Сборник материалов Конференции в формате pdf

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ
ИМ. С.Н. ВИНОГРАДСКОГО РАН
НАУЧНЫЙ СОВЕТ ПО МИКРОБИОЛОГИИ РАН
РОССИЙСКИЙ ФОНД ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
МОО «МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЩЕСТВО»
VI МОЛОДЕЖНАЯ ШКОЛА–КОНФЕРЕНЦИЯ
С МЕЖДУНАРОДНЫМ УЧАСТИЕМ
«АКТУАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ СОВРЕМЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ»
ТЕЗИСЫ
25 – 27 ОКТЯБРЯ 2010 г.
Москва – 2010
I
KRIBBELLA
.
1
.
.
,
1
. .
2
.
,
.
1
.
3
, . .
,
.
.
.
,
.
3
.
.
.
,
,
.
Kribbella (
,
1
1
2
1
, . .
,
,
,
Nocardioidaceae)
LL
(
3 )
.
-9(
4),
(
–
15:0,
15:0,
16S
16
16:0).
–
99,6%.
.
,
,
Kribbella
,
,
,
97–99%
, 4
K. ginsengisoli.
Kribbella
–
2,311-
,
,
,
,
11
16S
100%
,
.
-O
,
2-
.
,
(
),
-3,5,7,9-4
-L-
(5,7),
-L.
Kribbella
,
15
.
12
AZOSPIRILLUM LIPOFERUM Sp59b
. .
1
1
, . .
1,2
, . .
,
.
1
.
1,2
, . .
1
,
,
2
.
.
.
,
,
Azospirillum
,
.
–
(
(
)
,
(
)
)
–
[1, 2]
[3].
[4].
,
,
A. lipoferum Sp59b (
-1519).
[5]
,
[6] (
.
).
A. lipoferum Sp59b
-L-Rhap-(1 3)- -L-Rhap-(1 2)- -L-Rhap-(1
3)- -D-Manp
1
4
3)- -D-Galp-(1 3)- -D-Galp-(1
-D-Glcp
1
Ac~60%
3
2)- -L-Rhap-(1
2
3)- -L-Rhap-(1
4
3)- -L-Rhap-(1
24
,
.
,
–
.
2 : 1,
: N
– 10 : 1.
,
,
.
:
Sepharose CL-4B.
),
2 (
1 (
3(
)
).
A. lipoferum Sp59b,
2
,
3
(
),
.
2
Sp59b
A.
lipoferum
3
1),
(
A. lipoferum
A. lipoferum Sp59b (
,
Sp59b,
(
2
).
.).
3
,
.
2
(13000
32.9
24.5%
2
3.
2%-
.
, 20
),
Sephadex G-50.
3
.
,
L-Rha
1,5-4-
1,3,5-
-2,3,4,6-2,4- -
,
3,
D-Glc
~ 3:1.
, 1,2,3,5.
,
3-
2
, 2,3-
.
5
-
13
1
-
A. lipoferum Sp59b,
[6].
,
,
2
3
,
,
,
1(
,
A. lipoferum Sp59b
.).
,
,
.
,
,
A. lipoferum Sp59b.
,
-
,
,
.
,
,
.
1.
.,
.,
.,
.
.,
.,
Azospirillum brasilense,
,
//
. 1995. .64,
2.
.,
//
3.
4.
5.
6.
6. . 762-768.
.,
. 2001. .70,
.,
.,
.,
.
3. . 384-390.
.,
.,
.
Azospirillum brasilense
//
. 2001.
.70, 1. . 45-50.
Fischer S.E., Miguel M.J., Morri G.B. ffect of root exudates on the polysaccharide
composition and the lipopolysaccharide profile of Azospirillum brasilense Cd under
saline stress // FEMS Microbiol. Lett. 2003. V.219. P. 53-62.
Fedonenko Yu.P., Konnova O.N., Zatonsky G.V., Konnova S.A., Kocharova N.A.,
Zdorovenko E.L., Ignatov V.V. Structure of the O-polysaccharide from the
Azospirillum lipoferum Sp59b lipopolysaccharide // Carbohydr. Res. 2005. V.340. P.
1259-1263.
.,
.,
.,
.,
.,
.,
.,
.
Azospirillum lipoferum Sp59b:
,
//
. 2010. .75,
. 5. C. 707-716.
6
R. LOTI
. .
,
. .
,
,
.
Rhizobium
.
.
,
,
Rhizobium.
(
),
.
Rhizobium
.
Rhizobium loti
,
.
73
(R. loti),
(Lotus corniculatus)
».
(YMA)
.
,
YMA
,
,
.
.
45
.
,
,
YMA c
.
(YMA)
,
,
:
,
(
-
. 1).
.
,
.
.
.
YMA
7
,
-
.
,
,
,
.
,
,
-
,
,
(
. 2).
,
)
. 1.
. 2.
R. loti,
R. loti
.
.
1, 2 – R. loti
;
3–
(
4 – R. loti
).
,
–
;
–
R. loti
;
–
R. loti
.
8
:
);
LENTINUS EDODES (BERK.) SING
.
.
, .
,
,
,
,
Lentinus edodes (Berk.) Sing. (
).
[1].
L. edodes
.
–
,
[2].
,
,
,
.
(
)
«
»
,
.
L. dodes.
:
,
.
,
.
,
,
,
.
,
[3].
,
.
,
23
33
,
,
,
.
,
.
,
70, 80, 110, 130 150
.
,
,
,
.
9
94 97
100
,
–
,
[4].
,
,
.
.
,
,
,
,
.
,
,
.
,
.
130
150
,
,
L-D-
.
,
1:32768
1:65536.
,
,
.
L. edodes
[5].
,
,
,
.
,
,
[6, 7].
,
,
,
L. edodes –
.
,
.
,
,
.
,
.
.
,
,
,
,
,
,
.
,
.
.
1.
edodes
2.
.,
(
//
E.A.,
.,
.,
.
Lentinus
).
. – 1999. – . 33, 2. – . 107–110.
B.M.,
.B.,
E. .
JI.A.,
10
3.
4.
5.
6.
7.
Lentinus edodes (Berk.) Sing
. – 1998. – T. 67,
5. – C. 649–
[Lentinula edodes (Berk.) Pegler] //
654.
.,
.
Lentinus edodes //
. – 2007. – T. 9, 4. – . 1085–1090.
.,
.,
.
Lentinus edodes F-249
//
. – 2008. – . 77, 2. – . 171–177.
.,
.
Lentinus
edodes
//
. – 2008. – . 10, 2. – 631–636.
nska G. Lectins of higher fungi (Micromycetes) – Their occurrence, physiological role,
and biological activity // Int. J. Med. Mushr. – 2006. – Vol. 8, N 1. – P. 19–30.
Vetchinkina E.P., Pozdnyakova N.N., Nikitina V.E. Laccase and Lectin Activities of
Intracellular Proteins Produced in a Submerged Culture of the Xylotrophic
Basidiomycete Lentinus edodes // Curr. Microbiol. 2008. Vol. 57. P. 381–385.
SPIRULINA PLATENSIS
GeO2
. .
,
,
.
: 1)
; 2)
; 3)
[1].
[2].
,
,
.
Spirulina
platensis
–
.
,
.
GeO2
Spirulina platensis.
11
Spirulina
platensis,
.
-
.
100
144
,
30–35° , . .
S.platensis.
GeO2
: 10, 20, 30, 40
.1
,
GeO2,
.
50
.
.
,
.
.1
Spirulina platensis
GeO2
1,3
1,2
1,1
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0
10
20
30
40
50
GeO2
. 2, GeO2
,
),
20–30
30
50
14%
.
12
(
32%
.
.2
,
,
GeO2
30
25
%
20
15
0
10
5
0
0
10
20
30
40
50
GeO2
,
GeO2 30
. GeO2
30
30
Spirulina
platensis,
.
,
GeO2
Spirulina platensis.
,
1.
2.
– 30
.
Asai K. Miracle Cure: Organic Germanium. Japan Publications Inc. 1980.
Hara S, Hayashi N., Nrano S., Lhond X.N., Yasuda S., Komai H. Detemination of
germanium in some plants and animals. // Zeitschrixte fur Naturforschuny – 1990, –
45, c: 1250–1251.
13
,
.
1, 2
.
, .
1, 2
.
3
, .
1
,
,
2
,
,
,
3
,
,
,
,
,
.
,
,
.
,
,
.
–
,
,
.
,
,
.
,
120
,
,
,
,
,
,
-
).
,
,
Rhodococcus erythropolis, R.
16S
rhodochrous, Pseudomonas fluorescens, P. putida.
,
,
.
5
,
.
.
,
,
,
–
,
2
,
.
,
2
,
70%.
,
,
,
.
14
«
2009–2013
»(
(2009–2010
02.740.11.0078)
«
)».
. .
,
. .
,
. .
,
,
,
.
,
.
,
10%
.
.
: tRFLP (terminal restriction length polimorphism),
,
16S-
.
.
,
,
.
.
.
,
.
(
-Podsolluvisol).
15
.
:
,
.
tRFLP
16S-
.
,
.1)
,
,
Streptomyces.
Corynebacterium, Micromonospora
15
.1
.2)
,
,
Alvinella, Finegoldia, Spiroplasma
Pirellula, Spingomonas,
Mycoplasma.
.2
,
.
.
(
. 3)
16
,
,
Caloramator
Rumen.
.
.3
,
tRFLP
,
,
.
,
,
,
.
09-04-13730–
1,2
. .
1
, . .
,
1
. .
1
,
,
2
,
,
.
.
,
,
,
,
,
.
,
,
,
,
,
.
.
16
,
,
17
,
,
1,5
3
(
,
–
.
.
)
(
«Royal canin».
),
5
0,1
«
«
» (1991)
,
»(1999).
–
Bergey (1997).
157: 7,
,
Escherichia oli
.
,
,
,
,
–
.
:
157
7
E. oli
«
E. oli 157: 7» (2000).
«
E. coli 0157: 7» ( .
157: 7
).
(
– 5,0;
7,2±0,2.
):
– 20,0;
- 0,075;
– 5,0;
«
– 12,0;
– 12,0;
»,
-
,
»
( .
.
20
.
),
(VT1 VT2)
.
–
90
37°
.
18–20
3
.
7,5
30
10
.
.
3000
.
16–18 :
–
1
(
)
1
.
10–12 .
,
(
,
,
,
.
).
.
.
18
2
–
,
45
,
.
(
10%
1–2%
(
, .
),
–
).
,
.
,
,
7
.
10 –108
8
10 –10
6
,
– 104–105
,
6
–
,
7
– 10 –10
.
E. coli
157: 7
(12,5%
)
,
E. coli
E. coli 157: 7
,
(90,5%),
.
–
,
157: 7
(87,8%),
;
;
(92,3 %);
–
–
(57,8%).
(61,3%),
(79,6%);
–
–
;
(72,3%)
(60,1%),
(98,3%),
,
.
69,3 %
.
.
(9
)
.
E. coli.
E. coli 157: 7,
,
.
–
–
E. coli 157: 7
,
.
,
8–9
.
,
,
.
,
,
.
.
,
.
,
,
,
,
,
,
.
E. coli
157: 7,
19
,
,
–
.
1
. .
,
1
2
. .
.
,
1
. .
.
2
,
.
.
,
,
,
Sulfobacillus
,
,
.
Fe(II), S0,
.
,
.
,
,
,
.
–
asporogenes 41
.
Sulfobacillus sibiricus (N1
S. thermotolerans Kr1.
,
,
SSO), S. thermosulfidooxidans subsp.
Fe(II),
2S2O3
.
.
,
,
.
.
,
,
(
(
.
N1, SSO Kr1
– 15–20 15
.
,
. 1),
. 2),
.
,
,
,
,
I-
3–5
5–6
,
55–70%,
13%
.
41
;
41 –
2
Fe(II) – 5.8–7.15
;
.
20
1.
S. thermosulfidooxidans subsp. asporogenes 41, S. sibiricus N1, S. sibiricus SSO
41
N1
SSO
S. thermotolerans Kr1
Kr1
41
N1
SSO
Kr1
2
,
50–80
46
15–20
10
16–20
11
15–18
14
3.5
3.0
5
1.8
4
2.3
5
2.3
250–260
0.9
150–160
12.9
130–150
10.1
150–160
15.4
16–18
7.1
12–14
21.5
13–15
18.4
15–16
22.3
,
,
7
, 1 × 10
2.
,
,
(
41,
.
./
28.5/39.
2
.
2
101.2/40.0
4.2/22.3
0.9/
.
640/1175
4.5/19.0
(
N1,
.
./
)
94.6/105.
9
)
10.9/9.8
.
2
13.6/7.2
.
