удк 581.412:633.877 экспериментальный морфогенез в культуре

УДК 581.412:633.877
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ МОРФОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ ОСИНЫ
ТРИПЛОИДНОЙ (POPULUS TREMULA L.)
Исхакова Д. Я.
Евразийский национальный университет им. Л.Н. Гумилева, г. Астана, Казахстан
e-mail: [email protected]
Научный руководитель – к.б.н, доцент, Турпанова Р. М.
Культура клеток растений – область биологии, тесно связанная с практикой. Почти
каждый открытый здесь научный факт находит свое отражение в прикладных
исследованиях. В отличие от клеток животных практически любая растительная клетка
способна в определенных условиях и на соответствующих питательных средах
регенерировать полноценные растения (свойство тотипотентности растительных клеток).
Решающую роль во вторичном образовании органов (корней или почек) из
недифференцированных тканей in vitro играет соотношение фитогормонов (ауксинов и
цитокининов) и их концентраций в питательной среде. Изучение процесса
экспериментального морфогенеза на всех уровнях организации – от отдельной клетки до
верхушки побега – привело к созданию технологии клонального микроразмножения
растений, которая уже в большинстве стран, таких как США, Италия, Великобритания,
Голландия, Новая Зеландия, Франция перешла на коммерческий уровень [1].
Метод микроклонального размножения играет важн ую роль для ускоренного
клонирования плодовых, ягодных, клубнеплодных, декоративных видов растений и
древесных пород. Впервые этот метод применил французский исследователь Ж. Морель в
1960 г. для размножения орхидей (Cymbidium). Из исходного экспланта ему удалось в
течение года получить около четырех миллионов новых растений, свободных от вирусной
инфекции [ 2].
По своей сути микроклональное размножение аналогично вегетативному типу
размножения растений с той лишь разницей, что оно протекает в пробирке в условиях in
vitro, где из клеток изолированных тканей в итоге можно получить достаточно большое
количество новых растений. Обязательным условием микроклонального размножения
является идентичность полученного растительного материала исходному материнскому
растению. Еще недавно этот способ рассматривали как возможность ускоренного
клонирования вегетативно размножающихся видов растений, а также как
вспомогательный метод освобождения растений от вирусов. Однако результаты
некоторых исследований показали, что значение этого метода существенно возрастает для
клоновой селекции растений (экспериментальный мутагенез и расхимеривание),
криосохранения ценного исходного материала, а также ряда других. Способность к
образованию больших количеств (несколько миллионов и более) соматических
зародышей в условиях in vitro используется для разработки технологии массового и
непрерывного получения "искусственных семян". Более того, метод клонального
микроразмножения может быть с успехом использован для создания синтетических
сортов. К настоящему времени число видов, которые можно клонировать «в пробирке»,
уже составляет около одной тысячи [3].
Преимуществами данного метода по сравнению с традиционными являются:
· значительно более высокие коэффициенты размножения (можно получить до 100 000-1
000 000 мериклонов в год, тогда как при обычном размножении – 5-100 растений за тот же
срок;
· миниатюризация процесса, приводящая к экономии площадей, занятых маточными и
размножающимися растениями;
· оздоровление растений от грибных и бактериальных патогенов, вирусов,
микоплазменных, вироидных и нематодных инфекций;
· возможность размножения и укоренения растений, размножение которых затруднено
обычными способами [4].
Хотя этот метод микроклонального размножения растений является довольн о
трудоемким и затратным, в ряде случаев на его основе уже стало возможным создавать
экономически рентабельные биотехнологии.
В 2011 г. нами совместно с лабораторией генетики и репродукции лесных культур в
«Институте общей генетики и цитологии» КН МОН РК в городе Алматы, были начаты
первые эксперименты в этом направлении. В качестве объекта для микроклонального
размножение in vitro нами была выбрана осина триплоидная (Populus tremula L.).
Осина является одной из уникальных быстрорастущих пород, устойчивых к
сердцевинной гнили. Стволы отличаются полнодревеснотью и прямизной, хорошо
очищаются от сучьев [5].
Интерес к работе с осиной (Populus tremula L.) вызван главным образом
необходимостью сохранения ее генофонда, быстрыми сроками поспевания и труд ностью
размножения черенками. Для осины применение клонального микроразмножения
является наиболее перспективным способом, так как семена данной породы быстро
теряют всхожесть. Введение в культуру осины и ее последующее размножение
необходимо с целью получения достаточного количества посадочного материала, который
главным образом может использоваться для создания энергетических плантаций, в
многочисленных хозяйственных отраслях и для оздоровления лесов, т.е. иметь большое
экологическое значение [6].
В экспериментах был использован основной метод клонального микроразмножения
растений – это активация развития уже существующих в растении меристем и метод
адвентивного побегообразования в первичной и пересадочной каллусной ткани.
