МЕХАНИЗМ НАКОПЛЕНИЯ БЕЛКОВ В ЯДРЫШКЕ
реклама
На правах рукописи Мусинова Яна Рафаеловна МЕХАНИЗМ НАКОПЛЕНИЯ БЕЛКОВ В ЯДРЫШКЕ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в отделе электронной микроскопии Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Поляков Владимир Юрьевич Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Макарова Ольга Васильевна доктор химических наук, доцент Сергиев Петр Владимирович Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук Защита состоится «17» апреля 2012 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.52 при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд. М-1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова Автореферат разослан «16» марта 2012 г. Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Калистратова Елена Николаевна 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Нормальное функционирование интерфазного ядра (как и других органоидов эукариотической клетки, ограниченных липидными мембранами) обеспечивается механизмами, контролирующими селективный транспорт белков и РНК между цитозолем и внутренним компартментом. Макромолекулы, импортирующиеся в ядро или экспортирующиеся из ядра в цитозоль, несут специальные сигналы, которые узнаются белками комплексов ядерных пор. В случае импортируемых макромолекул эти сигналы обозначаются как сигналы ядерной локализации (Nuclear Localization Signal, NLS). После вхождения в ядро импортированные белки (например, белки хроматина, факторы транскрипции и процессинга РНК и многие другие) перераспределяются по ядерным субдоменам. В настоящее время в интерфазных ядрах описано большое число структурно-функциональных субдоменов: ядрышки, тельца Кахаля (Cajal bodies), интерхроматиновые гранулы (nuclear speckles), тельца, содержащие белки «молчания» генов (Polycomb bodies), стрессовые белки (PML bodies) и многие другие (Mao et al., 2011). Вопрос о том, каков механизм «узнавания» импортированными белками мест своей локализации в сложной системе интерфазного ядра, остается открытым. При этом необходимо учитывать, что ядерные субдомены не ограничены мембранами, а большинство ядерных белков (за исключением коровых гистонов и ламинов) являются высоко динамичными, т.е. связаны со своими сайтами не стабильно, а только на протяжении небольшого времени, называемого «временем удержания». Наиболее значимые факты, проливающие свет на эту проблему, получены при анализе белков ядрышка. Показано существование особого класса аминокислотных последовательностей, которые обеспечивают накопление белков в ядрышке. Эти последовательности принято называть «сигналами ядрышковой локализации» (Nucleolar Localization Signal, NoLS). Интересно, что некоторые NoLS перекрываются с хорошо известными NLS (Kubota et al, 1999; Rowland and Yoo, 2003; Zemach et al, 2006; Melen et al, 2007; Wang et al, 2010). Последовательности аминокислот в составе NLS хорошо охарактеризованы, что позволяет достаточно точно предсказывать их присутствие в белках (Cokol et al, 2000). В отличие от NLS предсказание NoLS представляет сложную задачу. Недавно 3 было показано, что NoLS некоторых клеточных и вирусных белков обогащены аргининами (Reed et al, 2006), однако, существование NoLS без аргининов говорит о том, что данный вариант не является универсальным (Favre et al, 1994; Shu-Nu et al, 2000). По-видимому, NoLS крайне гетерогененны по структуре. Возможно, механизм взаимодействия NoLS с компонентами ядрышка не требует какой-либо определенной последовательности аминокислот. Таким образом, механизмы, контролирующие динамические взаимодействия белков с ядрышком, остаются неизвестными. Выяснение природы этих механизмов чрезвычайно важно для понимания принципов организации, функционирования и формирования ядерных субдоменов, не содержащих мембран. Цель исследования Изучение механизмов накопления белков в ядрышке за счет специализированных сигнальных последовательностей – сигналов ядрышковой локализации (NoLS). Задачи исследования 1. Разработать метод количественной оценки эффективности действия сигналов, обеспечивающих накопление белков в ядрышке. 