–
– 64.1.2.13,
2.7.1.40;
–
1.1.1.42,
2.7.1.1,
– 6–
26.6/20.6
197.3/127.1
-64.2.1.12 + 2-32.7.1.11,
4.1.3.7,
–
1.3.99.1,
–
38.9/27.3
–
.
21
1.1.1.49,
-6–
490.1/472.2
4.1.2.14,
1.1.1.43,
–
-1,61.2.1.12,
–
– 634.2.1.3,
4.2.1.2,
66.8/68.4
–
–
1.1.1.37,
.–
Fe(II) (0.18–0.75
Kr1,
2
)
10
.
SSO, N1
–
.
,
,
Fe(II)
Fe(III)
.
,
,
;
,
,
–
,
.
,
,
.
(
41
. 2)
.
–
.
–
.
,
,
(
. 2).
Fe(II),
,
.
.
–
,
;
;
;
,
.
,
.
SPIRULINA PLATENSIS
1
. .
, . .
. .
1
2
, . .
2
, . .
2
,
, .
. .
1
2
.
2
.
1
,
2
, .
,
2
, .
,
,
,
,
.
Spirulina platensis,
,
22
,
,
,
,
[3,4].
,
Co(II)
,
VO2
Spirulina platensis,
:
2+
.
Spirulina platensis.
Spirulina platensis
(NORDST.) Geitl. CNM-CB-01,
.
-
[5].
5
.
[2].
,
,
[1].
8–16%
[(VO)2(2PyFX)]SO4·4H2O
VO22+
10–15
.
.
Spirulina
platensis
,
.
. 1.
,
,%
VO22+ Co(II)
5
20
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
1
2
3
1 – [(VO)2(2PyTCH)]SO4•4H2O
2 – [(VO)2(2PyCH)]SO4•4H2O
3 – [(VO)2(2PyFX)]SO4•4H2O
10
25
4
4 – CoLen
5 – Na[Co(DH)2(NO2)2]
23
15
0
5
,
(200
[6].
M CoCl2 )
,
Na[Co(DH)2(NO2)2]
8%
,
10
,
.
.
.
1.
Burris R. Nitrogenases.The journal of biological chemistry, 1991, vol. 266, no. 15, p. 93399342
2.
Lowry O. et.al. Protein measurement with the folin phenol reagent. In: J. Biol Chem. 1951,
vol. 193, no. 1, p.265-275.
3.
Romay C. et. al. C-Phycocianin: a biliprotein with antioxidant, anti-inflammatory and
neuroprotective effects. In: Protein and peptide science. 2003, vol. 4, no. 3, p. 207-216
4.
Rudic V., Cojocari A., Cepoi L., Chiriac T., Rudi L. Ficobiotehnologia – cercet ri
fundamentale i realiz ri practice. Chi in u, 2007 (Tipogr. „Elena V. I.” SRL). - 365p.
5.
Rudic V., Dencicov L. Optimizarea mediului nutritiv pentru cultivarea spirulinei. În: Anale
t. USM. 1991, vol. 37, p. 91-94.
Sudhakar B., Sabat S., Mohanty P. Alterations in photosystem II organization by cobalt
treatment in the cyanobacterium Spirulina platensis. Journal of plant biochemistry and
biotechnology,1992, vol. 1, p. 1781-1789
E. COLI
. .
, . .
,
,
,
.
E.
coli
.
,
.
.
.
LB
.
,
E. coli JC-158
).
E. coli
.
0,004%
–
: 0,14 M NaCl; 0,35 M NaCl; 2 M NaCl; 6 M
0,01
– HCl
pH
24
6,8.
-X
–
(«Merk»).
,
,
- 22%,
,
E. coli
–11%,
–14%
,
:
–50%;
,
.
.
LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. CREMORIS
. .
1
, .
1
.
,
2
.
1
2
, .
,
–493–
,
2
,
,
,
,
.
,
,
.
,
.
Lactococcus lactis subsp. cremoris
-49317
24
30° .
PBS(
7,4)
10000 g
20
.
(2:1,
)
15
1
24
37°
.
50° .
(430 )
5
1 (45×1,8 )
(
120° )
Silica gel 60 (70–230 mesh, «Merck»).
,
(
400
),
3
).
(V=100 )
50° .
:
(I-Chl
IV-Chl),
;
(I-Ac – IV-Ac)
;
(I-Met – IV-Met) –
( . 1 ).
I-Ac (80,5
),
,
2.
: 0, 5, 10, 15,
20, 30, 50, 100%.
(V=50 )
I-Chl-2, II-Chl-2, I-5%Met-2,
II-5%Met-2, I-10%Met-2, II-10%Met-2, I-15%Met-2, II-15%Met-2, 20%Met-2, 30%Met-2,
25
50%Met-2, 100%Met-2.
. 1.
1 2
3
Lactococcus lactis subsp. cremoris B-493I-10%Met-2,
( . 1 ).
,
Lactococcus lactis subsp. cremoris B-493-
4 5
6 7 8
9 10 11 12 13
1( )
2( )
14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
: 1–4 –
(
) I-Chl
IV-Chl; 5–8 –
(
) I-Ac – IV-Ac; 9–12 –
(
) IMet – IV-Met; 13 –
(
); 14–25
I-Chl-2, II-Chl-2, I-5%Met-2,
II-5%Met-2, I-10%Met-2, II-10%Met-2, I-15%Met-2, II-15%Met-2, 20%Met-2, 30%Met-2, 50%Met-2,
100%Met-2; 13 –
(
);
–
0,5%3% H2SO4.
18
,
(
. 2.
Lactococcus lactis subsp. cremoris
. 2).
Lactococcus lactis subsp. cremoris
-
493-
:
(65:25:4
I
;
26
,
(80:12:18:5
–
)
)
0,5%3% H2SO4.
II
( - Lactobacillus plantarum B-495- , – Lactococcus lactis subsp. cremoris
– Bifidobacterium adolescentis 94)
Lactococcus lactis subsp. cremoris
-493- .
(1
/50
)
«Greiner»
4
.
3.
200
17 (
)
10
(5 %).
(37 )
24 ,
.
.
3
Lactococcus lactis subsp. cremoris
-493- .
,
Lactococcus lactis subsp. cremoris
).
-424- ,
24
. 3.
Lactococcus lactis subsp. cremoris
-493- (1 - Lactobacillus plantarum B-495- , 2 - Lactococcus lactis subsp. cremoris -424-D, 3 –
Bifidobacterium adolescentis 94; –
, –
)
2,5
2
1,5
1
0,5
0
,
.
27
AZOSPIRILLUM LIPOFERUM SP59B
1
. .
1,2
, . .
2
, . .
1
.
1,2
, . .
.
,
2
,
,
.
–
,
,
.
,
Azospirillum,
.
,
.
)
.
:
A. lipoferum Sp59b –
(Sigma),
.
[1, 2]
.
,
,
A. lipoferum
Sp59b
– 3
.
,
SDS,
A. lipoferum Sp59b
(0.4
, 72 )
.).
–
,
, –
.
,
,
.
A. brasilense Cd
[3].
«
»
[4].
28
,
,
A. lipoferum Sp59b,
.
,
.
5
0.15
M NaCl
,
45%-
.
,
.
Sephadex G-50
53.9%
(
.
,
)
1.2% 22.3%.
-31
(38.8%), 0.5%
4.4%
2
.
:1–
,
,
.
,
0.4
.
;2–
,
,
[1],
.
,
A. lipoferum Sp59b,
.
-
,
,
,
,
[2].
,
,
,
.
A. brasilense Cd,
[3].
3-
.
3.
,
,
,
,
.
,
29
,
,
.
(
1.
2.
3.
4.
08-04-00669).
Fedonenko Yu.P., Konnova O.N., Zatonsky G.V., Konnova S.A., Kocharova N.A.,
Zdorovenko E.L., Ignatov V.V. Structure of the O-polysaccharide from the Azospirillum
lipoferum Sp59b lipopolysaccharide // Carbohydr. Res. 2005. V. 340. P. 1259–1263.
.,
.,
.,
.,
.,
.,
.,
.
Azospirillum lipoferum Sp59b:
,
//
.
2010. . 75,
. 5. C. 707–716.
Fischer S.E., Miguel M.J., Morri G.B. Effect of root exudates on the polysaccharide
composition and the lipopolysaccharide profile of Azospirillum brasilense Cd under
saline stress // FEMS Microbiol. Lett. 2003. V. 219. P. 53–62.
.,
.
Sinorhizobium meliloti
,
//
. 2004. . 73, 3. . 350–357.
SACCHAROMYCES CEREVISIAE
. .
,
.
.
, .
.
,
,
,
.
[1,2],
Saccharomyces
–70°
-
cerevisiae
,
.
1
8·10
-2
1,5%
.
«MODULYO-4K»
–55°
Edwards.
mbar
4-
0,1%
;
.
,
1
).
1
,
8·10-2 mbar – 18
(10%
1
.
30
Saccharomyces cerevisiae
1
1
3,6·107
8·108
6,4·107
3·108
Y-177
Y-178
Y-717 .
Y-717 C
9,6·106
4·108
4·107
2,3·108
9·106
1·108
2,5·107
7·107
1
Y-178.
,
.
,
,
,
,
(
,
-
).
,
,
,
,
,
.
,
.
Saccharomyces
cerevisiae
,%
Y-178
.
3,5
3,25
3
2,75
2,5
2,25
2
1,75
1,5
0
24
48
72
,
-
31
96
1.
2.
Kirsop B. Freeze-drying and cryopreservation of yeast cultures / B. Kirsop //
Commonwealth Mycological Institute Publication. Kew, Surrey, U.K. 1983
.
Saccharomyces
/
.
,
.
// «
».V
(
, 26 — 27
2009 .). . 29-30.
ACIDOBACTERIA
. .
.
.
,
,
,
Acidobacteria (1).
,
(2).
,
.
Acidobacteria,
«
»,
SN10,
(
(pH 3.8)
., 56°34'
,
., 32°46'
,
SN10
R2A (pH 5.2),
4–6
,
.
SN10
0.6–0.9 ×1-3
,
,
(3-8
.).
)
,
,
.
.
.
SN10
,
.
15–33° ,
pH 5–5.5.
pH – 3.5–7.3,
22–28° ,
,
.
.
(
,
,
,
),
.
SN10
(
SN10
.
,
,
-
.
.
).
;
,
–
,
32
,
-,
-,
,
-
,
AS-BI
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
.
,
SN10
.
,
,
,
1% NaCl
NaCl
iso-
,
.
0.1%.
iso-C15:0 (62.0%), iso-
(19.0%)
,
-
17:1 w9c
17:0 (10.2%).
16S
1 (subdivision 1)
SN10
Acidobacteria.
Acidobacterium capsulatum (93.2%
16S
) (3).
1 Acidobacteria,
Terriglobus, Edaphobacter
Granulicella,
SN10
92.3–93.1%
16S
.
c
54.1
. %.
Acidobacterium capsulatum
,
,
,
,
pH,
NaCl,
SN10
1
Acidobacteria,
‘Acidicapsa borealis’
gen. nov., sp. nov.
09-04-00004.
1.
2.
3.
Dedysh S.N., Pankratov T.A., Belova S.E., Kulichevskaya I.S. and Liesack W. (2006). Appl.
Environ. Microbiol. 72, 2110-2117.
Barns S.M., Takala S.L. and Kuske C.R. (1999). Appl. Environ. Microbiol. 65, 1731-1737.
Kishimoto N., Kosako Y. and Tano T. (1991). Current Microbiol. 22, 1-7.
1
. .
1
, . .
2
, . .
. .
.
.
,
.
[Lin et al., 2006],
,
,
(
2
. .
, . .
2
,
2
1
2
,
,
,
.
,
) [Ivanov, Lein, 2006].
33
,
,
,
,
,
Desulfomicrobium, Desulfotomaculum
Desulfovibrio,
. [Pimenov, Neretin, 2006; Pimenov et al., 2010].
,
in situ
(FISH)
.
16S
,
2009
«
30, 70, 120
165
4%-
.
»
.
FISH
,
Ø 25
.
0,5
.
Axio Imager.D1 («Carl Zeiss»,
16S
16S
907R.
).
341F
pGEM-T
«Promega» (
).
HaeIII
.
BLAST (
,
EUB338 II,
,
39%
.
,
120
(
).
EUB338
30 70 (
),
7
7
1,03 × 10
2,20 × 10
,
)
165
(
)
,
63
8
(2,33 × 10
8
4,41 × 10
,
).
,
30
70 )
(
,
,
4%).
67%
SRB385
Desulfomicrobium (6,2% 20%
).
SRB385,
-Proteobacteria,
11%
.
,
Desulfovibrio (23%), Desulfotomaculum (7,6%) Desulfomicrobium (
9%
.
,
.
.
.
34
,
,
Cr (VI)
(
Mo (VII), KI,
)
.
(
)
,
Cr (VI).
,
16S
,
57
,
.
