2vr22

АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ И АНТИАДГЕЗИВНАЯ
АКТИВНОСТЬ ХИТОЗАНА
Червинец В. М., *Бондаренко В. М., Виноградов В. Ф.,
Чернин В.В., Базлов С. Н., **Комаров Б. А., Албулов А. И.,
Смоленская Л. В.
Государственная медицинская академия, Тверь, *НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи,
Москва, **ВНИТИБП РАСХН, ИПХФ РАН Черноголовка, Моск. обл. Россия.
сукцинат хи тозана
хити н М
ch 6 00 kDa
ch 3 60 kDa
ch 3 20 kDa
ch 2 60 kDa
ch 1 30 kDa
ch 1 28 kDa
ch 8 0 kDa
ch 2 6kDa
олигомеры
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
HCl 0,2%
% ч увств ительных штаммов
По данным Ю. Ф. Коваль с соавт. (1992), Л. А. Нудьга (1992), R. A. A. Muzzarelli (1986, 2001), R.
Shepherd et al. (1997) в настоящее время во всем мире нарастает интерес специалистов к препаратам
на основе хитина ракообразных, его производным и возможностям их использования в различных
областях медицины. Весьма полезными качествами хитозана при использовании его в пищевых целях
являются его сорбционные свойства, способность восстанавливать микробный пейзаж желудочнокишечного тракта, местный и общий иммунитет. Перспективным является применение хитозана в
терапии язвенной болезни желудка (ЯБЖ) и 12-перстной кишки (ЯБДПК). Однако немногочисленными
являются сведения о влиянии хитозана на мукозную микрофлору воспалительно-эрозивно-язвенных
поражениях желудка и 12-перстной кишки.
Методом диффузии в агар определяли чувствительность 145 штаммов бактерий, относящихся к
14 родам, выделенных из биоптатов слизистой оболочки больных ЯБЖ и ЯБДПК. В результате
проведенных исследований установлено, что большинство микроорганизмов в той или иной степени
чувствительны к 1% раствору хитозана на 0,2% водном растворе соляной кислоты, включая
Helicobacter pylori. Исключение составляли грамотрицательные Acinetobacter lwoffii, Hafnia alvei,
Pseudomonas vesiculans, грамположительные Enterococcus durans и один штамм Streptococcus
salivarius. Причем, грамотрицательные бактерии обладали чувствительностью к самой соляной
кислоте, на которой бал растворен хитозан, но даже на этом фоне Helicobacter pylori, E.coli, Serratia
marcescens, Pseudomonas putrefaciens и др. бактерии были более чувствительны к хитозану.
Грамположительные микроорганизмы были менее чувствительны к 0,2% соляной кислоте и
проявляли практически 100% чувствительность к хитозану. Грибы рода Candida показали
устойчивость к соляной кислоте и абсолютную чувствительность к хитозану.
При определении методом диффузии чувствительности пристеночной микрофлоры, выделенной
от больных с воспалительно-эрозивно-язвенными заболеваниями желудка и 12-перстной кишки, к
хитозану с разной молекулярной массой установлено (рис. 1), что пищевой хитозан с молекулярной
массой 310–350 kDа (степень дезацетилирования 75–85%) показал более выраженное антимикробное
действие по сравнению с хитозаном других ММ. К 1% раствору хитозана на 0,2% водной HCl были
чувствительны 81,7–85% исследуемых штаммов микроорганизмов. Нечувствительными были только
лактобациллы, представляющие нормальную микрофлору. 71,7% штаммов было чувствительно к
хитозану с ММ 128 и 600 kDа, 68,3% микроорганизмов – к хитозану с ММ 130 kDа, 66.6% штаммов – к
хитозану с ММ 26 kDа, 61,7% – к хитозану с ММ 260 kDа, 58,2% – к хитозану с ММ 80 kDа. К соляной
кислоте показали чувствительность 45% исследуемых микроорганизмов, а к хитину – 21,7%. К
олигомерам хитозана вся исследуемая микрофлора оказалась устойчивой.
Рис. 1. Степень чувствительности микроорганизмов к хитозану разной молекулярной массы
Наиболее восприимчивыми к хитозану всего диапазона ММ оказались грамположительные
стафилококки и коринебактерии. Стрептококки были малочувствительны к хитозану с ММ 80 и 600
kDа, а к остальным – восприимчивы. Микрококки чувствительны ко всем разновидностям хитозана,
устойчивы к хитину и соляной кислоте. Грибы рода Candida показали высокую чувствительность к
хитозану в диапазоне молекулярных масс от 80 до 350 kDа. H. pylori были более чувствительны к
хитозану ММ 26, 80 и 320 kDа, но малочувствительны или нечувствительны к хитозану с другой
молекулярной массой.