2. Изучить эффективность накопления искусственных сигналов ядрышковой локализации (NoLS) в зависимости от состава аминокислотных остатков. 3. Выявить в гистоне Н2В мотивы, обладающие свойствами сигнала ядрышковой локализации (NoLS). 4. Изучить динамику передислокаций гистона Н2В-EGFP из ядрышка в хроматин ядер культивируемых клеток. 5. Определить возможный молекулярный механизм взаимодействия гистона Н2В с компонентами ядрышка. Научная новизна Предложен метод количественной оценки эффективности тестируемой последовательности в качестве NoLS. Показано, что эффективность искусственных сигналов ядрышковой локализации зависит от величины и плотности суммарного 4 заряда аминокислотных остатков. Показано наличие в гистоне Н2В участка, обладающего свойствами сигнала ядрышковой локализации. Этот участок включает также сигнал ядерной локализации. Детально изучена динамика передислокаций гистона Н2В-EGFP в ядрах культивируемых клеток. Показано, что депонирование избыточного белка в ядрышках является временным событием, по-видимому, связанным с медленным обменом гистонов в хроматине. На основании полученных данных предложена гипотеза, согласно которой накопление гистона Н2В-EGFP в ядрышке определяется электростатическими взаимодействиями NoLS с компонентами, содержащими РНК. Практическое значение Знания о механизме накопления белков в ядрышке могут быть использованы при разработке методов направленного транспорта веществ. В частности, это может иметь значение для поиска новых, более специфических противоопухолевых препаратов, цитотоксическая активность которых связана с подавлением транскрипции рибосомальных генов. Апробация работы Результаты диссертационной работы были представлены на 50-м симпозиуме американского общества клеточных биологов, ASCB (Филадельфия, США, 2010), на XXIII Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, Россия,2010), на XVI Всероссийском совещании “Структура и функции клеточного ядра” (Санкт-Петербург, Россия, 2010), на XVII Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (Черноголовка, Россия, 2011) и на 22-м симпозиуме Вильгельма Бернхарда по клеточному ядру (Рига, Латвия, 2011). Основные результаты работы были доложены на заседании Ученого Совета НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ и на заседании кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ. Публикации По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисов. 5 Объём и структура диссертации Диссертация изложена на 131 странице, включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, выводы и список цитируемой литературы. Материал диссертации содержит 34 рисунка и 4 таблицы. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Культивирования эукариотических клеток Клетки HeLa-M культивировали на среде DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) с добавлением противомикробно-противогрибкового препарата (Sigma, США), 10%-ой эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США) и l-глутамина Для проведения экспериментов клетки высаживали на покровные стекла или чашки Петри с адгезионным покрытием (Costar). Трансфекция Для исследования локализации гистона Н2В в клеточном цикле использовали клетки, трансфецированные плазмидой, кодирующей EGFP-гистон H2B. Плазмида была любезно предоставлена G. Wahl. Трансфекцию производили непосредственно перед каждым экспериментом с использованием препарата Turbofect (Fermentas) в соответствии с инструкцией производителя. Получение конструктов Конструкты с короткими фрагментами изготавливались путем вставки адаптера. Более длинные вставки готовились с помощью полимеразной цепной реакции (с использованием Pfu-полимеразы). Адаптеры и праймеры для полимеразной цепной реакции подбирались с помощью программы SerialCloner. Лигирование производили с использованием Т4-лигазы (Fermentas) в соответствии с инструкциями производителя. Метод иммуноцитохимического выявления белков во внутренних районах ядра Некоторые ядрышковые белки не могут быть выявлены иммуноцитохимически из-за высокой плотности материала