подсолнечного масла в качестве источника углерода и энергии благодаря функционированию анаплеротического пути глиоксилатного цикла осуществляется ресинтез оксалоацетата. Активность цитратсинтазы на масле также выше в сравнении с “глюкозными” и “глицериновыми” клетками, что, возможно, связано с дополнительным участием цитратсинтазной реакции в глиоксилатном цикле (Моргунов, 2009; Kamzolova et al., 2008). В регуляции синтеза ЛК при росте дрожжей на глюкозе важную роль играет 6фосфофруктокиназа, которая является ключевым регуляторным ферментом гликолиза практически у всех организмов (Катаева с соавт., 1986; Соколов с соавт., 1996). Фосфофруктокиназа дрожжей ингибируется цитратом и АТФ, поэтому необходимым условием для сверхсинтеза ЛК является активно функционирующий гликолиз. Устойчивая к цитрату фосфофруктокиназа дает возможность дрожжам Y. lipolytica активно переводить глюкозу в цитрат с последующим накоплением его в значительных количествах (Катаева с соавт., 1986; Соколов с соавт., 1996). Таким образом высокая активность цитратсинтазы, НАД- и НАДФ-изоцитрат-дегидрогеназ и относительно низкая активность аконитат-гидратазы характерны для клеток, синтезирующих цитрат. При биосинтезе ЛК дрожжами Y. lipolytica из этанола было показано, что, по-видимому, источник азота (ионы аммония) регулирует активность цитратсинтазы в клетке, поскольку его снижение повышает активность цитратсинтазы. При этом активность других ферментов ЦТК не увеличивается. Можно предположить, что здесь нерегулируемый синтез ЛК является защитной реакцией клетки на стрессовую ситуацию - избыток этанола, который таким 38 образом выводится из клетки. Снижение активности аконитат-гидратазы скорее всего объясняется общим снижением метаболической активности клетки вследствие исчерпания источника азота, а не действием непосредственно на сам фермент (Ильченко с соавт., 2002). Ранее говорилось, что с помощью глиоксилатного цикла дрожжи осуществляют непрерывный ресинтез оксалоацетата. В процесс ассимиляции жирных кислот дрожжами Y. lipolytica вовлечены ферменты глиоксилатного цикла (Holdsworth et al., 1988). При росте на маслах дрожжи гидролизуют их до жирных кислот, которые затем окисляются до ацетил-КоА, который является субстратом для ЦТК и глиоксилатного цикла. Активности других ферментов – глицерол-киназы, изоцитрат-лиазы и малат-синтазы не изменялись при культивировании Y. lipolytica на растительных маслах. Установлено, что переход клеток из фазы роста в фазу синтеза не влияет на активности ферментов при окислении глицерина и жирных кислот продуктов гидролиза масел (Моргунов, 2009). Кулаковской Т.В. с соавторами (1993) было показано, что в условиях сверхсинтеза ЛК вакуолярная цитрат-транспортирующая система не функционирует у Y. lipolytica. Концентрация цитрата в клетках в условиях сверхсинтеза может быть значительной, если он транспортируется из клетки путем простой и облегченной диффузии. И.Г. Моргуновым (2009) было показано, что ингибирующей концентрацией для очищенной цитратсинтазы является концентрация цитрата 10-15 мМ, которая ингибирует ее активность на 50 %, а концентрация 50 мМ – на 80 %. Если бы внутриклеточная концентрация цитрата была такая же как в среде культивирования, то активность цитратсинтазы проявлялась бы слабо в сравнении с ее максимальной активностью. В таком случае сверхсинтез цитрата не мог бы осуществляться. Также в этих экспериментах было изучено ингибирующее воздействие АТФ на очищенную цитратсинтазу из дрожжей Y. lipolytica, и выдвинуто предположение, что существуют внутриклеточные механизмы защиты ферментов от ингибирующих воздействий высоких концентраций продуктов метаболизма, а внутриклеточное микроокружение цитратсинтазы делает ее более устойчивой к ингибирующему влиянию интермедиатов ЦТК (Моргунов, 2009). 1.8. Глюкоза - субстрат для микробных трансформаций В таблице 9 представлен сравнительный анализ цен различных видов сырья на мировом рынке. Данные показывают, что получение ЛК из этих продуктов с помощью дрожжей Y. lipolytica из возобновляемых источников является экономически рентабельным. Это сырье также экологически безопасно. В качестве перспективных субстратов в настоящее время рассматривается глюкоза. Глюкоза как субстрат обладает рядом преимуществ перед другими субстратами: является 39 Таблица 9. Стоимость 1 т основного сырья для микробиологической промышленности в 2006 году Вид сырья Метанол Этанол Уксусная кислота Сахароза Сахар-сырец Меласса Глюкоза Соевая мука Парафины Цена на международном рынке, дол. 230-260 430-470 600-670 500 174 150 80-100 260-315 330 дешевой, экологически чистой и постоянно возобновляемым сырьевым источником. Цена 1 тонны глюкозы для микробиологической промышленности в 2006 году является одной из самых низких и составляет 80-100 долларов. Расщепление глюкозы дрожжами Y. lipolytica идет по двум путям: гликолитическому и пентозофосфатному. Наиболее важный путь – гликолитический, его вклад составляет 80 %. (Hirai et al., 1977). В гликолитическом пути после стадии фосфорилирования в процесс вовлекаются гексозы (Рисунок 2). У дрожжей Y. lipolytica присутствуют активности ферментов гексокиназы (КФ 2.7.1.1) и глюкокиназы (КФ 2.7.1.2) (Hirai et al., 1977; Petit and Gancedo, 1999). Проведенный нализ кинетических параметров этих ферментов показал, что гексокиназа играет основную роль в фосфорелировании глюкозы. Также на это указывает и тот факт, что делеция гена HXK1, кодирующего гексокиназу, влияла на рост дрожжей на глюкозе (Petit, Gаncedo, 1999). 6-фосфофруктокиназа (ФФК) катализирует одну из ключевых реакций гликолиза. Практически у всех организмов, включая и дрожжи, ключевым регуляторным ферментом гликолиза является ФФК (Sols and Salas, 1966). Этот фермент обеспечивает нормальное функционирование гликолиза, ЦТК и окислительного фосфорилирования. При увеличении концентрации цитрата активность ФФК ингибируется, что снижает скорость трансформации субстрата через гликолиз (Sols and Salas, 1966). Несмотря на это некоторые грибы и дрожжи при росте на глюкозе накапливают значительные количества ЛК в среде (Sols and Salas, 1966; Moresi, 1994; Anastassiadis, Aivasidis, Wandrey, 2002). Было показано, что активность ФФК у дрожжей C. lipolytica, продуцирующих ЛК значительно выше, чем у дрожжей, неспособных продуцировать ЛК. 40 Глюкоза Глюкозо-6-Ф Фруктозо-6-Ф ФФК Фруктозо-1,6-ди-Ф Глицеральдегид-3-Ф 1,3-ди-Ф-глицерат Ф-глицерат Ф-енолпируват Пируват СО2 Ацетил-СоА Цитрат Оксалоацетат Аконитат Фумарат Изоцитрат Малат α-Кетоглутарат Сукцинат 2Н Сукцинил-СоА ФАД Н2 НАДН КоQ Цит.b Цит.с Цит.а Рисунок 2. Схема окисления глюкозы у дрожжей Y. lipolytica Цит.а3 О2 41 На глюконеогенетических субстратах у дрожжей Y. lipolytica наблюдалась более высокая экспрессия гена PGK1, который кодирует фосфоглицерат-киназу, чем на гликолитических (LeDall et al., 1996). Растущий на глюкозе штамм, лишенный гена PGK1, становился ауксотрофным по пролину. Фосфоглицерат-фосфомутаза (КФ 5.4.2.1) и енолаза (4.2.1.11), катализируют образование Ф-енолпирувата из Ф-глицерата. У Y. lipolytica также изучалась регуляция гликолиза на уровне пируваткиназы (КФ 2.7.1.40). Пируваткиназа из Y. lipolytica не активируется фруктозо-1,6-ди-Ф и имеет гиперболическую кинетику (Strick et al., 1982). Был клонирован ген PYK, который кодирует пируваткиназу у Y. lipolytica. Он имеет сложную структурную организацию, содержащих два интрона, разделенных короткой вставкой из 45 нуклеотидов (Strick et al., 1982). В ЦТК вовлекается пируват, образующийся в результате пируваткиназной реакции. Ацетил-КоА и СО2 образуются при декарбоксилирования одной молекулы пирувата. Затем в реакции карбоксилирования второй молекулы пирувата ацетил-КоА расходуется и образуется оксалоацетат. В клетках дрожжей Y. lipolytica кроме фосфорилирующей дыхательной цепи была обнаружена альтернативная цианидрезистентная дыхательная цепь, по которой перенос электронов не сопровождается генерацией трансмембранного потенциала. Авторами было показано, что футильный сброс восстановительных эквивалентов, избыточных для основной фосфорилирующей дыхательной цепи, осуществляет цианидрезистентная оксидаза (Акименко, 1989; Акименко, Меденцев, 1989; Акименко, Головченко, 1989; Акименко с соавт., 1989). Функцию“предохранительного клапана” выполняют футильные пути, предотвращая протеолиз ферментов, и, тем самым, поддержания их в рабочем состоянии. Считалось, что механизм восполнения ЦТК С4-дикарбоновыми кислотами при ассимиляции глюкозы состоит в карбоксилировании пирувата пируваткарбоксилазой (КФ 6.4.1.1) (Глазунова, Финогенова, 1976; Финогенова, Шишканова, Катаева, 1989). Но в последнее время было показано, что в отличие от других эукариотических клеток рост Y. lipolytica на минеральной среде с глюкозой не тормозится делецией гена PYC1, кодирующего пируваткарбоксилазу. Это связано с тем, что глюкоза не полностью репрессирует ферменты ГЦ. Однако, лишенные пируваткарбоксилазы и изоцитрат-лиазы двойные мутанты PYC1 ICL1, на среде с глюкозой не росли, пока в среду не добавляли аспартат и глутамат (Flores et al., 2005). У дрожжей хорошо изучены метаболические пути ассимиляции глюкозы, однако до сих пор вопросы о том, как контролируется гликолиз и, где локализован ключевой фермент анаплеротичсеких путей – пируваткарбоксилазы, остаются открытыми. Также нет точных 42 данных о наличие ферментов (АТФ-цитратлиазы, малик-фермента) (Evans, Ratledge, 1985c; Финогенова с соавт., 1989). В этой главе были представлены сведения по микробиологическому получению ЛК с использованием дрожжей Y. lipolytica. Отмечается, что для создания эффективного процесса получения ЛК имеются широкие возможности c использованием доступных и дешевых субстратов, в качестве которых в настоящее время рассматриваются глюкоза, растительные масла и глюкозо-содержащие сиропы. Они обладают рядом преимуществ перед другими субстратами: являются дешевыми, экологически чистыми и постоянно возобновляемыми сырьевыми источниками. Таким образом, возможность получения ЛК с помощью дрожжей представляет большой как научный, так и практический интерес. 43 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Объекты исследования Работа проводилась с 34 природными штаммами дрожжей, относящихся к родам Debaryomyces, Candida, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis и Yarrowia, полученными из ВКМ ИБФМ РАН и коллекции культур лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов ИБФМ РАН. Культуры поддерживали на сусло-агаре при + 4оС, пересевали один раз в 3 месяца. 2.2. Культивирование дрожжей 2.2.1. Состав и подготовка основной среды Для культивирования дрожжей использовали среду Ридер следующего состава (г/л): минеральные соли - (NH4)2SO4 – 3,0; MgSO4·7Н2О – 0,7; Ca(NO3) 2 – 0,4; NaCl – 0,5; КН2РО4 – 0,1; К2НРО4 – 1,0; микроэлементы (мг/л): KJ – 0,1; B – 0,01; Mn2+ - 0,01; Zn2+ - 0,03; Cu2+ - 0,01; Mo2+ - 0,01; Fe2+ - 0,05 (Burkholder, 1944); агар-агар г/л – 20,0. Дрожжевой автолизат «Difco» в количестве 0,5 г/л использовали как источник витаминов, пуриновых и пиримидиновых оснований, а также аминокислот. В качестве источника углерода использовалась глюкоза (Украина; «Servа» Германия) растительные масла, ферментолизаты древесины. Исследовалась способность дрожжей синтезировать ЛК. Клетки культивировали в колбах объемом 750 мл с 50 мл минеральной среды Ридер на качалке (180-200 об/мин) в условиях лимитирования роста клеток азотом при температуре 28оС в течение шести суток. Субстрат вносили дробно, его конечная концентрация составляла 20 г/л. Аэрация в этих условиях составляла 1,95 г О2/л/час, концентрация азота в среде – 63 мг/л. Объем посевного материала – 5% от объема среды. Подтитровку вели 10%-ным раствором NaOH, значение pH поддерживали на уровне 5,0 6,0. Способность дрожжей синтезировать кислоты оценивалась на селективной среде с мелом в чашках Петри. Состав среды (г/л): глюкоза – 20,0; МgSO4·7H2O – 0,7; Ca(NO3)2 – 0,4; NaCl – 0,5; KH2PO4 - 1,0; K2HPO4 – 0,1; дрожжевой автолизат - 8,0 мл/л (содержание аминного азота не выше 60 мг/л); микроэлементы по Буркгольдеру (Burkholder, 1944); бакто-агар – 20,0. Стерильный мел (CaCO3 – 6,0 г/л) вносили непосредственно перед разливом в чашки в разогретую среду. На полностью остывшую среду репликатором наносили о клетки исследуемых культур. Клетки инкубировали в течение 6 суток при 28 C. По величине зоны растворения мела судили об активности кислотообразования. 44 2.2.2. Подготовка посевного материала Посевной материал готовили путем отсева рабочей культуры на косяки с суслоагаром, которые затем выращивали в термостате при температуре (28±0,5)ºC в течение 3-4 суток. Выросшую культуру использовали сразу или поддерживали в холодильнике при температуре +4оС в течение трех суток. Посевной материал для опытов, проводимых в колбах, выращивался следующим образом: ─ культура отсевалась на косяки с сусло-агаром, выдерживалась трое суток в термостате при температуре 28-29оС; ─ пересев дрожжей с косяка в колбу с 50 мл среды Ридер методом «смыва» – первичный инокулюм, источник азота: (NH4)2SO4 – 3,0 г/л. Продолжительность выращивания одни сутки; Посевной материал для ферментера выращивался следующим образом: ─ культура отсевалась на косяки с сусло-агаром, выдерживалась трое суток в термостате при температуре 28-29оС; ─ пересев дрожжей с косяка в колбу с 100 мл среды Ридер методом «смыва» – первичный инокулюм, источник азота: (NH4)2SO4 – 3,0 г/л. Продолжительность выращивания одни сутки; ─ посев по 5 мл первичного инокулюма в две колбы со 100 мл жидкой среды Ридер. источник азота: (NH4)2SO4 – 3,0 г/л. Продолжительность выращивания одни сутки. Посевной материал выращивали в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с минеральной средой Ридер на круговой качалке (180-200 об/мин) при температуре 28-29оС. 2.2.3. Методы культивирования дрожжей Для культивирования дрожжей в колбах: посев по 5 мл первичного инокулюма в две колбы с 50 мл жидкой среды Ридер, источник азота: (NH4)2SO4 – 3,0 г/л; продолжительность выращивания 6 суток. Культивирование природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 и его мутанта Y. lipolytica № 15 проводили в режиме периодического культивирования в ферментере АНКУМ2М (Россия) объемом 3 л (исходный объем среды 1,5 л) и объемом 10 л (исходный объем среды 5 л). Температуру поддерживали автоматически (28,0 0,5oC), концентрацию растворенного в среде кислорода (55–60% от насыщения), pH среды 5,0 (подтитровкой 20%ным раствором NaOH). Состав среды был следующий (г/л): глюкоза, глюкозосодержащее сырье, рапсовое масло (концентрация указана в тексте); (NH4)2SO4 – 3,0; МgSO4·7H2O – 0,7; Ca(NO3)2 – 0,4; NaCl – 0,5; KH2PO4 - 2,0; K2HPO4 – 0,2; дрожжевой экстракт «Difco» - 0,5; 45 раствор микроэлементов по Буркгольдеру; тиамин – 0,5 мг/л. Культивирование продолжалось 6 суток. Периодическое и отъемно-доливное культивирование Y. lipolytica № 15 проводилось в ферментерах Biostat B Plus («Sartorius», Germany) объемом 5 л (исходный объем среды 2 л). Температуру поддерживали автоматически (29,0 0,1oC), концентрацию растворенного в среде кислорода (25 5% от насыщения), pH среды 5,5 (подтитровкой 40%-ным раствором NaOH). При периодическом режиме питательная среда имела следующий состав (г/л): глюкоза – 50; NH4Cl – 3,0; MgSO4·7Н2О – 1,0; K2HPO4 – 0,2; дрожжевой экстракт «Difco» – 1,0. После 24 и 60 ч культивирования вносилось 30 г/л глюкозы. Общее содержание глюкозы составляло 110 г/л. При отъемно-доливном режиме питательная среда имела следующий состав (г/л): глюкоза – 50; NH4Cl - 3,0; MgSO4. 7Н2О – 1,0; K2HPO4 – 0,2; дрожжевой экстракт «Difco» – 1,0. Процесс шел в периодическом режиме первые 75 ч, затем часть культуральной жидкости 30% и 40% сливалась, и в ферментер добавлялась свежая питательная среда. Процесс проводили 4 раза для каждого варианта. Состав доливаемой среды был следующий (г/л): NH4Cl – 4,0; MgSO4·7Н2О – 1,0; K2HPO4 – 0,2; дрожжевой экстракт «Difco» – 1,0. Объем культуральной жидкости в начале каждого цикла отъемно-доливного режима составлял 2 л, а концентрация глюкозы – 50 г/л. Окончание каждого из циклов отъемно-доливного культивирования определяли измерением содержания глюкозы; долив необходимого объема питательной среды осуществлялся при содержании глюкозы меньше 0,5 г/л. Также проводили непрерывное культивирование мутантного штамма Y. lipolytica №15 в ферментере Biostat B Braun (Германия) («Sartorius», Germany) объемом 3 л (исходный объем среды 1,2 л), оснащенном выносным спиральным мембранным модулем (Bioengineering AG) и перистальтическим насосом (Ismatec). В модуль помещались мембраны из полиэфирсульфона («Sartorius»), диаметр которых составлял 47 мм, размер пор – 0,45 мкм. Температуру поддерживали автоматически (29,0 0,1oC), концентрацию растворенного в среде кислорода (25 5% от насыщения), pH среды 5,5 (подтитровкой 40%-ным раствором NaOH). Питательная среда при культивировании с использованием мембранного модуля имела следующий состав (г/л): глюкоза – 20; NH4Cl – 4,0; MgSO4·7Н2О– 1,0; K2HPO4 – 0,2; дрожжевой экстракт «Difco» – 1,0. Среда для непрерывного культивирования содержала (г/л): глюкоза 50 и бакто-пептон – 0,75. Посевная среда для этих режимов культивирования имела следующий состав (г/л): глюкоза – 20; дрожжевой экстракт «Difco» - 2,0; бакто-пептон – 3,0. 46 При периодическом, отъемно-доливном и непрерывном способах культивирования Y. lipolytica № 15 в качестве источника микроэлементов использовали водопроводную воду. 2.3. Метод получения мутантов – активных продуцентов ЛК 2.3.1. Получение мутантов при облучении ультрафиолетом (УФ) Штамм поддерживали на агаризованной среде Ридер. В качестве мутагенных агентов использовали УФ-лучи (длина волны 200-400 нм), источником которых служила бактерицидная лампа (ВИО-2, Россия, «Фимет») с расстояния 10 см. Природный штамм Y.lipolytica ВКМ Y-2373 выращивали на полноценной среде Ридер, состав которой приведен (глюкоза – 20,0 г/л, (NH4)2SO4 – 3,0 г/л), когда рост дрожжей не был лимитирован азотом и источником углерода. Клетки, находящиеся в фазе активного роста (биомасса 3 - 4 г/л) отделяли от культуральной жидкости центрифугированием, дважды промывали 0,1 М раствором MgSO4 (Дж. Миллер, 1976) и суспендировали в 0,1 М MgSO4. Суспензию клеток облучали УФ с расстояния 10 см, время облучения варьировали от 2 до 10 минут. Облученную и контрольную суспензии далее использовали для приготовления разведений и рассева клеток. Из обработанной и контрольной суспензий готовили ряд стандартных разведений и высевали на чашки Петри со средой Ридер, содержащей 20 г/л бакто-агара и 20 г/л глюкозы. Чашки инкубировали в термостате при температуре 28 оС в течение 48 ч. После этого подсчитывали количество выросших колоний, строили график выживаемости клеток в зависимости от времени облучения и рассчитывали процент выживших клеток (отношение количества колоний выросших после обработки клеток УФ к количеству выросших в контроле). Анализировали те чашки, где процент выживаемости облученных клеток составлял менее 1%. 2.3.2. Индукции мутаций нитрозогуанидином (НГ) N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидин (НГ) является мощным химическим мутагеном (Sigma, США). Широко используется в генетике бактерий, так как с высокой частотой индуцирует мутации при таких дозах, при которых жизнеспособность понижается незначительно. При выживаемости клеток 50% - 0,3% выживших клеток несут мутации. НГ вызывает замены оснований, хотя имеются данные, что он индуцирует небольшие делеции. Мутации, индуцированные НГ, происходят главным образом в точке репликации ДНК. Исходные растворы НГ готовятся непосредственно перед опытом, растворяя НГ в соответствующем буфере до концентрации 1 мкг/мл. 47 Кривые выживаемости: Для построения кривых выживаемости клетки обрабатывают либо разными дозами НГ в течение одного и того же времени, либо одной и той же дозой при разной длительности воздействия. Если обработка ведется в условиях, благоприятных для роста клеток, то выживаемость резко снижается. 