Document 2299357

2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В настоящее время особую актуальность имеют
исследования по разработке методов сохранения растений, ареалы и численность которых резко снижаются, а также для уникальных форм, сортов и генотипов растений, расширяющих и улучшающих сортимент возделываемых растений. В связи с прогрессом селекции и появлением большого количества новых сортов, имеющих сложное генетическое происхождение, технологии выращивания посадочного материала требуют усовершенствования.
Одними из новых и перспективных ягодных культур для Западной Сибири являются смородина золотистая (Ribes aureum Pursh) и голубика топяная (Vaccinium
uliginosum L.). Смородина золотистая представляет интерес в связи с поздним, по
сравнению с другими видами смородины, созреванием ягод, жаро-, засухоустойчивостью, она практически не поражается болезнями и редко – вредителями (Ягудина, 1976). Голубика топяная, широко распространенная на территории Западной
Сибири, хорошо зарекомендовала себя в условиях интродукции (Снакина, 2007).
Сорта североамериканской голубики, созданные на основе голубики щитковой
(V. corymbosum L.), имеющие огромный спрос на мировом потребительском рынке, в Сибири недостаточно зимостойки. Одной из особенностей многих перспективных сортов R. aureum и V. uliginosum является их невысокая способность к
воспроизводству при традиционных способах размножения. Применение современных методов вегетативного размножения, таких как клональное микроразмножение оправдано и экономически эффективно, особенно в отношении ягодных культур (Ruzic, Lazic, 2006). Использование методов размножения in vitro является оптимальным решением задачи как для размножения растений с нарушенным процессом воспроизводства, так и для массового размножения ценных генотипов растений (Высоцкий, 1998; Бутенко, 1999).
Считается, что все виды растений потенциально могут быть размножены
через культуру тканей, но далеко не для всех видов эти методики разработаны
(Мамаева и др., 2008). Широкому использованию методов клонального микроразмножения для многих видов, сортов и форм растений препятствует то, что
морфогенетический потенциал и регенерационная способность культивируемых тканей часто строго зависят от генотипа и условий культивирования. В
связи с этим, возникает необходимость идентификации растительного материала, отражающая происхождение и индивидуальные особенности генотипа, степень сходства и различия отдельных генотипов растений (Окунева, 1998).
Таким образом, при решении задачи сохранения, воспроизводства и рационального использования коллекционного фонда особое значение приобретает
вопрос всестороннего изучения биологических особенностей растений как исходной базы для репродукции.
Цель и задачи исследований. Цель данной работы – выявить особенности
размножения сортов Ribes aureum и Vaccinium uliginosum в культуре пазушных
почек in vitro и дать оценку эффективности данного метода. В соответствии с
этим были поставлены следующие задачи:
1
– провести идентификацию сортов Ribes aureum и Vaccinium uliginosum с
помощью анализа водосолерастворимой фракции белков семян;
– разработать эффективные методы получения стерильной культуры эксплантов;
– определить влияние возраста экспланта на микроразмножение Ribes
aureum;
– оптимизировать состав питательных сред на всех этапах культивирования;
– исследовать особенности влияния регуляторов роста и физиологически
активных добавок питательной среды на процессы микроразмножения эксплантов на всех этапах культивирования;
– разработать методы адаптации растений-регенерантов к условиям ex vitro;
– дать экономическую оценку эффективности метода клонального микроразмножения.
Научная новизна. Впервые предложен метод выявления особенностей
культивирования эксплантов в зависимости от генотипа растений с использованием метода белковых маркеров, и на основе этого предложен способ оптимизации процесса микроразмножения. Разработаны эффективные приемы получения
асептической культуры первичных эксплантов. Показано, что в культуре in vitro
почки от зрелых растений смородины золотистой реювенилизируются. Изучена
реакция эксплантов на экзогенные регуляторы роста и физиологически активные
добавки питательной среды. Показана возможность успешной адаптации растений-регенерантов на гидропонной установке «Минивит». Проведена оценка
экономической эффективности метода микроразмножения 4 сортов Ribes
aureum и 4 сортов Vaccinium uliginosum, и показана его рентабельность.
Защищаемые положения:
1. Использование предварительной идентификации сортов Ribes aureum методом белковых маркеров позволяет выявить специфику их культивирования in vitro.
2. Увеличение коэффициента размножения сортов Vaccinium uliginosum
достигается применением двухстадийного этапа собственно размножения.
Практическая и теоретическая ценность. На основании полученных результатов предложены технологии ускоренного размножения и адаптации смородины золотистой и голубики топяной, создана коллекция этих растений in vitro.
Работа в лабораторных условиях дает возможность планировать выпуск посадочного материала к определенному сроку. Применение разработанных элементов
технологий позволяет более успешно решать проблему ускоренного размножения
ценных сортов и форм и сохранения ценного растительного материала.