16S
HaeIII (13
),
(45
).
,
Desulfosporosinus (97%
,
(99%
),
),
Vibrio
.
,
FISH-
,
situ,
,
Desulfosporosinus
in
.
.
Desulfosporosinus
,
.
Desulfosporosinus
FISH-
,
.
1.
2.
3.
4.
Ivanov M., Lein A. Fractionation of stable isotopes of carbon and sulfur during biological
processes in the Black Sea // Past and Present Water Column Anoxia / Ed. Neretin L.
NATO Science Series. Springer-Verlag, 2006. P. 373-418.
Lin X., Wakeham S.G., Putnam I.F., Astor Y.M., Scranton M.I., Chistoserdov A.Y., Taylor
G.T. Comparison of vertical distributions of prokaryotic assemblages in the anoxic
Cariaco Basin and Black Sea by use of fluorescence in situ hybridization // Appl.
Environ. Microbiol. 2006. V. 72. No. 4. P. 2679-2690.
Pimenov N.V., Bryukhanov A.L., Korneeva V.A., Zakharova E.E., Sigalevich P.A., Rusanov
I.I., Yakushev E.V., Chasovnikov V.K. Anaerobic microbial community in the aerobic
water and at the oxic/anoxic interface in the Black Sea // Chemical Structure of Pelagic
Redox Interfaces: Observation and Modeling / Ed. Yakushev E.V. The Handbook of
Environmental Chemistry. Springer-Verlag, 2010. DOI 10.1007/698_2010_84.
Pimenov N., Neretin L. Composition and activities of microbial communities involved in
carbon, sulfur, nitrogen and manganese cycling in the oxic/anoxic interface of the Black
Sea // Past and Present Water Column Anoxia / Ed. Neretin L. NATO Science Series.
Springer-Verlag, 2006. P. 501-522.
35
MN-
AZOSPIRILLUM BRASILENSE
. .
,
.
.
, . .
,
,
.
Azospirillum –
.
[1].
–
,
;
,
Mn-
,
.
Azospirillum
Mn-
. [2]
,
.
.
(Mn )
n2+,
Mn
n3+,
,
,
,
.
[3].
Mn
,
Mn
.
,
Mn
Azospirillum brasilense Sp245
.
37°
.
Mn
2.6-
) ( =30.5 mM-1cm-1)
(
30° [4].
468
1
( )
1
1
.
.
2-
,
20
Sephadex G25
0,1
4° .
: 0,025 M Na-
,
, pH=5,0.
TSK Bioassist Q,
NaCl
1
Mn
.
.
Mn.
36
.
,
Mn
.
1
.
.
SDS-
(
)
43 kDa.
Mn ,
Mn
,
Azospirillum.
Mn
0,1
, 2,61
.
.
; 0,5
24 36
,
,
Mn.
.
,
.
3
Mn ,
,
24
,
1
Mn
0,1
1
0.1
36
.
0,1
1
,
0,1
1
Mn-
,
.
,
,
brasilense Sp245
A.
,
,
,
,
.
Mn
,
,
.
Mn A. brasilense Sp245
,
,
,
,
10
0,12
0,25
0,48
1
1,6
0,04
0,0032
12,5
26
37
Mn A. brasilense Sp245
1.
2.
3.
4.
Diamantidis, G., Effosse, A., Potier, P., Bally, R. Purification and characterization of the
first bacterial laccase in the rhizospheric bacterium Azospirillum lipoferum // Soil Biol.
Biochem. – 2000. – V. 32. – P. 919–927.
.,
.,
,
.
Azospirillum //
. – 2010. –
79, 3. .
344-351.
.,
.
//
. – 1992. – .
18. – . 309-345.
Paszczynski, A., Crawford, R., Huynh, V.-B. Manganese peroxidase of Phanerochaete
chrysosporium: purification.// Methods Enzymol. – 1988. – Vol. 161. – P. 264–270.
BACILLACEAE
. .
1
1,2
, .
.
2
«
2
»,
,
, 1949)
Clostridium (
ill
– Bacillus (
).
Bacillus,
38
.
)
,
,
.
,
,
.
,
–
,
Bacillus,
ill
,
manual of systematic
(Bergeys
.
Bacillus
Second edition,
bacteriology,
V. 3,
16S
,
Firmicutes,
19
2009).
(16S rRNA –
),
«
»
.
Bacillus,
,
,
,
16S rRNA.
–
16S rRNA
Bacillus.
,
1, 2, 3, 4,
,
.
,
.
.
:
,
(
5
(
:
,
, D,
, D-
– B –
,
,
, D,
,
,
,
;
,
,
,
;
,
, N –
,
,
,
,
;
,
, D-
,
,
)
L-
,
, L-
,
2
(
;
65° );
10%).
,
:
,
–
,
;
,
,
,
.
,
, D– D –
,
,
,
,
,
.
16S rDNA
:
8f – aga gtt tga tcc tgg ctc ag; 926r – ccg tca att cct ttr agt tt; 1492r – ggt tac cct tgt tac gac tt,
: 95° – 3
., 35
; 95° – 30
.; 57° – 30
.; 72° – 1
.; 72° – 5
.
3000.
GenBank RDP-II.
39
.
Bacillus
,
edition, V. 3, 2009),
.
(Bergeys manual of systematic bacteriology, Second
,
,
,
Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Bacillaceae; Geobacillus stearothermophilus (
– Bacillus stearothermophilus).
GenBank RDP-II ( . 1)
,
Bacteria; Firmicutes;
Bacillales; Bacillaceae; Bacillus,
Bacillus licheniformis
99
%,
Geobacillus stearothermophilus
96%.
16S rDNA
1
GACGTGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCT
AATACCGGATGCTTGATTGAACCGCATGGTTCAATTATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTACAGATG
GACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAG
AGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTT
CCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTG
TTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGG
CTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATGATTGGGCGTAAAGC
GCGCGCAGGCGGTTTCTAAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAAACCGGGGATGGGTCATTGGAAA
,
97%,
,
,
,
Bacillus licheniformis.
1, 2, 3, 4
Bacillus licheniformis.
1.
Bacillaceae
–
.
2.
–
Bacillaceae.
1.
2.
William B. Whitman. Bergeys manual of systematic bacteriology, Second edition, V. 3,
2009.
.,
.,
.
–
.–
:
– 1982.
40
,
.
. .
,
.
,
. .
, . .
, .
.
.
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
.
,
.
,
,
.
,
,
.
,
(Methyl Red),
Ponceau S),
.),
.
(
(Tartrazine,
,
200-600
,
.
,
,
(
),
.
.
,
,
,
.
,
,
Methyl Red,
Tartrazine,
.
,
.
41
,
,
,
(
,
,
(
,
2-
).
(
)
).
,
2-
,
2-
2-
0,08
+
CH4,
NH4+
0,20
,
,
0,022
,
1,419
0,113
-
0,312
-
)
,
CH4, CO2
,
CH4, CO2
(
-
)
,
CH4, CO2
-
0,0745
-
,
CH4, CO2
,
2-
0,002
+
CH4, CO2,
NH4+
CH4, CO2
(
2-
2
CO2,
2
CH4, CO2
0,011
,
-
-
0,5
-
,
-
42
-
CH4, CO2
CH4, CO2
-
0,019
-
,
-
,
-
-
-
-
CH4, CO2
2
-
-
,
CH4, CO2
(
,
)
-
,
,
CH4, CO2
,
)
,
,
.
.
(FEMS)
(FRF 2009-2, RU-IMRS).
GLUCONOBACTER
1
. .
2
, . .
2
, . .
1
,
, .
2
.
,
2
,
(
,
).
,
.
(
)
.
.
3
Gluconobacter,
)
,
(
2,6-
(
).
43
)
(
G. oxydans subsp. industrius
B-1227
G. cerinus
B-1283
(
,
).
melanogenes
B-1280, G. oxydans subsp.
.
(
.
12
0.5
)
6–7
– 8–
6, 30
.
200 ,
.
,
).
. 1,
,
(
1283
1280 ( . 1 ) 1227 (
1283) (
. 1 ).
,
1227
.1 )
1280
,
11%.
1280.
[Reshetilov et al., 2006]
(3
),
)
(0.075
(III)
)
(2.5
,
).
Na(30
)
),
(3.0
(5
–
.
10
20
–300
.
0.25
A
0.20
0.04
1280
0.15
0.02
0.10
.
0.00
0.05
0.00
0.12
-0.02
B
,
0.10
0.08
0.02
1227
,
0.06
0.04
0.00
0.02
0.00
0.10
C
0.08
0.02
1283
0.06
0.00
0.04
-300
-200
-100
0
0.02
-0.02
0.00
0
1
2
. 1.
Gluconobacter
(
1280, 1227
3
4
5
6
7
8
,
. 2.
.
). ,
1283
.
Gluconobacter.
C–
.
44
0
.
(
(
.)
).
2,
1280
–180
).
(
(
.
,
20
1283
1227
.
,
)
,
1280
,
1/3
.
,
(
).
,
.
(
)
,
1280
.
1227
.
1227
1283,
,
.
,
1227
.
,
1283
,
:
,
,
(
).
-
–
Gluconobacter
Gluconobacter.
–
,
,
.
Gluconobacter
,
,
,
,
.
,
,
1280
,
.
1227
1283
,
,
.
A. Reshetilov, S. Alferov, L. Tomashevskaya, O. Ponamoreva. Electroanalysis, 18(19-20), 2030 –
2034 (2006).
45
PECTOBACTERIUM ATROSEPTICUM SCRI 1043
1
. .
,
1
.
1
.
(
,
2
. .
)
,
,
2
2
. .
,
,
,
,
.
.
,
.
,
0.001 – 0.005
trosepticum SCRI
(
1043
,
),
.
ß-(1
4)-
.
p
Erwinia
.
,
.
.
–
. trosepticum SCRI 1043.
(IM)
Solanum tuberosum,
P. atrosepticum
,
,
.1).
(1.0 – 1.5
).
. 1.
P. atrosepticum,
IM:
1:
«Low range»;
2: IM, pH 6.0;
3: IM, pH 6.0,
(30
/ );
4: IM, pH 7.0;
5: IM, pH 7.0,
(30
/ ).
(20
)
,
de novo
46
.
,
P. atrosepticum,
(Mr < 1
,
,
),
.
1,9
,
,
1,7
1,5
,
1,3
(
1,1
. 2).
0,9
,
0,7
,
0,5
.
P.
atrosepticum,
(5-9 )
(15-20 ) log,
.2.
0,06 0,15 0,26 0,79 1,31 1,83 2,62 P.
atrosepticum
,
(
).
(24-48 )
.
IM
,
),
(5
,
8
24
48
.
(
)
(0.006
),
.
,
P. atrosepticum
P. atrosepticum SCRI1043
,
.
,
, QS,
,
.
P. atrosepticum
(
,
104
109
)
,
10
,
QS-
,
.
,
,
.
47
7
,
: elA (~ 3%
0,7
,
)
0,6
, el
(~ 25%) –
, elD
el
el
0,5
0,4
(> 70 %) –
.
0,3
./
,
0,2
P.
0,1
atrosepticum
,
0
5,5
6
. 3.
6,5
7
7,5
IM
(30
)
P. atrosepticum.
.
,
Pectobacterium atrosepticum SCRI1043
,
.
,
.
B. ADOLESCENTIS
.
.
,
,
–
,
.
,
.
,
- ( -D,
,
,
3.2.1.23).
.
,
.
.
.
:
ifidobacterium adolescentis f,
.
48
F
37°
MRS
0,05%
.
.
-D15
37° .
(3
)
1 Na2CO3.
7,0; 0,1
0,4
.
10
(
0,7
),
5-
0,2
.
0,2
10 000 g, 4° ,
:
= [1000* OD 420] / [V(ml)*T(min)*OD590],
OD 420 –
590 –
.
;T–
; OD
,
;V–
,
590
,
.
:
,
B. adolescentis Cf
.
,
(1%)
B. adolescentis f,
,
,
.
5–6
7-8
(
,
1).
0,12
0,4
0,35
0,1
0,3
0,08
0,25
0,06
0,2
0,15
0,04
0,1
0,02
0,05
0
0
12 13 15 18 19 20 21
. 1.
( )
B.adolescentis Cf
49
( )
,
B. adolescentis Cf.
,
(
. 2).
,
2
,
6–8
.
120
.
100
80
60
40
20
0
2
3,5
5
7
8
13
. 2.
14
16
18
19,5
,
B. adolescentis Cf
(
)
,
B. adolescentis.
,
(0,1; 0,5%)
76%,
98–99% (
72
1,0
2,0%
0,50%
1%
3).
120
E, %
100
80
60
40
20
0
0,10%
2%
)
. 3.
2
B. adolescentis f
B. adolescentis f
.
.
.
50
,
DACTYLORHIZA MACULATA (L.) SOO (ORCHIDACEAE)
1
. .