в ядрышке. Был разработан метод, позволяющий выявлять такие антигены с помощью специфических антител. Для этого клетки, 6 фиксированные формальдегидом, после пермеабилизации обрабатывали трипсином, что увеличивало доступность внутренних районов ядрышка для антител. Микроскопия Препараты изучали и фотографировали с использованием оптического микроскопа Axiovert 200M (Carl Zeiss), оборудованного объективом Planapochromat 100/1.4 и цифровой камерой Hamamatsu ORCAII-ERG2 (1300х1030, 12 бит), управляемой программным комплексом AxioVision v4,5. Полученные изображения обрабатывали в программах ImageJ и Adobe Photoshop (Adobe Inc). Трехмерную деконволюцию серий оптических срезов осуществляли по алгоритму Constrained Iterative Filter с помощью соответствующего модуля из комплекта поставки программы AxioVision v3.1 (Carl Zeiss, Германия). Прижизненные наблюдения Для проведения прижизненных наблюдений клетки рассаживали на чашки Петри со стеклянным дном. Наблюдения осуществляли на второй день после трансфекции. Для сохранения жизнеспособности клеток температура предметного столика и объектива микроскопа поддерживали на уровне 37°С. Чтобы предотвратить испарение среды и насыщение ее углекислотой на поверхность наносили минеральное масло. Фотографирование проводили с использованием конфокального микроскопа LSM510 (Carl Zeiss, Германия). Для определения использовали метод времени FRAP полуобмена (Fluorescence химерных Recovery белков After в ядрышке Photobleaching- восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания). FRAP проводили при помощи конфокального микроскопа LSM510 (Carl Zeiss). После 4-ого кадра с помощью лазера осуществляли обесцвечивание интересующей области. Для обработки результатов использовали макрос для программы ImageJ (любезно предоставлен С.А. Голышевым). Данные обрабатывали с помощью программы Microsoft Excel. 7 РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ Все известные NoLS обогащены положительно заряженными аминокислотами На первом этапе работы был проведен анализ литературы, и собраны данные об экспериментально доказанных NoLS в белках вирусов, животных, растений и грибов. На рисунке 1 представлена диаграмма, показывающая, что почти половина всех аминокислот в составе NoLS – положительно заряженные аминокислоты (26% лизинов и 23% аргининов). В настоящее время не описано ни одной последовательности NoLS, имеющей нейтральный или отрицательный заряд. Данное наблюдение позволило выдвинуть следующую рабочую гипотезу: накопление белков в ядрышке может опосредоваться электростатическими взаимодействиями положительно заряженных NoLS с какими-то отрицательно заряженными компонентами ядрышка. Данная гипотеза предполагает, что эффективность накопления белка в ядрышке будет пропорциональна заряду NoLS. Именно это следствие было использовано для верификации гипотезы. Уровень накопления химерных белков в ядрышке зависит от аминокислотного состава искусственных NoLS Для изучения механизмов действия сигнальных последовательностей, обеспечивающих накопление и временное удержания белков в ядрышке, мы использовали модель искусственных NoLS. Искусственные NoLS – это последовательности произвольного состава (не существующие в природе), которые способны обеспечить накопление маркерного белка (например, EGFP) в ядрышке. Удобство состоит в том, что меняя количество аминокислот в составе искусственного NoLS, можно варьировать уровень накопления белка в ядрышке. Для того чтобы оценивать уровень накопления количественно, мы измеряли отношение концентраций EGFP в ядрышке и нуклеоплазме. Эта величина (активность NoLS) характеризует эффективность тестируемой последовательности в качестве NoLS. Для проверки идеи зависимости эффективности накопления от заряда мы создали серию конструктов, кодирующих EGFP, слитого с участками, кодирующими искусственные NoLS разного заряда (разное число лизинов или аргининов). Как видно из рисунка 2, существует корреляция между зарядом и эффективностью аминокислотной последовательности в качестве NoLS. Причем, на участке графика, 8 Рис. 1. Аминокислотный