Показана возможность использования метода белковых маркеров для выявления особенностей культивирования эксплантов в зависимости от генотипа
растения.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на II Научнопрактической конференции в рамках 3-го Фестиваля науки в г. Москве и Биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех» «Перспективы развития инноваций в биологии (г. Москва, 2008), на Молодежной Всероссийской школесеминаре «Современные фундаментальные проблемы физиологии и биотехно2
логии растений и микроорганизмов» (г. Томск, 2008), на XXXV научной конференции студентов, магистрантов, аспирантов и учащихся лицейных классов
«Дни молодежной науки в Алтайском государственном университете» (Барнаул, 2008), на форуме о биологических и экологических проблемах в лесном хозяйстве г. Хэйхэ, провинции Хэйлунцзян (г. Хэйхэ, 2009), на Всероссийской
конференции с международным участием «Ботанические сады и актуальные
проблемы интродукции растений на современном этапе» (Томск, 2010), экспонировались на 2-й Биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех-2008»
(г. Москва, 2008), на Международной выставке-конгрессе «Высокие технологии. Инновации. Инвестиции» (г. Санкт-Петербург, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том
числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 165 страницах
машинописного текста, состоит из введения, списка сокращений, 6 глав, выводов, списка литературы; содержит 33 рисунка и 18 таблиц. Список литературы
включает 303 работы, в том числе 170 – на иностранных языках.
ГЛАВА 1. СОСТОЯНИЕ ИЗУЧЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ
(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
На основе литературных данных рассмотрены вопросы использования методов биотехнологии в системе сохранения и воспроизводства ценных генотипов растений. В данной главе проанализированы основные факторы, влияющие на
процесс микроразмножения: первичный эксплант, генотип растения, компоненты
питательной среды, физические условия культивирования. Рассмотрены методы
идентификация ягодных культур на основе молекулярно-генетических маркеров.
Представлен обзор исследований, касающийся размножения in vitro представителей подсемейства Vaccinioideae Arnott и семейства Grossulariaceae DC.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы (объекты) исследования. Исходным материалом для разработки метода микроразмножения послужили 5-7-летние растения смородины
золотистой сортов Валентина, Дар Алтая, Ида, Сибирское Солнышко селекции
НИИСС им. М.А. Лисавенко (г. Барнаул) и 15-летние растения голубики топяной сортов Иксинская, Шегарска, Юрковская и Дивная селекции ЦСБС СО
РАН (г. Новосибирск).
Для электрофоретического изучения водосолерастворимой фракции белков
семян в работе анализировались образцы семян смородины золотистой сортов
Сибирское Солнышко, Дар Алтая, Ида, Валентина, Подарок Ариадне, Барнаульская, Левушка и голубики топяной сортов Иксинская, Шегарская, Дивная и
форм № 2.38, 3.35, 3.41, 5.29, 5.32, 5.33, 5.35, 5.36, 5.45, 7.29, 8.46. Материал по
смородине золотистой были взяты от коллекционных растений НИИСС
им. М.А. Лисавенко, а по голубике топяной – из коллекции лаборатории интродукции пищевых растений ЦСБС СО РАН.
3
Для изучения влияния возраста экспланта на микроразмножение смородины
золотистой использовались зародыши из семян сортов Сибирское Солнышко,
Дар Алтая, Ида, Валентина.
Методы и условия проведения исследований. В работе использованы
общепринятые приемы работы с культивируемыми изолированными тканями
растений (Калинина и др., 1980).
Поверхностную стерилизацию исходного растительного материала (пазушные почки) осуществляли путем погружения почек на 3–5 с в 70 %-ный
этанол, затем в 0,1 %-ный раствор сулемы (20 мин.) для смородины золотистой
и в 0,2 %-ный раствор сулемы (30 мин.) для голубики топяной, с последующим
промыванием в стерильной дистиллированной воде (не менее четырех раз).
Первичными эксплантами служили меристематические верхушки 0,5–1,0 мм,
выделенные из почек с использованием стереомикроскопа МБС-9.
Зрелые плоды смородины золотистой поверхностно стерилизовали путем
обжигания в пламени спиртовки, затем из них извлекали семена, а из семян
изолировали зародыши, которые культивировали на тех же вариантах питательных сред, что и почки от взрослых растений.
Для культивирования эксплантов были испытаны составы агаризованных
питательных сред: Мурасиге и Скуга (МС); Гамборга и Эвелега (В5); Ли и де
Фоссарда (ЛФ); Мак Коуна (МК); Андерсона (А); Лепуавра (Л); Као и Михайлюка (КМ); Такаяма, Мисава, Ко и Мисато (ТМ). Микросоли и органические
соединения добавляли по прописи МС. Для выявления влияния источника углеводов на развитие эксплантов в питательную среду добавляли сахарозу и/или
глюкозу в концентрации 30 или 45 г/л. pH среды до автоклавирования 5,8–5,9.
