Сравнительная характеристика методов определения

Иммунопатология, аллергология, инфектология
Immunopathology, allergology, infectology
2004,№4: 99–103
АЛЛЕРГОЛОГИЯ
Сравнительная характеристика методов определения концентрации
белка в клещевых аллергенах
В.М. Бержец, С.В. Хлгатян, В.А. Акутина, Л.А. Пищулина, Н.С. Петрова
ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН, лаборатория по разработке аллергенов, Москва
The comparative characteristic of methods of protein quantity determination in
ticks allergens
V.M. Berjets, S.V. Chlgatian, V.A. Akugina, L.A. Pischulina, N.S. Petrova
SU SRI of vaccines and sera by I.I. Mechnikov RAMS, antigens development laboratory, Moscow
Ключевые слова
Keywords
Клещи, аллергены, белок, методы определения.
Ticks, allergens, protein, methods of determination.
Около 10% населения в той или иной степени страдают аллергическими заболеваниями [1, 2]. Клинико-иммунологическими исследованиями, проведенными у больных с аллергией к домашней пыли, установлено, что в
этиологии таких аллергозов, как бронхиальная астма, атопический дерматит, ринит и др.
основным аллергизирующим фактором, присутствующим в большинстве образцов домашней пыли, являются пироглифидные
микроклещи рода Dermatophagoides и продукты их жизнедеятельности [3, 4].
Специфическая диагностика и специфическая иммунотерапия (СИТ) в противоаллергическом лечении тесно связаны с оценкой эффективности используемых препаратов. Для диагностики и лечения аллергических заболеваний, вызванных клещевой сенсибилизацией, используются лечебно-диагностические аллергены, полученные из клещей
Dermatophagoides pteronyssinus и Dermatophagoides farinae [9, 15]. Однако, несмотря на широкое
применение этих препаратов в медицинской
практике, проблема стандартизации и контроля лечебных и диагностических аллергенов остается нерешенной [6, 7].
Одним из важных вопросов, по которому
нет единого мнения среди исследователей, является стандартизация препаратов аллергенов по
содержанию в них белка. Окончательно этот
вопрос не решен до сих пор. Среди методов определения концентрации белка в препаратах
аллергенов можно выделить азотометрические,
к которым относится метод Кьельдаля, Несслера и некоторые другие, и колориметрические:
биуретовая реакция, метод Лоури, методы, основанные на реакции белка с красителем [3].
Азотометрические методы основаны на
определении количества белкового азота, образующегося при разрушении входящих во
все белки аминокислот. Неочищенные аллергены помимо азота в белковых компонентах
содержат неспецифические продукты, в состав которых тоже входит азот, что может
приводить к завышенным показателям белка.
Поэтому, в настоящее время концентрацию
белка в неочищенных аллергенах оценивают
по содержанию общего азота, пересчитанного в единицах белкового азота — PNU
(protein nitrogen) [4]. С некоторым приближением 1 ед. PNU соответствует 0,06 мкг белка (0,00001 мг азота белкового). Азотометрические методы трудоемки и плохо поддаются
стандартизации, кроме того, на результаты
определения оказывает воздействие целый
ряд дополнительных факторов. Колориметрические методы достаточно просты и недороги, хотя большинство из них не всегда воз-
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2004 N° 4
99
В.М. Бержец, С.В. Хлгатян, В.А. Акутина, Л.А. Пищулина, Н.С. Петрова
можно применить к исследованию белков в
аллергенных экстрактах.
Согласно данным литературы в настоящее
время применяют следующие методы для определения белка в клещевых аллергенах: метод сжигания с реактивом Несслера, метод
Кьельдаля, Лоури, биуретовый метод, метод
Бредфорда [3, 4].
Представленная статья посвящена сравнительному анализу результатов определения
концентрации белка в клещевых аллергенах
разными методами и выбору наиболее адекватного из них.