У бактерий родов Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Acinetobacter и Serratia наивысшая
чувствительность обнаружена к хитозану молекулярной массы 320–350 kDа. Enterobacter подавлялись
хитозаном ММ 260 kDа, и в меньшей степени хитозаном с другими параметрами, Citrobacter –
хитозаном ММ 128 и 600 kDа, Acinetobacter – всеми другими препаратами хитозана, кроме 80 kDа.
Минимальная ингибирующая концентрация хитозана представлена на рис. 2. Как видно из
рисунка более чувствительны к хитозану представители условнопатогенной микрофлоры, в то время
как нормальная микрофлора была более устойчива. Так, к хитозану в концентрации 600 мкг/мл
чувствительны Staphylococcus aureus, Peptococcus, Enterococcus durans, Candida albicans, Bacillus,
Actinomyces. А для ингибирования роста представителей нормальной микрофлоры требуется в 2 раза
большая концентрация хитозана. Так, концентрация хитозана 1200 мкг/мл ингибирует рост
непатогенных стафилококков, псевдомонад, коринебактерий, Serratia marcescens, а для подавления
роста Streptococcus salivarius необходимо 1700 мкг/мл хитозана.
1800
1600
1400
мкг/мл
1200
1000
800
600
400
Actinomyces s pp.
Hafnia alvei
Bacil lus spp.
Citrobacter freundii
Alcal igenes denitrificans
Serratia marcescens
Acinetobacter anitratus
Cory nebacteri um spp.
Candida albicans
Enter ococcus sakazaki i
Micrococcus k ristinae
Pseudomonas putrefaci ens
Peptococcus s pp.
Enter ococcus durans
Staphylococcus spp.
Streptococcus salivarius
0
Staphylococcus aureus
200
Рис. 2. Минимальная ингибирующая концентрация хитозана
На основе этого разработан способ лечения гастрита, язвенной болезни желудка и
двенадцатиперстной кишки путем трансэндоскопического орошения воспалительно-эрозивноязвенных поверхностей 1% раствором хитозана с параллельным назначением таблетированной
формы – хитодеза по 1 табл. 4 раза в день на протяжении 12 дней (Патент № 2150271 от 10.06.2000).
В опыте на 245 штаммов микроорганизмов, относящихся к 12 родам определяли степень адгезии
микроорганизмов, пользуясь средним показателем адгезии (СПА) по методу Брилис В. И. (1986) на
эритроцитах человека О (I) группы Rh+ , а также на клетках культуры ткани эпителиального типа НЕр 2.
Хитозан (1% раствор на 0,2% водной соляной кислоте) также как и лизоцим снижал СПА
большинства исследуемых микроорганизмов (рис. 3): у стафилококков на 27,5% (p<0,022), у
стрептококков – на 21,7% (p<0,005), у H.pylori – на 19,4% (p<0,002), у Enterococcus – на 21,7% (р =
0,02), у Gemella – на 15,9% (p>0,05), у Criptococcus spp. – на 34,2% (p<0,001), у Citrobacter – на 33,8%
(p<0,001), у Pseudomonas – на 27,4% (p<0,001), у Serratia – на 42,4% (р = 0,001), у Alcaligenes – на
65,7% (p<0,001).
При добавлении к смеси бактерий раствора хитозана на клетках культуры ткани эпителиального
типа НЕр 2 (рис. 4) произошло снижение СПА (р<0,05) у H.pylori в 5,9 раза, у Peptococcus spp. в 4 раза,
у S.xylosus в 3 раза, у S.warneri в 2,7 раза, у Alcaligenes denitrificans в 2 раза, у S.salivarius в 1,9 раза, у
остальных бактерий снижение СПА было недостоверно.
Сре днее ко личест во бактерий н а эритр оците (СПА)
4,5
4
3,5
контроль
хитозан
3
2,5
2
1,5
1
0,5
Alca ligenes
den itrificans
Serr atia
mar cescens
Citro bacter
freu ndii
Pse udomon as
spp.
Gemella
mor billorum
H.pylori
Crip tococcu s
spp.
Ente rococcu s
dura ns
Stre ptococcus
spp.
Stap hylococcus
spp.
0
контроль
4,5
4
хитозан
3,5
лизоцим
3
2,5
2
1,5
1
Alcaligenes
denit rificans
Serr atia
marc escens
Pseudomonas
spp.