На этапе собственно размножения изучено влияние различных цитокининов: ИПА (1 – 20 мкМ); БАП (1, 3, 5, 10 и 20 мкМ), Кн (5 и 10 мкМ), ИПА (5 и
10 мкМ), предшественника цитокининов – сульфата аденина (Ас) (100 и
200 мг/л), ГК3 (1, 3, 5 мкМ), а также других физиологически-активных веществ:
аскорбиновой кислоты (1 и 10 мг/л) и глютатиона (50, 100, 200 мг/л).
Для укоренения использовали питательную среду ½ МС для смородины золотистой и А – для голубики топяной. В качестве индукторов ризогенеза использованы ауксины: ИМК (2–15 мкМ), ИПК (2–15 мкМ), ИУК (1–10 мкМ) и
НУК (0,05–5 мкМ).
Адаптацию растений-регенерантов проводили на гидропонной установке
«Минивит 0,35», заполненной питательным раствором минеральных солей по
прописи ½ А или ¼ МС. Продолжительность пассажа составляла 30–35 суток
для голубики топяной и 40 суток для смородины золотистой.
Экспланты культивировали в следующих условиях: фотопериод – 16/8 часов свет/темнота, освещенность – 2–3 клк, температура – 24 ± 1°С.
Изучение белков семян проводили методом денатурирующего электрофореза (вертикальный электрофорез) по Лаемли (Laemli, 1970). В качестве электродного буфера использовали трис-глициновый буфер (рН 8,3), содержащий
0,1 % ДСН. Применяли 10 %-ный разделяющий и 5 %-ный ПААГ с 0,1 % ДСН.
Для экстракции белков семенной материал тщательно растирали в ступке
4
(семян было не менее 30 шт. в навеске), взвешивали по 20 мг и заливали 0,15М
фосфатным буфером (рН 7,0) на сутки. Образцы готовили на 0,0625 М трис-НСl
буфере с рН 6,8, включавшем 0,2 % ДСН, глицерин, меркаптоэтанол и 0,001 %
раствор бромфенолового синего. В каждый карман гелевой ячейки вносили по
15 мкл образца. Процесс разделения белков проходил при 18°С в течение 2 часов. По окончании электрофореза гелевые пластинки ополаскивали водой и
производили окраску в растворе Кумасси голубого R-250 (0,2 %). Через 18 часов отмывали гель в смеси ледяной уксусной кислоты (7 %), этилового спирта
(25 %) и дистиллированной воды (68 %).
Все эксперименты проводились в 2−3 повторностях. При обработке результатов использовался пакет статистического анализа Microsoft Excel. В таблицах показаны средние арифметические величины и доверительные интервалы. Доверительность оцениваемых показателей принимали на уровне значимости Р < 0,05 (Лакин, 1990).
ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ВОДОСОЛЕРАСТВОРИМОЙ ФРАКЦИИ
БЕЛКОВ СЕМЯН RIBES AUREUM И VACCINIUM ULIGINOSUM
При разработке методов клонального микроразмножения первостепенное
значение имеет генотип растений. Для идентификации изучаемых сортов был
использован метод электрофореза в ПААГ. Нами были изучены водосолерастворимые фракции белков семян смородины золотистой (7 сортов) и голубики
топяной (3 сорта и 11 форм).
Полученные спектры белков смородины золотистой (рис. 1) были проанализированы по качеству (наличие и отсутствие компонента) и по сходным позициям
полипептидов разделены на 4 группы: № 1 – Дар Алтая, Валентина, Подарок Ариадне, Барнаульская; № 2 – Сибирское Солнышко; № 3 – Ида; № 4 – Левушка.
1
2
3
4
5
6
7
8
Рис. 1. Электрофореграммы водосолерастворимой фракции белков семян Ribes aureum
Сорта: 1 – Сибирское Солнышко (белки эндосперма); 2 – Сибирское Солнышко (белки семян);
3 – Дар Алтая; 4 – Ида; 5 – Валентина; 6 – Подарок Ариадне; 7 – Барнаульская; 8 – Левушка
5
Электрофорез запасных белков семян сортов голубики топяной не показал
по данному маркеру сортовых различий. С другой стороны, четкие морфологические отличия сортов (компактность куста, цвет и размер цветка, форма ягод)
позволили разделить сорта голубики топяной на 2 группы, соответствующие
исходным популяциям: № 1 – Иксинская (иксинская популяция); № 2 – Юрковская, Шегарская, Дивная (юрковская популяция).
ГЛАВА 4. ОСНОВНЫЕ СТАДИИ РАЗМНОЖЕНИЯ RIBES AUREUM
И VACCINIUM ULIGINOSUM В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
4.1. Введение эксплантов в культуру in vitro
Смородина золотистая. Применение этанола и сулемы для поверхностной
стерилизации почек оказалось приемлемым и эффективным: выход неинфицированных эксплантов смородины золотистой составил 93,5 %, из них 90 % были жизнеспособными. Выделенные меристематические верхушки помещали на
питательные среды различного минерального состава (МС, B5, А), дополненные БАП. Оптимальной для культивирования оказалась среда MС, на ней экспланты лучше росли и развивались, тогда как экспланты, культивируемые на
питательных средах B5 и А, уступали по темпам роста и развития.