2.3.3. Состав питательных сред для скрининга мутантов Состав питательных сред использованных при получении мутантов – продуцентов ЛК представлены в таблице 10. Таблица 10. Состав селективных сред для получения и отбора мутантов1 Полные среды Состав среды 1 Среда с лимитом по азоту, Г (г/л) Среда с ацетатом, Б (г/л) Среда с цитратом, В (г/л) 2 20,0 3 - 4 - 5 20,0 Ацетат натрия - 45,0 - - Цитрат натрия - - 37,2 - Дрожжевой автолизат - - - 7,0-8,0 (NH4)2SO4 3,0 3,0 3,0 - МgSO4·7H2O 1,0 1,0 1,0 0,7 NaCl 1,0 1,0 1,0 0,5 Ca(NO3)2 1,0 1,0 1,0 0,4 KH2PO4 0,1 0,1 0,1 0,1 K2HPO4 1,0 1,0 1,0 1,0 Глюкоза Среда с глюкозой, А (г/л) 1 Микроэлементы в среды добавлялись по Буркгольдеру (Burkholder, 1944) 2.4. Аналитические методы 2.4.1. Методы контроля роста дрожжей Биомассу определяли весовым методом. Для этого аликвоту культуральной жидкости (1мл) наносили на мембранные фильтры "Synpor" № 4 ("Хемапол", Чехословакия). Биомассу промывали водопроводной водой с последующим высушиванием о фильтров в вакуумном шкафу при температуре 80 С и давлении 0,8 атм до постоянного значения. Содержание биомассы рассчитывали по формуле: 48 W W1 - W2 , К где W - вес сухой биомассы, мг/мл; W1 – вес фильтра с биомассой, мг; W2 – вес фильтра, мг; К – количество отобранной культуральной жидкости, мл. Нарастание биомассы контролировали также по изменению оптической плотности клеточной суспензии, которую определяли колориметрически на приборе ФЭК-56 при длине волны 540 нм. 2.4.2. Определение концентрации глюкозы Содержание глюкозы определяли ферментативным фотометрическим тестом «Godpap» с использованием глюкозооксидазы, для чего использовали набор реактивов фирмы «Диакон» (Россия). Определение глюкозы основано на реакции ферментативного окисления, катализируемой глюкозооксидазой: Глюкоза + О2 глюконовая кислота + Н2О2 Образующаяся в ходе данной реакции перекись водорода вызывает окисление субстратов пероксидазы с образованием окрашенного продукта хинонимина. Увеличение оптической плотности раствора пропорционально концентрации глюкозы в реакционной смеси. Реакционная смесь содержала 250 мМ фосфатного буфера; субстраты пероксидазы, глюкозооксидазу 15Е/мл, пероксидазу более 1 Е/мл; образец или стандарт глюкозы (30 г/л). Реакционную смесь предварительно инкубировали в течение 30 минут при 37 о С. К 1 мл реакционной смеси добавляли 10 мкл образца культуральной жидкости (конечная концентрация образца меньше, чем 3 г/л), тщательно перемешивали. Измеряли первоначальную оптическую плотность реакционной смеси при 500 нм на спектрофотометре «Shimadzu» (Япония). По истечении 30 минут измерение оптической плотности повторяли. Расчет концентрации глюкозы проводили по формуле: С Ао 30, Аст 49 где С – концентрация глюкозы в исследуемом образце, г/л; ∆АО и ∆Аст – разности первоначальной и конечной оптической плотности образца и стандарта, соответственно, измеренные относительно реакционной смеси не содержащей глюкозу; 30– концентрация глюкозы в стандарте, г/л. 2.4.3. Определение концентрации органических кислот Для определения содержания лимонной и изолимонной кислот был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Элюцию вели при следующих условиях: скорость потока 1 мл/мин; температура 350С, в качестве буфера использовали 20мМ фосфорную кислоту. Для разделения лимонной и изолимонной кислот применяли колонку с обращенной фазой Inertsil ODS-3 (250·4мм) («Элсика», Россия). В работе использовали хроматограф фирмы LBK. Регистрацию экстинкции проводили при длине волны 210 нм. Органические кислоты идентифицировали в соответствии со стандартным раствором лимонной кислоты (Boehringer Manheim, Германия) и другими стандартами: янтарная кислота, цис- и транс-формы аконитовой кислоты, фумаровая кислота, яблочная кислота, пировиноградная кислота, a-кетоглутаровая кислота. Содержание кислоты (А, г/л) в пробе рассчитывали по формуле: A qст Sк N, Sст где qст – концентрация стандарта, мг/л; Sк, Sст – соответственно площади пиков кислоты и стандарта, ед. площади; N – разведение. 2.4.4. Определение концентрации ЛК химическим методом Количественное определение лимонной кислоты по методу Жаболовской (Жаболовская с соавт., 1968) основано на окислении лимонной кислоты перманганатом в ацетондикарбоновую кислоту, которая при бромировании превращается в пентабромацетон (реакция Штаре). Количество пентабромацетона оценивается спектрофотометрически. В процессе проведения определений использовались реактивы в следующих количествах: В мерную пробирку с притертой пробкой вносили 1,0 мл исследуемого раствора. Затем добавляли 0,5 мл 40 %-го раствора H2SO4 и 0,25 мл 30 %-го раствора КВr. После перемешивания смеси добавляли 1,0 мл 5 %-го раствора КМnO4 и оставляли на 10 мин, 50 периодически перемешивая. После окончания реакции вносили 5,0 мл насыщенного раствора соли Мора ([NH4]2[SO4]FeSO4 · 6 Н2О) для удаления избытка двуокиси марганца и брома, а затем 5,0 мл перегнанного хлороформа. Содержимое пробирки энергично встряхивали в течение одной минуты, при этом пентабромацетон экстрагировался хлороформом. Верхний водный слой после расслоения отбрасывали, нижний слой использовали для измерения экстинкции пентабромацетона при длине волны 300 нм на спектрофотометре «Shimadzu». Количество лимонной кислоты в анализируемой пробе определяли по соответствующей калибровочной кривой. 2.4.5. Определение трео-Ds-изолимонной кислоты энзиматическим методом В основу энзиматического метода определения изолимонной кислоты (Biochem. Catalog Boekringer, 1995) положена реакция, которую катализирует фермент изоцитратдегидрогеназа: Изолимонная кислота + НАДФ Мn2+ Кетоглутаровая + кислота НАДФН2 + СО2 Окисление изолимонной кислоты сопровождается образованием НАДФН2, экстинкция которого регистрировалась на спектрофотометре «Spekol» при длине волны 340 нм. При высоком содержании изоцитрата в пробе перед определением делали разведение образца дистиллированной водой. Метод позволяет определить 5-40 мкг кислоты в пробе, объем которой может колебаться от 0,1 мл до 2,2 мл. Реактивы: - 0,25 μ трис НСL – буфер рН 7,4; - 0,018 μ MnCL2· 4H2O; - 1,35 мM НАДФ; - НАДФ-изоцитратдегидрогеназа из сердца свиньи. В кювету (d =1,0 см) последовательно вносили реагенты: 0,3 мл трис-НСL, 0,1 мл MnCL2, Х мл пробы, (2,2-Х) мл Н2О, 0,1 мл НАДФ-изоцитратдегидрогеназа, 0,3 мл НАДФ. В контрольную кювету вносили все кроме пробы. Окончательный объем жидкости в кювете должен составлять 3 мл. Реакция начинается при добавлении НАДФ, протекает при комнатной температуре. Увеличение экстинкции регистрируется через каждые 0,5 – 1,0 минуту до окончания реакции. Ее увеличение на 0,01 ед. соответствует восстановлению 0,0048 мкмоль НАДФ или окислению 51 0,92 γ изоцитрата. Точность метода определения трео-Ds-изолимонной кислоты составляет 90-95 %. Концентрацию изолимонной кислоты (г/л) рассчитывали по формуле: Х (D Do) 92 V1 , V 2 1000 где D – экстинкция анализируемого раствора; Dо - экстинкция раствора сравнения; V1 – разведение пробы, мл, V2 – объем анализируемой пробы, мл; 92 – пересчетный коэффициент. 2.4.6. Анализ содержания азота Содержание ионов аммония определяли потенциометрическим методом с помощью ионоселективного электрода «Эком-NН4». Метод анализа заключается в измерении величины равновесного потенциала ионоселективного электрода, погруженного в анализируемую жидкость. Потенциал измеряют относительно электрода сравнения с помощью иономера (Экотест-120, ИЭЛРАН НПП ЭКОНИКС). Для анализа содержания азота была использована культуральная жидкость, отделенная от клеток, в которую погружали электрод «Эком-NН4» и электрод сравнения и измеряли значение равновесного потенциала. Скорость потребления азота дрожжами рассчитывали по формуле: qN N 2 N1 , m 2 m1 ( t 2 t1) 2 где N1 – концентрация азота на момент времени t1, г; N2 – концентрация азота на момент времени t2, г; m1 и m2 – вес сухой биомассы в момент времени t1 и t2 (в часах), г. 2.4.7. Определение содержания белка В гомогенатах дрожжей определяли белок методом Брэдфорда с кумасси синим (Bradford, 1976). К 0,1 мл образца, содержащего 10-100 мкг белка, добавляли 5 мл реактива, инкубировали не менее 5 мин при комнатной температуре. На спектрофотометре «Shimadzu» (Япония) измеряли поглощение при 595 нм. По калибровочной кривой, построенной для стандартных растворов бычьего сывороточного альбумина («BDH», Великобритания) определяли концентрацию белка. 52 2.5. Методы расчета технологических параметров ферментации Технологические параметры рассчитывали общепринятыми методами (Перт, 1978). Удельная скорость роста дрожжей ( ) за определенный промежуток времени рассчитывали по уравнению: м ln( x2 - x1) , t2 - t1 где х2 – концентрация биомассы в конечный момент времени, г/л; x1 - концентрация биомассы в начальный момент времени, г/л; (t2-t1) – промежуток времени, в течение которого возросла биомасса, ч. Экономический коэффициент (Yx) рассчитывали по уравнению: X , S Yx Выход продукта по субстрату (Y, %) был рассчитан по уравнению: Р 100 , S Yp/s Удельная скорость синтеза ЛК (qЛК, г/г биомассы в час) была рассчитана с использованием следующего уравнения: P , Х t qЛК Объемную продуктивность процесса биосинтеза ЛК (СЛК, г/л·ч) рассчитывали по уравнению: C ЛК P , V t где P - общее количество ЛК с учетом фактора разведения в конце культивирования, г; S – количество потребленного субстрата за время кислотообразования, г; Х – общее содержание биомассы в конце культивирования, г; V – начальный объем среды (л); t – продолжительность культивирования, ч. Для непрерывного культивирования применялись следующие уравнения. с использованием мембранного модуля 53 Удельная скорость синтеза ЛК (qЛК, г/г биомассы в час) была рассчитана с использованием следующего уравнения: qp P D, Х Объемную продуктивность процесса биосинтеза ЛК (СЛК, г/л·ч) рассчитывали по уравнению: C ЛК P D, где Р – средняя концентрация ЛК при непрерывном режиме, г/л; D – скорость разбавления, ч1. Х – общее количество биомассы с учетом фактора разведения в конце культивирования. 2.6. Определение активности ферментов 2.6.1. Получение бесклеточных экстрактов. Клетки от культуральной жидкости отделяли центрифугированием в течение 10 мин при 5 000 g и дважды промывали 0,9% раствором NaCl. Затем клетки ресуспендировали в 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН=7,5, содержащем 1 мМ ЭДТА, 5 мМ ДТТ и 0,3 мМ фенилметилсульфонилфторида, и разрушали на планетарной мельнице при 1000 об/мин в течение 3 минут с помощью стеклянных бус «баллотини» (100-150 мкм). В некоторых экспериментах дезинтеграцию дрожжей проводили на прессе Френча. После разрушения суспензию центрифугировали при 10 000 g в течение 30 мин для удаления неразрушенных клеток и клеточных фрагментов при температуре 4 оС. В супернатанте определяли активность ферментов. 2.6.2. Методы определения активности ферментов. Для опредения активности ферментов использовали двухлучевой спектрофотометр «Shimadzu» UV-160 (Япония), температура 25оС. Определяли активности следующих ферментов. Активность глицеролкиназы (КФ 2.7.1.30) определяли методом, описанным Wieland (Wieland et al., 1957). В реакционной смеси присутствовали 2,5 мМ глицерина, 2,0 мМ АТФ, 0,5 мМ НАД, 2,0 мМ MgCl2, 0,5 ед. глицерол-3-фосфатдегидрогеназы и 200 мМ глицина (pH=9,8). Активность цитратсинтазы (КФ 4.1.3.7) определяли методом, описанным Srere (Srere, 1969). В реакционной смеси содержалось 0,25 мМ оксалоацетата, 0,25 мМ ацетил-КоА, 0,10 мМ ДТНБ и 100 мМ трис-HCl буфера (pH=8,5). 54 Активность аконитат-гидратазы (КФ 4.2.1.3) определяли методом, описанным Anfinsen (Anfinsen, 1955). В реакционная смеси содержалось 5,0 мМ монокалиевой соли трео-DS-ИЛК и 100 мМ калий фосфатного буфера (pH=7,5). Активность НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.41) определяли методом, описанным Kornberg и Pricer (Kornberg, Pricer, 1951). В реакционной смеси содержалось 0,25 мМ мононатриевой соли трео-DS-ИЛК, 4,0 мМ НАД, 0,5 мМ АМФ, 15 мМ MgCl2 и 50 мМ трис-HCl буфера (pH=7,5). Активность НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.42) определяли методом, описанным Kornberg и Pricer (Kornberg, Pricer, 1951). В реакционной смеси присутствовали 1,0 мМ мононатриевой соли трео-DS-ИЛК, 0,75 мМ НАДФ, 15 мМ MgCl2 и 50 мМ трис-HCl буфера (pH=9,0). Активность изоцитрат-лиазы (КФ 4.1.3.1) определяли методом, описанным Dixon and Kornberg (Dixon, Kornberg, 1959). Реакционная смесь содержала 4 мМ калиевой соли треоDS-ИЛК, 8 мМ фенилгидразин-HCl, 4 мМ цистеин-HCl, 10 мМ MgCl2 и 75 мМ калий фосфатного буфера (pH=6,85). Активность малатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37) определяли методом, описанным Катаевой и Финогеновой (Катаева, Финогенова, 1987). Реакционная смесь содержала 1,0 мМ НАДН, 2,5 мМ оксалоацетата и 50 мМ трис-HCl буфер (рН=8,5). Активность ферментов выражали в микромолях продукта реакции, образующегося за 1 минуту в расчете на 1 мг белка (Е/мг белка). Представленые в диссертации результаты экспериментов проведены не менее трех раз, в каждой точке по два-три параллельных измерения. Стандартная ошибка в экспериментах не превышала 10 %. 55 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Отбор продуцента среди природных штаммов. Условия культивирования, оптимальные для биосинтеза ЛК из глюкозы Изучена способность 34 природных штаммов дрожжей, принадлежащих к родам Debaryomyces, Candida, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis и Yarrowia, синтезировать лимонные кислоты (ЛК и ИЛК) из глюкозы (Таблица 11). Природные штаммы были получены из коллекции лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов ИБФМ РАН. Дрожжи выделяли из образцов активного ила очистных сооружений нефтеперерабатывающих предприятий (Иерусалимский и др., 1965). Ранее, в работах А.Б. Лозинова с соавторами (1974) показано, что при культивировании дрожжей на полноценных питательных средах образования ЛК не происходит. Условием сверхсинтеза ЛК является лимитирование роста дрожжей минеральными компонентами среды – азотом, фосфором или серой при одновременном избыточном содержании в среде источника углерода. Поэтому исследуемые дрожжи культивировали в аэрируемых на качалке колбах в условиях лимитирования роста азотом. Концентрацию азота подбирали с таким расчетом, чтобы биомасса не превышала 3,5 г/л сухих клеток во избежании лимитирования роста кислородом; содержание глюкозы в среде – 20 г/л; в качестве источника витаминов использовали дрожжевой экстракт «Difco» или тиамин (100 мкг/л); объем питательной среды в колбах – 50 мл. Определение биомассы, содержания ЛК и ИЛК в культуральной жидкости проводили на 6 сутки культивирования. Как видно из таблицы 11, все исследуемые штаммы росли на среде с глюкозой, и лимитирование роста клеток азотом приводило к экскреции кислот у большинства исследуемых штаммов (29 из 34). Однако количество ЛК было различно: 19 штаммов экскретировали ЛК в количестве менее 1 г/л, 8 штаммов – от 1 до 7 г/л ЛК и один штамм – Y. lipolytica ВКМ Y-2373 накапливал наибольшее количество ЛК (17,6 г/л ЛК). Одновременно с ЛК большинство штаммов накапливали ИЛК, лучшее соотношение ЛК : ИЛК (6,82:1) отмечалось у Y. lipolytica ВКМ Y-2373. Штамм Y. lipolytica ВКМ Y-2373 был отобран для дальнейшей работы в качестве продуцента. Подбор условий, оптимальных для получения ЛК из глюкозы у Y. lipolytica ВКМ Y2373 проводили по следующей схеме: клетки, находящиеся в фазе активного кислотообразования (60 ч), отбирали из ферментера, отделяли от культуральной жидкости центрифугированием, дважды промывали 0,9% NaСl и суспензировали в 50 мМ фосфатным буфере (рН=7,0). Клеточную суспензию вносили в колбы объемом 50 мл среды Ридер 56 Таблица 11. Биосинтез ЛК дрожжами из глюкозы Организм Candida catеnulata ВКМ Y-5 C. zeylanoides ВКМ Y-6 C. zeylanoides ВКМ Y-2324 Debaryomyces sp. Pichia besseyi ВКМ Y-2084 P. media ВКМ Y-1381 P. inositofora ВКМ Y-2494 Saccharomyces cerevisiae ВКМ Y381 Torulopsis candida 127 Y. lipolytica 12a (ВКМ Y-2366) Y. lipolytica ВКМ Y-47 Y. lipolytica 68 Y. lipolytica 69 Y. lipolytica 76 Y. lipolytica 79 Y. lipolytica 86 Y. lipolytica 212 Y. lipolytica 374/4 Y. lipolytica 571 Y. lipolytica 582 Y. lipolytica 585 Y. lipolytica 607 Y. lipolytica 646 Y. lipolytica 655 Y. lipolytica 666 Y. lipolytica 668 Y. lipolytica 672 Y. lipolytica 683 Y. lipolytica 694 Y. lipolytica 704 (ВКМ Y-2373) Y. lipolytica 709 Y. lipolytica 710 Y. lipolytica 716 Биомасса (г/л) 2,5 2,0 1,9 1,9 1,65 1,35 1,25 1,45 ЛК (г/л) 0,2 0 0 0 0,4 0,4 0,5 0,3 ИЛК (г/л) ЛК:ИЛК 0,3 0,1 0,1 0 0,2 0,1 0,1 0,1 1:1,5 2:1 4:1 5:1 3:1 1,65 2,9 2,6 3,0 2,5 2,8 2,5 2,4 2,9 2,9 3,4 3,0 2,9 2,5 2,7 2,2 3,0 2,9 3,0 2,8 1,0 3,45 3,0 3,0 2,4 0,45 0,31 0 0 1,0 0,3 0,4 3,8 6,3 0,86 2,74 0,92 1,5 0,6 0,18 0,8 0,54 1,52 3,5 0,16 0,8 17,60 0,72 0,31 1,20 0,1 0 0 0 0,3 0 0 1,0 0,86 0 0,46 0,3 0,2 0,1 0 0 0,1 0 0,6 0 0 2,58 0 0 0,30 4,5:1 3,3:1 3,8:1 7,3:1 6,1:1 3:1 7,5:1 6:1 5,4:1 5,8:1 6,82:1 4:1 57 без витаминов и азота и инкубировали на качалке при 29 ºС в течении 24 ч при дробном внесении глюкозы. Концентрация клеток во всех вариантах опыта по кислотообразованию поддерживалась на уровне не выше 3,5 г/л. В ходе экспериментов оценивали жизнеспособность клеток. На рисунке 3 представлены данные о влиянии pH среды, концентрации глюкозы и интенсивности аэрации на биосинтез Y. lipolytica ВКМ Y-2373. При всех исследованных значениях рН среды (в диапазоне от 3,0 до 8,0) клетки синтезировали ЛК, интенсивное кислотообразование наблюдалось в интервале рН=4,0–6,0, при более низком значении рН (3,0) и более высоких значениях рН (7,0-8,0) накопление ЛК значительно снижалось (Рисунок 3а). На биосинтез ЛК также существенное влияние оказывала концентрация глюкозы в среде (Рисунок 3б). При всех исследованных концентрациях глюкозы происходило кислотообразование. Максимальное накопление ЛК наблюдалось при содержании глюкозы в среде до 40 г/л, повышение концентрации глюкозы свыше 50 г/л снижало биосинтез ЛК в 1,5 раза. Биосинтез ЛК в значительной степени зависит от уровня насыщения среды кислородом (Рисунок 3в). Различные уровни интенсивности аэрации создавали изменением объема среды в колбах - 50 мл (соответствует 0,56 ммоль О2/л·мин), 100 мл (0,3 ммоль О2/л·мин), 150 мл (0,26 ммоль О2/л·мин) и 200 мл (0,24 ммоль О2/л·мин) и 250 мл (0,2 ммоль О2/л·мин). Максимальный синтез ЛК дрожжами Y. lipolytica в среде с глюкозой происходил при аэрации 0,24-0,3 ммоль О2/л·мин. При содержании кислорода, равном 0,56 и 0,2 ммоль О2/л·мин, биосинтез ЛК снижался в 2 раза. В результате проведенных исследований подобраны условия, обеспечивающие наибольший синтез ЛК дрожжами у природного продуцента Y. lipolytica ВКМ Y-2373 в среде с глюкозой: pH=4,0-6,0, концентрация глюкозы в среде не выше 40 г/л. Оптимизация условий культивирования привела к увеличению биосинтеза ЛК в 2 раза у Y. lipolytica ВКМ Y-2373. Результаты оптимизации условий кислотообразования дрожжей Y. lipolytica ВКМ Y2373 легли в основу эксперимента в условиях глубинного периодического культивирования в 10-ти л ферментере АНКУМ-2М с контролируемыми значениями температуры, pH и pO2. Культивирование проводили при аэрации (pO2) 30-40% (от насыщения). Поддержание pH среды на уровне 4,5 осуществляли подтитровкой 20% NaOH. Глюкозу вносили дробно порциями по 20 г/л в тот момент, когда концентрация кислорода повышалась на 5-10%, что свидетельствовало о полном потреблении источника углерода. 58 (б) (a) 3 (в) 3 2 2 2 1 1 1 0 0 0 ЛК (г/л) 3 0 3 6 pH среды 9 0 25 50 75 глюкоза (г/л) 100 0 0,2 0,4 0,6 аэрация (ммоль О2/л мин) Рис. 3. Влияние pH среды (а), содержания глюкозы (б), аэрации (в) на синтез ЛК у Y. lipolytica ВКМ Y-2373 На рисунке 4 приведены кривые роста и накопления кислот у Y. lipolytica ВКМ Y-2373. В экспоненциальной фазе (до 12 ч) скорость роста Y. lipolytica ВКМ Y-2373 поддерживалась на максимальном уровне, питательные вещества имелись в избытке, а ингибиторы роста отсутствовали; значение максимальной удельной скорости роста (μmax) у Y. lipolytica ВКМ Y2373 составляло 0,145 ч 1, а выход клеток по массе (YX/S) - 52,1% от потребленной глюкозы. C 12 ч культивирования культура переходила в фазу замедления роста, вызванную исчерпанием азота из среды, и удельная скорость роста постепенно снижалась до 0,022 ч 1, к 60 ч рост культуры полностью прекращался. В экспоненциальной фазе выделения ЛК в среду не происходило; интенсивная экскреция ЛК отмечалась в фазе замедления роста и в стационарной фазе после прекращения роста культуры. Удельная скорость синтеза ЛК, высокая (0,04 – 0,06 г ЛК/г биомассы· ч) в начале процесса биосинтеза, снижалась до 0,0260,04 г ЛК/г биомассы· ч при накоплении свыше 70 г/л ЛК. В конце культивирования на 192 ч накопление ЛК составляло 80,0 г/л, и содержание ИЛК было 8,0 г/л (соотношениет ЛК : ИЛК = 10:1), выход ЛК по массе (YX/S) составил 46% от потребленной глюкозы. Для промышленной реализации любого биотехнологического процесса желательна концентрация продукта в 100 г/л. Рассмотренные выше данные позволяют сделать заключение, что при длительном культивировании (192 ч) природного штамма-продуцента Y. lipolytica ВКМ Y-2373 в среде с глюкозой не удалось достичь требуемой концентрации ЛК. В связи с этим задачей следующего этапа работы было получение мутантных штаммов Y.lipolytica, обладающих повышенной способностью к синтезу ЛК из глюкозы. 59 Биомасса ЛК ИЛК Азот 100 0,8 0,6 (NH4)+(г/л) Биомасса, ЛК, ИЛК (г/л) 80 60 0,4 40 0,2 20 0 0 0 24 48 72 96 120 144 168 Время (ч) log X удельная скорость роста qp Логарифм биомассы 1,4 0,1 0,9 Удельная скорость роста (ч-1), qp (г/г ч) 0,15 1,9 0,05 0,4 -0,1 0 24 48 72 96 120 144 168 0 Время (ч) Рисунок 4. Динамика роста и накопления ЛК у природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 в среде с глюкозой 60 3.2. Получение мутантных штаммов Y. lipolytica с применением УФ-облучения и Nметил-N’-нитро-N-нитрозогуанидина При получения мутантов в качестве исходного штамма использовали природный штамм Y. lipolytica ВКМ Y-2373, отобранный как наиболее активный продуцент ЛК из глюкозы среди природных штаммов. Известно, что возможность получения устойчивых мутантов дрожжей определяется плоидностью клеток (Соом с соавт., 1971). Устойчивые мутанты можно получить при работе с гаплоидными клетками и практически невозможно получить у диплоидных и полиплоидных форм. Мутанты получали при обработке облучением (УФ) и Y. lipolytica ВКМ Y-2373 N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидином ультрафиолетовым (НГ), а также их комбинированным воздействием. 3.2.1. Обработка Y. lipolytica ВКМ Y-2373 ультрафиолетовым облучением (УФ) Облучение УФ индуцирует у бактерий широкий спектр мутаций, так как вызывает не только замены оснований, но и с высокой эффективностью вызывает образование делеций. Обычно для индукции мутаций используют такую дозу УФ-облучения, при которой выживаемость клеток составляет 0,1 – 1 % (Миллер, 1976). Из обработанной и контрольной суспензий готовили ряд стандартных разведений и высевали на чашки Петри с агаризованной средой Ридер, содержащей 20 г/л глюкозы в качестве источника углерода и энергии. Разведения подбирали с расчётом, чтобы на каждой чашке вырастало примерно до 100 колоний. Чашки инкубировали в термостате при температуре 28 оС в течение 48 ч. После этого подсчитывали количество выросших колоний, строили график выживаемости клеток в зависимости от времени облучения (Рисунок 5) и рассчитывали процент выживших клеток (отношение количества колоний выросших после обработки клеток УФ к количеству выросших в контроле). Анализировали те чашки, где процент выживаемости облучённых клеток составлял менее 1%, т.