состав NoLS. Остатки положительно заряженных аминокислот – лизина (К) и аргинина (R) – составляют почти половину от всех аминокислот в NoLS. где заряд экспериментальных последовательностей варьирует от 0 до 5, наблюдается слабое, постепенное увеличение активности NoLS; затем на участке, где заряд изменяется от 5 до 17, происходит более быстрый рост активности NoLS. На основании полученных данных можно сделать вывод, что эффективность сигнала, отвечающего за накопление белка в ядрышке (NoLS) может определяться его зарядом. Возникает вопрос - удержание белков в ядрышке, осуществляемое за счет активности NoLS, определяется только общим зарядом NoLS, или зависит от плотности распределения заряда по последовательности сигнала? Для проверки были созданы два типа искусственных NoLS – с положительно заряженными аминокислотами расположенными блоком, либо разбитые незаряженными глицинами (рис. 3А). Как видно из гистограммы на рисунке 3Б, химерные белки с не разделенными заряженными аминокислотами интенсивно накапливаются в ядрышке, а при разделении аргининов глицинами накопление идет намного слабее (различия статистически значимы, p≤0.01). 9 Рис. 2. Зависимоcть накопления эффективности химерных белков с искусственным NoLS (активность NoLS) от количества остатков аргинина во вставке (т.е. от заряда искусственного NoLS). Аналогичные получены искусственных с данные были использованием NoLS, содержащих различное количество лизинов. Все эксперименты были поставлены также с искусственными NoLS, сконструированными на основе другой заряженной аминокислоты (лизина), при этом были получены схожие результаты. По-видимому, данные эффекты не зависят от типа аминокислотных остатков, создающих заряд. Таким образом, эксперименты с искусственными NoLS, описанные в этом разделе, показывают два важных факта. Во-первых, для эффективного накопления в ядрышке белки должны содержать положительно заряженные аминокислоты. Вовторых, эффективность искусственно сконструированного сигнала ядрышковой локализации (NoLS) зависит не только от характера суммарного заряда, но и от его плотности. Однако такие данные не являются достаточными, а потому важно проверить гипотезу и на белке, содержащем NoLS. Гистон Н2В содержит потенциальный NoLS Для работы был выбран гистон Н2В, в котором присутствует участок (28KKRKRSRK35), содержащий мотивы, характерные для NoLS – (R/K)(R/K)X(RK) или (R/K)X(R/K)(R/K) (Weber et al., 2000). Можно предположить, что он содержит NoLS (далее – putative NoLS или pNoLS). Чтобы проверить эффективность данного участка в качестве сигнала ядрышковой локализации, был синтезирован адаптер, кодирующий аминокислоты KKRKRSRK. Адаптер вставлен на 5’ конец EGFP для создания конструкта pEGFP10 Рис. 3. Зависимость активности NoLS от распределения плотности заряда по его последовательности. А – схематическое изображение сконструированных химерных белков, Б – активности NoLS для данных белков (среднее значение ± стандартное отклонение). pNoLS. рEGFP локализуется, преимущественно, в нуклеоплазме и в цитоплазме (рис. 4А). Химерный белок pEGFP-pNoLS локализуется в ядрышках и в нуклеоплазме (рис. 4А). С помощью метода FRAP показано, что время полуобмена pEGFP-pNoLS в ядрышках крайне невелико (t1/2~0.6 сек), т.е. данный белок взаимодействует с компонентами ядрышка динамически. Важно подчеркнуть, что в гистоне Н2В предсказываются два участка (23QKKGGKKRK31 и 28 KKRKRS33), которые могут выступать в качестве сигналов ядерной локализации (NLS). Эти участки перекрываются друг с другом и с рNoLS (28KKRKRSRK35). Обнаруженные участки были названы NLS1 (23QKKDGKKRK31) и NLS2 (28KKRKRS33). Были созданы конструкты на основании pEGFP и адаптеров, кодирующих NLS1 и NLS2. После трансфекции оба химерных белка накапливаются в ядрышке и отсутствуют в цитоплазме (рис. 4Б). Таким образом, анализируемый участок гистона Н2В, по-видимому, играет роль NLS и потенциально может играть роль NoLS. Но способен ли гистон Н2В накапливаться в ядрышке за счет этого участка или нет? Избыток гистона Н2В накапливается в ядрышке Через 24 часа после