Citrobacter
freundii
Gemella
morbillorum
Candida spp.
Enterococcus
durans
Criptococcus
spp.
Pept ococcus spp.
H.py lori
0
Streptococcus
spp.
0,5
Staphylococc us
spp.
Сре днее ко личест во бак терий н а клетк е (СПА )
Рис. 3. Влияние хитозана на адгезивные свойства микроорганизмов
Рис. 4. Средний показатель адгезии микроорганизмов на клетках НЕр 2 при действии хитозана и лизоцима
При комплексном воздействии хитозана с другими противобактериальными препаратами
наилучший антимикробный эффект наблюдали при сочетании хитозана с метиленовым синим,
хитозана с раствором Люголя (1:100), хитозана с диоксидином. К таким комбинациям были
чувствительны 75–100% всех исследуемых микроорганизмов включая H.pylori и грибы рода Candida.
Сочетание 1% раствора хитозана на 0,2% водной соляной кислоте и водного раствора висмута
повышало чувствительность стрептококков на 50%, снижало чувствительность стафилококков на 25%,
псевдомонад на 12%, H.pylori на 100%, не изменяло чувствительности грибов рода Candida.
Таким образом, исследованиями установлена высокая антимикробная активность нового
препарата хитозана, с преимущественной активностью в отношении представителей условнопатогенной микрофлоры (УПМ). Пищевой хитозан с ММ 320–360 kDa может быть рекомендован в
качестве антибактериального препарата для эндоскопического орошения эрозий и язв пищевода,
желудка и двенадцатиперстной кишки при их воспалительно-эрозивно-язвенных поражениях.
Хитозан обладает выраженным деадгезивным свойством на УПМ в том числе и на H.pylori.
Адсорбция хитозана на биополимерах обусловлена образованием связей между гидроксильными,
аминными и ацетамидными группами макромолекул хитозана и функциональными (или полярными)
группами молекул органических веществ (Косарев А. с соавт., 1995, Chen R. et al., 1995, Weltrowski M.
et al., 1995). Деадгезивная активность хитозана, по-видимому, связана с блокадой рецепторов
микробных клеток и неспособностью их к образованию связей с поверхностью эпителиальных клеток и
эритроцитов. Хитозан можно рекомендовать в качестве противоинфекционного средства.
Литература
1. Коваль Ю. В., Жоголев К. Д., Никитин В. Ю., Буланьков Ю. И., Десятова А. В. Медико-биологические
аспекты использования хитина, хитозана и их производных. Совершенствование производства хитина и хитозана
из панцырьсодержащих отходов криля и пути их использования. М., 1992, С. 30–36.
2. Косарев А., Лазарева Е. В., Кривцов Г. Г. Изучение сорбции органических веществ на хитине, хитозане и
некоторых химических производных данных биополимеров. Производство и применение хитина и хитозана.
Тез.докл. 4-й Всеросс. конф. М., Изд. ВНИРО, 1995: 77.
3. Нудьга Л. А. Биоматериалы на основе хитина и хитозана. Совершенствование производства хитина и
хитозана из панцырьсодержащих отходов криля и пути их использования. М., 1992, С. 40–44.
4. Червинец В. М., Комаров Б. А. Способ лечения хронического гастрита, язвенной болезни желудка и
двенадцатиперстной кишки. Патент на изобретение № 2150271. Официальный бюллетень Российского агентства
по патентам и товарным знакам. Изобретения. Полезные модели. 2000, № 16, II ч., С. 257.
5. Chen R., Huei and Hwa Horng-Dar. Effect of chain flexibilities of chotosans on the physical and permeability
properties of the ultrafiltration membranes prepared. 1-st International conference of the European Chitin Society.
Abstracts book. Brest-France. – September 11–13, 1995: 38.
6. Muzzarelli R. A. A., Jeuniaux C., Gooday G. W. Chitin in nature and technology. Plenum Press, New York, 1986,
420 p.
7. Muzzarelli R. A. A. Chitosan per os from dietary supplement to drug carrier. Atec Edizioni. 2001. 371 р. перевод
«Олигофарм».
8. Shepherd R., Render S., Falshaw A. Chitosan functional properties. Glycoconj J. 1997, 14 (4): 535–542.
9. Weltrowski M., Patry J., Bourget M. Reactive filter for textile dyes adsorption. 1-st International conference of
the European Chitin Society. Abstracts book. Brest-France. – September 11–13, 1995: 39.