е. в диапазоне облучения от 3 до 7 мин. и отбирали колонии, отличающиеся более мелким размером, изменённой морфологией в отличие от исходных (Авчиева, Винаров, 1993). Всего после обработки УФ было отобрано 500 колоний для дальнейшей работы. Следует отметить, что кривая выживаемости клеток дрожжей Y.lipolytica ВКМ Y-2373 имела сложный характер: начальный участок ее имел прямолинейную зависимость, затем следовало плато, указывающее на то, что облучаемая суспензия содержала клетки, устойчивые к УФоблучению. Подобные кривые были получены ранее для этого штамма Н.В. Шишкановой (1979) и указывают на гаплоидность клеток Y.lipolytica ВКМ Y-2373. 61 Концентрация клеток 1,00E+08 1,00E+06 1,00E+04 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Время (мин) Рисунок 5. Кривая выживаемости после облучения дрожжей УФ. 3.2.2. Обработка Y. lipolytica ВКМ Y-2373 N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидином В литературе имеются данные, что при обработке дрожжевых клеток C. lipolytica химическими мутагенами, такими как нитрозоэтилмочевина (НЭМ) и нитрозодиэтилмочевина (НДЭМ), были получены мутантные штаммы, у которых синтез ЛК из парафина значительно превышал кислотообразующую активность природного штамма. Было показано, что суперпродуцентами ЛК были варианты, меньшие по размерам, чем исходный штамм. Наибольшее накопление ЛК (15 г/л) наблюдалось у мутантного штамма, полученного обработкой НЭМ. Вторую серию опытов по получению мутантов мы проводили с использованием Nметил-N’-нитро-N-нитрозогуанидина (НГ). НГ является мощным химическим мутагеном (супермутагеном), широко применяющийся в генетике бактерий, так как с высокой частотой индуцирует мутации при таких дозах, при которых жизнеспособность понижается незначительно. При выживаемости 50% - 0,3% клетки несут мутации. НГ вызывает замены оснований, также имеются данные, что он индуцирует небольшие делеции. Мутации, индуцируемые НГ, происходят, главным образом, в точке репликации ДНК. 62 Природный штамм Y.lipolytica ВКМ Y-2373 также выращивали на полноценной среде Ридер (глюкоза – 20,0 г/л, (NH4)2SO4 – 3,0 г/л). Клетки, находящиеся в фазе активного роста (биомасса 3 - 4 г/л) отделяли от культуральной жидкости центрифугированием при 3000 g в течение 15 минут, дважды промывали 0,1 М цитратным буфером (pH 5,5) (Миллер, 1976). По 0,1 мл клеточной суспензии вносили в пробирки с цитратным буфером объемом 1 мл и содержащем НГ в количестве от 0 до 100 мкг/мл и инкубировали при 280С в течение 30 мин. Затем клетки отделяли от буфера центрифугированием и промывали от НГ 0,1 М цитратным буфером (рН 7,0). Суспензии клеток далее использовали для приготовления разведений и рассева на твёрдую среду. После соответствующих разведений делали высевы на агаризованную среду с глюкозой (среда А) и инкубировали 48 ч при 28о С. Разведения были подобраны так, чтобы число выживших колоний на чашках Петри не превышало 100. Подсчет колоний осуществляли на третьи сутки, строили график выживаемости клеток (Рисунок 6) в зависимости от концентрации НГ. Начальный участок кривой выживаемости клеток под воздействием НГ имеет прямолинейный характер, за которым следовало плато, указывающее на то, что суспензия клеток Y.lipolytica ВКМ Y-2373, подвергнутая обработке НГ, содержала колонии, устойчивые к обработке химическим мутагеном. Анализировали те чашки, на которых процент выживших клеток был не более 25 %. Отбирали меньшие по величине колонии (Рисунок 7), предполагая, что колонии, с измененными морфологическими признаками, обладают положительными свойствами. Всего после обработки НГ было отобрано 1000 колоний для дальнейшей работы. Под влиянием УФ-лучей и НГ-обработки из исходного штамма дрожжей Y. lipolytica ВКМ Y-2373 были получены самые различные варианты, со слабым ростом на глюкозе, ауксотрофные,“petit”, разнообразной окраски и другие. 63 Kонцентрация клетокк 1,00E+08 1,00E+06 1,00E+04 0 10 20 30 40 50 60 70 80 НГ, мкг/мл Рис. 6. Кривая выживаемости после обработки дрожжей НГ. Рисунок 7. Разнообразие колоний после обработки НГ на глюкозе. 90 100 64 3.2.3. Отбор продуцентов Наиболее сложным и ответственным этапом получения мутантов-продуцентов ЛК было создание рациональной схемы тестирования клеток, полученных в результате обработки мутагенами, и быстрый отбор форм, обладающих необходимыми свойствами. После проведения мутагенеза проводилась селекция по отбору ацетат и цитрат негативных мутантных штаммов. Схема отбора продуцентов с использованием ацетата была ранее разработана в лаборатории P. Srere (США). Предполагалось, что клетки дрожжей, утратившие способность к росту на ацетате, характеризуются различными нарушениями в ЦТК. Блокировка ЦТК на уровне одного или нескольких ферментов может приводить к повышенному синтезу цитрата клетками. Этот принцип селекции был успешно использован в работах польских ученых, В. Римовича с соавторами. Полученный ацетат-негативный мутант Y.lipolytica AWG-7 продуцировал до 120 г/л ЛК на глюкозо-содержащей среде (Rymowicz, Rywińska, 2003). Принцип отбора нужных продуцентов с использованием цитрата был предложен в нашей лаборатории в 1978 г. Отмечалось, что мутанты – продуценты ЛК характеризовались низкой активностью аконитат-гидратазы, фермента, ответственного за превращение ЛК в ИЛК, и при использовании среды с цитратом, удалось селекционировать мутант Y. lipolytica 187/1 – продуцент ЛК на н-парафинах (Шишканова, 1979). В связи с этим, селекция нужных продуцентов проводилась на среде с ацетатом и цитратом. Отбирались штаммы, которые характеризовались сниженной скоростью роста на средах с ацетатом или цитратом. Далее отобранные варианты оценивали на активность кислотообразования на твердых средах по зонам растворения мела или с помощью индикатора бромкрезолового зеленого. В основу подготовки среды для экспресс-методов положены три основных принципа: избыток глюкозы, лимитирующая концентрация азота (60 мг/л) и использование только органического источника азота (дрожжевого автолизата) вместо сульфата аммония во избежание влияния физиологической кислотности. 3.2.3.1. Селективная работа на средах с ацетатом и цитратом За основу отбора мутантов взят метод реплик или отпечатков (Lederberg J, Lederberg E, 1952). 500 колоний, полученные при обработке УФ, и 1000 колоний - при обработке НГ, переносили с помощью репликатора на чашки Петри с селективными агаризованными средами Ридер, содержащими глюкозу в качестве контроля - 20 г/л (среда А), ацетат - 45,0 г/л (среда Б) или цитрат – 37,2 г/л (среда В) и инкубировали в течение 3 - 4 суток при 28 оС. Отбирали колонии, характеризующиеся замедленным ростом на средах с ацетатом и цитратом (Рисунок 8). 65 Рисунок 8. Рост колоний на среде с ацетатом. У отобранных вариантов рост на ацетате был замедлен В результате скрининга из 1500 колоний на среде с ацетатом было отобрано 10 вариантов, а на среде с цитратом – 6 вариантов; 4-6 минутное УФ воздействие и обработка НГ при концентрации 40–80 мкг/мл дали наибольшее количество измененных форм с положительными свойствами (отсутствие или замедленный рост на среде с цитратом/ацетатом). 3.2.3.2. Отбор продуцентов на твердой среде с мелом или индикатором бромкрезоловым зеленым 16 вариантов далее подвергались отбору на селективных средах с мелом и индикатором бромкрезоловым зеленым. На среде с мелом в процессе выделения кислот вокруг колоний появлялись различные по величине зоны растворения мела, соответствующие количеству образующихся кислот. Этот метод был предложен Lodder (1970) для определения таксономического положения дрожжей семейства Brettanomyces. Впоследствии многие исследователи использовали этот метод для оценки кислотообразующей способности микроорганизмов, растущих на н-алканах и других источниках углерода. В Отделе биоэнергетики ИБФМ АН СССР метод был модифицирован Н.В. Шишкановой для первичного отбора и последующей селекции мутантов – продуцентов ЛК из н-алканов. 66 Для предварительного отбора использовали агаризованную среду с лимитом по азоту (среда Г). Мел (6 г/л) добавляли в разогретую среду непосредственно перед разливом в чашки Петри. После полного остывания среды уколом наносили клетки исследуемых культур. Инкубацию проводили в течение 7 суток в термостате при 280С. На рисунке 9 показаны зоны растворения мела на чашках Петри у полученных мутантов в сравнении с исходным штаммом Y. lipolytica ВКМ Y-2373. Зоны чётко различимы визуально, и зоны растворения мела у отобранных вариантов такие же или больше, чем у исходного штамма Y.lipolytica ВКМ Y2373. Для количественной оценки эффективности кислотообразования после 7 суток инкубации при температуре 280С измеряли ширину зоны растворения мела. Способностью образовывать зоны растворения мела при росте на глюкозе в условиях дефицита азота обладают 12 из 16 отобранных вариантов. Следует отметить, что размеры зоны растворения мела варьируют от 0,1 до 0,8 см. Исходный штамм Y. lipolytica ВКМ Y-2373 образует зону растворения мела, равную 0,35 см. Варианты, образующие небольшие зоны растворения мела (менее 0,35 см), исключили из дальнейшего обследования как очень слабые кислотообразователи. 4 мутантных штамма, облученные УФ (УФ4-1; УФ5; УФ5-1; УФ5-6) и 4 мутанта, обработанные НГ (НГ40-5; НГ40-6; НГ60-2; НГ80-4), у которых диаметр зоны был больше, чем у исходного штамма (Таблица 12) были отобраны для дальнейшей работы. Также 16 отобранных вариантов оценивали на активность кислотообразования на индикаторных чашках с бромкрезоловым зеленым. Еще в 1950 г. разработан метод отбора почвенных кислотообразующих грибов с использованием индикатора бромкрезолового зеленого. Также известно использование бромкрезола синего при дифференцировке мутантов Aspergillius niger, образующих органические кислоты. При исследовании микробиологической деградации галогенсодержащих пестицидов до кислоты используются индикаторы бромкрезол багряный и эонзинметиленовый синий. Позднее был описан метод отбора продуцентов органических кислот, основанный на применении жидких индикаторных сред (Авчиева, Винаров, 1993). Активность кислотообразования у отобранных вариантов оценивали на агаризованной среде (Г) в условиях лимитирования роста клеток азотом. Для этого к агаризованной среде (среда Г), добавляли 8 мл 0,4 % раствора индикатора на 100 мл среды перед тем как разлить по чашкам Петри. Культуру выращивали троё суток при 28 о С. Оценку кислотообразования проводили по зонам, изменяющим свой цвет с синего на светло-желтый. По мере роста культуры и накопления кислот вокруг колоний, синяя окраска среды 67 Рисунок 9. Кислотообразующая активность мутантов на агаризованной среде с мелом (№1 – НГ 60-2; №2 – НГ 40-6; №3 – УФ 5-2; №4 УФ 4-1; К - Y.lipolytica ВКМ Y-2373) Таблица 12. Кислотообразующей активность природного штамма Y.lipolytica ВКМ Y-2373 и мутантных штаммов на твердой среде, содержащей мел Штамм Y.lipolytica ВКМ Y-2373 УФ 4-1 УФ 5-1 УФ 5-2 УФ 5-6 НГ 40-5 НГ 40-6 НГ 60-2 НГ 80-4 Диаметр зоны растворения мела (cм) 0,3 – 0,4 0,5 – 0,8 0,4 0,3 – 0,6 0,5 – 0,6 0,5 – 0,7 0,3 – 0,5 0,7 0,3 – 0,4 68 изменялась на желтую (Рисунок 10). Все исследуемые мутанты образуют характерные жёлтые ореолы вокруг колоний. Зоны жёлтой окраски сопоставимы с зонами растворения мела вокруг колоний на агаризованной среде Ридер. Следует отметить, что селекция на средах с мелом по сравнению с бромкрезолом позволяет более четко визуально оценивать диаметр зоны вокруг колонии на 7 сутки выращивания, а на среде с бромкрезолом зоны были четко различимы только в первые 3 суток выращивания. Таким образом, в результате скрининга на селективных средах с мелом и бромкрезоловым зелёным были отобраны 8 мутантных штаммов, из которых 4 мутанта, получены УФ-облучением и 4 мутанта – обработкой НГ. Следует отметить, что тесты на кислотообразование не дают возможности однозначно сказать, какая кислота накапливается в среде. С целью идентификации кислот, а также для проверки результатов, полученных экспресс-методами, проводили культивирование отобранных штаммов в жидкой среде с глюкозой в условиях дефицита азота. Рисунок 10. Кислотообразование на агаризованной среде с бромкрезолом (№1 – НГ60-2; №2 – НГ40-6; №3 – УФ5-2; №4 -УФ4-1; № 5 -УФ5-1; К - Y.lipolytica ВКМ Y-2373) 69 3.2.4. Отбор продуцентов в жидкой среде Следующим этапом работы было выявление способности мутантов синтезировать ЛК и ИЛК на среде, содержащей глюкозу в качестве источника углерода и энергии. В качестве контроля использовали исходный штамм Y. lipolytica ВКМ Y-2373. Основным условием синтеза лимонных кислот является лимитирование роста клеток источником азота (Лозинов с соавт., 1974; Финогенова, 1982). В этой связи рост дрожжей был лимитирован азотом. Дрожжи культивировали в колбах объемом 750 мл со 100 мл среды Ридер, содержащей 0,3 г/л (NH4)2SO4. Обязательным условием эксперимента было постоянное присутствие источника углерода (глюкозы) в достаточном количестве (20 г/л в начале культивирования и далее по мере потребления субстрата 40 г/л были внесены в среду культивирования). pH среды поддерживали на уровне 5,5-6,0 добавлением 10 % раствора NaOH, количество которой учитывали. Посевной материал выращивали в среде с пониженным содержанием азота в среде, и клетки брали для засева в опытные колбы в начале фазы замедления роста, то есть в условиях, когда рост культуры был замедленным по сравнению с его ростом в полноценной контрольной среде (не обедненной каким-либо компонентом). Указанные условия эксперимента обеспечивали накопление в среде достаточных для точных определений количеств экскретируемых метаболитов, и вместе с тем, позволяли избежать нарастания большой биомассы (выше 3,5 г/л сухих клеток) и лимитирования роста культуры кислородом. В ходе эксперимента была изучена динамика титруемой кислотности среды у отобранных вариантов в сравнении с исходным штаммом Y.lipolytica ВКМ Y-2373. Кривые титрования представлены на рисунке 11 (а,б). Анализ кривых титруемой кислотности среды у природного штамма и его мутантов показал, что объем израсходованной за время культивирования щелочи у некоторых мутантных штаммов (УФ5-1, НГ40-6 и НГ80-4) превышал природный Y.lipolytica ВКМ Y-2373. Следует отметить, что титруемая кислотность культуральной среды в опытах с большим накоплением ЛК была выше, чем в опытах с меньшим накоплением ЛК. Это связано с тем, что при физиологическом подкислении среды должно иметь место прямопропорциональное соотношение, то есть при большем накоплении кислот подкисление среды соответственно возрастает. На 144 ч культивирования проводили определение биомассы, содержание ЛК и ИЛК. Все исследуемые мутанты способны синтезировать преимущественно ЛК (Таблица 13). Однако накопление биомассы, абсолютное количество ЛК и ИЛК, их соотношение были различными в зависимости от штамма. Наименьшее накопление ЛК отмечено для мутанта УФ5-1, а наибольшее накопление ЛК по сравнению с исходным штаммом было отмечено у мутантов УФ5, НГ40-6 и НГ80-4. 70 Кроме того, эти мутанты характеризовались низким содержанием ИЛК (соотношение ЛК:ИЛК составляло 14,8:1, 7,58:1 и 8,17:1, соответственно). Максимальное значение выхода ЛК от потребленной глюкозы YЛК (более 40 %) отмечено у мутантов УФ4-1, УФ5, УФ5-6, НГ60-2, что значительно выше величины, представленной другими авторами для дрожжей Y.lipolytica LGAM S(7) (19,0 %) (Papanikolaou et al. 2002). Нужно отметить, что данные, представленные для дрожжей Y.lipolytica LGAM S(7)1 получены при культивировании в колбах при большом накоплении биомассы (10 г/л), когда на метаболизм клеток могут оказывать существенное влияние недостаток кислорода и другие возможные лимитации. Следует отметить, что накопление биомассы у мутантов было в среднем на 10,8% ниже, чем у исходного штамма (Таблица 13). В связи с этим была рассчитана продуктивность биосинтеза ЛК (Р) для каждого варианта, выраженная как количество кислоты в граммах, продуцируемое 1 граммом клеток. У мутантов УФ5, НГ40-6 и НГ80-4 величина Р была в среднем на 23,0 % выше, чем у исходного штамма. Следует отметить, что мутанты УФ5, НГ40-6, НГ80-4, характеризующиеся максимальной продуктивностью, образовывали большие по диаметру зоны растворения мела вокруг колоний (Таблица 12). 3.3. Получение мутантов с применением комбинированного мутагенеза и оценка их кислотообразующей активности В работах по селекции гриба Aspergillius niger было показано, что комбинированное воздействие химических супермутагенов (НГ, НММ) с УФ приводит к повышению активности мутантов на 50 - 70 % (Карклиньш, Лиепиньш, 1993). В связи с этим отобранные в результате проведенной селекции 4 НГ и 4 УФ мутантных штамма были подвергнуты перекрестной обработке мутагенами. Штаммы, облученные УФ, обрабатывали НГ, а штаммы после НГ облучали УФ. Для повторной обработки НГ штаммов, полученных воздействием УФ, использовали дозу индукции мутаций – 50 мкг/мл. Обработка НГ мутантов с помощью УФ проводилась со временем экспозиции от 3-х до 6 мин. После обработки комбинированным мутагенезом было отобрано 1000 колоний для дальнейшей работы. Отмечено, что если обработка природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 УФ не приводила к изменению морфологии полученных мутантов, то после обработки УФ-мутантов НГ появлялось большое количество морфотипов. В популяции просмотренных и отобранных клеток обнаруживались мелкие, точечные, гладкие и шероховатые колонии с измененной пигментацией, некоторые из которых характеризовались наличием коричневого пигмента, имели мягкую маслянистую текстуру. Среди отмеченных морфологических изменений преобладали мелкие и точечные колонии. 71 а Расход титранта (мл) 6 5 4 3 2 Y.lipolytica ВКМ Y-2373 УФ 4-1 УФ 5-1 УФ 5-2 УФ 5-6 1 0 24 48 72 96 120 144 96 120 144 Время (час) Расход титранта (мл) 6 5 б Y.lipolytica ВКМ Y-2373 НГ 40-5 4 НГ 40-6 3 НГ 60-2 2 НГ 80-4 1 0 24 48 72 Время (час) Рисунок 11. Кривые титрования природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 и мутантных штаммов полученных в результате облучения УФ (а) и обработки НГ (б), в среде с глюкозой 72 Таблица 13. Рост и кислотообразование у исходного штамма Y.lipolytica ВКМ Y-2373 и мутантных штаммов, полученных в результате обработки УФ и НГ, в среде с глюкозой Штамм Y. lipolytica ВКМ Y-2373 УФ4-1 УФ 5 УФ 5-1 УФ 5-6 НГ 40-5 НГ 40-6 HТГ60-2 НГ 80-4 Биомасса (г/л) ЛК, г/л P, г ЛК/г ЛК:ИЛК YЛК, % 3,45± 0,22 17,60±0,66 2,58±0,20 6,82:1 40,83 5,29 0,35 3,25± 0,05 2,95± 0,05 2,31± 0,11 3,40± 0,2 3,60± 0,08 2,76± 0,25 3,30± 0,32 3,05± 0,15 8,70:1 14,8:1 2,6:1 7,0:1 6,04:1 7,58:1 8,16:1 8,17:1 42,80 48,66 9,74 41,66 31,20 39,65 49,65 39,50 5,18 6,51 1,86 4,78 4,26 6,57 5,27 6,48 0,45 0,65 0,25 0,55 0,60 0,50 0,50 0,60 16,83±0,72 19,20±0,37 4,29± 0,19 16,24±0,16 15,34±1,30 18,12±0,27 17,38±0,57 19,76±0,69 ИЛК, г/л 1,92±0,55 1,29±0,29 1,64±0,13 2,31±0,14 2,54±0,28 2,39±0,16 2,0± 0,13 2,42±0,04 Д, см Представлены средние значения из 4 экспериментов. Каждый эксперимент – средний результат двух повторностей. Р – продуктивность биосинтеза ЛК, Д – диаметр зоны растворения мела (см) на агаризованной среде с мелом. Отбор мутантных штаммов проводили путем высева обработанных проб сразу на селективные чашки, содержащие среду с ацетатом (Б). На данной среде лучше заметно отставание в росте мутантных штаммов. Это позволило сразу отобрать большое количество колоний, отличающихся от исходного штамма по размеру колоний и морфологии. После скрининга на агаризованной среде Ридер с ацетатом было отобрано 14 мутантных штаммов – НГ-мутанты, обработанные вторично УФ (НГ/УФ = №1-№14), и 13 УФ-мутантов, обработанные вторично НГ (УФ/ НГ = №15-№27). Отобранные 27 мутантов далее анализировались на активность кислотообразования на селективных средах по зонам растворения мела и с помощью индикатора бромкрезолового зеленого. Зоны растворения мела на чашках Петри у природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y2373 и полученных мутантов четко различимы визуально, а вокруг некоторых колоний образовывались кристаллы цитрата. В таблице 14 представлены данные по величине зон растворения мела вокруг колоний, полученных комбинированным воздействием мутагенов. Все варианты образовывали зоны растворения мела большего или одинакового размера по сравнению с исходным штаммом. 