1
, . .
,
1
. .
,
1
. .
,
2
. .
1
.
.
,
,
2
.
.
,
,
,
.
,
,
. Orchidaceae,
(
., 2001, 2003,
2004, 2005; Tsavkelova et al., 2007; Wilkinson et al., 1989, 1994; Zambrano et al., 2007).
,
,
.
,
,
.
«
»
.
,
.
,
Dactylorhiza maculata (L.) Soo (Orchidaceae).
,
D. maculata,
.
(
)
3
,
.
(
,
,
1998).
:
(
) (Tsavkelova et al., 2007),
.
28
,
,
.
. Desulfovibrio
(
. 1),
Mycobacterium).
D. maculata,
33
51
,
– 31 (
(%),
D. maculata
,
: . Acetobacter, Pseudomonas,
Sphingomonas, Xanthomonas
Agrobacterium radiobacter
. Ochrobactrum
: .Methylococcus
Sphingobacterium spiritovorum
: FeRed
. Bacteroides
. Riemerella
. Wolinella
: . Desulfovibrio
: . Nitrobacter
: . Caulobacter, Hyphomicrobium
: . Cytophaga
,%
,
:
. Bacillus
. Clostridium
. Micrococcus
:
. Acetobacterium, Butyrivibrio, Eubacterium
. Propionibacterium
:
8,1
10,9
1,1
0,4
4,7
0,5
0,1
0,4
0,6
1,2
0,0
4,8
6,3
0,4
28,6
4,6
2,1
2,5
5,0
11,1
5,4
5,7
6,7
5,7
0,8
7,4
0,9
0,1
0,7
0,6
1,0
2,4
2,2
3,2
0,8
36,7
3,4
1,7
1,7
4,7
10,3
6,3
4,1
6,2
31,6
26,6
12,4
12,1
71,4
1,3×108
63,3
1,7×108
. Arthrobacter, Mycobacterium
. Corynebacterium
:
. Nocardia, Rhodococcus, Pseudonocardia
,
:
. Streptomyces, Nocardiopsis, Actinomadura
,%
,
/
:
–
;
,
–
;
–
: –
;
.
12
(
., 2001, 2004; Tsavkelova et al.,
2007; Wilkinson et al., 1994; Zambrano et al., 2007)
: Acetobacter, Agrobacterium, Pseudomonas,
Sphingomonas, Xanthomonas, Micrococcus, Arthrobacter, Mycobacterium, Nocardia,
52
Rhodococcus, Streptomyces, Bacillus.
108
.
.
2,5
,
1,7
–
(50–60%)
(
: 31,6
26,6%
.
–
:
2,2–2,5
.
(8 – 11%).
,
,
,
D. maculata
,
.
. 1).
,
(8,4
. Clostridium, Bacteroides,
,
11,2%).
(5,4 6,3%),
, –
Desulfovibrio.
,
1,1±0,10×10
18
6
)
5
:I–
7,2±0,30×10
,
(4
,
); IV –
.
(
); III
.
(
,
–
); V –
(
–
).
. III (35%).
(
. IV
.
.I
Bacillus
),
4%.
).
); II –
,
,
,
,
–
(
D. maculata
/
(
–
6
2%).
–9
12,5%
26 (
)
.
16%
–
,
,
,
D. maculata –
.
33
12
,
.
D. maculata
,
,
(50–60%)
.
,
D. maculata
.
«
271.
»,
53
,
CHLOROBI
. .
CHLOROFLEXI
, . .
,
. .
.
( .
–
)
–
,
.
.
,
(
Firmicutes ( . Clostridium,
. Cellulomonas, Streptomyces).
Chlorobi Chloroflexi,
Actinobacteria
»
,
,
).
Caldicellulosiruptor,
Bacillus)
«
[1],
,
.
,
16S
,
3
Anaerolineae, Caldilineae [2]
Chloroflexi
Ignavibacteria
.
–
Chlorobi [3],
.
.
,
2009
,
.
Chloroflexi)
-1
Ignavibacteria (
Levilinea saccharolytica
16S
,
16S rRNA
Anaerolinea
-2
Chlorobi),
,
.
-1
KIBI-1T,
– 92.8%).
200
.
-1
47° ,
7,5–7,8
0.1% NaCl.
.
.
0.1
,
1
.
-1
54
,
.
.
-2
Mat9-16 (
-2
T
Ignavibacterium album
2
90.8%).
,
15
16S
,
.
.
60° ,
37°
6.0-8.7,
47°
7.5,
-2
.
,
,
.
6% NaCl
(10
-2
.
,
5%
)
:
(5
)
,
,
;
(10
(10
)
,
)
.
-2
-,
-(
,
)
(
).
,
,
0.1
.
.
2
.
-2,
47° .
50
Anaerolineae
,
Caldilineae)
.
ris-HCl
(
8,8
20° )
NaCl (20 100
)
.
Chloroflexi
,
,
.
-1.
-2 Ignavibacterium album
Chlorobi,
,
,
Mat9-16T
,
.
,
Chlorobi
Chloroflexi,
,
,
.
2283,
02.740.11.0077,
«
»
55
1.
2.
3.
Zinder, S. H. & Dworkin, M. (2006). Morphological and Physiological Diversity. In The
Prokaryotes, Third Edition, vol. 1, pp. 185-221. Edited by M. Dworkin, S. Falkow, E.
Rosenberg, K.-H. Schleifer & E. Stackebrandt. Singapore: Springer.
Yamada, T. et al. (2006). Anaerolinea thermolimosa sp. nov., Levilinea saccharolytica gen.
nov., sp. nov. and Leptolinea tardivitalis gen. nov., sp. nov., novel filamentous
anaerobes, and description of the new classes Anaerolineae classis nov. and Caldilineae
classis nov. in the bacterial phylum Chloroflexi. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56, 13311340.
Iino, T. et al. (2010). Ignavibacterium album gen. nov., sp. nov., a moderately thermophilic
anaerobic bacterium isolated from microbial mats at a terrestrial hot spring and proposal
of Ignavibacteria classis nov., for a novel lineage at the periphery of green sulfur
bacteria. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60, 1376-1382.
BACILLUS SP
)
. .
, . .
,
,
,
.
,
,
,
.
,
,
,
.
.
,
,
,
.
,
.
Se-110,
(
(
).
Se-1-10,
).
–
. (Erlanger et.al., 1961),
:
(N56
5
-L-
- -
),
),
),
: GlpAALpNA (
: TpNA (LLpNA
(L-
- (N-
), ApNA (L),
ZAAGlupNa
)
,
.
24, 36, 48, 60, 72, 84, 96
AA)
12,
–
108 .
Na (
)
–
,
–
(
).
,
,
,
(
.,
108 ).
–
GlpAALpNA
96–108 .
–
ZAAGlupNa.
1,325 1,099
.
7,4
10,3,
4,46
10,3
.
).
0,8
0,7
1
2
0,5
0,4
1
0,6
,
,
0,7
0,6
0,5
2
0,4
0,3
0,2
0,3
0,1
0
0,1
0,2
0
2,17 3,25 4,1 4,9 5,52 6,6 7,4 8,2 9,26 10,3 11,3
( )
( )
3,2 4,46 5,14 5,7 6,26 6,77 7,52 8
Se-1-10
GlpAALpNA (2)
8,5 8,93 9,55 10,4
ZAAGlupNa (1)
,
23
60° ,
40–50° .
,
(
)
.
,
,
,
:
DFP)
(
(
, PMSF) (
57
,
,
1991).
,
.
Se-1-10
(%
)
)
GlpAALpNA
86,4
67,9
92,5
2,78
1,1
0,01
0,01
0,1
0,01
0,01
:
ZAAGlupNa
15
.
77
4,5
0
.–
,
Se-1-10
GlpAALpNA
–
)
86,4%,
,
,
,
ZAAGlupNa,
0,01 (
15%
).
GlpAALpNA,
Se-1-10,
.
92,5%
,
.
,
(
ZAAGlupNa
),
.
-
Se-1-10
(
)
77%.
4,5%.
(
)
.
Se-1-10,
,
,
Superdex-75
85000
Se-1-10
,
–
,
2.1.1/2165,
38
58
95.
.
,
.
1, 2
. .
1
, . .
1
.
2
.
.
,
2
. .
,
,
.
.
,
,
.
,
.
.
.
(Laridae)
.
(Ardea cinerea L.)
.(
., 2008).
.
–
.
.
(Laridae)
(Ardea cinerea L.)
.
,
200
.
60
40%-
20, 28
2%.
(19, 27
; 3, 10,
; 9, 23
; 11, 21
; 10
).
,
«YSI Model 55» (
.
,
,
).
,
,
,
DAPI.
.
2009
(
. 1)
.
.
59
, 106
. 1.
–
( 200
,
),
.
),
–
–
( 200
–
.
14
12
10
8
6
4
2
0
19.05. 27.05. 03.06. 10.06. 20.06. 28.06. 09.07. 23.07. 11.08. 21.08. 10.09.
,
,
)(
,
.
. 2)
.
,
.
,
80%
.
0,02%
. 2.
,
300
250
200
150
100
50
0
19.05. 27.05. 03.06. 10.06. 20.06. 28.06. 09.07. 23.07. 11.08. 21.08. 10.09.
,
(
,
,
.3),
50%
,
.
.
,
,
60
.
,
,
.
.
. 3.
,%
70
60
50
40
30
20
10
0
19.05. 27.05. 03.06. 10.06. 20.06. 28.06. 09.07. 23.07. 11.08. 21.08. 10.09.
,
,
.
.
,
,
,
.
ESCHERICHIA COLI
.
.
, . .
,
.
.
,
,
Escherichia coli
.
,
,
.
.
7
E.
coli.
.
.
.
.
,
E. coli
(2.5
).
61
3–29%
(
2
2
. 1).
2
.
,
2
. 1.
2
(
.1).
E. coli NM111
2
2
2
,
(10
.
2
2)
,
.
(
)
in vitro.
H2O2
(r = + 0.97, p > 0.05).
10
2
-
2
in vitro.
,
.
118.4
in vitro
20
.
.
in vivo
.
E. coli.
H2O2
I
katG.
(HPI),
H2O2-
katG
.
katG
katG::lacZ.
E. coli NM111,
katG
H2O2
OxyR.
,
H2O2,
OxyR-
katG
.
62
,
,
katG::lacZ
,
1,5–2
,
(
H2O2
. 2).
,
katG.
katG
,
2
2
in vitro.
2
katG::lacZ (
. 2).
.
.2.
katG::lacZ
E. coli NM111
,
,
,
,
,
,
.
,
,
,
H2O2,
in vitro.
H2O2,
,
.
H2O2
,
H2O2.
10-04-96017
.
63
. .
,
. .
,
,
,
,
.
,
5,8 ÷ 7,2.
)
,
,
(
=9,5 ÷ 10,8,
(
),
.
Tris·HCl,
:
,
,
,
,
.
,
,
,
,
,
7,5 ÷ 9,5.
,
=7,0 ÷ 8,5.
,
.
,
7,5 ÷ 9,5.
(NH2CH2CH2SO2OH),
,
.
– 2,
,
.
,
,
,
(10,48
/100
.
3
5$
–
) 320° .
20° ),
2
(
SO3H (pK 1,5)
.
.
NH2 (pK 9,06),
5,12.
100%,
(pH=7,4)
– 96,3%,
.
.
.
7,5
10,7.
1
.
22°
64
.
0,1
100
10
3,6
,
50
,
PB-11 (Sartorius,
),
PY-Y01 (pH=4,01), PY-Y02 (pH=7,00), PY-Y04 (pH=10,00) (Sartorius,
).
7,5 ÷ 10,7.
NaOH (
).
(40
.
1
)
:
,
,
.
.
1%
, (%):
– 0,5;
. 1.
– 1;
0,1
3,6
1
– 0,5;
– 1,5.
,
(22° ).
,
.
.
=8,8
,
.
,
,
.
,
.
,
.
1
,
2×108
4° .
.
=7,5
8,8
1.
, %: 0,5; 1; 2; 3; 5.
.
20%
1
.
6
.
4
37° ,
.
.
65
2
.
3%
,
.
5%.
. 2.
L20
2 ÷ 3%,
L50 4,6 ÷ 5%.
.
.
–
7,5 ÷ 10,7.
,
,
,
,
,
.
0,2 ÷ 1,5%.
BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM
VIGNA UNQUICULATA
. .
(Vigna unquiculata)
.
,
.
.
,
,
,
.
,
–
.
,
,
,
,
.
.
.
Bradyrhizobium japonicum
Vigna unquiculata.
66
10
(Bradyrhizobium
japonicum),
.
–
.
Bradyrhizobium japonicum
,
,
,
.
japonicum
.
Bradyrhizobium
,
23%.