Голубика топяная. Кроющие чешуи пазушных почек оказались надежной
защитой меристематических верхушек от токсичного действия сулемы, выход
неинфицированных жизнеспособных эксплантов составил 100 %. Выделенные
меристематические верхушки помещали на среду А, дополненную 5 мкМ ИПА,
и к концу пассажа они сформировали 2–5 побегов длиной 10–15 мм.
4.2. Особенности этапа собственно размножения
Смородина золотистая. На этапе собственно размножения при изучении
влияния цитокининов (БАП, Кн, ИПА) и Ас на рост и развитие пазушных почек
установлено, что максимальный стимулирующий эффект для изучаемых сортов
достигается при введении в среду 5 мкМ БАП (табл. 1). Относительно высокие
концентрации БАП (10 или 20 мкМ) индуцируют развитие большего количества
пазушных почек и, таким образом, повышают коэффициент размножения, но такие концентрации БАП также стимулируют необратимую гипергидратацию.
Отмечено положительное влияние на морфологию развивающихся побегов
ГК3. Только при культивировании пазушных почек смородины золотистой на
среде, содержащей по 5 мкМ БАП и ГК3, длина побегов увеличилась почти
вдвое по сравнению со средой, содержащей только 5 мкМ БАП (8,2±1,4 мм
против 4,8±0,6 мм) (рис. 2). Одной из наиболее актуальных проблем при культивировании древесно-кустарниковых растений является поликонденсация веществ фенольной природы, которая приводит к снижению показателей роста и
развития культур in vitro. Одна из возможных причин этого негативного эффекта – возраст исходного растительного материала и его физиологическое состояние. Для изучения специфики культивирования эксплантов (почек) от ювенильного и реювенилизированного растительного материала в культуру in vitro
были введены зрелые зародыши смородины золотистой (табл. 2).
6
Таблица 1
Влияние БАП на коэффициент размножения Ribes aureum in vitro, n = 15
БАП, мкМ
0
1
3
5
10
20
Сибирское Солнышко
0
1,0
3,2±0,7
3,0±0,7
3,3±0,8
4,1±0,3
Сорт
Ида
Валентина
0
0
2,1±0,8
1,6±0,5
3,0±0,6
2,9±0,6
3,7±0,6
3,6±0,7
4,3±0,5
4,0±0,5
4,8±1,0
4,6±0,7
а
Дар Алтая
0
2,2±0,4
3,1±0,7
3,5±0,7
4,2±0,4
5,0±0,8
б
Рис. 2. Побеги Ribes aureum (сорт Валентина) in vitro на средах MС,
содержащих БАП 5 мкМ (а) и БАП 5 мкМ + ГК3 5 мкМ (б)
Таблица 2
Влияние происхождения экспланта на рост и развитие растений Ribes aureum
Физиологически
активные
вещества
БАП 5 мкм +
ГК 5мкМ +
глютатион 200 мг/л
Вид
экспланта
Пазушные почки
(реювенилизированный)
Зрелые зародыши
(ювенильный)
БАП 2 мкм
Пазушные почки
(реювенилизированный)
Зрелые зародыши
(ювенильный)
15
18
20
20
10
11
13
12
12
15
15
15
Высота
растения,
мм
8,9±1,5
10,2±1,6
10,4±0,8
10,0±0,7
9,4±2,0
12,1±1,6
13,1±1,1
12,4±1,0
4,5±0,7
5,5±0,9
4,9±1,1
5,3±0,6
Коэффициент
размножения,
шт./экспл.
3,0±0,7
4,2±0,8
6,8±0,7
6,7±0,6
3,8±0,8
4,1±0,7
6,8±0,9
6,6±1,0
2,7±1,0
3,4±0,9
3,7±0,7
3,5±0,8
11
10
15
15
9,3±1,3
9,8±1,8
10,2±0,8
10,1±1,2
4,1±0,6
3,9±0,5
4,0±0,5
3,8±0,7
Сорт
n
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
Примечание. 1 – Сибирское солнышко, 2 – Ида, 3 – Валентина, 4 – Дар Алтая.
7
Коэффициент размножения, шт./экспл.
Полученные данные указывают на отсутствие существенных различий между характеристиками эксплантов, изолированных от ювенильных и взрослых
растений. Эти данные свидетельствуют также о том, что в культуре in vitro
произошла реювенилизация растительного материала. Поэтому все сложности
культивирования этих объектов не связаны с возрастом и физиологическим состоянием исходного растения.
