ТЕХНИКА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

ТЕХНИКА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
IN VITRO КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
РАСТЕНИЙ
Лекция 2
ПЛАН ЛЕКЦИИ
1. Общие требования к лаборатории. Условия
асептики при выполнении работ по
культивированию растений in vitro.
2. Методы и приемы стерилизации растительного
материала при введении в культуру.
3. Питательные среды для культивирования
растительных клеток и тканей in vitro.
4. Регуляторы роста растений и их
использование для культивирования
растительных клеток и тканей in vitro.
5. Физические условия культивирования клеток и
тканей растений
Основное условие
успешного культивирования –
СТЕРИЛЬНОСТЬ
СТЕРИЛИЗАЦИИ ДОЛЖНЫ ПОДВЕРГАТЬСЯ:
•операционная комната, в которой производят
изоляцию и посадку культур;
•одежда и руки работающего персонала;
•посуда, используемая для культивирования
объектов;
•все необходимые инструменты и материалы
(пинцеты, ланцеты, петли и др.);
•питательные среды;
•объекты культивирования.
Стерилизация операционной комнаты:
• тщательное удаление загрязнений и пыли
со всех поверхностей с помощью
мыльного раствора;
• УФ-облучение
СПОСОБЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ ПОСУДЫ:
•сухим горячим жаром в сушильном
шкафу. Продолжительность стерилизации
при 150 °С – 2,5 ч,
160 °С – 2 ч,
170 °С – 1 ч.
•автоклавирование при 2 атм (133°С) в
течение 25-30 мин.
СТЕРИЛИЗАЦИЯ ИНСТРУМЕНТОВ:
•предварительная
(сухим горячим жаром в сушильном шкафу в
течение 2 ч при 140°С; кипячением);
•непосредственная
(в ламинар-боксе инструменты стерилизуют еще
раз, помещая в фарфоровый стакан с 96%-ным
этиловым спиртом и обжигая в пламени
спиртовки)
Стерильный инструмент используют
только для одноразовой манипуляции!
СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
Вариант
Среды, не
содержащие
термолабильные
элементы
Термолабильные
элементы
питательных
сред
Способы
стерилизации
Автоклавирование
при 0,5-0,75 атм и
115-120°С
Фильтрование
через
стерильные
бактериальные
фильтры
25-40 мл – 15-20 мин
2-4 л – 30-40 мин
Дробная
стерилизация
(тиндализация)
Холодная
стерилизация
Некоторые химические агенты, используемые для
поверхностной стерилизации растительных
тканей:
соединения, содержащие активный хлор, – 0,5-1%
(гипохлорит кальция, гипохлорит натрия, хлорная
известь, хлорамин);
двухлористая ртуть (сулема), 0,1-1 %-ный раствор;
формалин, 5%-ный раствор;
перекись водорода, 10-20%-ный раствор;
этиловый спирт, 70%-ный раствор;
фенол, 5%-ный раствор;
CuSO4,10%-ный раствор;
антибиотики.
ТЕХНИКА ПРОВЕДЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОЙ
СТЕРИЛИЗАЦИИ РАСТИТЕЛЬНОГО
МАТЕРИАЛА:
1) Предварительная стерилизация
(проводят очистку поверхности путем ее промывания
проточной водой; обработки этанолом (70%-ный раствор
в течение 1 мин), растворами CuSO4 либо KMnO4)
2) Стерилизация
(в условиях ламинар-бокса предварительно
простерилизованные ткани помещают в стерилизующий
раствор)
3) Постстерилизация
(растительный материал отмывают от стерилизующего
агента 3-4 порциями стерильной дистиллированной воды)
Главные практические аспекты получения
культуры и ее поддержания группируются
вокруг проблемы подбора подходящей среды
для культивирования
Основные компоненты
питательных сред:
макроэлементы;
микроэлементы;
источники углерода;
витамины;
регуляторы роста
ПРИМЕРЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
Среда Мурасиге и Скуга (MS) – наиболее
универсальная и многоцелевая среда, пригодная для
культивирования клеток и тканей многих видов растений.
Среда Гамборга и Эвелега (среда В5) дает хорошие
результаты при культивировании клеток и тканей бобовых
растений и злаков.
Среда Уайта используется для укоренения побегов и
нормального роста стеблевой части после регенерации.
Среда Ничей, китайские среды рекомендуются для
индукции андрогенеза в культуре пыльников.
Среда Као и Михайлюка используется для
культивирования единичных (или с малой плотностью
высева) изолированных протопластов и клеток.
ФИЗИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ:
•условия освещения;
•температура;
•условия аэрации;
•осмотическое давление;
•газовая фаза и др.