,
,
Vigna unquiculata
5
5
Bradyrhizobium japonicum.
,
.
,
Bradyrhizobium
,
japonicum,
,
, 120
.
3
Bradyrhizobium japonicum,
.
,
. .
, .
.
,
,
,
.
–
,
,
,
,
.
–
,
,
4-521, B. angulatum
infantis
,
. 1).
.
Bifidobacterium longum subsp.
-524, B. animalis subsp. lactis
-522,
-523
(
«
») –
.
,
67
0.1–0.5
,
)
1–4
.
.
(Err)
,
(Cmr) (
1).
,
(
1).
.
,
,
.
,
.
,
, V-
,
Y-
,
.
1-2
.
1.
,
B. longum subsp.
infantis
-521
B. animalis subsp.
lactis
-522
B. animalis subsp.
lactis
-523
B. angulatum
-524
. .
. .*
Err
Cmr
. .
Err
Cmr
. .
Err
Cmr
. .
Err
Cmr
0.1
0.5
0.3
0.3
1.0
0.6
0.5
1.0
0.8
0.3
1.0
0.5
1.0
4.0
6.0
4.0
6.0
10.0
4.0
10.0
15.0
2.0
4.0
10.0
.*–
.
20-24
,
(
),
,
(
(
)
(
68
. 2).
. 2).
,
2.
(24 )
600
. .
Err
Cmr
. .
Err
Cmr
. .
Err
Cmr
. .
Err
Cmr
B. longum subsp.
infantis
-521
B. animalis subsp.
lactis
-522
B. animalis subsp.
lactis
-523
B. angulatum
-524
2–3×109
1–2×109
2–3×109
5–7×109
2–5×109
6–9×109
4–6×109
4–6×109
5–7×109
1–3×109
1–3×109
1–3×109
2,367
2,152
2,324
3,310
3,160
3,515
3,292
3,221
3,320
2,752
2,732
2,698
4,03
3,93
3,97
4,21
4,11
4,28
4,00
3,97
4,13
4,16
4,21
4,26
14–16
14–16
14–16
10–12
10–12
10–12
10–12
10–12
10–12
–*
–
–
4,12
4,19
4,10
4,80
4,94
4,53
4,00
4,66
4,33
6,25
6,11
6,18
2–6×109
2–6×109
3–5×109
2–5×109
7–9×109
5–7×109
6–8×109
4–6×109
5–8×109
2–5×106
2–5×106
2–5×106
. –* –
(
. 3).
,
,
.
,
,
,
(
3.
,
, 0
B. animalis subsp.
lactis
-522
B. animalis subsp.
lactis
-523
B. angulatum
-524
. 3).
ß-
,
B. longum subsp.
infantis
-521
,
4–6×107
7–9×107
5–7×107
1–2×109
2–3×109
180
3–4×103
1–2×104
1–3×103
2–3×106
3–6×108
0
4–6×107
7–9×107
5–7×107
1–2×109
2–3×109
. .
Err
Cmr
. .
Err
92,2±1,5
93,6±1,3
115,3±1,7
243,6±1,6
327,6±2,1
0,239±0,008
0,110±0,010
0,085±0,006
0,286±0,012
0,334±0,015
Cmr
265,2±1,9
0,429±0,018 3–4×109 2–4×106 3–4×109
. .
Err
Cmr
. .
Err
Cmr
246,0±1,5
318,1±2,2
248,3±1,8
16,2±1,3
15,8±1,6
16,3±1,4
0,256±0,013
0,306±0,011
0,267±0,015
0.087±0,005
0.054±0,006
0.118±0,009
69
5–7×109
3–5×109
3–5×109
2–3×107
6–8×107
3–5×107
3–5×106
2–4×108
2–5×106
3–5×104
4–6×105
2–6×104
5–7×109
3–5×109
3–5×109
2–3×107
6–8×107
3–5×107
15
4–7×101
3–5×103
2–3×102
4–7×104
3–
7×106
5–
8×104
7–9×104
2–3×107
1–2×105
1–3×102
3–6×103
2–4×102
,
aeruginosa
plantarum
(
-153,
-155, Enterobacter sp.
-447, B. subtilis
-276.
,
. 4).
P.
L.
-246,
Enterobacter
sp.
-246
L. plantarum
-447
B. angulatum
-524
P. aeruginosa
-155
B. animalis subsp.
lactis
-523
–
–
–
–
–
–
3
3
3
–
–
–
P. aeruginosa
-1553
B. animalis subsp.
lactis
-522
–
–
–
–
–
–
–
–
–
10
10
10
E. coli
-238
. .
Err
Cmr
. .
Err
Cmr
. .
Err
Cmr
. .
Err
Cmr
B. longum subsp.
infantis
-521
B. subtilis
-276
,
B. subtilis
-25
/
B. cereus
-169
4.
6
6
–
–
–
–
–
–
–
10
10
10
10
10
10
8
8
8
9
9
9
20
20
20
8
8
8
8
8
8
7
7
7
15
15
15
4
4
4
1
1
1
2
2
2
12
12
12
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
. -* –
,
,
.
PSEUDOMONAS
. .
, .
.
,
. .
,
,
.
,
,
.
.
,
70
,
,
,
.
502
.
2009
.
.
.
(Alarcón et al., 2008,
,
, 2006),
Pseudomonas (Kuiper et al., 2004,
Juhanson et al., 2009).
,
Pseudomonas,
.
-
,
(1%).
1·108
Pseudomonas
/ .
,
7
,
,
28º
.
,
3-
.
Pseudomonas
,
.1).
. 1.
Pseudomonas
98
96
94
92
%
90
88
86
84
+Pseudomonas
82
+Pseudomonas
80
Pseudomonas
.
,
Pseudomonas
9,3%
71
8,9%
.
17,9%
– 76,1%
),
.
.
32,3%
,
(
,
,
(
.2).
. 2.
:1–
2–
;3–
+ Pseudomonas; 4 –
,
1.
2.
3.
4.
(
+ Pseudomonas
);
Pseudomonas
.
Rhizoremediation: a beneficial plant-microbe interaction / Kuiper I. [et al.] // Molecular
Plant –Microbe Interactions.- 2004.– Vol. 17, 1.- P. 6-15.
.,
.
Azospirillum.
.
. 2006. .5-6.
Arbuscular mycorrhiza and petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation
of petroleum-contaminated soil / Alarcón A. [et al.] // International J. of
Phytoremediation. – 2008. – Vol. 10. – P. 251-263.
Survival and catabolic performance of introduced Pseudomonas strains during
phytoremediation and bioaugmentation field experiment / Juhanson J. [et al.] // FEMS
microbiology ecology. – 2009. – Vol. 70, 3. – P.446-455.
72
PECTOBACTERIUM ATROSEPTICUM
SCRI 1043
. .
,
.
, .
.
, . .
,
.
.
,
. .
,
,
,
.
,
,
.
.
SCRI1043 (
Pectobacterium atrosepticum
,
,
.
,
P ,
5
( 10
),
.
),
,
,
8
(10
),
5
5×10 – 1×106
1,00E+09
1,00E+08
1,00E+07
,
1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
0
1
2
3
8
,
. 1.
P.atrosepticum SCRI1043,
:
1
2
3
4
5
6
7
10 ( ),10 ( ), 10 ( ), 10 ( ),10 ( ), 10 ( ), 10 (
8
), 10 ( )
,
.
73
1,00E+08
,
1,00E+07
1,00E+06
1,00E+05
0
1
2
8
,
. 2.
P.atrosepticum SCRI1043,
:
4
6
8
10 ( ),10 ( ), 10 ( )
.
1
2
. 3.
P.atrosepticum SCRI1043:
6×104. 1 –
3
–
,
,2
,
–
,
–
,
,
–
.
.
.
.
,
.
74
.
,
P. atrosepticum,
LB,
(50° )
.
3-
,
,
.
1,00E+09
1,00E+08
1,00E+07
,
1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
0
1
2
24
,
. 4.
SCRI1043,
LB ( ), AB ( )
( )(
-
LB),
( )(
3
106
).
,
atrosepticum SCRI1043
P.atrosepticum
–
,
,
P.
.
.
,
,
,
,
,
.
. .
, . .
, .
,
.
. .
,
,
,
,
,
(«biofilms»).
(
,
75
)
.
,
.
,
.
»,
«
,
,
,
,
«
»
.
:
4 -6 ,
Dietzia sp.)
:
21684-1
2610-1
,
Chromohalobacter sp.)
(
8214.
[1,2].
.
.
,
.
,
50% (
.
-50).
,
6 .
,
-50
,
.
,
,
,
,
.
,
,
,
,
,
,
.
1.
.
,
.
,
.
.
//
.
2.
.
4. . 28–30.
,
.
//
,
.
, Dietzia sp.
.
.
. 2008. . 77.
76
5. . 581–589.
. 2008. . 3.
AZOSPIRILLUM LIPOFERUM SP59B
. .
, . .
, . .
, . .
,
,
Azospirillum
,
[1].
(
).
,
A. lipoferum Sp59b
,
[2].
,
(Fru)
–
A. lipoferum Sp59b,
.
24
KNO3
.
72
NH4Cl
10 : 1.
C : N
Sepharose CL-4B.
A. lipoferum Sp59b,
[3],
mal).
1.
A. lipoferum Sp59b
:
C:N
Fru:NH4Cl Fru:NH4Cl
10 : 1
10 : 1
72
24
-1
Fru:KNO3
10 : 1
24
-2
mal,
Fru:KNO3
10 : 1
72
-3
-4
-3 (38%),
54,3, 69,7
-1,
81,9%
Malate:NH4Cl
2:1
24
-2
-4
.
,
2%,
.
3%
77
(
0,5%
mal),
-2,
2-
.
-3-
(
-1,
-2,
mal – 4,4%.
.
0,3–0,7%,
) –
-3
,
,
,
S-
(
).
(
mal.
4),
,
-4,
.
(
)
.
,
.
2-
12:0,
,
3-
12:0
12:0
,
mal
3,
.
-4
1
:
2
-1 (1),
3
-2 (2),
16:0,
18:0
-1,
19:0
-2,
-3
,
.
4
-3 (3),
,
-4
(4).
.
2.
C12:0
-1
-2
-3
-4
mal
–
–
–
–
21.9
A.lipoferum Sp59b
2-OHC12:0
–
–
–
–
8.2
mal (
3-OHC12:0
–
–
–
–
30.7
3-OHC14:0
46.8
26.4
45.9
37.0
12.6
C16:0
3-OHC16:0
20.6
16.0
19.5
17.4
–
10.2
9.9
8.3
9.3
13.0
)
C18:1
C18:0
C19:0
19.0
38.4
21.6
16.1
10.1
–
3.9
–
21.0
–
3.5
5.3
4.9
–
–
(
lipoferum Sp59b.
,
)
A.
A. lipoferum Sp59b,
[3, 4].
,
,
.
-1,
.
78
.
,
-1,
-3
-4
.
-
-2
.
,
mal
.
,
,
,
A. lipoferum
Sp59b.
.
.
,
,
,
.
1.
Steenhoudt, O., Vanderleyden, J. Azospirillum, a free living nitrogen-fixing bacterium
closely associated with grasses genetic, biochemical and ecological aspects // FEMS
Microbiol. Rev. 2000. 24: 487–506.
Sadasivan, L, Neyra, C.A. Flocculation in Azospirillum brasilense and Azospirillum
lipoferum: Exopolysaccharides and Cyst Formation // J. Bacteriology. 1985. 163: 716–
23.
.,
.,
.
.
Azospirillum lipoferum Sp59b //
. 2010. 75:707–16.
Fedonenko, Yu.P., Konnova, O.N., Zatonsky, G.V. et al. Structure of the O-polysaccharide
from the Azospirillum lipoferum Sp59b lipopolysaccharide // Carbohydrate Research.
2005. 340: 1259–63.
2.
3.
4.
GEOBACILLUS STEAROTHERMOPHILUS
. .
1,2
1,2
, . .
1
,
,
2
.
.
.
.
,
,
.
-,
-
-179
,
(
)
:
+ Pi
-1-
2194
BL21(DE3)/pBstPYNP,
2.4.2.1)
(
0.2
IPTG
.
+
Geobacillus stearothermophilus
E. coli BL21(DE3)/pBstPNPII
II (
2.4.2.2) G. stearothermophilus
-2194.
TB,
,
SDS,
40%
,
,
27 kDa,
46
kDa.
G. stearothermophilus,
30
,
70°
.
(
),
55±4
(PuNPII)
112±7
stearothermophilus.
65°
(PyNP)
250
G.
118
,
.
G. stearothermophilus
dAdo
60 70°
E. coli.
(
– 1:1)
340
G. stearothermophilus
. 1).
1%
(14
24
60°
80
).