трансфекции плазмидой, кодирующей гистон H2B-EGFP, в популяции выявляется два типа клеток (рис. 5). Первый тип представлен клетками с типичной локализацией гистона в хроматине. Второй тип - клетки, с выраженным накопление белка в ядрышке. Анализ препаратов показал, что выявленные 11 Рис. 4. NoLS в гистоне H2B. А - локализация pEGFP-C1 (контроль) и pEGFP-pNoLS. Б - локализация pEGFP-NLS1 и pEGFP-NLS2. Масштабная линейка 5 µm. морфологические типы не сводятся к двум крайним вариантам: на препаратах можно найти любые промежуточные по уровню накопления экзогенного белка в ядрышке варианты. Через 48 часов после трансфекции в популяции выявляются только клетки с нормальной (хроматиновой) локализацией гистона H2B-EGFP. Является ли ядрышковая локализация гистона нормой или нет? Одна из частых причин ненормальности локализации белка – гиперэкспрессия. Возникает вопрос, не является ли гиперэкспрессия гистона H2B-EGFP непосредственной причиной накопления белка в ядрышке? Измерения показывают, что максимальный уровень экспрессии достигается не через 24, а через 48 часов после трансфекции. Кроме того, были проведены раздельные измерения интегральной интенсивности флуоресценции для клеток с ядрышковой и нуклеоплазматической локализацией гистона H2B-EGFP. Среди клеток с низким уровнем экспрессии доля клеток с ядрышковой локализацией относительно невелика (~12%), в то время как среди клеток с высоким уровнем экспрессии их доля увеличивается до ~50%. Следовательно, гиперэкспрессия не может считаться причиной накопления в ядрышке гистона H2B-EGFP. Что же является причиной исчезновения клеток с ядрышковой локализацией гистона, спустя 48 часов после трансфекции? Можно предположить, что клетки с ядрышковой локализацией не погибают, а постепенно становятся клетками с 12 Рис. 5. Распределение гистона H2B-EGFP в ядрах клеток HeLa часа (24 после трансфекции). В популяции одновременно выявляются два типа клеток: клетки с включением химерного белка преимущественно в хроматин и клетки с включением белка в ядрышки (треугольные стрелки). Масштабная линейка 5 µm. нормальной локализацией гистона (например, вследствие перемещения белка из ядрышек в хроматин). Для проверки данного предположения мы проследили за судьбой клеток с ядрышковой локализацией гистона Н2В-EGFP. С помощью прижизненных наблюдений мы смогли проследить процесс постепенного перемещения гистона из ядрышка в хроматин. Также необходимо подчеркнуть, что такие клетки способны делиться, что говорит о физиологичности выявленного явления. По-видимому, в ядрышке накапливается избыток гистона Н2В, который образуется после начала экспрессии белка с плазмиды. В пользу этого также свидетельствуют подсчеты соотношения клеток с ядрышковой и преимущественно хроматиновой (нормальной) локализацией гистона Н2В-EGFP. Максимальное число клеток с ядрышковой локализацией гистона наблюдается через 6 часов после трансфекции, затем доля постепенно падает. Гистон H2B-EGFP взаимодействует с ядрышком и хроматином посредством различных механизмов 13 Коровые гистоны характеризуются низкой подвижностью в живых клетках. Для большинства изученных ядрышковых белков характерно динамичное поведение, причем, гистон Н2В относится к немногочисленным нединамичным ядерным белкам. Чрезвычайно важно выяснить, как влияет накопление гистона в ядрышке на его динамические характеристики. С этой целью было проведено изучение динамики гистона Н2В методом FRAP. В составе ядрышек гистон обладает высокой подвижностью (рис.6А). Время полуобмена составляет 7 секунд (рис. 6Г). При этом не наблюдается полного восстановления флуоресценции, что может свидетельствовать о наличии в ядрышке небольшой малоподвижной фракции (~22% от общего количества ядрышкового гистона). Можно предположить, что в состав этой фракции входит гистон ядрышкового хроматина. В нуклеоплазме выявляются две фракции: с высокой (время полуобмена ~1сек) и низкой динамикой (рис. 6Б, Д). Доля фракции с низкой динамикой в нуклеоплазме значительно выше, чем в ядрышке (~62% от общего количества ядрышкового гистона). В составе хроматина