Предотвращение процессов интоксикации эксплантов наиболее часто достигается путем введения в состав питательной среды антиоксидантов. Такой
подход был использован в наших экспериментах: в состав питательной среды
добавляли аскорбиновую кислоту или глютатион. Использование глютатиона
(200 мг/л) позволило получить положительный эффект и, таким образом, увеличить коэффициент размножения у сортов Валентина и Дар Алтая (рис. 3).
8
7
6
5
Сибирское Солнышко
Ида
Валентина
Дар Алтая
4
3
2
1
0
1
2
Питательная среда
Рис. 3. Влияние глютатиона на коэффициент размножения сортов Ribes aureum.
1 – МС + БАП 5мкМ + ГК3 5 мкМ; 2 – МС + БАП 5мкМ + ГК3 5 мкМ + глютатион 200 мг/л
Согласно нашим данным, состав питательной среды оказывал существенное
влияние, как на коэффициент размножения, так и на качественные показатели побегов сортов смородины золотистой (табл. 3). Были испытаны следующие среды:
МС, ЛФ, МК, Л, КМ, ТМ. Положительные результаты получены на средах МС,
МК, КМ, ТМ. На остальных средах экспланты либо не развивались, либо имели
нарушенную морфологию (гипергидратация, хлороз листьев).
Культивирование эксплантов на различных питательных средах показало наличие сортовых отличий при выращивании смородины золотистой. Наибольшим
коэффициентом размножения отличался сорт Валентина (6,8 шт./экспл.), для которого эффективным оказалось применение глютатиона, сорт Сибирское Солнышко имел коэффициент размножения не более 3,1 шт./экспл. и характеризовался замедленным ростом.
8
Таблица 3
Показатели роста и развития Ribes aureum на различных питательных средах,
дополненных БАП 5 мкМ и ГК3 5 мкМ
Сибирское Солнышко
Ида
Валентина
Питательная
среда
Коэффициент
размножения,
шт./экспл.
Длина
растения,
мм
Коэффициент
размножения,
шт./экспл.
Длина
растения,
мм
Коэффициент
размножения,
шт./экспл.
Длина
растения,
мм
МС
МК
КМ
ТМ
3,0±0,7
3,1±0,5
1,5±0,7
3,4±0,5
8,9±1,5
9,0±1,2
9,0±1,0
11,3±0,9
4,2±0,8
3,4±0,5
2,0±0,4
7,5±1,5
10,2±1,6
11,7±1,7
11,6±1,6
12,7±1,4
6,8±0,7
3,3±0,5
2,0±0,3
9,6±1,1
10,4±0,8
10,8±1
9,4±1,6
14,8±1,6
В некоторых случаях отмечают, что культивирование изолированных органов и тканей ряда растений более целесообразно проводить на питательной
среде, содержащей не сахарозу, а другие источники углерода (Pua, Chong, 1984,
Liu et al., 1984). В наших экспериментах замена в питательной среде сахарозы
на глюкозу (3 %) оказала положительное влияние на такие показатели, как длина побегов и коэффициент размножения (рис. 4). На питательных средах (варианты 1 и 3), содержащих глюкозу, наблюдалось увеличение длины побега по
сравнению со средой, содержащей в качестве источника углерода сахарозу.
Длина побега, мм
16
12
сахароза, 3%
8
глюкоза, 3%
4
0
1
2
3
Питательная среда
Рис. 4. Влияние источника углерода на длину побега Ribes aureum (сорт Валентина).
1 – MС + БАП 5 мкМ; 2 – MS + БАП 1 мкМ + ГК3 5 мкМ; 3 – MС + БАП 5 мкМ + ГК3 5 мкМ
Голубика топяная. В наших исследованиях показано, что первостепенное
влияние на количество дополнительных побегов имели генетические особенности сортов (рис. 5). Так, самый высокий коэффициент размножения наблюдали
у сорта Иксинская (иксинская популяция), для которого характерна закладка
большого числа адвентивных побегов и развитие пазушных почек. Для сортов
Шегарская, Юрковская и Дивная (юрковская популяция) использование ИПА в
9
концентрации 1–10 мкМ приводило к росту лидирующего побега и регенерации
различного количества адвентивных побегов. Использование высоких концентраций ИПА способствовало развитию большего количества побегов, но нецелесообразно из-за возникающего эффекта гипергидратации. Для преодоления
этого эффекта и сохранения высокого коэффициента размножения успешным
оказался вариант использования двухстадийного этапа собственно размножения – выращивание пазушных почек в течение двух недель на среде с высокой
концентрацией ИПА, а затем на среде с пониженной концентрацией цитокинина (рис. 6). Так, у сорта Дивная последний показатель при обычном культивировании составлял не более 2,4 шт./экспл., при двухстадийном выращивании
данный показатель возрос более чем в 2 раза (5,8 шт./экспл.).
25
К о э ф ф и ц и ен т р а зм н о ж ен и я,
ш т ./э к сп л .
К оэффициент размножения,
шт./экспл.