Материалы и методы
В работе использовались аллергены следующих серий: 1, 2, 3, 36, 37, 60, полученные из культур клещей D.farinae и D.pteronyssinus методом
водно-солевой экстракции с использованием
жидкости Эванса-Кока. Определение белка
проводили методом сжигания по Несслеру, биуретовым методом, методами Лоури и Бредфорда. Реакции ставили по стандартным схемам [3, 5, 14]. Показания оптической плотности измеряли на спектрофотометре при соответствующих длинах волн. Для каждого метода
строили калибровочные кривые, используя в
качестве стандарта раствор бычьего сывороточного альбумина в различных разведениях.
Полученные результаты были обработаны
статистически с использованием компьютерной
программы Excel 5.0.
Результаты и обсуждение
В связи с тем, что используемая технология получения клещевых аллергенов связана
с экстракцией исходного сырья в фосфатном
буфере и феноле, полученный препарат содержит высокие концентрации солей фосфатов и фенола, которые, как известно, искажают результаты определения белка любым известным методом. Поэтому непосредственно
перед стандартизацией клещевого аллергена
по белковому содержанию мы ввели обязательный предварительный диализ клещевого
экстракта против дистиллированной воды,
что позволило нам освободиться от солей и
низкомолекулярных примесей и повысить чистоту полученного клещевого аллергена. В
таблице № 1 приведены примеры показателей
концентрации белка в клещевых аллергенах до
и после диализа. Как можно видеть из таблицы
в зависимости от метода определения, содержание белка в недиализованных образцах серийных аллергенов в среднем на 32–62 % выше, чем
в образцах, подвергнутых диализу, что, как упоминалось ранее, может быть связано с наличием фенола и примесей, завышающих истинное
значение концентрации белка.
Аллергенные экстракты являются многокомпонентными системами, включающими
протеины, гликопротеины, пептиды, углеводы
и др. [10, 11]. Для стандартизации условий
анализа белок определяли в специально приготовленных растворах клещевых аллергенов.
Мы сравнивали показатели концентрации
белка в аллергенных экстрактах азотометрическим (метод Несселера) и несколькими колориметрическими методами (биуретовая
реакция, Лоури и Бредфорда).
В результате проведенных исследований выявлено, что значения концентрации белка в об-
Таблица 1
Сравнение усредненных показателей содержания белка в некоторых сериях клещевых аллергенов до и
после диализа
Серии
аллергенов
из клещей
D.farinae
Биуретовый метод
(мг/мл)
до
диализа
№1
№2
№3
0,7563
0,7875
0,7375
Среднее
100
изменение
концентрации
белка (%)
после
диализа
изменение
Метод Бредфорда
концентрации (мг/мл)
белка (%)
до
после
диализа диализа
0,2517
0,3354
0,2804
66,7
57,4
62,0
37,8
27,4
32,1
62,0
0,0362
0,0332
0,0486
0,0225
0,0241
0,0330
32,4
Immunopathology, Allergology, Infectology 2004 N° 4
Аллергология: Сравнительная характеристика методов определения концентрации белка в клещевых аллергенах
разцах клещевых аллергенов всеми перечисленными методами, достоверно (p<0,001) различны, причем, определяемые концентрации разнились в два и более раз (табл. № 2). Так сравнение колориметрических методов показало, что
биуретовая реакция, основанная на способности пептидной связи молекулы белка образовывать цветное комплексное соединение меди в
щелочной среде [3], выявляет белки различной
структуры, но дает завышенные результаты и
обладает недостаточной аналитической чувствительностью. Согласно нашим данным метод
биуретовой реакции применим только в сериях
клещевых аллергенов с высоким содержанием
белка (чувствительность метода 0,1–2,0 мг/мл).
В то же время метод Лоури, основанный на
свойстве ароматических аминокислот давать
цветную реакцию, значительно чувствительней
(0,01 — 0,10 мг/мл) биуретового метода [14].