В опыте активации развития уже существующих в растении меристем в качестве
эксплантов в культуру были введены черенки, содержащие по 2-3 почки. Для нарезки
черенков использовали однолетние побеги. Для стерилизации нарезанные черенки
помещали в марлевые мешочки и в ламинар-боксе погружали в 0,1%-й раствор сулемы
(двухлористая ртуть) на 10 минут. После этого черенки промывали в 3-5 объемах
стерильной дистиллированной воды и слегка подсушивали. Затем готовили черенки для
введения в культуру. В качестве базовой среды использовали питательную среду
Мурасиге-Скуга с разным содержанием регуляторов роста. Процент регенерации
триплоидной осины составил 95%. Во всех исследуемых пробирках из апикальных
меристем почек формировались побеги, которые в течение одного месяца
культивирования достигали высоты 3 см.
Полученные микропобеги в дальнейшем использовали в исследованиях по
микроразмножению. Сформировавшиеся микропобеги на первичном экспланте,
расчеренковывали и рассаживали в большее количество колб. Из одного микропобега
получали 5-9 черенков аккуратно с помощью длинного узкого пинцета помещали в
питательную среду МS, содержащую 2ip (1 мг/л) и ИУК (0,5 мг/л). Колбы ставили в
световую комнату. Образовавшиеся в колбах пучки побегов делили, извлекали пинцетом
побег необходимой длины. Удаляли скальпелем с него листочки и расчеренковывали его,
таким образом, чтобы на каждом черенке была хотя бы одна пазушная почка и переносили
на свежую питательную среду МS, содержащую 2ip (0,05мг/л) и ИУК (0,01 мг/л). После 3х пассажей, добавляя в питательную среду ИМК в концентрации 1 мг/л, побеги укореняли
in vitro. Укоренение микропобегов – трудоемкий и ответственный этап клонального
микроразмножения. На этом этапе мы использовали среду Мурасига и Скуга. В качестве
стимулятора корнеобразования использовали ИМК (β-индолил-3-масляную кислоту).
Посаженные на среду для укоренения микрочеренки через 1-1,5 месяца превратились в
окорененные растеньица. Растения считались полностью сформированными и готовыми к
адаптированию к почвенным условиям, когда каждое из них полностью образовывало 4-5
листа и достаточно разросшиеся корни.
Во второй серии экспериментов изучали способность к каллусообразованию
эксплантов осины триплоидной на среде Мурасиге и Скугу, содержащие инозит (100
мг/л), тиамин (5 мг/л), пиридоксин (5 мг/л), никотиновую кислоту (1 мг/л), БАП (2 мг/л),
ИУК (0,5 мг/л), сахарозу (3%), и агар 0,7%. Визуально появление каллуса отмечали на 20й день с начала культивирования.
Полученную каллусную ткань субкультивировали каждые 1,5 месяца. В процессе
пересадки учитывали интенсивность роста каллусной ткани. Морфогенез в каллусной
ткани был отмечен на 45 сутки от момента культивирования. За это время формировалась
каллусная ткань плотного типа, в которой отмечалось появление меристематических
очагов, из которых в дальнейшем развивались растения-регенеранты.
Растения-регенеранты выращивали в световой комнате в течение 30 суток при 23 0 С,
24-часовом фотопериоде (круглосуточное освещение) и интенсивности освещения 3000
люкс.
В настоящее время мы проводим исследования по реинтродукции этого вида в
природные местообитания. Этот этап технологии, связанный с возвращением растений в
соответствующую среду обитания, пока до конца не разработан.
Таким образом, размножение ценной здоровой осины как быстрорастущей породы,
является задачей первостепенной важности. В связи с этим несомненный интерес
представляет поиск в естественных условиях быстрорастущих (гигантских), устойчивых к
сердцевинной гнили форм осины.
Принимая во внимание возрастающий интерес и спрос в Республике Казахстан на
новые виды декоративных растений и развитием внутреннего и внешнего озеленения
площадей городов и поселков, а также необходимостью уменьшения импорта
посадочного материала низкого качества, способствующих распространению патогенных
организмов, оказывающих отрицательное влияние на экологическую ситуацию региона
становится актуальной проблема массового размножения древесных культур.
Список использованной литературы:
1. Атанасов А.И. Биотехнология в растениеводстве. Новосибирск, 1993. 242 с.
2. Куликов П.В., Филиппов Е.Г. О методах размножения орхидных умеренной зоны в
культуре in vitro // Бюл. Главного ботан. сада. М.: Наука, 1998. С. 125-131.
3. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии в сельскохозяйственной науке и практике // Основы
сельскохозяйственной биотехнологии. М., 1990. С. 154-235.
4.ШевелухаB.C., Калашникова Е.А. и др. Лабораторно-практические ранятияпо
сельскохозяйственной биотехнологии. Методические указания. - 2- изд.-е. Москва, изд.-во
МСХА, 2004
5.Катаева Н. В., Бутенко Р. Г. Клональноемикроразмножение растений. — М., 1983
6. Родин А.Р., Калашникова Е.А. Использование методов клеточной и генной инженерии
для получения посадочного материала древесных пород. Учебное пособие. М.: МГУЛ,
1993.