гистон H2B-EGFP обладает низкой подвижностью (рис. 6В, Е), что соответствует опубликованным данным (Kimura and Cook, 2001). Для того чтобы выяснить, с какими компонентами ядрышка связывается гистон Н2В, была проведена обработка пермеабилизированных клеток нуклеазами. После обработки ДНКазой I яркость флуоресценции в нуклеоплазме снижается, а яркость флуоресценции в ядрышке не меняется (рис. 7). Обработка РНКазой А, снижает интенсивность флуоресценция белка в ядрышке (рис. 7). На этом основании можно предположить, что в ядрышке гистон Н2В-EGFP взаимодействует либо с РНК, либо с РНК-содержащими комплексами. Картирование активности NoLS в гистоне Н2В Таким образом, были установлены два принципиально новых факта. Вопервых, гистон Н2В содержит участок, играющий роль NLS, но который потенциально может играть роль NoLS. Во-вторых, гистон H2B, будучи в некотором избытке, способен накапливаться в ядрышке. Возникает вопрос – это накопление обеспечивается именно выявленным сигналом? 14 Рис. 6. Динамика гистона H2B-EGFP в ядрышках (А, Г) и нуклеоплазме (Б, Д) клеток с ядрышковой локализацией. Динамика гистона Н2В-EGFP в клетке с преимущественной локализацией химерного белка в хроматине (В, Е). Масштабная линейка 5 µm. После удаления участка, содержащего сигнал ядрышковой локализации (Δ2241) выявляется слабое накопление белка в ядрышке (рис. 8).Это свидетельствует о том, что NoLS в гистоне H2B может представлять собой более сложную структуру, чем выявлено изначально. Также было показано, что N-концевой участок гистона H2B (1-35) накапливается в ядрышке, в то время как остальная часть (36-126) не способна накапливаться в ядрышке (рис. 8). Можно сделать вывод, что сигнал ядрышковой локализации сосредоточен на N-концевой части гистона H2B. Поэтому было проведено более детальное исследования N-концевого участка белка. 15 Рис. 7. Обработка клеток ДНКазой I уменьшает интенсивность флуоресценции гистона H2B-EGFP в нуклеоплазме; обработка клеток РНКазой А уменьшает интенсивность флуоресценции в ядрышке. Масштабная линейка 5 µm. Рис. 8. Картирование NoLS в гистоне H2B. А - химерные белки, использованные в работе (pNoLS отмечен красным). Б - локализация химерных белков. Масштабная линейка 5 µm. Для этого была создана серия конструктов (рис. 9А) и произведена оценка активности NoLS химерных белков (рис. 9Б). Только один из исследуемых белков (EGFP-гистон H2B(1-11)) не имел ядрышковой локализации, остальные – в той или иной степени накапливались в ядрышке. Была произведена количественная оценка эффективности накопления белков в ядрышке (рис. 9В) и выявлена корреляция между активностью сигнала ядрышковой локализации и зарядом. Сигналом с наиболее сильным эффектом накопления оказался pEGFP-гистон H2B(21-35). Было отмечено, 16 Рис. 9. А - N-концевой участок гистона Н2В (положительно заряженные аминокислоты выделены красным) и участки белка, использованные для анализа. Б - все участки за исключением 1-11 приводят к накоплению EGFP в ядрышке. Масштабная линейка 5 µm. В активность участка в качестве сигнала ядрышковой локализации (NoLS activity) коррелирует с зарядом тестируемой последовательности (Predicted charge). Г - наибольшей активностью обладают участки с наибольшей плотностью заряда, что косвенно свидетельствует об отсутствии четких границ у сигналов ядрышковой локализации. что более длинные участки (12-35 и 1-35) имели наибольший положительный заряд, но их активность была ниже, чем pEGFP-гистон H2B(21-35). По-видимому, не только заряд, но и длина участка гистона оказывает влияние на эффективность NoLS. Была подсчитана отдельно последовательности) удельная и активность удельный заряд NoLS (активность (предсказываемый NoLS/длина заряд/длина последовательности) (Рис. 9Г). График демонстрирует четкую корреляцию между 17 этими величинами. Из графика видно, что участок pNoLS обладает наибольшей удельной активностью NoLS и наибольшим удельным зарядом. Заключение Согласно опубликованным данным, существует отдельный класс последовательностей, которые обеспечиваю накопление белков в ядрышке – сигналы