30
Иксинская
Шегарская
Юрковская
Дивная
20
15
10
5
0
1
2
5
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Иксинская
Шегарская
Юрковская
Дивная
10
2
ИПА, мкМ
б
а
5
ИПА, мкМ
б
100
90
80
% укоренения
% укоренения
Рис. 5. Влияние ИПА на коэффициент размножения сортов Vaccinium uliginosum в культуре
пазушных почек in vitro: а – одностадийный и б – двухстадийный способ культивирования
80
70
Сибирское
60
Солнышко
70
60
Сибирское
Солнышко
Ида50
50
40
30
Ида
40
Валентина
30
20
10
Валентина
20
10
0
2
3
4
5
10
0
1
ИМК, мкМ
2
3
5
ИУК, мкМ
а
б
Рис. 6. Влияние концентрации ИМК (а) и ИУК (б) на укоренение побегов
сортов Ribes aureum in vitro
10
4.3. Укоренение in vitro
Смородина золотистая. Сорта смородины золотистой (Сибирское Солнышко, Ида, Дар Алтая и Валентина) относятся к трудноукореняемым культурам. Известно, что развитие корневой системы в культуре in vitro и в целом
процесс микроразмножения определяется, в первую очередь, генотипом и поддается управлению с помощью химических факторов лишь в определенных
пределах (Гутиева, 2003; Кухарчик и др., 2008; Матушкина и др., 2009).
Наши исследования показали, что укоренение побегов in vitro зависит не
только от состава питательной среды, но и от сортовых особенностей смородины золотистой. Сорт Валентина, отличающийся лучшей укореняемостью при
традиционных методах вегетативного размножения, показал пропорциональное
увеличение количества укоренившихся микропобегов при увеличении концентрации ИМК в среде (с 42 до 93 %) (рис. 6, а).
Важной особенностью культивирования смородины золотистой in vitro является сокращение периода пассажа до 14 дней вследствие окисления тканей
полифенолами. Поэтому необходимым условием успешного укоренения in vitro
сортов Ribes aureum является введение в состав питательной среды более быстродействующих ауксинов (ИУК, НУК). Исходя из наших данных, применение
ИУК имеет следующие преимущества перед другими ауксинами (рис. 6, б):
первые корни появляются уже через 7 дней культивирования; при всех испытанных концентрациях (кроме 5 мкМ) ИУК не отмечается появления каллуса на
базальной части микрочеренков; все изучаемые сорта проявили способность к
укоренению на среде с данным ауксином; формировалась более развитая корневая система за счет закладки большего количества корней нормальной морфологии. Кроме того, растения-регенеранты, укорененные на среде с ИУК, показывают лучшее развитие побегов и готовность к этапу адаптации уже через
2 недели культивирования.
Голубика топяная. Укоренение полученных побегов (на среде А, дополненной ауксинами ИМК или ИПК) происходило только через 2,5 месяца. В
дальнейших исследованиях были использованы микропобеги с уже укорененных регенерантов голубики топяной. Фрагменты побега с парой пазушных почек помещали на питательную среду для стимуляции ризогенеза, а затем вновь
развившиеся побеги делили на микрочеренки для рекультивирования. Так, при
культивирвании эксплантов с укорененных регенерантов на среде с 10 мкМ
ИМК у сорта Дивная первые корни появились уже через 10 дней.
Проведенные исследования подтверждают, что первостепенное значение в
способности растений к ризогенезу принадлежит генотипу. Сорта голубики топяной по-разному отвечали на различные типы и концентрации, вносимых в
среду ауксинов. Исходя из анализа роста и развития регенерантов голубики топяной, можно заключить, что лучшим индуктором ризогенеза для сортов Шегарская, Дивная и Юрковская является ИУК в различных концентрациях (рис. 7), для
сорта Иксинская – ИПК. Голубика сорта Иксинская отличается от других сортов высоким коэффициентом размножения и возможностью более длительного
периода культивирования. Это свидетельствует о высоком эндогенном содер11
% укоренения
жании цитокининов, что часто препятствует процессу ризогенеза. Максимальный
процент укоренения (77 %) был получен нами через 1,5 месяца культивирования
на среде, дополненной 10–15 мкМ ИПК. Растения-регенеранты, полученные на
среде с данным ауксином, отличались лучшими показателями роста и развития:
более развитой корневой системой и формированием на побегах большего количества развитых листьев (рис. 8).
120
100
Иксинская
Шегарская
80
Юрковская
Дивная
60
40
20
0
2
3
4
5
10
15
Концентрация ИУК, мкМ
Рис. 7. Влияние концентрации ИУК на укоренение Vaccinium uliginosum
а
б
Рис. 8. Влияние различных ауксинов на показатели роста и развития регенерантов
Vaccinium uliginosum сорта Иксинская: а – ИПК 10 мкМ; б – ИМК 10 мкМ
12
ГЛАВА 5. АДАПТАЦИЯ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ
К УСЛОВИЯМ ВЫРАЩИВАНИЯ EX VITRO
Для адаптации растений-регенерантов смородины золотистой и голубики
топяной к условиям выращивания ex vitro использовали гидропонную установку «Минивит»: растения закрепляли в кассеты и помещали в вегетационную
кювету, заполненную питательным раствором (30 л). Период адаптации составил 4–5 недель. В целом, хорошо развитые за период адаптации корневая система и надземная часть растений, обеспечили высокую приживаемость растений в условиях открытого грунта (табл. 4, рис. 9).