73 Таблица 14. Сравнительный анализ кислотообразующей активности на селективной среде с мелом мутантов (1-27), полученных комбинированным воздействием мутагенов НГ/УФ Штаммы (НГ/УФ) №1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 №8 №9 №10 №11 №12 №13 №14 Диаметр зоны растворения мела (cм) 0,60 – 0,65 0,45 - 0,55 0,35 0,50 - 0,55 0,50 – 0,60 0,35 – 0,40 0,70 0,35 – 0,40 0,40 – 0,50 0,60 - 0,65 0,70 – 0,75 0,35 – 0,45 0,70 -0,80 0,55-0,60 Штаммы (УФ/НГ) №15 №16 №17 №18 №19 №20 №21 №22 №23 №24 №25 №26 №27 Y.lipolytica ВКМ Диаметр зоны растворения мела (cм) 0,75 – 0,80 0,40 0,40 – 0,50 0,55 – 0,65 0,60 – 0,70 0,35 – 0,40 0,50 0,55 0,40 – 0,50 0,40 – 0,50 0,65 0,50– 0,60 0,60 0,40 Y-2373 При проверке экскреции кислот у мутантных штаммов на среде с бромкрезоловым зеленым (Г), было показано, что синяя окраска среды в зонах вокруг штаммов менялась на желтую, что соответствовало зонам просветления на агаризованной среде с мелом. Отобраные 21 мутант с зоной растворения мела, большей чем у исходного штамма, были проверены на кислотообразование в жидкой среде Ридер с глюкозой. Результаты представлены в таблице 15. Все штаммы синтезировали преимущественно ЛК при лимитировании роста клеток азотом. У исследуемых штаммов обнаружены различия в накоплении биомассы, интенсивности кислотообразования и соотношении ЛК:ИЛК. Из 27 вариантов только три мутанта (15, 19 и 22) превосходят исходный штамм по накоплению ЛК, накопление ЛК у других мутантов невысокое. У мутантов 7 и 13, продуктивность была на 22,6 и 29,7%, соответственно выше, чем у исходного штамма. У мутантов 15, 19, и 22 продуктивность была выше на 43,9%. Выход YЛК у высокопродутивных мутантов был более 43 % и выше величины исходного штамма. (Таблица 15), что значительно выше величины, представленной другими авторами для дрожжей Y.lipolytica LGAM S(7) (19,0 %) (Papanikolaou et al., 2002). На рисунке 12 представлена последовательность операций при получении мутантов: 1) обработка исходного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 УФ-облучением и НГ; 2) селективная работа на средах с ацетатом/цитратом; 74 3) отбор продуцентов на твердых средах с мелом и индикатором бромкрезолом зеленым и в жидкой среде; 4) получение мутантов с применением комбинированного мутагенеза. Таблица 15. Рост и кислотообразование у Y.lipolytica ВКМ Y-2373 (И) и мутантных штаммов, полученных в результате комбинированного воздействия УФ и НГ ИЛК, г/л ЛК:ИЛК YЛК,% P, гЛК/г биомассы 17,60±0,77 2,58±0,34 6,82:1 40,83 5,29 3,25±0,3 16,83±0,68 1,92±0,1 8,70:1 42,80 5,18 2 3,00±0,3 15,26±0,98 2,26±0,1 6,75:1 43,01 5,09 4 2,7±0,2 11,62±0,56 2,44±0,1 4,33:1 35,93 4,30 5 2,86±0,3 15,63±0,87 2,31±0,12 6,77:1 45,35 5,47 7 2,51±0,25 15,94±0,89 1,61±0,12 10,0:1 43,90 6,35 9 2,1±0,2 10,86±0,34 1,47±0,12 7,39:1 43,13 5,17 10 2,4 ±0,24 13,96±0,78 2,85±0,43 4,9:1 44,77 5,82 11 2,32±0,23 13,45±0,78 2,36±0,36 5,69:1 36,0 5,79 13 2,39±0,24 16,05±0,98 1,39±0,12 11,5:1 46,58 6,72 14 1,83±0,18 10,37±0,45 2,32±0,32 4,47:1 43,0 5,63 15 2,55±0,26 19,80±1,0 1,70±0,17 11,62:1 44,11 7,61 16 2,9±0,29 14,89±0,67 1,8±0,18 8,27:1 43,0 5,13 17 1,95±0,2 8,7±0,44 1,94±0,19 4,49:1 43,0 4,46 19 2,50±0,25 19,25±0,87 1,70±0,15 11.32:1 42,62 7,70 21 2,78±0,3 14,19±0,78 2,5±0,25 5,68:1 43,0 5,10 22 2,24±0,22 17,64±0,77 1,55±0,15 11,41:1 44,30 7,66 23 3,35±0,3 16,86±0,66 1,89±0,18 9,11:1 40,0 5,03 24 2,85±0,3 12,92±0,44 1,8±0,16 7,18:1 33,32 4,53 25 2,53±0,25 16,39±0,67 1,99±0,19 8,24:1 45,0 6,48 26 3,4±0,3 19,94±0,77 1,87±0,2 10,66:1 42,03 5,86 27 2,61±0,25 15,37±0,57 2,7±0,3 5,69:1 42,11 5,89 Штамм Биомасса,г/л Исходный 3,45±0,4 1 ЛК,г/л 75 Обработка исходного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 УФ и НГ 1500 вариантов Селекция на средах: глюкоза (+), ацетат (-), цитрат (-) 16 вариантов Отбор на твердых средах с мелом и индикатором бромкрезоловым зелёным 8 вариантов Отбор в жидкой среде 3 мутанта (активность выше на 23%) Повторная обработка УФ и НГ (перекрестно) 1000 вариантов Селекция на средах с ацетатом, мелом и индикатором бромкрезоловым зелёным 27 вариантов Отбор в жидкой среде 3 мутанта (активность выше на 43,9%) Рисунок 12. Схема получения мутантов 76 В результате обработки природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 УФ и НГ получены 3 мутанта (УФ5, НГ40-6, НГ80-4), у которых продуктивность биосинтеза ЛК в среднем на 23 % выше, чем у исходного штамма. При комбинированном воздействии мутагенов селекционированы ещё 3 мутанта (15, 19, 22), у которых продуктивность была в среднем выше на 43,9%, чем у исходного штамма. Последующая работа проводилась с наиболее активным продуцентом - мутантом №15. Мутанты были получены в совместных работах с рядом соавторов (Финогенова с соавт., 2008). 3.4. Характеристика мутанта Y. lipolytica № 15 Трехсуточная культура мутанта Y. lipolytica № 15 в жидкой глюкозо-пептонной среде представлена овальными, удлиненно-овальными и округлыми клетками размером 4,0-6,0 x 4,5 - 13 мкм, также встречаются небольшие округлые клетки 2,0 x 3,0 мкм (Рисунок 13). Почкование полярное или латеральное. Клетки единичные или в цепочках, включающих 3 - 4 клетки. Штрих на глюкозо-пептонном агаре непрерывный, плоский, блестящий, белого цвета, пастообразный, края ровные. Колонии на сусло-агаре (возраст 4 недели) белого цвета, пастообразные, слегка приподнятые в центре, слегка шероховатые, с фестончатым краем. На 2-е сутки роста на жидкой глюкозо-пептонной среде образуются тонкая пленка, кольцо на стенках, тяжелый осадок на дне пробирки. Строгий аэроб. Ассимилирует: н-алканы, глюкозу, этанол, ацетат, глицерин (Morgunov et al., 2013), глицерин-содержащие отходы производства биодизельного топлива (Kamzolova et al. 2015), рапсовое и подсолнечное масла, результаты представлены в статье Камзоловой с соавторами (2007, 2011), олеиновую кислоту, янтарную, яблочную, лимонную кислоты, не ассимилирует сахарозу. Усваивают азот только в аммонийной форме, способны гидролизовать мочевину. Не растет в безвитаминной среде, требует тиамин. Оптимальное pH для роста 5,0. Не растет при 37oC. Максимальная температура роста при 290C. Характеризуется высокой активностью экзолипазы. Эти свойства идентичны тем, что описаны в определителе Kreger van Riy "The Yeast. A taxonomic study" (1984), для дрожжей вида Y. lipolytica. В ходе последующей работы было выявлено, что мутант Y. lipolytica №15 может ассимилировать в качестве источника углерода ряд новых возобновляемых субстратов (ферментолизат, рапсовое масло). 77 Рисунок 13. Трехсуточная культура Y. lipolytica № 15 в жидкой глюкозо-пептонной среде 3.5. Биосинтез лимонной кислоты из глюкозы у Y.lipolytica №15 в ферментере Дальнейшие эксперименты были связаны с изучением кислотообразующей активности мутанта Y.lipolytica №15 в 10-ти л ферментёре с рабочим объемом 5 л в условиях лимитирования роста клеток азотом. Концентрация лимитирующая рост клеток Y.lipolytica, сульфата подбиралась аммония сотрудниками (NH 4)2SO4, лаборатории экспериментальным путём в колбочных экспериментах на полноценной среде с глюкозой, которая присутствовала в избытке. Было показано, что концентрация (NH 4)2SO4 в диапазоне от 0,01 до 0,3 г/л лимитирует рост дрожжей, о чём свидетельствовала пропорциональная зависимость между предельной величиной нарастающей биомассы и концентрацией (NH4)2SO4 (Мандева, 1981). При культивировании в ферментере штамма Y. lipolytica ВКМ Y2373 концентрация (NH4)2SO4 была увеличена до 3 г/л с необходимостью получения рабочей биомассы на уровне не менее 10 г/л. Все остальные компоненты среды Ридер брались в количестве в два раза большем, чем обычно для избежания лимитирования культуры дрожжей каким-либо иным фактором (Глазунова, Финогенова, 1976). При культивировании lipolytica №15 также использовали эту концентрацию (NH4)2SO4. Полученные результаты приведены на рисунке 14. В экспоненциальной фазе (до 24 ч) рост Y. lipolytica №15 поддерживался на максимальном уровне, питательные вещества имелись в избытке, а ингибиторы роста отсутствовали; значение максимальной удельной скорости роста (μmax) у Y. lipolytica №15 составляло 0,205 ч 1, а выход клеток по массе (YX/S) – 61,4% от потребленной глюкозы. C 24 ч культивирования культура переходила в фазу замедления роста, вызванную исчерпанием азота из среды, и удельная скорость роста постепенно 78 (a) Биомасса ЛК ИЛК Азот 0,8 80 0,6 60 0,4 40 (NH4)+(г/л) Биомасса, кислоты (г/л) 100 0,2 20 0 0 0 24 48 72 96 120 Время (ч) 144 168 (б) qp 0,2 0,15 1,4 0,9 0,1 0,4 0,05 -0,1 0 24 48 72 96 120 Время (ч) 144 168 0 Удельнaя скорость роста (ч ), Уд. скорость синтеза ЛК qp (г/г ч) Логарифм биомассы удельная скорость роста -1 log X 1,9 Рисунок 14. Динамика роста, потребления азота и синтеза ЛК и ИЛК в среде с глюкозой у Y. lipolytica №15 79 снижалась до 0,016 ч 1; на 44 ч рост культуры полностью прекращался. В экспоненциальной фазе выделения ЛК в среду не происходило; интенсивная экскреция ЛК отмечалась в фазе замедления роста и в стационарной фазе после прекращения роста культуры. Удельная скорость синтеза ЛК, высокая (0,043 – 0,072 г ЛК/г биомассы/ ч) в начале процесса биосинтеза, снижалась до 0,028 г ЛК/г биомассы/ ч при накоплении свыше 50 г/л ЛК. В конце культивирования на 192 ч накопление ЛК составляло 100 г/л, содержание ИЛК было незначительно (4,0 г/л), выход ЛК по массе (YЛК) составил 63% от потребленной глюкозы. Сравнительные данные, характеризующие эффективность процессов синтеза ЛК у природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 и мутанта Y. lipolytica №15 представлены в таблице 16. У мутанта №15 накопление ЛК, выход ЛК по массе (YЛК) и удельная скорость синтеза ЛК (qp) - на 25, 37 и 12,5%, соответственно выше, чем у исходного штамма. Для того, чтобы создать представление о причине повышенного синтеза ЛК у мутанта Y.lipolytica №15 в сравнении с исходным штаммом Y.lipolytica ВКМ Y-2373 проведено определение активности ЦТК. В таблице 17 представлены данные, характеризующие активности ключевых ферментов ЦТК: цитрат-синтаза (ЦС), аконитат-гидратаза (АГ), НАД- и НАДФ-зависимые изоцитратдегидрогеназы (НАД- и НАДФ-ИЦДГ), осуществляющие три последовательные реакции цикла в период экспоненциального роста и активного синтеза ЛК. Сравнительно низкие активности АГ и НАД-ИЦДГ в сравнении с ЦС обусловливают способность как природного штамма, так и мутанта в условиях лимитирования роста клеток азотом экскретировать ЛК и ИЛК, а не другие интермедиаты цикла Кребса. (Моргунов, 2009) Таблица 16. Биосинтез ЛК у природного штамма Y.lipolytica ВКМ Y-2373 и мутанта Y.lipolytica №15 Мутант №15 Биомасса в период синтеза ЛК (г/л) Y.lipolytica ВКМ Y-2373 13,0±0,1 ЛК (г/л) 80,0±0,78 100,0±0,96 ИЛК (г/л) 8,0±0,06 4,3±0,03 Соотношение ЛК:ИЛК 10:1 23:1 Выход ЛК (YЛК) (%) 46,0 63,0 Параметры Средняя удельная скорость синтеза 0,048 ЛК (qp) (ч-1) 18,7±0,17 0,054 80 Таблица 17. Активность ферментов (Ед./мг белка) в период синтеза лимонных кислот Y. lipolytica №15 Ферменты Y. lipolytica ВКМ Y-2373 Рост Синтез Рост Синтез ЦС 1,25±0,12 2,20±0,20 0,710±0,068 0,620±0,04 АГ 0,20±0,018 0,06±0,004 0,390±0,02 0,280±0,024 НАД-ИЦДГ 0,10±0,09 0,10±0,05 0,170±0,014 0,110±0,01 НАДФ-ИЦДГ 0,14±0,012 0,23±0,018 0,250±0,015 0,260±0,02 В период синтеза ЛК мутант №15 в сравнении с природным штаммом Y. lipolytica ВКМ Y2373 обладает повышенной активностью ЦС (в 3,5 раза); по-видимому, этим и объясняется увеличенный синтез ЛК у мутанта. Также как в период роста, так и синтеза мутант в сравнении с природным штаммом обладает резко сниженной активностью АГ. В отношении активности ферментов, осуществляющих дальнейшие превращения изоцитрата (НАД- и НАДФ-ИЦДГ) не было обнаружено существенных различий у исследованных штаммов. Таким образом, мутант Y. lipolytica №15, полученный в результате комбинированного воздействия УФ и НГ, характеризовался высокой кислотообразующей активностью в ферментере и накапливал до 100 г/л ЛК в условиях периодического Однако, недостатком этого процесса является его культивирования. ограниченная продолжительность. Продуктивность культуры (qp) Y. lipolytica №15 (рисунок 14б), максимальная в начале биосинтеза ЛК, постепенно снижалась в ходе культивирования при накоплении ЛК свыше 50 г/л, что делало нецелесообразным продолжение процесса дольше 5 суток. Возможными причинами снижения синтеза ЛК являлось резкое снижение метаболической активности мутанта, а также ингибирующее действие высоких концентраций ЛК. Указанные недостатки периодического культивирования определяли необходимость поиска других способов культивирования, позволяющих продлить активный синтез ЛК. 3.6. Способы культивирования, обеспечивающие продолжительный и стабильный синтез лимонной кислоты Исследованиями последних лет показано, что одним из перспективных направлений является осуществление процесса в непрерывном режиме, а также использование полупронецаемых мембран с целью удержания биомассы продуцента в ферментере и увеличения эффективности процесса (Anastassiadis et al., 2008; Rymowicz et al., 2010; Фатыхова, 2011). 81 В связи с этим, в число основных задач исследования входило изучение возможности получения ЛК из глюкозы отобранным мутантом в условиях непрерывного культивирования. 3.6.1. Использование мембранного модуля для биосинтеза ЛК Одним из микробиологических перспективных процессов при способов увеличения продолжительности получении метаболитов, экскретируемых в культуральную жидкость, является культивирование в мембранном биореакторе (Gledhill et al., 1973; Rane, Sims, 1995; Rymowicz et al., 2010; Фатыхова, 2011). Мембранный биореактор представляет собой ферментер, оснащенный фильтрующим модулем. Данный способ культивирования предоставляет возможность непрерывно удалять образующийся продукт, что особенно важно при его ингибирующем воздействии на продуцент. Вся биомасса продуцента остается в ферментере и продолжает синтезировать продукт. При данном способе культивирования в ферментер подается среда, содержащая глюкозу – 50 г/л и азот в “следовых” количествах содержащийся в бакто-пептоне (0,75 г/л), обеспечивающем поддержание клеток в активном состоянии, но не достаточном для клеточного роста. В условиях постоянного выведения ЛК из культуральной жидкости можно было ожидать увеличения продолжительности ферментации за счет поддержания концентрации ЛК, не ингибирующей метаболизм клеток. В настоящей работе использовали биореактор с выносным спиральным мембранным модулем (Рисунок 15). На рисунке 16 представлены результаты непрерывного культивирования в мембранном биореакторе. После культивирования дрожжей Y. lipolytica № 15 в периодическом режиме (72 ч), к ферментеру подключали мембранный модуль и осуществляли непрерывное культивирование. Скорость протока выбрана 0, 014 ч-1, так как в условиях периодического культивирования при удельной скорости роста дрожжей (µ), равной 0,014 ч-1, удельная скорость синтеза ЛК (qp), максимальна. Продолжительность ферментации с использованием мембранного модуля - 480 ч. Интенсивное кислотообразование (40-32,1 г/л) наблюдалось до 300 ч. Средняя производительность аппарата и выход (YЛК) в данный промежуток времени составляли 0,47 г/л·ч и 77%, соответственно. Концентрация ИЛК составляла менее 4 % от суммы кислот. После 300 ч наблюдалось снижение синтеза ЛК. Снижение образования ЛК не связано с повышением ее концентрации в культуральной жидкости, а скорее всего со снижением метаболической активности клеток. 82 Рисунок 15. Биореактор с мембранным модулем ЛК Биомасса 50 80 60 30 40 20 Биомасса (г/л) ЛК (г/л) 40 20 10 0 0 0 100 200 300 400 Время (ч) Рисунок 16. Биосинтез ЛК у Y.lipolytica №15 при использовании мембранного биореактора 83 Микроскопирование клеток после 310 ч культивирования показало, что клеточная популяция была полиморфна: в среде присутствовали как клетки округлой формы, так и мицелиальные формы. Следует отметить, что при периодическом культивировании у Y.lipolytica №15 в фазе активного синтеза ЛК преобладающей формой клеток являются округлые, а снижение скорости синтеза ЛК коррелировало с уменьшением количества округлых клеток в среде культивирования и появлением мицелиальных форм, что согласуется с данными других исследователей (Makri et al., 2010). В литературе отмечается, что условия, которые вызывают переход дрожжей к мицелиальному росту или наоборот к округлой форме различны, к ним относятся изменения рН (Ruiz-Herrera, Sentandreu, 2002; Szabo, Stofanikova, 2002), температуры, атмосферного состава и наличие специфических соединений в среде культивирования (Domínguez et al., 2000; Ruiz-Herrera, Sentandreu, 2002; Kawasse et al., 2003; Cervantes-Chávez, 2009), таких как цитрат (Janghwan et al., 2000), стрессовые условия (Janghwan et al., 2000), а также природa углеродного субстрата (Papanikolaou et al., 2007) и источника азота (Szabo, Stofanikova, 2002). В литературе имеются сведения о непрерывных процессах биосинтеза ЛК дрожжами. Одними из первых экспериментов по получению ЛК в ферментере с использованием мембранного модуля описаны Enzminger и Asenjo (1986). Ими проводилось непрерывное культивирование с использование дрожжей S.lipolytica NRRL Y-7576 в среде с глюкозой в мембранном биореакторе, где выход ЛК от потребленного субстрата составлял 86%, а объемная продуктивность процесса 1,16 г/л·ч, и эти параметры поддерживались стабильными в течение более 200 ч (Enzminger, Asenjo, 1986). Kim et al. (1987) исследовали способы увеличения продуктивности и жизнеспособности клеток Y. lipolytica в условиях непрерывной ферментации в среде с глюкозой в течение достаточно длительного времени. Авторы подобрали концентрацию азота в доливной среде, при которой не наблюдался рост клеток, и клетки сохраняли свою активность в течение длительного срока (600 ч). Rane, Sims, (1995) при культивировании дрожжей C.lipolytica Y-1095 на среде с глюкозой смогли достичь стабильного кислотообразования в течение 500 ч, производительность ферментера составила 1,32 г/л·ч, а выход ЛК от потребленного субстрата составил 65%. Но такая производительность достигалась за счет накопления большой биомассы в ферментере (около 60 г/л), что резко снижало выход продукта за счет затрат субстрата на поддержание высокой рабочей биомассы. В работе Т.Е. Арзуманова (Arzumanov et al., 2000) описаны эксперименты с использованием керамического фильтрационного модуля и модуля на полых волокнах. С использованием керамического модуля были сопряжены значительные трудности: поры 84 керамического фильтрационного модуля забивались клетками, а металлические части насоса подвергались коррозии под воздействием ЛК. При использовании фильтрационного модуля на полых волокнах, большая площадь фильтрации такого модуля значительно уменьшает степень забивания мембранного элемента при той же скорости прокачки культуральной жидкости через фильтрующий элемент. Показано, что постоянная скорость образования ЛК в среде с этанолом наблюдалась до 140-160 ч, при этом объемная продуктивность процесса и удельная скорость синтеза ЛК составили 2,03 г/л·ч и 0,09 г/г· ч, соответственно. Сравнительно недавно в работе Rywińska и Rymowicz (2011) представлены результаты непрерывного культивирования двух ацетат-негативных мутантных штаммов Y. lipolytica в среде с глицерин-содержащими отходами производства биодизеля в мембранном биореакторе. Продолжительность культивирования более 500 ч. Концентрация ЛК зависела от штамма. Для Y. lipolytica Wratislavia 1.31 стабильный синтез ЛК на уровне 96 г/л наблюдалась до 330 ч. При использовании Y. lipolytica Wratislavia AWG7 достигались лучшие результаты: постоянная скорость образования ЛК наблюдалась в промежутке времени 160-550 ч, концентрация ЛК при этом была выше и составляла 116 г/л. Оба штамма синтезировали ЛК с постоянной и относительно высокой удельной скоростью синтеза 0,07 и 0,06 г/г·ч для Y. lipolytica Wratislavia AWG7 and Wratislavia 1.31 соответственно. В работе А.Р. Фатыховой при культивировании мутанта Y.lipolytica A-101-1.22 в биореакторе с выносным спиральным модулем на среде с глицерин-содержащими отходами показано, что интенсивный синтез ЛК (до 107 г/л) наблюдался до 300 ч культивирования, концентрация ИЛК не превышала 6 % от общей суммы лимонных кислот (Фатыхова, 2011). Таким образом, собственные эксперименты с использованием мембранного модуля, а также литературные данные показали, что данный метод культивирования перспективен для продолжительного синтеза ЛК без снижения скорости кислотообразования. 3.6.2. Отъемно-доливной метод культивирования Более продолжительный стабильный процесс биосинтеза ЛК был реализован с применением отъемно-доливного метода, при котором производится отъем культуральной жидкости через определенные промежутки времени, и в ферментер добавляется свежая питательная среда с содержанием всех компонентов, в том числе и азота, в количестве, достаточном для возобновления клеточного роста. В сравнении с традиционным периодическим процессом применение отъемно-доливного метода культивирования делает процесс более эффективным. Этот метод успешно применен при получении ЛК из этанола (Arsumanov et al., 2000; 2002), глюкозы (Moresi, 1994; Anastassiadis, Rehm, 2006) и глицеринсодержащих отходов (Фатыхова, 2011; Rywińska, Rymowicz, 2010). 