Однако он не может быть применен в недиализованных препаратах клещевых аллергенах
из-за высокого содержания в них фенола, что
создает неудобства для определения белка в
коммерческих препаратах аллергенов. Определение белка в различных сериях клещевых
аллергенов проводили еще одним колориметрическим методом — методом Бредфорда,
основанным на сорбции реагента Кумасси G250 на белках. Этот метод обладает высокой
чувствительностью (0,005–0,050 мг/мл), прост
в исполнении и удобен для определения белка
в серийных препаратах клещевых аллергенов.
Кроме того, отклонения показателей оптической плотности параллельных проб находятся в пределах допустимых погрешностей.
Как видно из табл. № 2 расхождения в показателях содержания белка, определяемого
различными методами, в некоторых случаях
превышает десять раз, что может быть обусловлено различными причинами. Одной из
них может быть чувствительность метода,
т.е. способность достоверно различать две
близкие концентрации белка. Применительно к фотометрии чувствительность метода
прямо зависит от разницы значений адсорбции двух близлежащих концентраций. Другой причиной может служить погрешность,
привносимая возможными интерферирующими агентами. Однако основной недостаток
всех колориметрических методов заключается в различной способности белков разной
структуры взаимодействовать с красителями.
Поэтому, для наиболее достоверной оценки
концентрации белка в клещевых аллергенах
целесообразно определять его двумя разными
методами, при этом для уменьшения ошибки
должны быть найдены специальные пересчетные коэффициенты. Однако при большом
объеме производства препаратов аллергенов
такой подход является не рациональным.
Результаты, полученные с помощью колориметрических методов, мы сравнивали с азотометрическим методом сжигания по Несслеру.
Данный метод определения белка имеет высокую чувствительность (0,01–0,4 мг/мл) и основан на свойстве реактива Несслера давать цветную реакцию с ионами аммония, образующимися после минерализации белковых продуктов. Этот метод широко используется в нашей
стране на предприятиях по производству пре-
Таблица 2
Примеры результатов определения белка (мг/мл) колориметрическими методами в диализованных клещевых аллергенах
Серии аллергенов
Биуретовый метод
Метод Бредфорда
Метод Лоури
0,2517
0,3354
0,2804
0,2917
0,0225
0,0241
0,0330
0,0370
0,0631
0,0657
0,0728
0,0787
0,1892
0,1875
0,0265
0,0256
0,0562
0,0555
D. farinae
№1
№2
№3
№ 60
D. pteronyssinus
№ 36
№ 70
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2004 N° 4
101
В.М. Бержец, С.В. Хлгатян, В.А. Акутина, Л.А. Пищулина, Н.С. Петрова
паратов аллергенов. Содержание белка выражают в единицах белкового азота — PNU. Метод
сжигания по Несслеру трудоемок, однако, получаемые результаты очень хорошо воспроизводимы и не зависят от структуры белков, входящих в состав клещевых аллергенов. Нами показано, что при сравнении метода Лоури и метода определения белкового азота с реактивом
Несслера, значения концентраций белка в сериальных препаратах аллергенов оказались очень
близкими. Концентрации белка, определенные
методом Бредфорда и с реактивом Несслера
отличались в среднем в два раза (табл. № 3).
Идеального метода определения концентрации белка пока не существует. У каждого есть
свои достоинства и недостатки. Создание «идеального метода» неосуществимо в силу уникальности структуры каждого белка и гетерогенности клещевых аллергенов.