9%
24
70°
G. stearothermophilus E. coli
2–
G. stearothermophilus
100%
dAdo. 1 –
70° , 3 –
E. coli
G. stearothermophilus
60° , 4 –
E. coli
dAdo
60° ,
70° .
,
E. coli
8
45%
,
.
.
,
.
,
,
,
2CldAdo (2.1).
,
-2’-
)
2Fara (9- -D-
-2-
)(
G. stearothermophilus
,
KH2PO4,
,°
,
pH
,
,
dAdo
dGuo
PuNPII:PyNP)
1:2
2:1
dThd, 15
dThd, 15
Ade, 5
Gua, 5
5
5
75
70
2CldAdo
AraA
2FaraA
1:2
1:2
1:1
dThd, 15
araU,15
araU,15
2ClAde, 5
Ade, 5
2FAde, 5
5
5
5
75
75
75
*
, **
50
-NaOH
81
7.5
10.0
**
7.5
7.5
7.5
(
10.0
%*
2
10
89
96
4
4
8
86
88
85
70°C)
,
G.
,
stearothermophilus
,
.
,
,
.
08-04-12143, 08-04-01842)
1.1.09).
.
1
. .
,
2
. .
1
,
,
2
,
,
,
,
.
,
.
.
4,
.
.
-(
2008–2010
)
.
,
.
(
1986).
70
(
,
5-
1:3
23–25°
27
.
., 2001;
BG-11 (1%
1:5).
.,
1.
, pH=7,0),
2000–3000 .
5
,6
, 11
, 17
22
.
Cyanoprokaryota Chlorophyta – 37,0 51,8 %
Streptophyta, Xanthophyta
Heterokontophyta
: Klebsormidium flaccidum (Kützing)
82
P.C.Silva, K.R.Mattox & W.H.Blackwell, Vaucheria sp.
Eustigmatos magnus (J.B.Petersen)
D.J.Hibberd,
.
4
: Nostocaceae, Chlamydomonadaceae, Chlorococcaceae
4
14,8 %) Chlorellaceae (2
7,4 %).
13
48,2 %
.
(
,
, 1984;
, 2009).
Chlamydomonadaceae, Chlorococcaceae Chlorellaceae
(pH . = 4,95)
.
,
(
,
, 1990).
,
.
Bacillariophyta,
,
,
.
,
12
.
(
,
, 1990)
,
4
Eustigmatos magnus
: Pleurochloris magna J.B. Petersen), Bracteacoccus minor (Chod) Petrova, Chlorella
vulgaris Beijerinck Chlorella mirabilis V.M. Andreeva.
,
Coccomyxa, Chlamydomonas, Neospongiococcum, Tetracystis
Spongiochloris,
.
.
(
,
, 1984)
Nostoc muscorum C. Agardh ex Bornet & Flahault, Nostoc punctiforme (Kützing)
Hariot, Anabaena cylindrica Lemmermann, Plectonema gracillimum Zopf ex Hansgirg, Tolypothrix
tenuis Kützing ex Bornet et Flahault, Phormidium aerugineo-coeruleum (Gomont) Anagnostidis &
Komárek (
: Lyngbya aerugineo-coerulea (Kütz.) Gom.), Leptolyngbya notata (Schmidle)
Anagnostidis & Komárek (
: Plectonema notatum Schmidle), Chroococcus minutus
(Kützing) Nägeli (
: Gloeocapsa minuta (Kützing) Hollerbach), Bracteacoccus minor,
Chlamydomonas cf. reinhardtii P.A. Dangeard, Chlamydomonas cf. oblonga Pringsheim
: Chlamydomonas oblonga Anachin)
Characium.
,
(
,
)
,
,
.
Chlorophyta.
Aphanothece saxicola Nägeli, Cylindrospermum minutissimum Collins,
Chlamydomonas applanata Pringsheim, Chlamydomonas cf. pumilio Ettl, Coccomyxa cf.
subglobosa Pascher, Tetracystis excentrica R.M. Brown & Bold, Neospongiococcum cf.
alabamense (Deason) Deason, Chlorosarcinopsis gelatinosa Chantanachat & Bold, Spongiochloris
minor Chantanachat & Bold, Mychonastes homosphaera (Skuja) T.Kalina & M.Puncochárová,
Klebsormidium flaccidum
Vaucheria
.
.
.
.
.
.
.
83
2.1.1/3819
1.
2.
09-04-00652.
.,
, 1984. . 149.
.,
.
.
. 1990. .80.
.
/
.
,
4.
5.
.:
.
:
3.
. –
,
.,
.–/
.,
, 2009, 168 .
.
.-
:
.
.
, 2001. 60 .
.
.–
:
, 1986. 172 .
SINORHIZOBIUM MELILOTI S3
MEDICAGO SATIVA
. .
,
,
.
,
,
.
Sinirhizobium meliloti S3 Rif
(Medicago sativa),
.
S. meliloti S3,
,
«
».
-3-
.
Medicago sativa
S. meliloti S3
,
.
2,4
4
,
.
.
,
:
–
84
,
,
31–35%.
,
(45%)
,
20 32%
5,5×107
.
.
.
.
.
38%,
.
3
1
16%
15%
,
.
(
)
,
,
.
.
S. meliloti S3
,
,
2,48×107
4
.
.
.
,
66%,
15%
63
24%
19%
9%
,
.
M. sativa.
(
)
,
,
,
,
S. meliloti S3
11%.
.
62%.
,
,
.
46,7%,
17,1%
S. meliloti S3
.
M. sativa
,
.
32,1%,
31,4%
– 32,2
– 12,4%.
23,2%,
.
47,5%
,
.
3,5
.
85
,
S. meliloti S3
M. sativa
,
.
.
ARTHROBACTER,
xylA
1
. .
1
, .
1
.
, .
2
.
«
»,
2
,
,
(
DD-
,
,
D-
5.3.1.5)
,
– D-
.
.
,
,
,
.
,
,
,
,
.
Arthrobacter
,
,
xylA
.
Arthrobacter
10
.
,
,
,
,
,
,
(0,5%
,
250
(180-200
,
)
72
,
27–29° ,
.
1
K,Na-
).
50
1
0,05
70° .
.
A. oxydans
,
B-248
A. nicotianae
B-5,
.
,
A. nicotianae
,
B-5
A. oxydans
B-248.
86
LB,
A. citreus
B3,
–
B-2239,
B-2240,
B-2241,
B-2242 Arthrobacter sp., A. oxydans
B-248, A. nicotianae
B-5, A. ureafaciens
B-6, A. globiformis
B-10 A. crystallopoietes
B-13.
0,11–0,15
.
Arthrobacter
EcoRI,
5–10
.,
pUC18.
,
Arthrobacter.
.
xylA
Escherichia coli
101 (xyl-).
,
D(1%)
.
4
E. coli
101,
A. oxydans
B-248, A. ureafaciens
B-6,
Arthrobacter sp.
B-2241, Arthrobacter sp.
B-2240
D.
,
,
E. coli
101 (xylA-).
pUC18
D-
,
,
.
B-248, A. ureafaciens
2240
E. coli
.
B-6, Arthrobacter sp.
,
xylA
A. oxydans
B-2241, Arthrobacter sp.
BE. coli HB101.
101
Arthrobacter,
2
. (A. oxydans
B-248)
(Arthrobacter sp.
B-2241).
,
,
Arthrobacter
,
,
oxydans
B-248 A. nicotianae
B-5,
xylA
A. oxydans
B-248, A. nicotianae
B-5, A. ureafaciens
Arthrobacter sp.
B-2240, Arthrobacter sp.
B-2241
E. coli
101.
,
09-135.
87
6,5
.
A.
.
B-6,
AZOSPIRILLUM LIPOFERUM
1
. .
2
, . .
1
. . .
,
,
2
,
,
Azospirillum
;
,
.
,
,
.
.
.
,
Azospirillum lipoferum
.
20
Azospirillum lipoferum
4
.
lipoferum: SR5, SR16, SR44, SR54 –
A.
(A. lipoferum Sp59b, A. brasilense Sp7, Sp245
JM125A2).
A. lipoferum SR16.
cv.
29)
.
A. lipoferum SR16
(Festuca valesiaca subsp. sulcáta (Hack.) Schinz et R.Keller –
.
,
7
60
,
.
,
88
)
.
A. lipoferum SR16
3
.
10
(Triticum aestivum
,
60-
.
,
,
(
),
.
,
,
.
,
SR16,
,
,
,
60
,
,
.
7
,
.
Sp59b
.
,
(
.
SR16,
,
)
,
: SR5, SR44, SR54.
A. lipoferum SR16 (1), SR5 (2), SR44 (3), SR54 (4) Sp59b (5)
c
A. lipoferum SR16
,
A lipoferum SR5, SR16, SR44, SR54
,
.
Azospirillum
.
89
lipoferum,
. .
,
. .
,
,
.
,
.
,
,
,
,
,
,
.
,
.
,
.
,
,
Pseudomonas, E. oli,
staphylococcus, Enterococcus, Yersinia, Bacillus, Clostridium, Campylobacter, Klebsiella,
Gardnerella.
,
.
,
.
.
Bifidobacterium adolescentis
-42, B. adolescentis
B-456 , B.adolescentis
-87, B.
adolescentis
B-455 , B. adolescentis -01, B.longum 379 , B. bifidum
3, B. infantis,
B. bifidum 791.
: Staphylococcus saprophyticus,
Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus 2098, Salmonella typhimurium, Listeria
monocytogenes,
.
20–24
(
4,5
7,0).
10000g
4°
20
.
0,2
.
.
.
90
3
4,5
3
1,0
,
3, 6, 9, 12, 18, 24
.
,
590 .
)
:
2– 1
× 100%
4– 3
.
,
(
= 100 :
2 –
1
-
–
;
;
–
4 –
100 –
;
;
, %.
(
5
7) (
1).
1.
,%
Salmonella
typhimurium
pH 7 pH 5
B. adolescentis MC42
B. adolescentis
B-456
B. adolescentis 94
B. adolescentis
B-455
B. adolescentis B01
B. longum 379
B. bifidum
3
B. infantis AS-6
B. bifidum 791
Staphylococcus Staphylococcus
aureus
saprophyticus
pH 7 pH 5
pH 7
pH 5
Staphylococcus
aureus 2098
pH 7
pH 5
36,8
100
0
93,1
0
97,2
0
95,0
38,7
42,6
100
100
0
0
84,4
81,0
0
0
91,6
88,8
0
0
80,0
77,5
56,2
42,6
58,1
32,9
46,5
48,4
100
100
100
100
100
100
0
0
0
0
0
0
86,2
87,9
84,4
86,2
87,9
82,7
16,6
0
13,8
0
0
0
88,8
88,8
88,8
91,6
91,6
83,3
0
0
0
0
0
0
82,5
85,0
87,5
87,5
87,5
82,5
.
typhimurium.
Staphylococcus aureus 2098
7
32,9%
58,1%
,
(
5)
100%
Salmonella
Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus
77%
97%
.
Salmonella typhimurium,
B. adolescentis
B-455
91
B. adolescentis
B-456
5,0 (
2.
.
2, 3).
B. adolescentis
Staphylococcus
saprophyticus
Listeria
Staphylococcus
monocytogenes aureus 2098
B-455 , %
Staphylococcus Salmonella
aureus
typhimurium
3
.
100
100
100
100
100
6
.
100
100
88,5
97,5
100
9
.
100
100
84,6
98
100
12
.
100
100
83,7
100
100
18
.
100
100
77,9
94,7
100
24
.
100
100
72,5
91,6
100
3.
Staphylococcus
saprophyticus
B. adolescentis
Listeria
Staphylococcus
monocytogenes aureus 2098
B-456 , %
Staphylococcus Salmonella
aureus
typhimurium
3
.
100
100
100
100
100
6
.
100
100
90,4
99,6
100
9
.
100
100
89,6
96,1
100
12
.
100
100
85,0
100
100
18
.
100
100
78,8
93,6
100
24
.
100
100
68,3
91,5
100
,
,
Staphylococcus
saprophyticus, Salmonella typhimurium Listeria monocytogenes
,
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus 2098 –
.
3
100%
,
24
100%
Staphylococcus saprophyticus, Salmonella typhimurium Listeria monocytogenes.
Staphylococcus aureus
72,5%,
Staphylococcus aureus
2098 – 68,3%
.
92
XANTHOMONAS
. .
,
. .
, . .
. .
, .
.
,
, . .
,
,
.
,
.
,
,
.
(4-
, 2,4- , 2,4,5- ).
,
.
,
(4(42,4,5.
4-
, 2,4- , 2,4,5- ).
33DCP,
), 2,4(2,4,5- )
4(2,4- )
,
9-
,
2,416S
2,4,5-
7- .
,
,
Xanthomonas.
33DCP.
,
,
,
(4-
, 2,4-
Xanthomonas sp.
Xanthomonas sp. 33DCP,
2,4,5- ).
.