85 В данном разделе работы было проведено отъемно-доливное культивирование мутанта Y.lipolytica №15 в среде, содержащей глюкозу в качестве единственного источника углерода. При проведении экспериментов варьировали количеством доливаемой среды и длительностью циклов, в каждом из которых культивирование осуществляли в периодическом режиме. Были исследованы следующие варианты: отъем-долив 40% и 30% культуральной жидкости. Такие объемы были взяты для того, чтобы культура обогощалась компонентами питательной среды для роста новых клеток, а также имела достаточное количество рабочей биомассы способной синтезировать ЛК. На рисунке 17 представлены результаты отъемнодоливного метода культивирования. Процесс биосинтеза в режиме отъемов-доливов шел интенсивно в течение 1280 ч (53 суток), концентрация ЛК была высокой и составляла 65-70 г/л. В таблице 18 представлены содержание биомассы, концентрация ЛК, ИЛК, производительность ферментера (QЛК) и выход продукта (YЛК) от потребленного субстрата при разных режимах культивирования. При обоих режимах количество экскретируемой ЛК ЛК (г/л) ЛК Б ЛК Биомасса Биомасса 80 80 80 80 60 60 60 60 40 40 40 40 20 20 20 20 0 0 0 197 317 437 557 677 0 772 Время (ч) 892 1012 1132 Время (ч) 1252 Рисунок 17. Биосинтез ЛК дрожжами Y. lipolytica №15 в режиме отъемов–доливов: отъем-долив 40% (А) и 30% (Б) Таблица 18. Биосинтез ЛК дрожжами Y. lipolytica №15 в режиме отъемов-доливов 40% 5 сут. Биомасса (г/л) 13,8 ЛК (г/л) 68,1 ИЛК (%) 2,6 QЛК (г/л·ч) 0,26 YЛК (%) 57,0 30% 5 сут. 13,7 69,4 2,8 0,23 47,0 Режим Биомасса (г/л) А 86 было одинаковым, и в среднем составляло 68,1 – 69,4 г/л. Производительность ферментера (QЛК) в обоих случаях также отличалась незначительно и составила 0,23 г/л·ч и 0,26 г/л·ч для 30% и 40% (0,8 и 0,6 л), соответственно. Выход ЛК (YЛК) при отъёме-доливе 40% выше на 10,0 %, чем при 30%, что, возможно, вызвано более высокой степенью обновления культуры и повышенной скоростью потребления глюкозы. Средняя производительность ферментера (QЛК) и выход (YЛК) в течение 53 суток культивирования в режиме отъемов-доливов составляли 0,25 г/л·ч и 52%, соответственно. Во всех вариантах культивирования в режиме отъемов–доливов содержание ИЛК не превышало 2,6-2,8 г/л, что упрощает процесс выделения ЛК из культуральной жидкости. В литературе, также, представлены данные о процессах биосинтеза ЛК дрожжами при использовании отъемно-доливного способа культивирования. При использовании этанола в качестве единственного источника углерода для биосинтеза ЛК применен способ отъемнодоливного культивирования, который обеспечивал высокую биосинтетическую активность дрожжей Y.lipolytica в течение более 760 ч (32 сут). (Arzumanov et al., 2000). В данной работе было показано, что наилучшие результаты (105 г/л ЛК и выход продукта (YЛК)=88,3%) наблюдались при использовании режима с доливом питательной среды в количестве 50 % от исходного объема и длительностью 3 суток. В работе Anastassiadis и Rehm (2006) представлены данные об отъемно-доливном культивировании Candida oleophila в среде с глюкозой. Отъемы-доливы последовательно проведены 20 раз, концентрация ЛК составляла 37,6-57,8 г/л. При проведении этих экспериментов никаких технических проблем, а также проблем с удержанием культуры в физиологически-активном состоянии не наблюдалось. В работе Rywińska и Rymowicz культивирования дрожжей Y.lipolytica (2010) приведены данные отъемно-доливного в среде с глицерин-содержащими отходами. Длительность культивирования составляла 1350 ч (56 сут) для Y. lipolytica Wratislavia 1.31 и 1680 ч (69 сут) для Y. lipolytica Wratislavia AWG7 соответственно. Для обоих штаммов при применении режима с доливом 20% от исходного объема была достигнута концентрация ЛК 176 г/л для Y. lipolytica Wratislavia 1.31 и 197 г/л для Y. lipolytica Wratislavia AWG7, но наблюдалось значительное накопление эритритола, побочного продукта ферментации (17,7 г/л и 15.5 г/л соответственно). Накопление полиолов рассматривается как защитая реакция клетки на стрессовую ситуацию – избыток ЛК или глицерина (Rymowicz et al., 2009). Сравнительно недавно в работе Makri et al. (2010) показано одновременное образование ЛК и липидов дрожжами Y. lipolytica в среде с глицерин-содержащими отходами при отъемнодоливном культивировании. При начальной концентрации субстрата 27,8 г/л Y. lipolytica ACA- 87 DC 50109 синтезировали 19,0 г/л ЛК, при этом наблюдалось значительное накопление внутриклеточных липидов. При начальной концентрации глицерин-содержащих отходов 104,9 г/л и увеличении аэрации среды дрожжи синтезировали 35-40 г/л ЛК (Makri et al., 2010). В работах А.Р. Фатыховой с соавторами была показана возможность биосинтеза ЛК в режиме отъемов-доливов у мутантных штаммов Y.lipolytica в среде с глицерин-содержащими отходами. Культивирование проводилось в течение 1108 часов при количестве доливаемой среды 40%, 30% и 20 %. Лучшие результаты наблюдались при доливе среды 30 % и составили 124, 2 г/л ЛК для мутанта Y.lipolytica A-101-1.22 и 145,2 г/л для мутанта Y.lipolytica № 15 соответственно (Rymowicz et al., 2010; Фатыхова, 2011). В таблице 19 представлена сравнительная характеристика различных способов культивирования с использованием двух изучаемых штаммов: Y. lipolytica ВКМ Y-2373 и его мутанта Y. lipolytica №15. В периодическом режиме удалось достичь более высокой концентрации ЛК с высокими значениями производительности ферментера (С) и выхода (YЛК) с использованием мутантов Y. lipolytica №15 по сравнению с природным штаммом. К 192 ч накопление дрожжами Y. lipolytica № 15 ЛК, соотношение ЛК:ИЛК, СЛК и YЛК составляли 100 г/л, 25:1, 0,27 г ЛК/л·ч и 63% соответственно. При культивировании природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 в культуральной жидкости накапливалось лишь 80 г/л ЛК, соотношение ЛК:ИЛК составляло 19:1. Культивирование Y. lipolytica № 15 в мембранном биореакторе позволило продлить активный синтез ЛК до 300 ч, в течение этого периода концентрация ЛК поддерживалась на достаточно высоком уровне (32,1 - 40 г/л), а выход (YЛК) и производительность ферментера (С) составляли 77% и 0,47 г ЛК/л· ч соответственно. Метод отъемов-доливов рассматривается как наиболее перспективный режим для длительного и эффективного синтеза ЛК. Метод обеспечивает высокую Таблица 19. Эффективность процессов биосинтеза ЛК из глюкозы Режим Штамм Периодический Y.lipolytica ВКМ Время (ч) 192 ЛК (г/л) 80,0 ИЛК(г/л) YЛК (%) СЛК (г/л·ч) 8,0 46,0 - 192 100 4,3 63,0 0,27 4032,1 68,169,4 1,56-1,31 77,0 0,47 2,6-2,8 0,25 Y-2373 Y. lipolytica №15 Мембранный Y. lipolytica №15 300 a модуль ОтъемноY. lipolytica №15 1280 б доливной a Мембранный модуль в интервале 100-300 ч, б Режим отъемов-доливов 30% 5 суток 52,0 88 биосинтетическую активность дрожжей Y. lipolytica N 15 (68,1-69,4 г/л) в течение 1280 ч, что связано с непрерывным обновлением культуры. Кроме того, отъемно-доливной способ позволяет снизить расходы сырья, тепло- и электроэнергии за счет сокращения количества необходимого посевного материала и увеличения времени между циклами подготовки и стерилизации ферментера. 3.7. Особенности роста мутанта Y. lipolytica № 15 и синтеза ЛК при использовании рапсового масла в качестве источника углерода Рапсовое масло является основным источником сырья для производства биодизеля в странах ЕС. Именно рост производства биодизеля привел к заметному увеличению спроса на рапсовое масло в течение 2001-2012 года. Европа является основным потребителем рапсового масла для производства биодизеля (в США для этих целей используется соя, в Юго-восточной Азии – пальмовые деревья). Согласно прогнозам Informa Economics, в 2013/14 мировое производство рапса составит 65,3 млн. тонн. Данная цифра включает 20,8 млн. тонн в ЕС, 16,5 млн. тонн в Канаде, 12,8 млн. тонн в Китае и 6,9 млн. тонн в Индии [http: //www.oilworld.ru]. Существуют проекты и по использованию пустующих сельскохозяйственных угодий для выращивания рапса и последующего получения масла из этой культуры в России, в частности, в Краснодарском, Алтайском, Ставропольском крае, Татарстане, Ростовской, Тульской, Липецкой, Орловской, Белгородской областях. По оценкам экспертов, к 2015 году темпы производства рапсового масла в России должны начать разгоняться, к этому времени показатели производства достигнут 280 тыс. тонн продукции в год. После этого в сегменте начнется бурный рост, и к 2020 году на долю рапсового масла будет приходиться уже порядка 17% рынка растительных масел России. При этом рынок будет предоставлять высокий показатель рентабельности [http://www.agrosever.su]. Рапсовое масло является прекрасным сырьем для производства органических кислот. Использование рапсового масла обеспечивает высокий выход продукта, образование продуктов c высоким уровнем чистоты, который позволяет применять целевые продукты не только для технических целей, но и в пищевом производстве, медицине и сельском хозяйстве. Во многих странах разработаны долгосрочные промышленные программы по производству растительных масел и использованию их в различных отраслях промышленности и биотехнологии. Однако сведения относительно роста дрожжей и других микроорганизмов на растительных маслах и получения ценных продуктов на момент начала работы были единичны и касались получения микробных липидов и липаз (Bati et al., 1984; Barth, Giallardin, 1996; Papanikolaou et al., 2003b; Pignege G. et al., 2000). 89 Дрожжи Y. lipolytica способны ассимилировать широкий спектр жиров животного и растительного происхождения. Это свойство является таксономической характеристикой данных дрожжей (Lodder et al., 1970). По своему химическому строению жиры представляют собой смесь сложных эфиров трехатомного спирта глицерина и высокомолекулярных жирных кислот. Начальным этапом ассимиляции триглицеридов является их гидролиз липазами с образованием глицерина и жирных кислот (Рисунок 18). Ассимиляция жирных кислот до ацетил-КоА происходит через β-окисление. Индукция глиоксилатного цикла (ГЛЦ), включающего два фермента: изоцитрат-лиазы (ИЛ) и малат-синтазы (МС) необходима для утилизации жирных кислот. Глицерин проникает в клетки посредством простой диффузии, и его дальнейшая ассимиляция до ацетил-КоА происходит по фосфорилирующему пути. Ранее в бесклеточных экстрактах Y. lipolytica обнаружены только активности ферментов фосфорилирующего пути ассимиляции глицерина – глицеролкиназа (КФ 2.7.1.30) (ГК) и две глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (НАД- и ФАД-зависимые) (Г-3-ф ДГ), а ферменты, катализирующие реакции окислительного пути - НАД-зависимая глицеролдегидрогеназа, превращающая глицерин в диоксиацетон, и диоксиацетонкиназа, отсутствовали (Моргунов с соавт., 1991). При росте на глицерине в клетках активно функционирует цикл трикарбоновых кислот (ЦТК), а ГЛЦ не оперирует и анаплеротическую роль выполняет пируваткарбоксилаза, осуществляющая конденсацию пирувата и бикарбоната и образование оксалоацетата (Ермакова с соавт., 1986). Продуктами гидролиза триглицеридов масел являются ди-, моноглицериды, глицерин и свободные жирные кислоты. Показано, что содержание глицерина и свободных жирных кислот, образованных в результате гидролиза триглицеридов, поддерживается постоянным. Глицеролкиназа – ключевой фермент метаболизма глицерина, и ферменты ИЛ и МС, вовлеченные в метаболизм жирных кислот, индуцируются в первые часы роста, и их активность существенно не изменяется в ходе культивирования, что позволило авторам заключить одновременное потребление из среды глицерина и жирных кислот (Моргунов, 2009; Kamzolova et al., 2011). Целью данного раздела работы было продолжение исследований, проводимых в лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов ИБФМ РАН, по биосинтезу ЛК из растительных масле у дрожжей Y. lipolytica. В качестве основного объекта был взят мутант Y. lipolytica № 15, а в качестве объектов сравнения - природный штамм Y. lipolytica ВКМ Y-2373 и селекционированный ранее Шишкановой Н.В. (Шишканова, 1979) мутант Y. lipolytica №1. 90 Дрожжи Y. lipolytica № 15 выращивали в ферментерах АНКУМ-2М (СКБ, Пущино) объемом 10 л (с объемом питательной среды 5 л) в режиме периодического культивирования на минерально-солевой среде. После засева ферментера отключали подачу воздуха и как только pO2 снижался до 25% включали исходно минимальный расход воздуха 0,1-0,15 л/мин на объем ферментера. Далее в процессе роста концентрацию растворенного кислорода 25-30% (от насыщения) и в период синтеза 55-60% (от насыщения) поддерживали увеличением расхода воздуха до 10 л/мин на 5 л среды и увеличением скорости оборотов мешалки с 400 об/мин до 1000 об/мин. После снижения рН среды до 4,5 (в связи с размножением дрожжевых клеток и поглощением NH4+ из среды) включали подачу стерильного 20%-ного раствора NaOH и поддерживали pH=4,5 автоматически в ходе всего процесса. Культивирование проводили при температуре (28 0,5)oC. Исходно вносили 20 г/л рапсового масла, затем по 20 г/л вносили его в момент повышения pO2 на 5-10% в сравнении со стабильным уровнем насыщения кислорода. Такое повышение pO2 указывало на полное потребление дрожжами ранее присутствующего субстрата. На рисунке 19 приведены кривые роста и накопления кислот у мутанта Y. lipolytica №15 в среде с рапсовым маслом. В экспоненциальной фазе (до 24 ч) рост Y. lipolytica №15 в среде с рапсовым маслом поддерживался на максимальном уровне, питательные вещества имелись в избытке, параметры среды были близки к идеальным, а ингибиторы роста отсутствовали; значение максимальной удельной скорости роста (μmax) у Y. lipolytica №15 составляло 0,205 ч 1, а выход клеток по массе (YX/S) – 100% от потребленного масла. К концу экспоненциальной фазы биомасса продуцента достигала 20 г/л. C 24 ч культивирования культура переходила в фазу замедления роста, вызванную исчерпанием азота из среды, и удельная скорость роста постепенно снижалась до 0,032 ч 1, на 36 ч рост культуры полностью прекращался. В экспоненциальной фазе выделения ЛК в среду не происходило; экскреция ЛК отмечалась в фазе замедления роста и была интенсивной в стационарной фазе после прекращения роста культуры. Удельная скорость синтеза ЛК, была высокой (0,06 – 0,086 г ЛК/г биомассы· ч) в ходе всего процесса культивирования. В конце культивирования на 192 ч накопление ЛК составляло 175,0 г/л, и содержание ИЛК было незначительно (5,6 г/л), соотношение ЛК к ИЛК составляло 32 : 1. У мутанта №15 продуктивность процесса, удельная скорость синтеза ЛК (qЛК) и выход по субстрату YЛК были высокими и составляли 1,34 г ЛК/л·ч, 0,063 г ЛК/г биомассы· ч, и 150% соответственно. 91 Триглицериды Липаза Глицерин ГК 3-Ф-Глицерол Г-3-Ф ДГ 3-Ф-Дигидроксиацетон Жирные кислоты Пируват Ацетил-КоА ЦС ОАА Цитрат МДГ АГ Малат Глиоксилат И Л МС Изоцитрат НАД-ИЦДГ НАДФ-ИЦДГ Фумарат α-КГК ЯК Рисунок 18. Схема ассимиляции масел у дрожжей Y. lipolytica (Моргунов, 2009) 92 ИЛК Биомасса Азот 35 150 30 ЛК, ИЛК (г/л) 180 + -1 Биомасса, (NH4) * 10 (г/л) ЛК 25 120 20 90 15 60 10 30 5 0 0 0 24 48 72 96 120 144 168 Время (ч) log X удельная скорость роста qp Логарифм биомассы 0,17 1,2 0,12 0,7 0,07 0,2 -0,3 , 0,02 0 24 48 72 96 120 144 168 -1 1,7 Удельная скорость роста (ч ), уд. скорость синтеза ЛК qp (г/г ч) 0,22 -0,03 Время (ч) Рисунок 19. Динамика роста (●), потребления азота (Δ) и синтеза ЛК (▲) и ИЛК (□) у мутанта Y. lipolytica №15 в среде с рапсовым маслом 93 У природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 динамика роста и накопления лимонных кислот была подобна (Рисунок 20). В экспоненциальной фазе (до 12 ч) рост Y. lipolytica ВКМ Y-2373 поддерживался на максимальном уровне, значение максимальной удельной скорости роста у Y. lipolytica ВКМ Y-2373 составляло 0,297 ч 1. C 12 ч культивирования культура переходила в фазу замедления роста, удельная скорость роста постепенно снижалась до 0,01 ч 1, и на 24 ч культивирования рост культуры полностью прекращался. В экспоненциальной фазе и фазе замедления роста явного выделения кислот в среду не происходило; их интенсивная экскреция начиналась в стационарной фазе, после прекращения роста культуры. Удельная скорость синтеза ЛК низкая в сравнении с мутантным штаммом (в 6-8 раз). К концу культивирования (192 ч) накапливалось 87 г/л ЛК и 72 г/л ИЛК (ИЛК:ЛК = 1,21:1). Выход YЛК от потребленного масла составил 87%. Следует отметить, что значительное накопление ИЛК у природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 в среде с рапсовым маслом может иметь практическое значение в связи с возможным применением ИЛК и ее солей в качестве регуляторов энергетического обмена. В последние годы в лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов ИБФМ РАН накапливается всё больше данных, что ИЛК – единственный известный метаболит, который может снимать блок с сукцинат-дегидрогеназы и способствует максимальному использованию кислорода клеткой, даже при длительных интенсивных физических нагрузках. При этом, по-видимому, не происходит увеличения абсолютного количества поглощаемого кислорода, а изоцитрат лишь позволяет клетке максимально использовать имеющиеся запасы кислорода. В этом случае на повышение нагрузок организм отвечает не снижением выработки энергетических субстратов и, как следствие, утомляемостью, переходом на анаэробный путь окисления пирувата, с образованием лактата, а сохранением высокой активности ферментов цикла Кребса и высокой скорости образования АТФ. Это позволяет организму лучше переносить физические нагрузки, не снижая потребление кислорода и не накапливая в мышцах продукты анаэробного метаболизма. До сих пор использование ИЛК в качестве регулятора обмена и адаптогена тормозится отсутствием производства в стране. В настоящее время ИЛК выпускается фирмой «Sigma» в виде двух различных препаратов. Один из этих препаратов является продуктом химического синтеза и содержит смесь равных количеств трео-Ds- и трео-Ls-изолимонной кислот, из них биологической активностью обладает только один изомер – трео-Ds-изоцитрат. Начиная с 1980 года фирма «Sigma» продает монокалиевую соль Ds-(+)-изолимонной кислоты, которую выделяют из листьев растений по 497 € за грамм препарата. 94 ЛК ИЛК Биомасса Азот 35 30 25 60 20 15 30 10 5 0 + -1 Биомасса, (NH4) 10* (г/л) Параметры (г/л) 90 0 0 24 48 72 96 120 Время (ч) 144 удельная скорость роста log X 168 qp (Б) -1 0,25 Логарифм биомассы 0,2 1,2 0,15 0,7 0,1 0,05 0,2 уд. скорость синтеза ЛК qp (г/г ч) 1,7 Удельная скорость роста (ч ), 0,3 0 0 -0,3 24 48 72 96 120 Время (ч) 144 168 -0,05 Рисунок 20. Динамика роста, потребления азота и синтеза ЛК и ИЛК у природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 в среде с рапсовым маслом 95 У мутанта Y. lipolytica № 1, селекционированного ранее Н.В. Шишкановой, к концу ферментации (144 ч) концентрация ЛК составляла 135 г/л, и содержание ИЛК было также незначительно (7,8 г/л), соотношение ЛК к ИЛК составляло 17,3:1. У мутанта Y. lipolytica №1 продуктивность процесса, удельная скорость синтеза ЛК (qЛК) и выход по субстрату YЛК были высокими и составляли 1,25 г ЛК/л·ч, 0,127 г ЛК/г биомассы·ч, и 155% соответсвенно. В таблице 20 представлены показатели биосинтеза ЛК у трех изученных штаммов Y. lipolytica ВКМ Y-2373, Y. lipolytica N 15 и Y. lipolytica N 1 в среде с рапсовым маслом. Содержание ЛК, ИЛК, а также выход продукта зависели от конкретного использованного штамма. Максимальный биосинтез ЛК (175 г/л) с незначительным накоплением ИЛК (5,6 г/л) наблюдался у селекционированного нами Y. lipolytica №15. Следует отметить, что нам впервые в мире удалось достичь таких высоких показателей преимущественного биосинтеза ЛК из растительных масел с использованием мутанта Y. lipolytica №15. Для сравнения, Saccharomycopsis lipolytica NTG9 в среде с рапсовым маслом синтезирует 152,3 г/л ЛК, но соотношение ЛК к ИЛК составляет 5,34:1 (Good et al., 1985). Aurich et al. (2003) достигли высокой концентрации ЛК (198 г/л) с использованием мутанта Y. lipolytica H181 только к 300 ч культивирования. Анализ метаболитов проводился на 192 ч у Y. lipolytica ВКМ Y-2373 и Y. lipolytica N 15 и на 144 ч у Y. lipolytica N 1. Таблица 20. Биосинтез ЛК у Y. lipolytica в среде с рапсовым маслом Параметры Биомасса (г/л) Y. lipolytica ВКМ Y-2373 21,2±2,12 Y. lipolytica N 15 Y. lipolytica N 1 20,0±2,0 10,0±1,0 0,297 0,205 0,200 ЛК (г/л) 87,0±0,7 175,0±0,16 135,0±0,11 ИЛК (г/л) 72,0±0,65 5,6±0,4 7,8±0,6 ЛК:ИЛК 1,21:1 32:1 10,7:1 0,62 1,34 1,25 87 150 155 Удельная скорость роста (ч-1) Объемная продуктивность (г/л·ч) Выход ЛК (%) 96 Продуктивность процесса с использованием традиционных продуцентов ЛК грибов A. niger в среде с мелассой не превышает 0,8 г ЛК/л·ч с выходом 90% (Meers, Milsom, 1987), в то время как мутант Y. lipolytica № 15 в среде с рапсовым маслом способен производить 1,34 г ЛК/л час с выходом 150%. Для изучения путей биосинтеза ЛК были определены активности ферментов начальных этапов метаболизма рапсового масла и ЦТК у мутанта Y. lipolytica № 15 в сравнении с природным штаммом Y. lipolytica ВКМ Y-2373. Клетки отбирались в фазу экспоненциального роста (нет кислот) и в стационарную фазу (в период активного синтеза лимонных кислот). В таблице 21 представлены данные, полученные при определении активности ферментов. У обоих штаммов при ассимиляции рапсового масла ключевой фермент метаболизма глицерина, глицеролкиназа (ГК), и ферменты ГЛЦ – ИЛ и МС, вовлеченные в метаболизм жирных кислот, индуцируются в первые часы роста, изменяется в ходе синтеза ЛК, и их активность существенно не что позволяет предположить, что продукты гидролиза триглицеридов - жирные кислоты и глицерин - потребляются клетками одновременно. Для обоих штаммов характерна высокая активность ключевого фермента цитратсинтазы, ответственного за синтез цитрата, которая повышалась в период синтеза ЛК. Активность этого фермента у мутанта Y. lipolytica № 15 выше (на 34 %), чем у природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373. Таблица 21. Активности ферментов (Ед./мг белка) в среде с рапсовым маслом Ферменты Y. lipolytica №15 Y. lipolytica ВКМ Y-2373 Рост Синтез Рост Синтез ГК 0,310±0,031 0,330±0,027 0,250±0,022 0,235±0,018 ЦС 2,750±0,27 3,881±0,36 2,440±0,19 2,910±0,26 АГ 0,200±0,018 0,100±0,004 1,020±0,15 0,805±0,06 НАД-ИЦДГ 0,018±0,0016 0,010±0,002 0,060±0,003 0,020±0,0018 НАДФ-ИЦДГ 0,300±0,023 0,200±0,17 0,080±0,005 0,051±0,0045 4,200±0,4 4,100±0,38 3,700±0,32 3,800±0,35 ИЛ 0,150±0,012 0,180±0,015 0,111±0,015 0,121±0,01 МС 0,070±0,005 0,081±0,006 0,070±0,004 0,102±0,0071 МДГ 97 У обоих штаммов высокой как в ростовой, так и в стационарной фазе, оставалась активность малатдегидрогеназы (МДГ), фермента, вовлеченного в процесс ресинтеза оксалоацетата. Активности ЦС и МДГ у обоих штаммов значительно превышали активности последующих ферментов цикла: аконитат-гидратазы (АГ) и НАД-изоцитратдегидрогеназы (НАД-ИЦДГ). Соотношение синтезируемых дрожжами ЛК и ИЛК определяется соотношением активностей ферментов ЦС, АГ и НАД-ИЦДГ. Высокая активность ЦС и резко сниженная активность АГ (в период синтеза снижающаяся еще в 2 раза) приводит к преимущественному синтезу ЛК у мутанта Y. lipolytica N 15, в то время как достаточно высокая активность АГ при одновременно низкой активности НАД-ИЦДГ приводит к экскреции как ЛК, так и ИЛК у природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373. Также был исследован жирно-кислотный состав рапсового масла в начале и конце культивирования штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 (Таблица 22). Как видно из таблицы 22, Таблица 22. Жирнокислотный состав масла (% от суммы жирных кислот) в начале и конце культивирования Жирные кислоты (%) Масло (начальное) Масло (конечное) С14 тетрадекановая следы следы С15 пентадекановая следы следы С16 гексадекановая 4,0±0,1 4,6±0,1 С16:1пальмитолеиновая следы ─ С17 гептадекановая следы ─ С17:1 гептадеценовая следы ─ С18 октадекановая (стеариновая) С18:1 олеиновая 1,2±0,1 1,3±0,02 58,8±0,1 61,3±0,8 28±0,1 26,5±0,7 С18:3 α- линоленовая 5,9±0,05 4,6±0,3 С20эйкозановая (арахиновая) 0,3±0,02 следы С20:1 гадолеиновая 0,8±0,02 0,6±0,08 следы ─ 0,1±0,02 ─ 0,5±0,01 0,6±0,1 С18:2 линолевая С20:2 цис,цис-эйкозадиеновая -11,14 С22 докозановая (бегеновая) С23 трикозановая Следы – количество менее 0,1% 98 преобладающими жирными кислотами являются олеиновая (С18:1) 58,8-61,3% и линолевая (С18:2) 26,6-28,1. В ходе культивирования существенных изменений не наблюдалось - незначительно снижалось содержание линолевой кислоты и повышалось содержание олеиновой. Таким образом можно предположить, что в процессе роста происходит одновременное потребление всех жирных кислот, входящих в состав растительных масел. 