Проанализировав наши результаты, можно сделать вывод о том, что для количественного определения белка в серийных препаратах клещевых аллергенов, которые содержат
высокие концентрации фенола, наиболее
адекватным является метод определения белкового азота по Несслеру в единицах PNU. Он
достаточно чувствителен, точен, воспроизводим и менее специфичен, чем другие рассмотренные в данной работе методы. Однако необходимо отметить, что метод Бредфорда —
наиболее чувствительный из всех рассмотренных выше, и он может быть с успехом применен в препаратах аллергенов с низкой концентрацией белка, а простота и экономичность данного метода позволяет использовать его на производстве при изготовлении
крупных партий клещевых аллергенов. Кроме
того, важным является тот факт, что значение концентрации белка не всегда является
показателем биологической активности клещевых аллергенов, так как последние содержат как малоактивные, так и неактивные белковые компоненты. Следовательно, оценка
препаратов клещевых аллергенов должна сопровождаться дополнительной информацией
об аллергенной активности или дополнительным контролем перед применением в клинических условиях.
Таблица 3
Сравнение усредненных значений определения белка методами Бредфорда, Лоури и методом сжигания по Несслеру
Серии
аллергенов
Метод
Бредфорда
(мг/мл)
Метод
Лоури
(мг/мл)
Метод
сжигания
по Несслеру
Соотношение
содержания
белка
0,0225
0,0241
0,0330
0,0370
0,0631
0,0657
0,0728
0,0787
0,053
0,057
0,062
0,066
1: 2,90: 2,35
1: 2,73: 2,37
1: 2,21: 1,78
1: 2,10: 1,78
0,0265
0,0256
0,0562
0,0555
0,043
0,041
1: 2,12: 1,6
1: 2,17: 1,6
D. farinae
№1
№2
№3
№ 60
D. pteronyssinus
№ 36
№ 70
Среднее соотношение белка
1: 2,37:1,9
Литература
1. Адо А.Д. Общая аллергология. М., 1985.
2. Канчурин А.Х., Вайцекаускайте Р.Л. Аллергия к клещам, Вильнюс, 1988.
3. Фармакопейная статья. Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля
медицинских иммунобиологических препаратов. ФС 42–
3874–99.-1999: 2–14.
102
4. Фрадкин В.А. Диагностические и лечебные аллергены.
М., 1990: 32–33.
5. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the
quantitation ofmicrogram quantities of protein using the
principal of protein — dye binding. Anal. Biochem. 1976, V.72:
248–254.
6. Dreborg S., Einasson R., Longbottom J.I. The chemistry and
Immunopathology, Allergology, Infectology 2004 N° 4
Аллергология: Сравнительная характеристика методов определения концентрации белка в клещевых аллергенах
standardization of allergens. -In: Handbook of Experimental
Immunology. Oxford., 1986.
Amylase. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 1991; V.94, N 1–
4: 357–358.
7. Dust mite allergens and asthma: Report of a Second
International Workshops J. Allergy Clin. Immunol. 1992., V.
89: 1046–1060.
11. Lake F.R., Ward L.D., Simpson R.J. et al. House Dust MiteDerived Amylase -Allergenicity and Physicochemical
Characterization. J.Allergy Clin. Immunol. 1991, V. 87, N6:
1035–1042.
8. Hewitt C.R., Fosters S., Phillips C. et al. Mite allergens:
significance of enzymatic activity. Allergy, 1998, V. 53, N 48
suppl: 60–63.
12. Leung D.Y.M. Molecular-Basis of Allergic Diseases.
Molecular Genetics and Metabolism. 1998, V.63, N3: 157–167.
9. Ishii A., Noda K., Nagai Y. et al. Biological and biochemical
properties of the house dust mite extract Dermatophagoides
farinae. Jap. J. Exp. Med. 1973, V. 43: 495–507.
10. Lake F.R., Ward L.D., Simpson R.J. et al. Allergenicity and
Physicochemical Characterization of House Dust Mite Derived
13. Lovik M., Gaarder P.I., Mehl R.The house-dust mite: its
biology and role in allergy. A synopsis. Allergy, 1998, V. 53, N 48
Suppl: 121–135.
14. Platts-Mills T.A.E., Chapman M.D. Dust mite: immunology,
allergic disease and environmental control. J. Allergy Clin.
Immunol. 1987, V.80: 755–775.
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2004 N° 4
103