«
»
».
93
СЕКЦИЯ II
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭКОЛОГИЯ
И ГЕОХИМИЧЕСКАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ
ИЗМЕНЕНИЕ ВИДОВОГО И ШТАММОВОГО СОСТАВА
АССОЦИАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПРОЦЕССЕ БИООКИСЛЕНИЯ
КОНЦЕНТРАТОВ СУЛЬФИДНОЙ РУДЫ
А. Г. Булаев, Т. А. Пивоварова, Т. Ф. Кондратьева
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия.
Понимание
закономерностей
формирования
ассоциаций
ацидофильных
хемолитотрофных микроорганизмов (АХМ) в техногенных средах обитания важно для
пополнения информации об этой уникальной физиологической группе микроорганизмов.
Знание оптимальных условий и технологических режимов для процессов окисления
сульфидных минералов при участии АХМ необходимо для интенсификации и повышения
эффективности процессов получения цветных и благородных металлов.
Известна филогенетическая гетерогенность АХМ. Эти микроорганизмы относятся к
филумам Proteobacteria, Firmicutes, Crenarchaeota, Nitrospirae, Actinobacteria,
Euryarchaeota. В единую группу АХМ объединяет близость физиологических признаков
по ацидофилии, использованию в качестве источников энергии неорганических
субстратов (закисное железо, элементная сера, ее восстановленные соединения,
сульфидные минералы), по высокой толерантности к ионам металлов. Из руд разных
месторождений, их концентратов и из пульп биогидрометаллургических процессов на
различных
энергетических
субстратах
выделены
микроорганизмы
разного
таксономического статуса, различающиеся по скорости роста и окисления, оптимальными
значениями рН и температуры, устойчивостью к ионам тяжелых и токсичных металлов.
На видовой состав микробного сообщества существенное влияние оказывает
температура. В мезофильных условиях доминируют представители Acidithiobacillus
ferrooxidans, At. thiooxidans, Leptospirillum ferrooxidans, L. ferriphilum. В умеренно
термофильных – At. caldus, виды рода Sulfobacillus, Acidimicrobium ferrooxidans. Археи
родов Acidianus, Sulfolobus, Metallosphaera доминируют при температурах выше 60°С. В
последнее десятилетие внимание исследователей привлекают микробные сообщества с
оптимальными температурами роста в диапазоне 40–60°С. Это связано с эффектом
саморазогрева в процессах кучного и чанового окисления сульфидных минералов
(пирротина, пирита) в результате экзотермических реакций. Наше внимание было
обращено на изучение микробных сообществ, окисляющих сульфидные минералы в
биогидрометаллургической технологии извлечение золота из концентратов пирротинпирит-арсенопиритной руды Олимпиадинского месторождения.
94
Ранее на полупромышленной установке золотоизвлекательной фабрики (ЗИФ) ЗАО
«Полюс» процесс окисления сульфидных минералов флотоконцентрата шел при
температуре 30–35°С. В сообществе микроорганизмов при этом доминировали
мезофильные грамотрицательные бактерии At. ferrooxidans и At. thiooxidans. При
масштабировании процесса за счет саморазогрева пульпы температура повысилась. С
помощью охлаждения реакторов водой температуру удается удержать на уровне 39–40°С.
Анализ микробной ассоциации в реакторах показал, что доминирующую роль заняли
представители рода Sulfobacillus. Был выделен новый вид ‘S. olympiadicus’.
Присутствовали штаммы L. ferrooxidans, Ferroplasma acidiphilum. В минорном количестве
были отмечены At. ferrooxidans, At. thiooxidans и гриб Aspergillus niger.
При мониторинге сообщества микроорганизмов в пульпе реакторов в течение
нескольких лет было отмечено замещение одних штаммов Sulfobacillus другими, причем
кроме штаммов ’S. olympiadicus’ были выделены штаммы S. thermosulfidooxidans и S.
thermotolerans (рис. 1). Изменялось соотношение видов микроорганизмов в зависимости
от условий протекания процесса биоокисления.
Анализ библиотеки клонов генов 16S рРНК микроорганизмов из пульпы реакторов
ЗИФ в 2009 г. показал преобладание представителей родов Letptospirillum и
Acidithiobacillus, а также Ferroplasma acidiphilum (рис. 2). Под световым микроскопом в
ассоциации наблюдались спорообразующие палочки, предположительно сульфобациллы,
которые молекулярно-биологическими методами не идентифицировались. Также
культуральными методами были обнаружены гетеротрофные бактерии родов
Alicyclobacillus и Acidiphilium. Последние, очевидно, росли за счет потребления
органического вещества хемоавтотрофов Letptospirillum и Acidithiobacillus. Для решения
спорного вопроса о присутствии в ассоциации представителей Sulfobacillus был проведен
контрольный эксперимент, в котором смешивали биомассу ассоциации с биомассой
чистой культуры Sulfobacillus в контролируемых количествах – 10:0, 9:1, 5:5, 1:9, 0:10.
Наличие сульфобацилл было выявлено при содержании в ассоциации биомассы чистой
культуры Sulfobacillus равном 10% от суммарной. Это подтвердило достоверность
результатов, полученных молекулярно-биологическими методами. Отсутствие в
ассоциации бактерий рода Sulfobacillus, которые ранее выявлялись как доминирующие,
можно объяснить неблагоприятными для них условиями в результате изменения в составе
руды.
Полученные результаты сравнения состава ассоциаций, выделенных из пульпы
реакторов цехов БИО ЗИФ в разные годы, свидетельствуют о том, что в пульпе идет
непрерывный процесс адаптивной эволюции. Ассоциации микроорганизмов в природных
и техногенных системах очень лабильны, и соотношение видов в них зависит от многих
факторов среды. Изменение условий приводит к изменению доминирующего вида в
ассоциации.
95
Рис. 1. Филогенетическое дерево бактерий рода
Sulfobacillus, основанное на сравнении
нуклеотидных последовательностей генов 16S
рРНК. Изоляты, выделенные из пульпы
Олимпиадинской ЗИФ подчеркнуты.
Рис. 2. Консенсусные филогенетические деревья,
полученные при изучении состава ассоциации
Олимпиадинской ЗИФ:
А – дерево для клонов из группы
р. Leptospirillum
Б – дерево для клонов из группы
р. Acidithiobacillus.
96
ОБРАЗОВАНИЕ МИЛЛЕРИТА ШТАММАМИ DESULFOVIBRIO
О. П. Буторова1, Л. Н. Еренко 1, А. В. Козлова2, О. В. Забудченко2, А. А. Миллер3,
О. В. Карначук1
1
Кафедра физиологии растений и биотехнологии, Томский государственный университет,
Томск, Россия
2
Материаловедческий центр Томского государственного университета, Томск, Россия
3
НПО «Вирион», Томск, Россия
Образование сульфидов – основной механизм, посредством которого
сульфатредуцирующие бактерий (СРБ) осаждают тяжелые металлы из раствора.
Различные технологические схемы осаждения металлов в виде сульфидов используют
смешанные культуры СРБ. Существует возможность избирательного осаждения металлов
в виде сульфидов. Важным преимуществом таких технологий является их
избирательность по отношению к различным металлам. Так, например, из сточных вод,
содержащих железо и никель, могут быть отдельно осаждены сульфиды никеля. Эта
особенность позволяет использовать сточные воды в качестве вторичного источника
сырья для получения некоторых сульфидов никеля. В свою очередь, никель может быть
извлечены
из
сульфидов
традиционным
гидрометаллургическим
или
пирометаллургическим способом. Кроме того, сульфид никеля привлекает внимание
благодаря своим уникальным свойствам, в том числе благодаря существованию перехода
металл – изолятор, фазового превращения парамагнетик-антиферромагнетик (Ya-Hui
Zhang et al., 2007), использованию в качестве катализатора для реакции
дегидросульфирования и гидрогенизирования (Харлампиди, 2000).
Ранее было показано образование сульфидов никеля в смешанных культурах СРБ
(Gramp et al., 2007). Механизмы осаждения никеля чистыми культурами СРБ до сих пор
оставались не изученными. В нашей работе была исследована способность чистых
культур рода Desulfovibrio, устойчивых к ионам металлов, образовывать сульфид никеля.
Культуры СРБ выращивали анаэробно в пенициллиновых флаконах и 120 мл
сывороточных бутылях на пресноводной среде Видделя (Widdel, Back, 1992), в качестве
донора электронов использовали лактат, двухвалентный никель добавляли в
концентрации 100 и 250 мгNi/л. Культивирование проводили при температуре 28°С, в
течение 58 и 122 суток. Осадки сульфидов осаждали центрифугированием и высушивали.
Изучение образованных осадков проводили с использованием сканирующей электронной
микроскопии (Philips SEM515 с анализатором EDAX ECON IV). Кристаллическую фазу
определяли методом рентгенофазового анализа на дифрактометре Shimadzu XRD 6000.
Микроанализ (EDS) показал, что основными элементами, содержащимися в осадках
образованных штаммом Desulfovibrio sp. R2, были никель, железо и сера (Рис. 1).
Соотношение атомов серы и никеля, обнаруженное в биогенном осадке методом энергодисперсионного анализа, соответствовало минералу миллериту с химической формулой
NiS.
97
Рис. 1. Микрофотография и энерго-дисперсионный спектр осадка, образованного при
культивировании Desulfovibrio sp. R2 в присутствии ионов никеля (100 мгNi/л)
(сканирующий микроскоп Philips SEM515)
Осадки, полученные при культивировании штамма Desulfovibrio sp. А4, содержали
никель, серу, железо и кислород (Рис. 2). Соотношение Ni:S, также как и в осадке,
образованном штаммом Desulfovibrio sp. R2, составляло 1,1:1, что соответствует минералу
миллериту. При изучении осадка с помощью рентгенофазового анализа было показано
образование этого сульфида никеля (миллерита) в кристаллической форме (Рис. 3).
В контрольных осадках, полученных при инкубировании без добавления инокулята,
кристаллической фазы не наблюдали и основными элементами были никель и кислород.
Рис. 2. Микрофотография и энерго-дисперсионный спектр осадка, образованного при
культивировании Desulfovibrio sp. А4 в присутствии ионов никеля (250 мгNi/л)
(сканирующий микроскоп Philips SEM515).
98
Рис. 3. Дифрактограмма осадков, полученных при культивировании Desulfovibrio sp. А4 в
присутствии ионов никеля (250 мгNi/л) (дифрактометр Shimadzu XRD 6000).
Обозначения на дифрактограмме: Ml – Миллерит (NiS)
350
300
I (counts)
250
Ml
Ml
Ml
Ml
Ml
200
Ml
150
100
50
20
30
40
50
60
70
2 T h e ta
Работа финансировалась грантом ФЦП (договор №П336 от 7.05.2010) и фондом
УМНИК (договор №7450р/10262 от 29.01.2010).
БАКТЕРИИ–ДЕСТРУКТОРЫ ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА
В ЩЕЛОЧНЫХ ОЗЕРАХ БУРЯТИИ И ЗАБАЙКАЛЬСКОГО КРАЯ
А. Г. Захарюк, Д. В. Егорова
Институт общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения РАН,
Улан-Удэ, Россия
Забайкалье отличается широким разнообразием водных экосистем. Здесь широко
распространены солоноватые, содово-соленые, соленые озера и рассолы, которые по
своим характеристикам относятся к экстремальным экосистемам из-за высокой
минерализации (25–360 г/л), щелочности (1,5–450 г/л) и рН (9–11). В содово-соленых
озерах развивается специфическое алкалофильное микробное сообщество, включающее
представителей всех основных трофических групп микроорганизмов, обеспечивающих
замкнутый цикл веществ в системе [1]. Показано, что деструкция органического вещества
в щелочных озерах идет до полного его разложения, а бактерии-деструкторы здесь играют
ведущую роль [2].
Целью данной работы было изучение распространения алкалофильных первичных и
вторичных бактерий-деструкторов органического вещества в щелочных озерах
Забайкалья.
99
Объекты и методы
Исследования были проведены в 4 щелочных озерах, расположенных на территории
Бурятии и Забайкальского края. Объектами гидрохимических и микробиологических
исследований служили донные осадки и песчаные маты, отобранные с береговой линии
изучаемых озер.