3.8 Проверка синтезирующей активности мутанта Y.lipolytica №15 на средах с ферментолизатом осины в колбах В работах Клесова и Григораша (Клесов, Григораш, 1981) были выявлены основные пути образования глюкозы и целлобиозы путем ферментативного превращения нерастворимой целлюлозы. Авторами было показано, что гидролиз целлюлозы имеет единый механизм и осуществляется в результате последовательно-параллельного действия нескольких ферментов, входящих в состав так называемых целлюлазных комплексов независимо от их происхождения и состава. В данной работе изучена способность мутантного штамма Y.lipolytica № 15 синтезировать ЛК из ферментолизата осины, полученного из ВНИИ синтез белка. Получение ферментолизата Опилки, остающиеся от деревоперерабатывающего производства, размалывали с помощью стеклянных бус в специальной центрифуге до консистенции порошка (величина частиц 50-100 мкрн). Затем порошок заливался водой и добавлялся ферментный препарат Целюкласт 1,5 Л ФГ. Целюкласт 1,5 Л ФГ - это жидкий препарат целлюлазы, полученный глубинной катализирует ферментацией отобранного расщепление штамма целлюлозы до гриба глюкозы, Trichoderma reesei, целлобиозы и который высших глюкозосодержащих полимеров, произведён Novozymes (Switzerland). Активные компоненты препарата легко растворимы в воде при всех концентрациях, встречающихся в обычной практике. Используется для разрушения целлюлозы для получения сбраживаемых сахаров, для уменьшения вязкости или для повышения выхода при экстракции ценных веществ растительного происхождения. Целюкласт соответсвует требованиям для пищевых ферментов FAO/WHO (JECFA – Объединенный комитет экспертов по пищевым добавкам) и (FCC – Кодекс пищевой химии) (Novozymes Switzerland AG; http: //www.novozymes.com). Основные продукты, получаемые при гидролизе целюлозы с помощью Целюкласта, – целлобиоза и глюкоза. (ВНИИ Синтез Белка) 99 Содержание глюкозы в ферментолизате составляло 15,2-15,3 г/л при общей сумме сахаров 35 г/л. Посевной материал Y.lipolytica № 15 выращивали в течение суток на полноценной среде Ридер, содержащей 10 г/л глюкозы в качестве источника углерода и энергии. Далее культуру оценивали на активность кислотообразования на трёх видах сред, состав которых приведен в таблице 23. В основу подготовки сред положены два основных принципа: избыток глюкозы и лимитирование роста клеток азотом. В качестве контрольной среды использовали среду Ридер (I) с лимитирующей концентрацией азота (NH4)2SO4 (N=67 мг/л) и очищенную глюкозу (15 г/л). Основные среды представляли ферментолизат с содержанием глюкозы, равном 15,3 г/л, и азота N, равном 80 мг/л (среда II) и 147 мг/л (среда III), соответственно. По мере потребления источника углерода, вносили дополнительно очищенную глюкозу (как указано в табл. 23), а также с целью увеличения биомассы продуцента в среду с ферментолизатом, в которую дополнительно вносили азот (NH4)2SO4 в количестве 0,3 г/л. Во всех трех средах содержание (г/л): MgSO4·7H2O - 0,7; Ca(NO3)2 – 0,4; NaCl – 0,5; KH2PO4 – 1,0; K2HPO4 – 0,1; Таблица 23. Состав исходных питательных сред для выращивания мутанта Y.lipolytica № 15 и синтеза ЛК Компонент среды Среда Ридер (I) Среда c ферментолизатом (II) 15,3 Среда c ферментолизатом (III) 15,3 Глюкоза (г/л) 15,0 Источник азота (N) (мг/л) MgSO4·7H2O(г/л) 67,0 80,0 147,0 0,7 0,7 0,7 Ca(NO3)2(г/л) 0,4 0,4 0,4 NaCl(г/л) 0,5 0,5 0,5 KH2PO4(г/л) 1,0 1,0 1,0 K2HPO4(г/л) 0,1 0,1 0,1 Микроэлементы по Буркгольдеру (мл/л) Дрожжевой экстракт «Difco» (г/л) Тиамин (мг/л) 10 10 10,0 0,5 0,5 0,5 0,1 0,1 0,1 100 микроэлементы по Буркгольдеру - 10 мл/л; дрожжевой экстракт «Difco» - 0,5; тиамин – 0,1. На 144 ч культивирования проводили определение биомассы, содержание ЛК и ИЛК. Глюкозу в составе ферментолизата вносили на 72 и 96 часов культивирования. Как видно из таблицы 24 на средах, содержаших ферментолизат и ферментолизат с добавлением азота биомасса была высокой и составила 7,45 и 7,6 г/л, соотвественно. В то время как на контрольной среде Ридер биомасса не превышала 2,8 г/л. В колбах, содержащих ферментолизат и ферментолизат с азотом синтез ЛК был несколько ниже, чем в колбах с контрольной средой Ридер и составил 11,9 (г/л), 13,7 (г/л) и 19,8 (г/л) соответственно (Таблица 24). Следует отметить, что соотношение ЛК:ИЛК на средах с ферментолизатом и ферментолизатом с азотом несколько лучше, чем на контрольной среде Ридер и составило 14,88:1; 13,7:1 и 11,62:1, соответственно. Наименьшее накопление побочного продукта (ИЛК) наблюдалось на среде с ферментолизатом и составило 0,8 г/л. Дальнейшая работа проводилась в ферментере АНКУМ-2М (СКБ, Пущино) объемом 2 л (с объемом питательной среды 800 мл). Дрожжи культивировались в периодическом режиме на минерально-солевой среде при 600 об/мин. Концентрация растворенного в среде кислорода поддерживалась на уровне 20-25%. рН среды во время синтеза ЛК поддерживался на уровне 4,5 путем подачи стерильного 20% -ного раствора NaOH. Культивирование проводили при температуре (29 0,5)oC. По мере потребления глюкозы, упаренный ферментализат вносили дробно порциями по 100 мл. Содержание глюкозы в среде после внесения ферментолизата составляло 10 г/л после 1-ой добавки и 17 г/л после 2-ой добавки. На рисунке 21 приведены кривые потребления азота из среды, глюкозы, накопления биомассы и синтеза ЛК у Y. lipolytica №15. Через 3 часа культивирования начиналось активное размножение клеток и в течение первых 24-х часов наблюдался значительный рост клеток при активном переходила в потреблении азота и глюкозы из среды. После 24 ч роста культура фазу замедления и стационарную фазу, вызванную лимитированием роста клеток азотом (содержание азота в среде не превышало 60 мг/л). В это время происходят глубокие изменения в обмене веществ дрожжей Y. lipolytica: снижается содержание белков и нуклеиновых кислот, увеличивается содержание липидов (Карклиньш, Лиепиньш, 1993). Как отмечается в многочисленных исследованиях по биосинтезу ЛК, исчерпание азота в среде приводит к снижению внутриклеточного содержания азота, которое 101 Таблица 24. Рост и кислотообразование Y.lipolytica №15 на различных средах Условия ЛК (г/л) ИЛК (г/л) ЛК:ИЛК YЛК (%) Среда Ридер (I) Среда (II) 19,8±1,85 1,7±0,15 11,62:1 44,11 Биомасса (г/л) 2,55±0,2 11,9±1,0 0,8±0,06 14,88:1 26,44 7,45±0,6 1,6 Среда (III) 13,7±1,2 1,0±0,09 13,7:1 30,44 7,6±0,7 1,8 P,гЛК/г б/м 7,61 стимулирует синтез ЛК у дрожжей Y. lipolytica (Shimisu et al., 1973; Anastassiadis et al., 2001; Anastassiadis, Rehm, 2005; 2006). Ильченко с соавторами было показано, что при глубоком дефиците азота синтез ЛК увеличивается в 2,5 – 3 раза (Ильченко с соавторами, 2001). Активный синтез ЛК начинался с 10-12 часов во время активного роста культуры. Следует отметить, что это нетипично для процессов сверхсинтеза ЛК у дрожжей Y. lipolytica №15 на очищенных субстратах. Максимальная удельная скорость роста дрожжей (μmax) для Y. lipolytica №15, составляла -1 0,16 ч . К концу ферментации (144 ч) мутант Y. lipolytica №15 накапливал 22,3 г/л (Рисунок 21). Накопления ИЛК не происходило. Выход ЛК от потребленного субстрата составил 48,9 %. Таким образом, результаты этих исследований показывают, что ферментолизат осины является перспективным источником углерода для роста дрожжей Y. lipolytica и синтеза лимонных кислот и требует дальнейших исследований. 3.9. Аминокислотный состав биомассы продуцента В задачу данного раздела работы входило определение содержания белка в биомассе мутанта дрожжей Y.lipolytica №15, выращенного на ферментолизате осины, а также анализ состава свободных и связанных аминокислот. Это было сделано для того чтобы определить полезно ли использовать отработанную биомассу дрожжей как добавку к кормам сельскохозяйственных животных. Белковый дефицит в мире может быть устранен с помощью пищевых продуктов, получаемых, в частности, из дрожжей. Микроорганизмы растут намного быстрее всех других организмов – источников пищи и более эффективно превращают сырье в конечные продукты. Они могут дать достаточное количество пищи за короткий срок. Белок дрожжей можно использовать как корм для сельскохозяйственных животных, а также как источник комплекса витаминов группы В. Белок одноклеточных способен конкурировать с другими источниками белка на рынке. 102 биомасса ЛК глюкоза азот 0,6 20 0,5 15 0,4 0,3 10 0,2 5 (NH4)+(г/л) Биомасса, ЛК, глюкоза (г/л) 25 0,1 0 0 0 24 48 72 96 120 144 время (ч) log X уд. скорость роста роста qp 1 Логарифм биомассы 0,8 0,15 0,6 0,4 0,1 0,2 0,05 0 0 24 48 72 96 -0,2 120 144 0 Удельная скорость роста (ч-1), удельная скорость синтеза ЛК qp (г/г ч) 0,2 время (ч) Рисунок 21. Биосинтез ЛК мутантным штаммом Y.lipolytica №15 в ферментере (ферментолизат) 103 Для определения аминокислотного состава в клетках дрожжей биомасса была лиофилизирована, затем к ней было добавлено 2 мл 80 % -ного подкисленного HCl этанола. Биомассу дрожжей выдерживали в течение 24 ч при комнатной температуре. Полученный экстракт центрифугировали, осадок удаляли, а супернатант исследовали на анализаторе аминокислот по методу (Moore et al., 1958). Результаты представлены в таблице 25. Исходя из таблицы 23 в биомассе дрожжей обнаружилось 16 аминокислот, общий пул которых составил 236,54 мг/г сухой биомассы. В аминокислотном составе в наибольшей концентрации присутствовал глутамин (37,79 мг/г), который образуется в результате прямого аминирования Таблица 25. Аминокислотный состав биомассы Y.lipolytica № 15 Связанная форма Свободная форма (мг/г) (мг/г) Глутамин 31,96 5,83 Общее количество свободных и связанных АК (мг/г) 37,79 Аспарагин 26,17 0,32 26,48 Лизин 18,67 0,58 19,25 Лейцин 22,83 0,33 25,16 Аланин 13,42 1,65 15,07 Треонин 15,63 0,38 16,01 Фенилаланин 12,77 следы 12,77 Серин 13,83 0,34 14,16 Валин 18,43 1,27 19,69 Изолейцин 12,17 0,26 12,88 Тирозин 10,15 следы 9,97 Гистидин 5,84 0,23 5,96 Метионин 4,62 не обнар. 4,62 Цистеин - - - ГАМК 0 0,36 0,36 Глицин 15,91 0,32 16,23 АК 104 α-кетоглутаровой кислоты. В мажорных концентрацях присутствовали аспарагин (26,48 мг/г), лейцин (25,16 мг/г), валин (19,69 мг/г), лизин (19,25 мг/г). Содержание аланина, треонина, фенилаланина, серина, изолейцина колебалось от 10 до 15 мг/г. Пул свободных аминокислот составил 11,7 % от общей суммы. В таблице 26 приведен сравнительный анализ состава аминокислот в биомассе дрожжей Y.lipolytica № 15, выращенных на гидролизате осины, с аминокислотным составом соевого белка. Сравнение дрожжевого белка с соевым показало, что состав аминокислот в обоих белках практически одинаков. Количество незаменимых аминокислот у дрожжей ниже, чем у сои в 3 раза. Однако, соевые протеины имеют Таблица 26. Сравнение аминокислотного состава биомассы дрожжей Y.lipolytica № 15 с аминокислотным составом сои 151,2 Аминокислотный состав дрожжей на ферментолизате (мг/г) 37,79 Аспарагин 15,9 26,48 Лизин 54,0 19,25 Лейцин 66,0 25,16 Аланин 44,0 15,07 Треонин 40,0 16,01 Фенилаланин 57,0 12,77 Серин 23,7 14,16 Валин 42,0 19,69 Изолейцин 47,0 12,88 Тирозин - 9,97 Гистидин 23,0 5,96 Метионин 20,0 4,62 Цистеин 4,9 - ГАМК 18 0,36 Глицин 45,0 16,23 АК (заменимые, незаменимые) Глутамин Аминокислотный состав сои (мг/г) 105 невысокую скорость абсорбции и содержат компоненты, которые препятствуют перевариванию и поглощению множества различных питательных веществ. Перевариваемость биомассы дрожжей составляет 90%, а растительных белков около 80%. Аминокислоты, входящие в состав белка усваиваются лучше, чем свободные аминокислоты (Промышленная микробиология, 1989). Таким образом, разнообразный аминокислотный состав продуцента представляет возможность использования этой биомассы в составе комбикормов. 106 ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящей работе природный штамм дрожжей Y. lipolytica ВКМ Y-2373 обрабатывали УФ-облучением и N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидином. После обработки мутагенами анализировали те чашки, где процент выживаемости подвергнутых мутагенному воздействию клеток составлял менее 1% в случае УФ и менее 25% в случае НГ. Под влиянием УФ и НГ были получены морфологически различные варианты. Для быстрого отбора желаемых вариантов была разработана рациональная схема отбора полученных мутантов. На первом этапе проводилась селекция на среде с ацетатом. Предполагалось, что сниженная способность к росту на ацетате обусловлена различными нарушениями в цикле трикарбоновых кислот, и блокировка цикла на уровне одного или нескольких ферментов могла бы приводить к сверхсинтезу цитрата клетками. В результате скрининга на средах с ацетатом среди 1500 мутантов было отобрано 16 вариантов. На втором этапе активные продуценты выявлялись на твердых средах с мелом или бромкрезолом в условиях лимитирования азотом при избытке глюкозы. В результате двухступенчатого отбора из 16 ацетат-негативных вариантов были отобраны 8 мутантов. С целью идентификации кислот, а также для проверки результатов, полученных методами селекции на твердых средах, проводили культивирование 8 мутантов в жидкой среде Ридер с глюкозой в условиях дефицита азота. Все мутанты синтезировали преимущественно лимонную кислоту. У трех мутантов продуктивность синтеза была в среднем на 23,0 % выше, чем у исходного штамма. Полученные данные показали эффективность применения ультрафиолетового облучения и нитрозогуанидина. В последующей работе для усиления действия мутагенов применили комбинированное воздействие УФ-облучением и N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидином, в результате которого было отобрано 1000 колоний, характеризующиеся сниженной скоростью роста на среде с глюкозой. Из них на среде с ацетатом селекционированы 27 мутантов, у которых кислотообразующая активность была выше, чем у природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y2373. Штаммы были проверены в жидкой среде и среди них обнаружены три мутанта, у которых продуктивность была выше на 43,9%, по сравнению с исходным штаммом Y. lipolytica ВКМ Y-2373. Последующая работа проводилась в ферментере с одним из наиболее активных вариантов - мутантом Y. lipolytica N 15. В результате исследований были изучены физиологические и биохимические особенности синтеза ЛК мутантом дрожжей Y. lipolytica №15 из различных источников углерода. 107 На полноценной минеральной среде с глюкозой мутант Y.lipolytica характеризуется более высокими значениями удельной скорости роста №15 (µ max) (0,31 ч-1), скорости потребления глюкозы (1,45 г/г), скорости потребления азота (0,042 г/г) и выходом биомассы (Yx/s) (53% от потребленной глюкозы) по сравнению с исходным штаммом Y.lipolytica ВКМ Y-2373. Интенсивный синтез кислот начинался после полного потребления азота и перехода культуры в фазу замедленного роста и далее – в стационарную фазу роста. Синтез кислот продолжался до тех пор, пока в среде присутствовала глюкоза. На 192 ч мутант синтезировал 100 г/л ЛК и 4,3 г/л ИЛК (Таблица 24). Продуктивность процесса биосинтеза ЛК (0,67 г/л ч) и выход YЛК (63%) у мутанта Y.lipolytica №15 соответствуют лучшим мировым показателям: при культивировании дрожжей C.lipolytica Y1095 и Y. lipolytica ATCC 20346 в условиях периодического режима с подпиткой в ферментере авторам удалось достичь концентраций 78,5 г/л и 69,0 г/л с выходами по биомассе 0,79 г/г и 0,52 г/г, соответственно (Rane and Sims, 1993; Moresi, 1994). Было показано, что продолжительность процессов кислотообразования в периодическом режиме ограничена. В связи с этим были изучены возможности применения различных способов культивирования дрожжей, ведущих к увеличению длительности биосинтеза и эфективности кислотообразования. С целью увеличения продолжительности микробиологических процессов при получении метаболитов, экскретируемых в культуральную жидкость был использован биореактор с выносным спиральным мембранным модулем, что позволило увеличить время ферментации до 480 ч. Интенсивное кислотообразование (39-32,8 г/л) наблюдалось до 300 ч (Таблица 24). Концентрация ИЛК составляла менее 4 % от суммы кислот. После 300 ч наблюдалось снижение синтеза ЛК. Снижение образования ЛК не связано с повышением ее концентрации в культуральной жидкости, а скорее всего со снижением метаболической активности клеток. Наиболее эффективным для продолжительного стабильного процесса биосинтеза ЛК является отъемно-доливной метод, при котором производился отъем культуральной жидкости через определенные промежутки времени, и в ферментер добавлялась свежая питательная среда с содержанием всех компонентов, в том числе и азота, в количестве, достаточном для возобновления клеточного роста. При проведении экспериментов варьировали количеством доливаемой среды и длительностью циклов, в каждом из которых культивирование осуществляли в периодическом режиме. У Y.lipolytica №15 в условиях продолжительного культивирования в отъемно-доливном режиме накопление ЛК составило 68,1-69,4 г/л в течение 53 суток (Таблица 24). 108 Таблица 24. Синтез ЛК из глюкозы у мутанта Y. lipolytica №15 при разных условиях культивирования Режим Время (ч) ЛК (г/л) ИЛК (г/л) Y (%) СЛК (г/л·ч) Периодический 192 100 4,3 63,0 0,27 Мембранный модуль Отъемнодоливной 300 40,0-32,1 1,56-1,31 77,0 0,47 1280 68,1-69,4 2,6-2,8 52,0 0,25 В последнее время, в связи с экономным отношением к растительным ресурсам в высокоразвитых странах возобновляемое (дешевое) растительное сырье становится главным объектом исследований и разработок комплексных и экологически чистых технологий в продукты, используемые в различных областях промышленности; разрабатываются процессы микробиологического получения белка и липидов, аминокислот и органических кислот. В патентной и научной литературе мало сведений о биосинтезе ЛК из растительного сырья. В ряде стран (США, Польша, Греция) предпринимаются попытки разработать процесс получения ЛК из глюкозо-содержащих гидролизатов древесных отходов c помощью мутантных штаммов Y. lipolytica. Эти работы не привели к положительным результатам в связи с тем, что биохимический механизм синтеза кислоты до конца не изучен. Имеются единичные сведения о биосинтезе ЛК у Y. lipolytica из растительных масел. В настоящей работе также была проведена проверка способности мутанта Y.lipolytica №15 расти на средах с рапсовым маслом и с ферментолизатом осины. Дрожжи Y. lipolytica № 15 в конце культивирования с рапсовым маслом (192 ч) накапливали 175,0 г/л ЛК, в то время как содержание ИЛК было незначительно (5,6 г/л), соотношение ЛК к ИЛК составляло 32 : 1. Для сравнения, природный штамм Y. lipolytica ВКМ Y-2373 показывал подобную динамику накопления лимонных кислот. Однако, к концу культивирования в среде накапливалось 87 г/л ЛК и 72 г/л ИЛК, соотношение ЛК:ИЛК составило 1,21:1. Следует отметить, что нам впервые в мире удалось достичь таких высоких показателей преимущественного биосинтеза ЛК из растительных масел с использованием мутанта дрожжей Y. lipolytica. В работе были получены приоритетные данные о возможности биосинтеза ЛК из глюкозо-содержащих гидролизатов древесных отходов. В среде с ферментолизатом осины дрожжи Y. lipolytica № 15 накапливали 22,3 г/л ЛК с выходом от глюкозы 48,9 %. Кроме того биомасса продуцента Y. lipolytica № 15 характеризовалась повышенным содержанием белка и имела сходный с соевым белком аминокислотный состав. В наибольшей концентрации присутствовал глутамин (37,79 мг/г), в мажорных концентрацях аспарагин (26,48 мг/г), лейцин 109 (25,16 мг/г), валин (19,69 мг/г), лизин (19,25 мг/г). Содержание аланина, треонина, фенилаланина, серина, изолейцина колебалось от 10 до 15 мг/г. Пул свободных аминокислот составил 11,7 % от общей суммы. Разнообразный аминокислотный состав также дает возможность использовать биомассу продуцента в качестве добавки к комбикормам. Таким образом, был селекционирован высокоактивный мутантный штамм Y. lipolytica N 15, способный продуцировать ЛК из глюкозы и современных возобновляемых субстратов (глюкозосодержащих отходов, растительных масел) в концентрациях, достаточных для реализации в промышленном производстве и соответсвующих мировым показателям. Апробация процессов биосинтеза ЛК дрожжами Y. lipolytica №15 на средах с глюкозой, рапсовом масле и ферментолизатом осины была проведена на базе опытной технологической установки ИБФМ РАН и Вроцлавского Университета биологических наук и окружающей среды (Польша). Процессы биосинтеза проводились в ферментерах объемом 2-10 л. 110 ВЫВОДЫ 1. При обработке Y.lipolytica ВКМ Y-2373 ультрафиолетом и N-метил-N-нитро-N- нитрозогуанидином отобрано 3 мутанта, характеризующихся более высокой (на 23,0%), чем исходный штамм биосинтетической активностью. При дополнительном комбинированном воздействии мутагенов селекционирован высокоактивный мутант Y. lipolytica № 15, у которого биосинтетическая активность в среде с глюкозой на 44% выше, чем у исходного штамма. 