ядрышковой локализации (NoLS). В настоящее время большое количество таких последовательностей описано в белках вирусов, растений, животных и грибов. Все известные NoLS обогащены положительно заряженными аминокислотами, однако четкой структуры последовательности данного сигнала пока не выявлено. В случае гистона H2B-EGFP выявлен участок, который может потенциально выполнять роль NoLS. Действительно, искусственный белок содержащий сигнал NoLS из гистона локализуется в ядрышке, что может объяснить накопление гистонов в этом субдомене ядра. Накопление белка в ядрышке, по-видимому, может определяться не только функционированием белка в том или ином компартменте ядрышка (такой типа накопления принято называть накоплением, сопряженным с функционированием, activity-dependent retention). Накопление, не сопряженное с функционированием (activity-independent retention), может обладать особыми свойствами, что в литературе до сих пор еще не обсуждалось. Сигналы, обеспечивающие не сопряженное с функционированием накопление, первоначально назывались неспецифическими, так как предполагалось, что такой сигнал может быть характерен для белков с принципиально разными функциями. Наличие неспецифического NoLS в гистоне не удивительно. Этот участок обогащен положительно заряженными аминокислотами, что характерно для классических NLS. Согласно опубликованным данным, некоторые известные NoLS перекрываются с хорошо известными NLS (Kubota et al,1999; Rowland and Yoo,2003; Zemach et al, 2006; Melen et al, 2007; Wang et al, 2010). В нашем случае у гистона H2BEGFP присутствует участок, который функционально ведет себя как NLS и одновременно может выступать в качестве NoLS. Полученные данные позволяют утверждать, что наличие некоторых типов NLS может автоматически приводит к накоплению белка в ядрышке. Нельзя исключить, что присутствие в ядрышке огромного количества разнообразных белков как раз и 18 связано с тем, что присутствие NLS (или других участков, обогащенных положительно-заряженными аминокислотами) может вести к ядрышковой локализации. Состав последовательности NLS хорошо известен, и это позволяет достаточно точно предсказывать их присутствие в белках (Cokol et al, 2000). В отличие от NLS предсказание NoLS представляет сложную проблему. Учитывая тот факт, что все сигналы ядрышковой локализации обогащены положительно заряженными аминокислотами и несут собой положительный заряд, можно предположить, что основной механизм реализации активности данного типа сигналов связан с электростатическим взаимодействием. Если это предположение верно – то последовательность аминокислот не столь важна, в отличие от аминокислотного состава сигнала. Если ядрышко обогащено отрицательно заряженными компонентами, все белки с положительными заряженными участками будут неспецифически накапливаться в ядрышке. Конечно, на накопление может сильно влиять окружающие участки белка, включая наличие отрицательно заряженных мотивов, а так же общий отрицательный заряд белка. В случае гистона, который обогащен основными аминокислотами – эта проблема не возникает. Действительно, обнаружено, что предполагаемый NoLS (28-35) представляет собой только часть сигнала ядрышковой локализации (21-35). Основываясь на полученных данных участок NoLS с наибольшим положительным сигналом (плотностью заряда) будет давать наибольший вклад в накопление белка в ядрышке, в то время как окружающие участки будут только усиливать это накопление. Проведенное исследование показывает, что экспериментальное определение таких сигналов, как и выявление границ сигналов невозможно без количественной оценки активности NoLS, что существенно отличает данный тип сигналов от других известных мотивов. Очень мало известно о том, как NoLS взаимодействует с ядрышком. Накопление белка в ядрышке может быть связано с электростатическим взаимодействием положительно заряженных NoLS с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами и белками. К примеру, было показано, что кластеры основных аминокислот отвечают за связывание белком РНК, что обеспечивает ядрышковую локализацию