Таблица 4
Сравнительная характеристика некоторых показателей (до/после адаптации)
регенерантов Ribes aureum на гидропонной установке «Минивит 0,35»
Сорт
n
Высота
растения, мм
Количество
листьев, шт.
Количество
корней, шт.
Средняя длина
корней, мм
Сибирское
Солнышко
Валентина
Ида
10
29
42
12,6±1,2/125±48
10,2±1,3/108±19
14,7±2,1/101±11
6,1±0,6/10±6,6
6,5±0,4/12,4±1,8
6,3±0,8/11±1,1
4±1,9/10±4
2-3/10,8±2,1
5,5±1,5/13,2±1,3
5,5±0,6/48±15
4-6/52±10
6,4±0,8/49±3
Рис. 9. Растения-регенеранты Vaccinium uliginosum в конце периода адаптации
на гидропонной установке «Минивит 0,35»
13
ГЛАВА 6. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
МЕТОДА МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ RIBES AUREUM
И VACCINIUM ULIGINOSUM
Для сортов смородины золотистой снижение трудозатрат и интенсификация
производства посадочного материала возможна с помощью белковых маркеров.
Это позволяет (в конкретном случае) для 7 сортов, разделенных на 4 группы,
дать прогноз морфогенетического потенциала сортов и тем самым снизить трудозатраты, необходимые для исследования условий культивирования для каждого сорта в отдельности.
Как известно, стадия адаптация регенерантов к условиям выращивания ex vitro
остается самой критической. Поэтому успех микроразмножения во многом зависит от этой стадии. Использование гидропонных установок «Минивит 0,35» на
этапе адаптации регенерантов, во-первых, сокращает срок адаптации растений до
3−4 недель, во-вторых, обеспечивает высокий выход адаптированных регенерантов и высокую их приживаемость в условиях открытого грунта.
Для некоторых культур из-за низкого коэффициента размножения, применение методов биотехнологии является хорошей альтернативой. К таким растениям относится голубика топяная. В табл. 5 приводится сравнительная характеристика экономической эффективности традиционного (черенкование) и альтернативного (микроразмножение) способов вегетативного размножения.
Таблица 5
Экономическая эффективность двух способов вегетативного размножения
Vaccinium uliginosum
Показатели
Способ размножения
2
Площадь производства, м
Выход посадочного материала за год, тыс. шт.
Затраты на выращивание посадочного материала (2-й год), тыс. руб.
Себестоимость 1 шт., руб.
Средняя цена реализации 1 шт., руб.
Прибыль с 1 шт. растения, руб.
Годовой экономический эффект, тыс. руб.
Рентабельность, %
in vitro
10,0
12,0
340,0
28,3
200,0
171,7
2060,4
606
in vivo
10,0
2,5
138,5
55,4
200,0
144,6
361,5
261
Результаты показывают, что на фоне достаточно больших затрат на амортизацию лабораторного оборудования метод микроразмножения характеризуется
высокой эффективностью за счет более низкой себестоимости получаемых растений и высокого коэффициента размножения. Следовательно, можно рекомендовать этот способ для крупномасштабного размножения голубики топяной.
Таким образом, производство посадочного материала с использованием методов биотехнологии дает непосредственный экономический эффект, является
высокорентабельным и позволяет в более короткие сроки получать посадочный
материал высокого качества.
14
ВЫВОДЫ
1. Показана возможность выявления специфики культивирования in vitro
сортов R. aureum с помощью белковых маркеров. Все сорта R. aureum по сходным позициям полипептидов разделены на 4 группы.
2. Для стерилизации пазушных почек эффективно использовать 0,1 %-ный
раствор сулемы в сочетании с предварительной обработкой эксплантов
70 %-ным этиловым спиртом (для R. aureum) и 0,2 %-ный раствор сулемы (для
V. uliginosum).
3. В культуре in vitro пазушные почки от зрелых растений R. aureum реювенилизируются, что позволяет наиболее полно использовать морфогенетический
потенциал данной культуры.
4. На этапе собственно размножения сортов R. aureum оптимальной является питательная среда МС, дополненная БАП (5 мкМ), ГК3 (5 мкМ), глютатионом (200 мг/л) и 3 %-ной глюкозой. На этапе укоренения − ½ МС, дополненная
3 мкМ ИУК.
5. Наибольший коэффициент размножения сортов V. uliginosum получен
при двухстадийном приеме размножения: выращивание пазушных почек в течение 2 недель на среде Андерсона с высокой концентрацией ИПА (20 мкМ), а
затем на той же среде с пониженной концентрацией цитокининов (5 мкМ).