2. Для быстрого отбора мутантов разработаны селективные среды с цитратом и ацетатом, а также экспресс-методы для выявления активных продуцентов на твердых средах с мелом и бромкрезоловым зеленым, включавшие лимитирующую концентрацию аминного азота и избыток глюкозы. 3. В среде с глюкозой мутант Y. lipolytica № 15 в условиях периодического культивирования синтезировал лимонную кислоту с продуктивностью мирового уровня - 100 г/л. Для мутанта показана принципиальная возможность продолжительного активного биосинтеза ЛК с применением мембранного модуля (20 суток) и режима отъемов-доливов (53 суток). 4. Впервые обнаружена способность дрожжей Y. lipolytica к сверхсинтезу ЛК из ферментолизатов древесных отходов. Установлено, что биомасса продуцентов характеризуется высоким содержанием белка и незаменимых аминокислот и может применяться в качестве обогатителя комбикормов. 5. Разработан способ получения ЛК из рапсового масла с помощью мутанта Y. lipolytica № 15 с продуктивностью, превосходящей мировой уровень, цитрат:изоцитрат 32:1, выход 150%. 175 г/л ЛК, соотношение 111 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ ИЛК – трео-DS-изолимонная кислота КГК – α-кетоглутаровая кислота ЛК – лимонная кислота ЦТК – цикл трикарбоновых кислот Р – продуктивность биомассы, г ЛК/г клеток YЛК – выход ЛК от потребленного субстрата, % YX/S – выход биомассы, % μ – удельная скорость роста, ч-1 μmax – максимальная удельная скорость роста, ч-1 qЛК – удельная скорость синтеза, г ЛК/ г биомассы· ч СЛК – объемная продуктивность процесса биосинтеза ЛК, г/л·ч ηЛК – энергетический выход, % УФ – ультрафиолетовое облучение НГ – N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидин НММ – нитрозометилмочевина НДММ – нитрозодиметилмочевина ЦС – цитрат-синтаза АГ – аконитат-гидратаза НАД-ИЦДГ – никотинамиддинуклеотид-изоцитратдегидрогеназа НАДФ-ИЦДГ – никотинамиддинуклеотидфосфат-изоцитратдегидрогеназа ГЛЦ – глиоксилатный цикл ИЛ – изоцитрат-лиаза МС – малат-синтаза ГК – глицеролкиназа Г-3-ФДГ – глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа НДЭМ – нитрозодиэтилмочевина НЭМ – нитрозометилмочевина СМС – синтетические моющие средства ЛПК – лесопромышленный комплекс 112 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Получение дрожжей Candida lipolytica – активных продуцентов лимонной кислоты // Микробиология. 1993. Т. 62. В. 2. С. 243-248. 2. Агаджанян А.Е., Арзуманов Е.Н., Самойленко В.А., Мовсесян Р.А., Финогенова Т.В., Хачанов Д.Г. Способ получения лимонной кислоты из растворов щелочных цитратов. 2000. Авторское свидетельство RU (11) 96119371. 3. Акименко В.К. Альтернативные оксидазы микроорганизмов / 1989. М.: Наука. C. 262. 4. Акименко В.К., Меденцев А.Г. О появлении цианидрезистентного дыхания у дрожжей Candida lipolytica // Микробиология. 1989. Т. 45. С.146-150. 5. Акименко В.К., Головченко Н.П. Об отсутствии сопряжения между переносом электронов по альтернативному пути цианидрезистентных и образованием мембранного потенциала // Биохимия. 1989. Т. 43. С. 935-936. 6. Акименко В.К., Финогенова Т.В.. Ермакова И.Т., Шишканова Н.В. Цианидрезистентное дыхание у Candida lipolytica и сверхсинтез лимонных кислот // Микробиология. 1989. Т. 48. С. 632-638. 7. Андреева Е.А., Лирова С.А., Перевезенцев В.П. Влияние величины рН на свойства хемостатной культуры Candida utilis // Прикладная биохимия и микробиология. 1975. Т. 11. № 3. С. 317-321. 8. Арзуманов Т.Е. Биосинтез лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica: дисс. канд. биол. наук: 03.00.23. Пущино: ИБФМ РАН. 1998. С. 110. 9. Буткевич В.С., Тимофеева А.Г. Влияние отдельных минеральных элементов питательной среды на образование кислот грибом Aspergillus niger // Микробиология. 1935. Т. 4. № 4. С. 489-494. 10. Вислоух В.А., Чаплина Л.Б., Воробьева Г.И. К вопросу о влиянии различных концентраций магния в среде с углеводородами на качественный и зольный состав дрожжей Candida guilliermondii и их морфологию // Микробиологическая промышленность. 1972. № 4. С. 810. 11. Глазунова Л.М., Финогенова Т.В. Активность ферментов цитратного, глиоксилатного и пентозофосфатного циклов при синтезе лимонных кислот Candida lipolytica // Микробиология. 1976. Т. 35. № 3. С. 444-449. 12. Гордон И.О. Игнатьева Л.И. Минина В.С., Андрусенко М.Я. Лимонная кислота - ценный продукт микробиологического синтеза // Микробиологическая промышленность. 1979. В. 5. С.15-18 13. Дебабов В.Г. Биотопливо // Биотехнология. 2008. № 1. С. 3-14. 113 14. Ермакова И.Т. Условия и механизм биосинтеза α-кетоглутаровой кислоты при росте дрожжей Candida lipolytica на н-алканах: автореф. дисс. канд. биолог. наук: 096. Пущино: ИБФМ АН СССР. 1971. С.157. 15. Ермакова И.Т. Определение активности карбоксилирующих ферментов в клетках Candida lipolityca при росте на глюкозе и гексадекане // Микробиология. 1985. Т. 54. В. 4. С. 572576. 16. Ермакова И.Т., Ермоленко тиаминауксотрофными Е.А., дрожжевыми Финогенова организмами Т.В. при Биосинтез использовании α-кетокислот различных источников углерода // Прикладная биохимия микробиология. 1986. Т. 22. №. 3. С. 341-347. 17. Ермакова И.Т., Мандева Р.Д. Экскреция метаболитов дрожжами родов Torulopsis, Pichia, Debariomyces, Hansenula при лимитировании их роста источниками N, P, S или Mg // Микробиология. 1981. Т. 50. № 4. С. 476-481. 18. Жаболовская Н.А., Агеев Л.М., Петрова Л.Ф. Сравнительная оценка методов количественного определения лимонной кислоты // Хлебопекарная и кондитерская промышленность. 1968. № 5. С. 22-24. 19. Зякун А.М., Муслаева И.Н., Ашин В.В., Пешенко В.П., Аданин В.М., Машкина Л.П., Матяшова Р.Н., Финогенова Т.В. Гетеротрофная фиксация углекислоты Candida lipolytica и ее роль в биосинтезе лимонной кислоты // Микробиология. 1992. Т. 61. № 4. С. 561-570. 20. Иерусалимский Н.Д., Андреева Е.А., Лирова С.А., Ермакова И.Т. Окисление углеводородов дрожжами // Прикладная биохимия и микробиология. 1965. Т. 1. С.601-605. 21. Илларионова В.И., Финогенова Т.В., Глазунова Л.М. Изучение влияния условий культивирования на образование лимонной и изолимонной кислот Candida lipolytica на среде с гексадеканом. // Прикладная биохимия и микробиология. 1975. Т. 11. С. 172-178. 22. Илларионова В.И. Синтез лимонной и изолимонной кислот алкан-окисляющими дрожжами Candida lipolytica // Автореферат дисс. канд. биол. наук: 03.00.07. Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР. 1977. С. 120. 23. Ильченко А.П., Шишканова Н.В., Чернявская О.Г., Финогенова Т.В. Роль концентрации кислорода в регуляции ферментов центрального метаболизма и биосинтеза лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica при росте на этаноле // Микробиология. 1998. Т. 67. № 3. С. 293-297. 24. Ильченко А.П., Чернявская О.Г., Шишканова Н.В., Финогенова Т.В. Особенности метаболизма дрожжей Yarrowia lipolytica при синтезе из этанола α-кетоглутаровой и лимонной кислоты. Влияние [NH4+] и [O2] на синтез и дыхание // Микробиология. 2001. Т. 70. № 2. С. 189-195. 114 25. Ильченко А.П., Чернявская О.Г., Шишканова Н.В., Финогенова Т.В. Особенности метаболизма дрожжей Yarrowia lipolytica при синтезе α-кетоглутаровой и лимонной кислоты. Сравнительное изучение функционирования ферментов центрального метаболизма // Микробиология. 2002. Т. 71. №. 3. С. 316-322. 26. Камзолова С.В. Биосинтез лимонных кислот дрожжами Yarrowia lipolytica N 1 из этанола в условиях непрерывного культивирования: дисс. канд. биол. наук: 03.00.23. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН. 1995. С. 155. 27. Камзолова С.В., Чистякова Т.И., Дедюхина Э.Г., Шишканова Н.В., Финогенова Т.В. Исследование влияния температуры, pH и концентрации этанола на максимальную удельную скорость роста и состав биомассы мутантного штамма Yarrowia lipolytica N1 // Микробиология. 1996. Т. 65. № 2. С. 202-207. 28. Камзолова С.В., Финогенова Т.В., Лунина Ю.Н., Перевозникова О.А., Миначова Л.Н., Моргунов И.Г. Особенности роста на рапсовом масле и синтеза лимонной и изолимонной кислот у дрожжей Yarrowia lipolytica // Микробиология. 2007. Т. 76. № 1. С. 26-32. 29. Карклиньш Р.Я., Лиепиньш Г.К. Микробный биосинтез лимонной кислоты. Рига: Зинатне, 1993. С. 239. 30. Катаева И.А., Ермакова И.Т., Финогенова Т.В. Активности тиаминзависимых ферментов у дрожжей Candida lipolytica при росте на глюкозе в условиях избытка и недостатка тиамина // Микробиология. 1986. Т. 55. В. 4. С. 559-563. 31. Катаева И.А., Финогенова Т.В. Активность ферментов основных путей обмена глюкозы в клетках тиаминдефицитных дрожжей Candida lipolytica при синтезе кетокислот // Биохимия. 1987. Т. 52. № 5. С.850-855. 32. Клесов А.А., Григораш С. Ю. Ферментативный гидролиз целлюлозы. III.Закономерности образования глюкозы и целлобиозы при действии полиферментных целлюлазных систем на нерастворимую (природную) целлюлозу // Биоорганическая химия. 1981. Т. 7. № 10. С. 1538-1552. 33. Козлова Т.М., Медведева Г.А., Глазунова Л.М., Финогенова Т.В. О структурных изменениях клеток Candida lipolyitca при биосинтезе лимонной кислоты // Микробиология. 1982. Т. 51. С. 508-514. 34. Кондрашова М.Н. Структурно-функциональная организация Цикла трикарбоновых кислот // Биохимия. 1991. Т.56. № 3. С. 388-404. 35. Кондрашова М.Н. Гормоноподобное действии янтарной кислоты // Вопр. биол. мед. фармац. химии. 2002. Т. 1. С. 7. 115 36. Коротченко Н.И., Самохина О.В. Влияние концентрации магния в культуральной среде на потребление дрожжами микроэлементов // Прикладная биохимия и микробиология. 1975. Т .2. № 6. С. 873-875. 37. Котельникова, А.В., Звягильская, Р.Я. Особенности регуляции цикла трикарбоновых кислот у дрожжей и других микроорганизмов // Успехи биологической химии. 1979. В. 20. C. 214-228. 38. Кулаковская Т.В., Матяшова Р.Н., Шишканова Н.В., Финогенова Т.В., Окороков Л. Изменение транспортных активностей вакуолей дрожжей Yarrowia lipolytica в процессе роста на глюкозе // Микробиология. 1993. Т. 62. В. 4. С. 647-653. 39. Лирова О.А., Шуманн Е., Штрунк К., Хаврячев М.П., Работнова И.Л. Влияние неблагоприятных для роста значений рН среды на физиологические, морфологические и цитологические особенности хемостатной культуры Candida utilis // Микробиология. 1978. Т. 47. № 3. С. 414-423. 40. Лозинов А.Б., Финогенова Т.В. Микробиологический синтез органических кислот из углеводородов нефти // Журнал ВХО им. Д.И.Менделеева. 1972. Т. 17. С. 526-532. 41. Лозинов А.Б., Финогенова Т.В., Глазунова Л.М., Илларионова В.И. Лимитирование роста культуры Candida lipolytica и сверхсинтез некоторых метаболитов // Микробиология. 1974. Т. 43. В. 5. C. 786-790. 42. Лозинов А.Б., Глазунова Л.М. Ермакова, И.Т. Активность ферментов цитратного, глиоксилатного и пентозофосфатного циклов при росте дрожжей на гексадекане и глюкозе // Микробиология. 1976. Т. 35. С. 33-39. 43. Мандева Р.Д. Сверхсинтез метаболитов при лимитировании роста дрожжевых культур. Дисс. канд. биол. наук: Пущино: НЦБИ АН СССР ОНТИ ПНЦ РАН. 1981.С. 144. 44. Мандева, Р.Д., Ермакова, И.Т., Мельникова, О.Ф., Финогенова, Т.В., Лозинов, А.Б. Условия и динамика экскреции цитрата, изоцитрата и полиолов при росте дрожжей на глюкозе // Микробиол. 1981. В. 50. C. 636-644. 45. Матяшова Р.Н. Влияние концентрации растворенного в среде кислорода на рост и дыхание дрожжевых организмов и бактерий рода Pseudomonas : автореферат дисс. канд. биол. наук: Пущино: ИБФМ АН СССР. 1978. С. 159. 46. Миллер. Дж. Эксперименты в молекулярной генетике / Под. ред. С.И. Алиханяна. М.: Мир. 1976. С. 436. 47. Моргунов И.Г., Ильченко А.П., Шарышев А.А. Ферменты метаболизма глицерина у дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica // Биохимия. 1991. Т. 56. № 2. С. 258-266. 48. Моргунов И.Г. Метаболическая организация дрожжей Yarrowia lipolytica – продуцентов органических кислот: докт. диссертация: 03. 00. 04. Пущино: ИБФМ РАН. 2009. С. 281. 116 49. Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / Ред. Работновой И.Л. Москва: «Мир». 1978. С. 331. 50. Продиндустрия. Обзор рынка лимонной кислоты. 2005. № 5. 51. Промышленная микробиология / Ред. Егорова Н.С. - Москва: «Высшая школа».1989. С. 688. 52. Работнова И.Л. Некоторые данные о закономерностях роста микроорганизмов // Журнал общей биологии. 1972. Т.33. №5. С. 539-553. 53. Работнова И.Л. Физиологическая изменчивость микроорганизмов и ее регуляция // Успехи микробиологии. 1975. Т.10. С. 120-131. 54. Работнова И.Л., Иванова И.И. Рост и развитие микробных культур // Успехи микробиологии. 1971. T. C.67-107. 55. Сахарова З.Р., Работнова И.Л. Физиолого-биохимические свойства хемостатной культуры Bacillus megaterium при различных значениях рН // Микробиология. 1977. Т. 46. В. 4. С.1522. 56. Смирнова З.С., Рябчук В.А., Гавриленко С.А. Влияние условий культивирования на содержание и аминокислый состав белка метанотрофных бактерий // Прикладная биохимия и микробиология. 1982. Т. 18. В. 1. С. 23-29. 57. Солодовникова, Н.Ю. Роль нуклеотидов в регуляции процессов сверхсинтеза органических кислот у дрожжей Yarrowia lipolytica: дисс. канд. биол. наук: 03.00.04. Пущино: ИБФМ РАН. 1998. С. 104. 58. Соколов Д.М., Солодовникова Н.Ю., Шарышев А.А., Финогенова Т.В. Роль НАДзависимой изоцитратдегидрогеназы в биосинтезе лимонной кислоты у дрожжей // Прикладная биохимия и микробиология. 1995. Т. 31. № 3. С. 315-320. 59. Соколов Д.М., Солодовникова Н.Ю., Шарышев А.А., Финогенова Т.В. Роль фосфофруктокиназы в регуляции синтеза лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. С. 315-319. 60. Соом Я.О., Симаров Б.В. Исследования по генетике. Л.: ЛГУ. 1971. № 4. С. 110. 61. Фатыхова А.Р. Биосинтез лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica из глицеринсодержащих отходов производства биодизельного топлива: дисс. канд. биол. наук: 03.01.06. 2011. Пущино: ИБФМ РАН. С. 139. 62. Фаусек Е.А. Физиолого-биохимические особенности биосинтеза изолимонной кислоты дрожжами из этанола: автореферат дисс. канд. биол. наук: 03.00.07. ОНТИ НЦБИ АН СССР. 1991. С. 191. 117 63. Финогенова Т.В., Мунтян Л.Н., Лозинов А.Б. Относительные потребности в тиамине дрожжей рода Candida, выращиваемых на углеводном и углеводородном питании // Микробиологический синтез. 1969. Т. 7. С. 26-30. 64. Финогенова Т.В., Илларионова В.И., Лозинов А.Б. Образование лимонных кислот дрожжами С. lipolytica при росте на н-алканах // Микробиология. 1973. Т. 42. С. 790-794. 65. Финогенова Т.В., Гринчак А.В., Илларионова В.И., Шишканова Н.В. Биосинтез лимонной и изолимонной кислот природным и мутантным штаммами Candida lipolytica на средах c различными источниками углерода // Прикладная биохимия и микробиология. 1979. Т. 15. № 6. С. 811-816. 66. Финогенова Т.В. Биосинтез органических кислот дрожжевыми организмами и его регуляция: докт. диссертация: 03.00.07. ИБФМ АН СССР, Пущино. 1982. С. 243. 67. Финогенова Т.В., Глазунова Л.М. Активность ферментов цитратного и глиоксилатного циклов при синтезе лимонной и изолимонной кислот различными штаммами Candida lipolytica // Микробиология. 1982. Т. 51. В 1. С. 27-33. 68. Финогенова Т.В., Моргунов И.Г., Камзолова С.В., Чернявская О.Г. Перспективы производства органических кислот дрожжами Yarrowia lipolytica // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. Т. 41. № 5. C. 478-486. 69. Финогенова Т.В., Пунтус И.Ф., Камзолова С.В., Лунина Ю.Н., Монастырская С.Е., Моргунов И.Г., Боронин А.М. Получение мутантных штаммов Yarrowia lipolytica – продуцентов лимонной кислоты из глюкозы // Прикл. биохим. микробиол. 2008. Т. 44. N 2. С. 197-202. 70. Финогенова, Т.В., Шишканова, Н.В., Катаева, И.А. Сравнительное изучение дрожжей C.lipolytica с различной способностью продуцировать цитрат // Микробиология. 1989. Т. 58. В. 3. C. 387 – 392. 71. Фостер Д. Химическая деятельность грибов / М.: Иностранная литература. 1950. С. 112. 72. Шишканова Н.В. Получение мутантов дрожжей Candida lipolytica 704 // Прикладная биохимия и микробиология. 1979. Т. 15. №. 4. С. 555-559. 73. Щербакова Е. Я. Изменчивость и селекция A.niger – продуцента лимонной кислоты под влиянием химических мутагенов, СПб.: ЛНИИПП. 1971. Т. 1. C. 3-5. 74. Юсупова А.И. Биосинтез янтарной кислоты дрожжами из этанола: дисс. канд. биол. наук: 03.01.06. Пущино: ИБФМ РАН. 2011. С. 124. 75. Aiba S., and Matsuoka M. Identification of metabolic model: Citrate production from glucose by Candida lipolytica // Biotechnology and Bioengineering. 1979. V. 21. P. 1373-1386. 76. Akiyama S. Fermentative production of citric acid from n- paraffins // Journal of Japan Oil Chemists Society. 1974. V. 23. P. 438-444. 118 77. Akiyma S.I., Suzuki T., Sumino Y., Nakao Y., and Fukuda H. Induction and citric acid productivity of fluoroacetate-sensitive mutant strains of Candida lipolytica // Agriculturul and Biological Chemistry. 1973а. V. 37. № 4. P. 879-884. 78. Akiyma S.I., Suzuki T., Sumino Y., Nakao Y., and Fukuda H. Relationship between aconitase hydratase activity and citric acid productivity in fluoroacetate-sensitive mutant strain of Candida lipolytica // Agriculturul and Biological Chemistry. 1973b. V. 37. P. 885-888. 79. Anastassiadis S. Zymotiki methodos gia tin sinechi paragogi tou kitrikou oxeos; Process for the continuous production of citric acid by fermentation // Greek Patent. 1994. № 940100098. 80. Anastassiadis S., Aivasidis A., Wandrey Ch. Fermentationsverfahren zur kontinuierlichen Citronensäuregewinnung. Process for the continuous production of citric acid by fermentation // Austrian Patent. 1994. № 473/94. 81. Anastassiadis S., Wandrey C. Process for the continuous production of citric acid by fermentation // US Patent. 2001. № 08/208,123. P. 81-87. 82. Anastassiadis S., Aivasidis A., Wandrey C. Citric acid production by Candida oleophila under intracellular nitrogen limitation // Applied Microbiology and Biotechnology. 2002. V. 60. № 1. P. 81-87. 83. Anastassiadis S., Rehm H.J. Continuous citric acid secretion by a high specific pH dependent active transport system in yeast Candida oleophila ATCC 20177 // Electronic Journal of Biotechnology. 2005. V. 8. № 2. P. 147-162. 84. Anastassiadis S., Rehm H.J. Citric acid production from glucose by yeast Candida oleophila ATCC 20177 under batch, continuous and repeated batch cultivation // Electronic Journal of Biotechnology. 2006. V. 9. № 1. P. 26-39. 85. Anastassiadis S., Morgunov I.G., Kamzolova S.V., Finogenova T.V. Citric acid production patent review // Recent patents on biotechnology. 2008. V. 2. № 2. P. 107–123. 86. Anastassiadis S, Kamzolova S.V., Morgunov I.G. and Rehm. Comparative study of the effect of iron on citrate-producing yast growing on different substrates // In: Сommunicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology. Eds. Antonio MendezVilas. 2007. V. 1. P. 308-314. 87. Anfinsen Ch.B. Akonitase from pig heart muscle // In: Methods in enzymology. Eds. Colowics S.P., Kaplan N.O., N.Y. L.: Acade. Press. 1955. V.1. P. 695-698. 88. Arikawa Y., Kuroyanagi T., Shimosaka M., Muratsubaki H., Enomoto K., Kodaira R., Okazaki M. Effect of gene descriptions of TCA cycle on the production of succinic acid in Saccharomyces cerevisiae // Journal of bioscience and bioengineering. 1999. V. 87. № 1. P. 28-36. 119 89. Arzumanov T.E., Shishkanova N.V., Finogenova T.V. Biosynthesis of citric acid by Yarrowia lipolytica repeated-batch culture on ethanol // Applied Microbiology and Biotechnology. 2000. V. 53. № 5. P. 525–529. 90. Arzumanov T.E., Sidorov I.A., Shishkanova N.V., Finogenova T.V. Mathematic modeling of citric acid production by repeated-batch culture // Enzyme and Microbial Technology. 2002. V. 26. № 9. P. 826–833. 91. Ashkan, T. N., Adeli, M., Vossoughi, M. Synthesis of gold nanoparticle necklaces using linear– dendritic copolymers // European Polymer Journal. 2010. V. 48. № 2. P. 165-170. 92. Aurich A, Förster A, Mauesberger S, Barth G, Stottmeister U. Citric acid production from renewable resources by Yarrowia lipolytica. Journal of Bacteriology. 2003. V. 183. P. 5102-5109. 93. Farid M., Bal'a A., Marshall D. L. Organic acid dipping of catfish fillets: Effect on color, microbial load and Listeria monocytogenes // Journal of Food Protection. 1998. №. 11. P. 1470– 1474. 94. Barth G., Gaillardin C. Yarrowia lipolytica // In: Nonconventional Yeasts in Biotechnology. Eds. Springer Berlin Heidelberg. 1996. P. 313–388. 95. Barth G., Gaillardin C. Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica // FEMS Microbiology Reviews. 1997. V. 19. №. 4. P. 219-237. 96. Barth G., Weber H. Improved conditions for mating of the yeast Saccharomycopsis lipolytica // Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie. 1984. V. 24. №. 6. P. 403-405. 97. Bassel J., Mortimer R.K. Genetic and biochemical studies on n-alkane non-utilizing mutants of Saccharomycopsis lipolytica // Current genetics. 1982. V.5. №. 2. P. 77-88. 98. Bati N., Hammond E.G., Glatz B.A. Biomodification of fats and oils: Trials with Candida lipolytica // Journal of the American Oil Chemists’ Society. 1984. V. 61. №. 11. P. 1743-1746. 99. Behrens U., Weissbrodt E, and Lehmann W. Zur Kinetik der Citronens urebildung bei Candida lipolytica // Zeitschrift fur Allgemeine Mikrobiologie. 