рибосомального белка L22 (Houmani and Ruf,2009). Кроме того, было показано, что некоторые NoLS могут взаимодействовать с мажорным 19 ядрышковым белком B23 (Wang et al, 2010,Lechertier et al,2007; Endo et al,2009). Факт наличия в B23 длинных отрицательно заряженных участков 120EEDAESEDEEEED132 и 161 DEDDDDDDEEDDDEDDDDDDFDDEEAEE188 позволяет предположить что такого рода взаимодействия могут иметь электростатическую природу, как в случае взаимодействия с РНК. Также необходимо отдавать отчет, что не все механизмы накопления белков в ядрышке опосредованы NoLS. Например, было показано, что РНК связывающие мотивы отвечают за накопление нуклеолина в ядрышке (SchmidtZachmann and Nigg, 1993). Аккумуляция белка в ядрышке, вызванная наличием NoLS, может быть биологически значимой. В случае белка, функционирующего в ядрышке, неспецифическое накопление в пределах этой структуры повысит вероятность случайного взаимодействия со специфическими сайтами связывания. В других случаях ядрышковая локализация может быть либо безразличной в функциональном плане, либо даже вредной (если белок функционирует вне ядрышка). В любом случае, накопление белка в ядрышке не следует автоматически считать функциональнозначимым, по крайней мере, до получения экспериментального доказательства обратного. 20 ВЫВОДЫ 1. Разработан метод количественной оценки эффективности действия сигналов, обеспечивающих накопление ядерных белков в ядрышке. 2. Показано, что эффективность действия искусственных сигналов ядрышковой локализации (NoLS) зависит от величины заряда и от плотности расположения положительно заряженных аминокислот в последовательности. 3. Показано наличие в гистоне Н2В участка, обладающего свойствами сигнала ядрышковой локализации (NoLS). 4. Изучена динамика передислокаций гистона Н2В-EGFP в ядрах культивируемых клеток HeLa. Показано, что накопление «избыточного» белка в ядрышках является временным событием, по-видимому, связанным с медленным обменом гистона Н2В в хроматине. 5. На основании полученных данных предложена гипотеза, согласно которой накопление гистона Н2В в ядрышке определяется электростатическими взаимодействиями с компонентами, содержащими РНК. 21 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Musinova Y.R., Lisitsyna O.M., Golyshev S.A., Tuzhikov A.I., Polyakov V.Y., Sheval E.V. Nucleolar localization/retention signal is responsible for transient accumulation of histone H2B in the nucleolus through electrostatic interactions // Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 2011. V. 1813. P. 27–38. 2. Svistunova D.M., Musinova Y.R., Polyakov V.Y., Sheval E.V. A simple method for the immunocytochemical detection of proteins inside nuclear structures that are inaccessible to specific antibodies. Journal of Histochemistry & Cytochemistry // 2012. V. 60. P. 152–158. 3. Musinova Y.R., Lisitsyna O.M., Golyshev S.A., Polyakov V.Y., Sheval E.V. Nonspecific retention as a possible mechanism for histone H2B accumulation in the nucleolus // American Society for Cell Biology 50th Annual Meeting. 2010. P. 1133. 4. Мусинова Я.Р., Шеваль Е.В., Поляков В.Ю. Сигнал ядрышковой локализации в гистоне Н2В // Структура и функции клеточного ядра: Тезисы докладов и сообщений XVI Всероссийского совещания. Цитология. 2010. Т. 52. № 8. Стр. 675–676. 5. Мусинова Я.Р., Лисицына О.М., Шеваль Е.В. Несопряженное с функционированием удержание белков в ядрышке: к вопросу о механизме действия сигналов ядрышковой локализации // XXIII Российская конференция по электронной микроскопии. Черноголовка. 2010. Стр. 394. 6. Мусинова Я.Р., Кананыхина Е.Ю., Лисицына О.М., Шеваль Е.В. Количественный анализ выраженности действия естественных и искусственных сигналов ядрышковой локализации // XVII Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел. 2011. C. 254. 7. Musinova Y.R., Lisitsyna O.M, Kananykhina E.Y., Polyakov V.Y., Sheval E.V. The region of histone H2B with potential nucleolar localization signal (NoLS) activity // 22 Wilhelm Bernhard Workshop on Cell Nucleus. Annual Meeting. 2011. P. 99. Соискатель Я.Р. Мусинова 22