Лучший индуктор ризогенеза для сортов юрковской группы – ИУК, для иксинской – ИПК.
6. Показатели роста и развития эксплантов сортов R. aureum и V. uliginosum
in vitro зависят, в первую очередь, от генетических особенностей.
7. Для адаптации растений к условиям ex vitro эффективным является использование гидропонной установки «Минивит 0,35», что обеспечило 100 %-ную
адаптацию регенерантов V. uliginosum и 90 %-ную − регенерантов R. aureum.
8. Разработанные приемы показали возможность ускоренного размножения и
сохранения сортов R. aureum и V. uliginosum в культуре пазушных почек in vitro.
9. Использование метода размножения in vitro повышает рентабельность
производства саженцев сортов V. uliginosum в 2,3 раза, а для сортов R. aureum
является единственным экономически эффективным способом размножения.
15
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Эрст А.А., Вечернина Н.А., Санкин Л.С., Салыкова В.С. Особенности введения в
культуру in vitro смородины золотистой (Ribes aureum Pursh) // Биология: Теория, практика,
эксперимент / Материалы Междунар. науч. конф., посвящ. 100-летию со дня рождения д-ра
биол. наук, проф. Сапожниковой Е.В. Саранск, 2008. Кн. 2. С. 17-19.
2. Эрст А.А., Вечернина Н.А. Размножение смородины золотистой in vitro // Вестник
Алтайского гос. аграрного ун-та. 2008. № 4(42). С. 10-14. (Реценз.)
3. Вечернина Н.А., Таварткиладзе О.К., Эрст А.А., Горбунов А.Б. Ускоренное размножение голубики топяной in vitro // Вестник Алтайского гос. аграрного ун-та. 2008. № 6(44).
С. 21-25. (Реценз.)
4. Вечернина Н.А., Таварткиладзе О.К., Бородулина И.Д., Эрст А.А. Адаптация растений-регенрантов к условиям выращивания ex vitro // Современные тенденции развития промышленного садоводства / Материалы Международной научно-практической конференции,
посвященной 75-летию образования НИИ садоводства Сибири им. М.А, Лисавенко. Барнаул,
2008. С. 355-361.
5. Вечернина Н.А., Таварткиладзе О.К., Бородулина И.Д., Эрст А.А. Адаптация растений-регенрантов с использованием гидропоники // Известия АлтГУ. 2008. № 3(55) С. 7-10.
6. Эрст А.А., Вечернина Н.А., Санкин Л.С., Салыкова В.С., Ершова И.В. Технология ускоренного размножения новых перспективных сортов Ribes aureum и продукция на ее основе
// Перспективы развития инноваций в биологии / Материалы II Научно-практической конференции в рамках 3-го Фестиваля науки в городе Москве и Биотехнологической выставкиярмарки «РосБиоТех» (5-7 ноября 2008 г.). М., 2008. С. 121-123.
7. Вечернина Н.А., Таварткиладзе О.К., Эрст А.А., Горбунов А.Б., Новикова Т.И. Микроразмножение голубики // IX Международная конференция “Биология клеток растений in
vitro и биотехнология” (8-12 сентября 2008, Звенигород). М., 2008. С. 72-73.
8. Эрст А.А., Вечернина Н.А. Введение в культуру in vitro смородины золотистой // IX
Международная конференция “Биология клеток растений in vitro и биотехнология” (8-12
сентября 2008, Звенигород). М., 2008. С. 450-451.
9. Эрст А.А., Вечернина Н.А., Санкин Л.С., Салыкова В.С., Ершова И.В. Ускоренное
размножение Ribes aureum in vitro // Форум о биологических и экологических проблемах в
лесном хозяйстве г. Хэйхэ провинции Хэйлунцзян. Хэйхэ, 2009. С. 71-75.
10. Эрст А.А., Вечернина Н.А. Особенности размножения голубики топяной in vitro //
Международная научно-методическая дистанционная конференция “Актуальные проблемы
размножения ягодных культур и пути их решения”. Мичуринск, 2010. С. 310-314.
11. Эрст А.А., Вечернина Н.А. Микроразмножение новых перспективных сортов Vaccinium uliginosum L. // Вестник Харьковского национального аграрного университета. Сер. Биологическая. 2010. Вып. 2 (20). С. 96-103.
12. Эрст А.А., Вечернина Н.А. Использование методов биотехнологии для размножения
сортов Vaccinium uliginosum L. // Тр. Томского гос. ун-та. Сер. Биологическая: Ботанические
сады. Проблемы интродукции. Томск, 2010. Т. 274. С. 449-452.
13. Эрст А.А., Вечернина Н.А. Размножение Ribes aureum (Grossulariaceae) в культуре in
vitro // Биотехнология. 2010. № 5. С. 37-45. (Реценз.)
16