1978. V. 18. № 8. P. 549-558. 100. Berovic M., Legisa M. Citric acid production // Biotechnology annual review. 2007. V. 13. P. 303-343. 101. Boehringer-Mannheim Biochemicals catalog. 1995. 102. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analytical biochemistry. 1976. V. 72. №. 1. P. 248-254. 103. Briffaud J. and Engasser M. Citric acid prodaction from glucose. I. Growth and excretion kinetics in a stirred fermenter // Biotechnology and Bioengineering. 1979. V. 21. №. 11. P. 2083-2092. 104. Burkholder P.R., Mc Veigh J., Moyer D. Studies on some growth factors of yeasts // Journal of bacteriology. 1944. V. 48. №. 4. P. 385-389. 120 105. Carole T.M., Pellegrino J., Paster M.D. Opportunities in the industrial biobased products industry //In: Proceedings of the Twenty-Fifth Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals. Eds. Humana Press, 2004. P. 871-885. 106. Cervantes-Chávez J. A., Kronberg F., Passeron S., Ruiz-Herrera J. Regulatory role of the PKA pathway in dimorphism and mating in Yarrowia lipolytica // Fungal Genetics and Biology. 2009. V. 46. №. 5. P. 390-399. 107. Chang H.N., Chung B.H. US Patent. 1990. № 4910139. 108. Christopher H. S., Xuetong F., Hand A. P., Kimberly, B. S. Effect of citric acid on the radiation resistance of Listeria monocytogenes and frankfurter quality factors // Meat Science. 2003. V. 63. №. 3. P. 407–415. 109. Dilara O., Wayne P. Fungal generation of organic acids for removal of lead from contaminated soil // Water, Air, and Soil Pollution. 2007. V. 179. №. 1-4. P. 365–380. 110. Dixon G.H., Kornberg H.L. Assay methods for key enzymes of the glyoxylate cycle // Biochemical Journal. 1959. V. 72. Р. 3. 111. Domínguez A., Fermiñán E., Gaillardin C. Yarrowia lipolytica: an organism amenable to genetic manipulation as a model for analyzing dimorphism in fungi // In: Ernst, J.F., Schmidt, A. (Eds), Dimorphism in human pathogenic and apathogenic yeast. Karger, Basel, 2000. Р. 151-172. 112. Enzminger J.D., Asenjo J.A. Use of cell recycle in the aerobic fermentative production of citric acid by yeast // Biotechnology Letters. 1986. V. 8. № 1. P. 7-12. 113. Ermakova I.T., Shishkanova N.V., Melnikova O.F., Finogenova T.V. Properties of Candida lipolytica mutants with the modified glyoxilate cycle and their ability to produce citric and isocitric acid. 1. Physiological, biochemicaj and cytological characteristics of mutants grown on glucose or hexadecane // Applied Microbiology and Biotechnology. 1986. V. 23. №. 5. P. 372377. 114. Evans C.T., Ratledge C. The physiological significance of citric acid in the control of metabolism in lipid-accumulating yeasts // Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 1985. V. 3. №. 1. P. 349-376. 115. Finogenova T.V., Kamzolova S.V., Dedyukina E.G., Il’chenko A.P., Morgunov I.G., Chernyavskaya O.G., Sokolov A.P. Biosynthesis of citric and isocitric acids from etanol by munant Yarrowia lipolytica №1 under continuous cultivation // Applied Microbiology and Biotechnology. 2002. V. 59. № 4-5. P. 493-500. 116. Finogenova T.V., Shishkanova N.V., Ermakova I.T., Kataeva I.A. Properties of Candida lipolytica mutans with modified glyoxylate cycle and their ability to produce citric and isocitric acid. II. Synthesis of citric and isocitric acid by C. lipolytica mutants and peculiarities of their enzyme systems // Applied Microbiology and Biotechnology. 1986. V. 23. №. 5. P. 378 – 383. 121 117. Finogenova T.V., Shishkanova N.V., Fausek E.A., Eremina C.C. Biosynthesis of isocitric acid from ethanol by yeast // Applied Mikrobiology and Biotechnology. 1991. V. 36. №. 2. P . 231235. 118. Flores C.L., Martínez-Costa O.H., Sánchez V., Gancedo C., Aragón J.J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene // Microbiology. 2005. V. 151. №. 2. P. 1465-1474. 119. Fujitani T. Biochemical studies on the mineral components in sake yeast: Part I. The requirements of phosphorus potassium and magnesium by the yeast // Agricultural and Biological Chemistry. 1965. V. 29. № 5. P. 477-485. 120. Furukawa T., Matsuyoshi T., Minoda Y., and Yamada K. Fermentative production of citric acid from n-paraffins by yeast // Journal of Fermentation Technology. 1977. V. 55. №. 4. P. 356-363. 121. Gaillardin C., Heslot H. Genetic engineering in Yarrowia lipolytica // Journal of basic microbiology. 1988. V. 28. №. 3. P. 161-174. 110. Gallmetzer M., Meraner J., Burgstaller W. Succinate synthesis and excretion by Penicilliumsimplicissimum under aerobic and anaerobic condition // FEMS Microbiology Letters. 2002. V. 210. P. 221-225. 122. Gledhill W.E., Hill I.D., Hodson P.H. Citrate production from hydrocarbons by use of a nonsterile, semicontinuous cell recycle system // Biotechnology and Bioengineering. 1973. V. 15. №. 5. P. 963–972. 123. Good D.W., Droniuk R., Lawford R.G., Fein J.E. Isolation and characterisation of a Saccharomycopsis lipolytica mutant showing increased production of CA from canola oil // Canadian journal of microbiology. 1985. V. 31. №. 5. P. 436 - 440. 124. Grewal H.S., Kalra K.L. Fungal production of citric acid // Biotechnology advances. 1995. V. 13. №. 2. P. 209–234. 125. Guettler M.V., Rumler D., Jain M.K. Actinobacillus succinogenes sp. nov., a novel succinic-acidproducing strain from the bovine rumen // International journal of systematic bacteriology. 1999. V. 49. №. 1. P. 207-216. 126. Guillermo A., Jian Y., Ryan H. New biodegradable biocompatible citric acid nano polymers for cell culture growth and implantation engineered by Northwestern University Scientists. Nano patents and innovations, US Patent Application 20090325859. 2010. 127. Hatti-Kaul. R., Törnvall U., Gustafsson L., Börjesson P. Industrial biotechnology for the production of bio-based chemicals–a cradle-to-grave perspective // Trends in biotechnology. 2007. V. 25. №. 3. P. 119–124. 128. Heslot H. Genetics and genetic engineering of the industrial yeast Yarrowia lipolytica // In: Applied Molecular Genetics. Eds. Springer Berlin Heidelberg. 1990. P. 43-73. 122 129. Hirai M., Ohtani E., Tanaka A., Fukui S. Glucose-phosphorylating enzymes of Candida yeasts and their regulation in vivo // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Enzymology 1977. V. 480. № 2. P. 357-366. 130. Hofvendahl, K. and Hahn-Hagerdal, B. Factors affecting the fermentative lactic acid production from renewable resources (1) // Enzyme and microbial technology. 2000. V. 26. №. 2. P. 87–107. 131. Holdsworth. J., Ratledge C. Lipid turnover in oleaginous yeasts // Journal of general microbiology. 1988. V. 134. №. 2. P. 339-346. 132. Ikeno Y., Masuda Y.M., Tanno K., Oomori I., Takahashi N. Citric acid production from various raw materials by yeasts // Journal of Fermentation Technology. 1975. V. 53. P.752–756. 133. Islam M.S., Begim R, Choudhury N. Semi-pilot-scale prodyction of citric acid in cane melasses by gamma ray induced mutants of Aspergillus niger // Enzyme and microbial technology. 1988. V.8. № 8. P. 489. 134. Janghwan K., Seon Ah. C., Sehwan P., Yunkyoung S., Jeong-Yoon K. Serum-induced hypha formation in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica // FEMS microbiology letters. 2000. V. 190. №. 1. P. 9-12. 135. Kagaki K, Kaisa K, Hara T. Succinic acid conformers and the process for preparing the same. 1964. Japanese patent 1, 063,465. 136. Kamzolova SV, Vinokurova NG, Lunina JN, Zelenkova NF, Morgunov IG. Production of technical-grade sodium citrate from glycerol-containing biodiesel waste by Yarrowia lipolytica // Bioresource Technology. 2015. V. 193. Р. 250-255. 137. Kamzolova S.V., Lunina J.N., Morgunov I.G. Biochemistry of citric acid production from rapeseed oil by Yarrowia lipolytica yeast // Journal of the American Oil Chemists' Society. 2011. V. 88. №.12. Р. 1965–1976. 138. Kamzolova S.V., Shishkanova N.V., Morgunov I.G., and Finogenova T.V. Oxygen requirements for growth and citric acid production of Yarrowia lipolytica // FEMS Yeast Reserch. 2003. V. 3. № 2. P. 217-222. 139. Kamzolova S.V., Morgunov I.G., Aurich A., Perevoznikova O.A., Shishkanova Stottmeister U., Finogenova T.V. N.V., Lipase secretion and citric acid production in Yarrowia lipolytica yeast grown on animal and vegetable fat // Food Technology and Biotechnology. 2005. V. 43. № 2. P. 113-122. 140. Kamzolova S.V., Finogenova T.V., Morgunov I.G. Microbiological production of citric and isocitric acids from sunflower oil // Food Technology and Biotechnology. 2008. V. 46. N 1. P. 5159. 141. Kamzolova S.V., Yusupova A.I., Vinokurova N.G., Fedotcheva N.I., Kondrashova M.N., Finogenova N.V., Morgunov I.G. Chemically assisted microbial production of succinic acid by 123 the yeast Yarrowia lipolytica grown on ethanol // Applied Microbiology and Biotechnology. 2009. V. 83. №. 6. Р. 1027-1034. 142. Kawasse F.M., Amaral P.F., Rocha-Leão M.H.M., Amaral A.L., Ferreira E.C., Coelho M.A.Z. Morphological analysis of Yarrowia lipolytica under stress conditions through image processing // Bioprocess and biosystems engineering. 2003. V. 25. P. 371-375. 143. Kim E.K., Ambriano J.R., Roberts R.S. Vigorous stationary phase fermentation // Biotechnology and Bioengineering. 1987. V. 30. P. 805-908. 144. Kirimura К., Hirowatari Y., Usami S. Alterations of respiratory systems in Aspergillus niger under the conditions of citric acid fermentation // Agricultural and biological chemistry. 1987. V. 51. №. 5. P.1299-1301. 145. Klasson T.K., Clausen E.C., and Gaddy J.C. Continuous fermentation for the production of citric acid from glucose // Applied Biochemistry and Biotechnology. 1989. V. 20. №. 1. P. 491-509. 146. Kornberg A. and Pricer W.E.J. Di and triphosphopyridine nucleotide isocitrate dehydrogenase in yeast // Journal of Biological Chemistry. 1951. V. 189. №. 1. P. 123-126. 147. Koutinas, A.A., Malbranque F., Wang R., Campbell G.M., Webb C. Development of an oat-based biorefinery for the production of L(+)-lactic acid by Rhizopus oryzae and various value added coproducts // Journal of agricultural and food chemistry. 2007. V. 55. P. 1755–1761. 148. Kubicek C.P., Roch M. The citric acid fermentation // Critical Reviews in Biotechnology. 1986. V. 3. №. 4. P. 331-373. 149. Kujau M., Weber H., Barth, G. Characterization of mutants of the yeast Yarrowia lipolytica defective in acetyl-coenzyme A synthethase // Yeast. 1992. V. 8. №. 3. P.193-203. 150. LeDall M., Nicaud J.-M., Treton B.Y., and Gaillardin C.M. The 3-phosphoglycerate kinase gene of the yeast Yarrowia lipolytica de-represses on gluconeogenic substrates // Current genetics. 1996. V.29. P. 446-456. 151. Lederberg J., Lederberg E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants //Journal of Bacteriology. 1952. V. 63. №. 3. P. 399. 152. Lee P.C., Lee W.G., Kwon S., Lee S.Y., Chang H.N. Succinic acid production by Anaerobiospirillum succiniciproducens effects of the H2CO2 supply and glucose concentration // Enzyme and Microbial Technology. 1999. V. 24. P. 549-554. 153. Lee P.C., Lee S.Y., Hong S.H., Chang H. N., Park S.C. Biological conversion of wood hydrolysate to succinic acid by Anaerobiospirillum succiniciproducens // Biotechnology letters. 2003. V. 25. №. 2. P. 111-114. 154. Lin H., Bennet G.N., San K.Y. Fed-batch culture of a metabolically engineered Escherichia coli strain designed for high-level succinate production and yield under aerobic conditions // Biotechnology and bioengineering. 2005a. V. 90. P. 775-779. 124 155. Lin H., Bennett G.N., San K.Y. Metabolic engineering of aerobic succinate production systems in Escherichia coli to improve process productivity and achieve the maximum theoretical succinate yield // Metabolic engineering. 2005b. V. 7. P. 116–127. 156. Lodder J. The yeasts, a taxonomic study. Amsterdam.: North Holland Published Company. 1970. P. 1385. 157. Lockwood L.B. Organic acid production // In: The filamentous fungi – Industrial mycology. Eds. Edward Arnold Ltd. London. 1975. V. 1. P. 140-157. 158. Lupianez J.A., Machado A., Nunez de Castro I., Mayor F. Succinic acid production by yeasts grown under different hypoxic conditions // Molecular and cellular biochemistry. 1974. V. 3. № 2. Р. 113-116. 159. Makri A., Fakas S., Aggelis G. Metabolic activities of biotechnological interest in Yarrowia lipolytica grown on glycerol in repeated batch cultures // Bioresource Technology. 2010. V. 101. P. 2351–2358. 160. Maas R.H., Bakker R.R., Eggink G., Weusthuis R.A. Lactic acid production from xylose by the fungus Rhizopus oryzae // Applied Microbiology and Biotechnology. 2006. V. 72. №. 5. P. 861– 868. 161. Magnuson J.K., Lasure L.L. Organic acid production by filamentous fungi // In Advances in Fungal Biotechnology for Industry, Agriculture, and Medicine (Tkacz, J.S. and Lange, L., eds). 2004. P. 307–340, Kluwer Academic/Plenum Publishers. 162. Marchal R., Chaude O., Metche M. Production of citric acid from n-paraffines by Saccharomycopsis lipolytica: kinetics and balance of the fermentation // European journal of applied microbiology and biotechnology. 1977. V. 4. №. 2. P. 111-123. 163. Meers J.L., Milsom P.E. Organic acids and amino acids // In: Basic Biotechnology, London: Academic Press. 1987. P. 359–383. 164. Monon J. The growth of bacterial culture // Selected Papers in Molecular Biology by Jacques Monod. 2012. P. 139. 165. Moon S.K., Wee Y.J., Yun J.S., Ryu H.W. Production of fumaric acid using rice bran and subsequent conversion to succinic acid through a two-step process // In: Proceedings of the Twenty-Fifth Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals Held May 4–7, 2003, in Breckenridge, CO. Eds. Humana Press, 2004. P. 843-855. 166. Moresi M. Effect of glucose concentration on citric acid production by Yarrowia lipolytica // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 1994. V. 60. № 4. P. 387–395. 167. Morgunov I.G., Kamzolova S.V., Lunina J.N. The citric acid production from raw glycerol by Yarrowia lipolytica yeast and its regulation // Applied Microbiology and Biotechnology 2013, Vol. 97, P. 7387-7397. 125 168. Morgunov I.G., Kamzolova S.V., Perevoznikova O.A., Shishkanova N.V., Finogenova T.V. // Process Biochemistry. 2004. V. 39. P. 1469-1474. 169. Papanikolaou S., Aggelis G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture // Bioresource Technology. 2002. V. 82. P. 43-44. 170. Papanikolaou S., and Aggelis G. Selective uptake of fatty acids by yeast Yarrowia lipolytica // European Journal of Lipid Science and Technology. 2003b. V. 105. №. 11. P. 651-655. 171. Papanikolaou S., Chevalot I., Galiotou-Panayotou M., Komaitis M., Marc I., Aggelis, G., 2007. Industrial derivative of tallow: a promising renewable substrate for microbial lipid, single-cell protein and lipase production by Yarrowia lipolytica // Electronic Journal of Biotechnology. 2007. V. 10. №. 3. P. 426-435 172. Patel M.A., Ou M.S., Ingram L.O., Shanmugam K.T. Simultaneous saccharification and cofermentation of crystalline cellulose and sugar cane bagasse hemicellulose hydrolysate to lactate by a thermotolerant acidophilic Bacillus sp // Biotechnology progress. 2005. V. 21. №. 5. P. 1453–1460. 173. Peitit T., Gancedo C. Molecular cloning and characterization of the gene HXK1 encoding the hexokinase from Yarrowia lipolytica // Yeast. 1999. V. 15. №. 15. P .1573-84. 174. Pignede G., Wang H.J., Fidalej F., Seman M., Gailaardin C., Nicaud J.M. Autocloning and amplification of LIP2 in Yarrowia lipolytica // Applied and Environmental microbiology. 2000. V. 66. № 8. P. 3283-3289. 175. Rane K. D., Sims K.A. Production of citric acid by Candida lipolytica Y1095: Effect of glucose concentration on yield and productivity // Enzyme and Microbial Technology. 1993. V.15, N8. P.646-651. 176. Rane K.D., Sims K. Citric acid production by Candida lipolytica Y 1095 in cell recycle and fedbatch fermenters // Biotechnology and bioengineering. 1995. V. 46. № 4. P. 325-332. 177. Ruiz-Herrera J., Sentandreu R. Different effectors of dimorphism in Yarrowia lipolytica // Archives of Microbiology 2002. V. 178. P. 477-483. 178. Rymowicz W., Sobieszczanski J. Fermentation kinetics of citric acid from glucose by Saccharomycopsis lipolytica A-101 // Folia-Microbiol. 1990. V. 34. № 5. P. 441. 179. Rymowicz W., Rywinska A., Marcinkiewicz M. High-yield production of erythritol from raw glycerol in fed-batch cultures of Yarrowia lipolytica // Biotechnology letters. 2009. V. 31. P. 377– 380. 180. Rymowicz W., Fatykhova A.R., Kamzolova S.V., Rywińska A., and Morgunov I.G. Citric acid production from glycerol-containing waste of biodiesel industry by Yarrowia lipolytica in batch, repeated batch, and cell recycle regimes // Applied Microbiology and Biotechnology. 2010. V. 87. № 3. P. 971-979. 126 181. Rymowicz W., Rywińska A. Cišgła produkcja kwasu cytrynowego z syropu glukozowego przez mutanta Yarrowia lipolytica w reaktorze membranowym. // Acta Scientiarum Polonorum. Biotechnologia. 2003. V.2. N 1. P.21-30. 182. Rywińska A., Rymowicz W. High-yield production of citric acid by Yarrowia lipolytica on glycerol in repeated-batch bioreactors // Journal of industrial microbiology & biotechnology. 2010. V. 37. № 5. P. 431-435. 183. Rywińska A., Rymowicz W. Continuous production of citric acid from raw glycerol by Yarrowia lipolytica in cell recycle cultivation // Chemical Papers. 2011. V. 65. № 2. P. 119-123. 184. Samuelov N.S., Datta R., Jain M.K, Zeikus J.G. Whey fermentation by Anaerobiospirillum succiniciproducens for product of a succinate-based animal feed additive // Applied and environmental microbiology. 1999. V. 65. P. 2260-2263. 185. Sanjay Gupta and Chandra B. Sharma. Citric acid Fermentation by the mutant strain of A. niger Resistant to manganese ions inhibition.//Biotehnology letters. 1995. V.17. N 3 P. 269-274. 186. Sato S. Microbial production and control of cellular growth under high dissolved oxygen concentration // Hakko Kogaku Kaishi. 1990. V. 68. № 5. P. 411-421. 187. Sato M., Nakahara T., Yamada K. Fermentative production of succinic acid from n-paraffin // Agricultural and Biological Chemistry. 1972. V. 36. № 11. Р. 1969-1974. 188. Sauer M., Porro D., Mattanovich D., Branduardi P. Microbial production of organic acids: expanding the markets // Trends in Biotechnology. 2008. V. 26. № 2. Р. 100-108. 189. Shimizu J., Ishii K., Nakajima Y. DE 2202701. 1973. 190. Soccol C.R., Vandenberghe L.P.S., Rodrigues C., Pandey A. New perspectives for citric acid production and application // Food Technol and Biotechnology. 2006. V. 44. P. 141–149. 191. Sols A. and Salas M.L. Phosphofructokinase //In: Metods in Enzymology. Ed. Wood W.A., New York and London Academic Press. 1966. V. 9. P. 436-442. 192. Srere P.A. Citrat syntathase // In: Methods in enzymology. L.J.N.N.Y., LD: Academ. Press. 1969. V. 13. P. 3-11. 193. Stephanopoulos G. Challenges in engineering microbes for biofluels producton // Science. 2007. V. 315. № 5813. P. 801-804. 194. Strick C.A., James L.C., O’Donell M.M., Gollaher M.G., Franke A.E. The isolation and characterization of the pyruvate kinase-encoding gene from the yeast Yarrowia lipolytica // Gene. 1982. V. 118. №1. P. 65-72. 195. Szabo R., Stofanikova V. Presence of organic sources of nitrogen is critical for filament formation and pH–dependent morphogenesis in Yarrowia lipolytica // FEMS microbiology letters. 2002. V. 206. №. 1. P. 45-50. 127 196. Tabuci T., Hara S. Conversion of citrate fermentation to polyol fermentation in Candida lipolytica // Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan.1970. V. 47. P. 485-489. 197. Wieland O., Suyter M. Glycerokinase; isolierung und eigensohaften des enzyms // Biochem. Z. 1957. V. 329. P. 320-331. 198. Werpy T., Petersen G. Top value added chemicals from biomass. Volume 1-Results of screening for potential candidates from sugars and synthesis gas. No. DOE/GO-102004-1992. DEPARTMENT OF ENERGY WASHINGTON DC, 2004. 199. Willke T., Welter K., Vorlop K-D. Biotechnological production of itaconic acid from sugar // Applied microbiology and biotechnology. 2001. V. 56. №. 3-4. P. 289-295.. 200. Wojtatowicz M., Rymowicz W., Kautola H. Comparison of different strains of the yeast Yarrowia lipolytica for citric acid production from glucose hydrol // Applied biochemistry and biotechnology. 1991. V. 31. №. 2. P. 165–174. 201. Wu H., Li Z.M., Zhou L., Ye Q. Improved succinic acid production in the anaerobic culture of an Escherichia coli pflB ldhA double mutant as a result of enhanced anaplerotic activities in the preceding aerobic culture // Applied and environmental microbiology. 2007. V. 73. 7837-7843 202. Yang J., Webb A. R., Ameer G. A. Novel citric acid-based biodegradable elastomers for tissue engineering // Advanced Materials. 2004. V. 16. № 6. P. 511–516. 203. Zeikus J.G., Jain M.K., Elankovan P. Biotechnology of succinic acid production and markets for derived industrial products // Applied Microbiology and Biotechnology. 1999. V. 51. №.5. P. 545–552. 128 БЛАГОДАРНОСТИ Автор искренне признательна сотрудникам, способствовавшим выполнению и написанию данной диссертационной работы: к.б.н. Ермаковой И.Т., д.б.н. Козловскому А.Г., проф. Римовичу В. (Вроцлав, Польша), к.б.н. Пунтус И.Ф., Лысанской В.Я., к.б.н. Дедюхиной Э.Г., к.б.н. Зеленковой Н.Ф., а также всем сотрудникам лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов (ИБФМ РАН, г. Пущино). Особую благодарность автор выражает своим наставникам и учителям - д.б.н. Моргунову И.Г. и к.б.н. Камзоловой С.В. за постоянное внимание и поддержку.