Учет численности клеток микроорганизмов проводили методом предельных
разведений на элективных средах. Пробы высевали на жидкую или агаризованную
минеральную среду состава (г/л): КН2РО4 – 0,2; MgCl2 ˙ 6Н2О – 0,1; NH4Cl – 0,5; NaCl –
15; дрожжевой экстракт – 0,05; раствор микроэлементов по Пфеннигу – 1мл/л. Для
культивирования сульфатредуцирующих бактерий к вышеописанной среде добавляли
(г/л): Na2SO4 ˙ 10Н2О – 3; Na2S ˙ 9Н2О – 0,05; металлическая скрепка или FeSO4 – в
качестве индикатора процесса. Для культивирования железоредуцирующих бактерий к
среде добавляли цитрат железа (III) – 30 мМ. В качестве субстратов вносили: для
целлюлозолитиков – полоски фильтровальной бумаги; для сульфат- и железоредукторов –
лактат натрия (3 г/л). Сапрофитные бактерии определяли на среде РПА : 10. Значение рН,
соответствующее природному значению в озерах, устанавливали соотношениями NaHCO3
и Na2CO3 [3]. Морфологию клеток изучали в световом микроскопе Ahiostar plus (Karl
Zeiss, Германия) с фазовым контрастом при увеличении 1000×.
Результаты и обсуждения
По минерализации в период исследований воды озер, в соответствии с
классификацией Валяшко, различались от солоноватых до соленых. По химическому
составу относятся к карбонатному типу. Значения рН воды в озерах находились в
щелочной области и варьировали от 8,7 до 9,9 (табл. 1).
Таблица 1. Физико-химическая характеристика содовых озер Забайкалья, мг/л
Озеро
Местоположение
рН
ОМ,
г/дм3
Cl-
SO42-
HCO3-
CO32-
Соленое
Кяхтинский район,
республика Бурятия
Иволгинский район,
республика Бурятия
Агинский
район
Забайкальский край
Ононский
район
Забайкальский край
9,9
5,6
199,72
376,56
2171,6
720
8,7
1,8-2,6
335,5
477,7
106,7
54,0
9,15
71,0
19700
14461
1037
0
9,5
7,0
–
600
1952
600
Белое
Хилганта
ЗунТорей
Примечание: «ОМ» - общая минерализация; «–» – не определено.
Максимальная численность аэробных и факультативно анаэробных сапрофитных
бактерий (20 млн. КОЕ) зафиксирована в озере Соленое. Минимальная численность (3
млн. КОЕ) выявлена в песчаном мате озера Зун-Торей (табл. 2). Колонии сапрофитов на
чашках отличались размерами и пигментацией. Выявлены кремовые, желтые и ярко100
оранжевые колонии. Размеры колоний варьируют от 1 до 4–5 мм. Края колоний ровные,
профиль выпуклый или каплевидный, реже плоский и вросший в агар.
Численность целлюлозоразлагающих бактерий в исследуемых водоемах была
одинаковой и составила 1 млн. кл/см3 (табл. 2). Проведенные микроскопические
исследования накопительных культур целлюлозолитических бактерий выявили различные
морфотипы клеток. В большом количестве присутствовали изогнутые палочки, нередко
встречались тонкие подвижные палочки со спорой, отдельные споры, спириллы. Можно
предположить, что целлюлозоразлагающие бактерии представлены подвижными
спорообразующими палочками, что морфологически соответствует роду Clostridium.
Образование гидролитическими бактериями низкомолекулярных органических
веществ, присутствие сульфатов биогенного и абиогенного происхождения в содовых
озерах, способствуют активной деятельности сульфатредуцирующих бактерий (СРБ). Во
всех исследуемых водоемах эта группа бактерий выявлена в высокой численности (табл.
2). Наивысшая численность СРБ (10 млн. кл/см3) зарегистрирована в пробах донных
осадков озер Соленое и Хилганта. В пробах донных осадков озера Белое и в пробах
песчаного мата озера Зун-Торей численность СРБ составила 100 тыс. кл/см3.
Микроскопическое исследование СРБ показало доминирование подвижных вибрионов.
Реже встречались одиночные палочки, отличающиеся размерами и подвижностью.
Таблица 2. Численность бактерий-деструкторов органического вещества в щелочных озерах
Численность, кл/см3
Озеро
сапрофиты
6
ЦРБ
6
СРБ
ЖРБ
10
10
7
105
Соленое
20х10
Белое
10х106
106
105
103
Хилганта
11х106
-
107
107
Зун-Торей
3х106
106
105
104
Примечание: «ЦРБ» – целлюлозоразлагающие бактерии; «СРБ» – сульфатредуцирующие
бактерии; ЖРБ – железоредуцирующие бактерии.
Впервые в содовых озерах Забайкалья проведена оценка численности
алкалофильных железоредуцирующих бактерий (ЖРБ). В исследуемых нами содовых
водоемах в высокой численности выявлены бактерии, способные восстанавливать железо
в щелочных условиях. Максимальные значения численности ЖРБ (10 млн. кл/см3)
выявлены в озере Хилганта. Минимальная численность (1000 кл/см3) зарегистрирована в
озере Белое. Микроскопическое исследование накопительных культур железоредукторов
показало преобладание подвижных палочек, нередко встречались палочки со спорой,
отдельные споры.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том что, в щелочных
условиях содовых озер Забайкалья в высокой численности присутствуют бактерии,
осуществляющие процессы деструкции органического вещества.
101
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов МО РФ РНП.2.1.1./21, РФФИ
№ 10-04-01185а.
1.
2.
3.
Солоноватые и соленые озера Забайкалья: гидрохимия, биология / отв. ред. Б.Б.
Намсараев. – Улан-Удэ: Изд-во Бурятского госуниверситета. – 2009. – 340 с.
Жилина Т.Н. Хемотрофные анаэробы микробных сообществ содовых озер / Труды
института микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН. – Выпуск XIV. М.: «Наука». 2007. С. 158-224.
Справочник биохимика: Пер. с англ./ Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. – М.:
Мир.- 1991. – 554 с.
МИКРОБНАЯ СТРАТИФИКАЦИЯ ГЛУБОКОВОДНОЙ КОЛОНКИ
ОЛИГОТРОФНОГО РИФТОГЕННОГО ОЗ. РАДОК, ВОСТ. АНТАРКТИДА
ПО ДАННЫМ СЕКВЕНИРОВАНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ОБЛАСТЕЙ ГЕНОВ 16S рРНК
Д. С. Карлов, М. С. Чувочина, И. А. Алехина, С. А. Булат
Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, Гатчина, Россия
Антарктические прибрежные озера – это уникальные водные экосистемы c
экстремальными низкотемпературными и олиготрофными условиями существования,
характеризующиеся упрощенными трофическими связями [1]. Исследование их
микробных сообществ представляет особый интерес в плане изучения путей эволюции и
механизмов адаптации, как к холоду, так и недостаточным пищевым ресурсам. Озеро
Радок представляет собой холодный олиготрофный пресный глубоководный рифтогенный
водоем, практически весь год покрытый льдом. Сумма основных ионов в верхнем
горизонте составляет 133 мг/л, в придонном слое – около 100 мг/л. Температура воды
слегка изменяется от 0.8°С на поверхности до 1°С на глубине.
Целью исследования было оценить содержание и структуру микробных сообществ в
верхнем и придонном горизонтах глубоководной колонки оз. Радок, Оазиc Эймери,
Восточная Антарктида. В данном сообщении будут приведены результаты только по
доминантным (3 и более клонов) филотипам микроорганизмов как наиболее
существенной составляющей сообществ.
Материалом исследования послужили 2 образца воды, взятые с поверхности и у дна
в самой глубокой точке озера (R1 – 1.3м и R367 – 367м). Для амплификации
бактериальных генов 16S рРНК использовали геномную ДНК и три набора вырожденных
универсальных праймеров на вариабельные области гена v3-v5, v4-v8 и полноразмерный
ген (full-gene). В целом для двух образцов R1 и R367 было создано 6 клоновых библиотек:
0R и 3R (область v3-v5), 17R и 37R (v4-v8), f1R и f3R (full-gene), соответственно. Клоны
риботипировали с использованием трех рестриктаз (AluI, HpaII и HaeIII), объединяли в
рибогруппы, а представителей рибогрупп секвенировали. Филотипы определяли как ≥98%
сходства клонов по нуклеотидной последовательности. Филогенетический и молекулярноэволюционный анализ были выполнены с использованием программы MEGA 4.
102
Из результатов отметим, что по обоим горизонтам все три клоновые библиотеки (по
разным областям генов) выявили разного рода структуру сообществ с фактически
неперекрывающимися филотипами. Наименьшее число филотипов показали библиотеки
по полноразмерному гену (с фактически невырожденными праймерами). Наилучший
результат в плане вскрытия разнообразия показали библиотеки по областям v3-v5 и v4-v8,
хотя выявленные филотипы и их таксономическая принадлежность оказались различными
(данные не приведены). Таким образом, для более полного описания структуры
микробных сообществ следует использовать как минимум две разные области генов
микробных рРНК.
По объединенным данным всех трех библиотек в верхнем горизонте было выявлено
10 доминантных филотипов, из которых 8 представляли бактерии из 4 разделов, один –
хпДНК зеленой водоросли и еще один – мтДНК оомицета (таблица). При этом 3 филотипа
показали менее 90% сходства с ближайшими известными таксонами и, тем самым, были
отнесены к неидентифицированным новым для науки видам микроорганизмов.
В придонном горизонте было выявлено 14 доминантных филотипа, из которых 11
были отнесены к бактериям (6 разделов), 2 филотипа – к хпДНК зеленых и диатомовых
водорослей и один к мтДНК оомицета (таблица). Отметим, что 6 филотипов были
отнесены к неидентифицированным новым видам.
Сравнительный анализ верхнего и нижнего горизонтов по объединенным данным
клоновых библиотек выявил в целом 20 уникальных филотипов, принадлежащих 7
бактериальным разделам и 3 разделам эукариот. Из них только 4 филотипа были
встречены в обоих горизонтах: это два подвида Candidatus Planktophila limnetica,
относящиеся к acI-АVI и acI-AIV кладам, Mycobacterium vanbaalenii (все три
Actinobacteria) и отдаленный родственник хпДНК Chlamydomonas reinhardtii (зеленые
водоросли). В верхнем и нижнем горизонтах было выявлено 6 и 10 уникальных
филотипов, соответственно (таблица), что указывает на существенную микробную
стратификацию водной колони озера Радок, причины которой (основные факторы среды)
находятся в процессе анализа. Биоразнообразие придонного образца оказалось выше по
сравнению с поверхностью, что согласуется с литературными данными.
Раcпределение доминантных филотипов по верхнему и нижнему горизонтам водной колонки
(R1 и R367) и разным клоновым библиотекам
Филотип
Таксономическое
положение
Прокариоты
Actinobacteria
96.9% Candidatus
Planktophila limnetica
(FJ428831.1)
≥96.2% Candidatus
Planktophila limnetica
(FJ428831.1)
97.4% Candidatus
Planktophila limnetica
(FJ428831.1)
R1 - 0R
R1 - 17R
v3-v5
v4-v8
R1 - f1R
Full-gene
271
R367 - 3R
R367 - 37R
v3-v5
v4-v8
23
17
11
25
103
R367 - f3R
Full-gene
Mycobacterium vanbaalenii
(NR_029293)
93.9% Ilumatobacter
fluminis (AB360343)
α-proteobacteria
≥97.4% Roseomonas
frigidaquae (EU290160)
95.2% Rhodovarius
lipocyclicus ( NR_025629)
β-proteobacteria
Curvibacter putative
(FN543107)
δ-proteobacteria
83% Desulfomicrobium
hypogeium (AF132738)
Bacteroidetes
97.2% Chitinophaga sp.
(AM988942)
96.9% Sediminibacterium
salmoneum (EF407879)
Planctomycetes
96.3% Blastopirellula sp.
(EF419414)
92.9% Singulisphaera
acidiphila (AM902526)
89.9% Schlesneria
paludicola (AM162407)
83% Phycisphaera
mikrensis (AB474364)
Candidate division OD1
(AY922093)
Эукариоты
Bacillariophyta,
диатомовые (хпДНК)
≥90.7% Skeletonema
pseudocostatum (X82155)
Viridiplantae, зелёные
водоросли (хпДНК)
84% Chlamydomonas
reinhardtii (FJ458262)
Oomycetes (мтДНК)
73% Phytophthora infestans
(U17009)
73% Saprolegnia ferax
(AY534144)
10
26
16
16
5
4
8
14
13
4*
10
10
23
10
8*
11*
6*
8*
20*
84*
6*
54*
8*
8*
1
– процент клонов в библиотеке.
* – неидентифицированный филотип
Черные клетки – общие филотипы для обоих горизонтов.
1.
Laybourn-Parry J. No Place Too Cold// Science. -2009. -V. 324. -P. 1521–1522.
104
10*
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ
В РИЗОСФЕРЕ СОИ
А. К. Кизилова1, Л. В. Титова2, И. К. Кравченко1
1
2
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия
Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного НАНУ, Киев, Украина
Основным приемом агробиотехнологии в земледелии бобовых культур является
внесение микробных препаратов на основе ризобий, которые улучшают азотное питание и
продуктивность растений. Успех инокуляции сои симбиотическими бактериями
Bradyrhizobium japonicum в значительной степени зависит от выживания
интродуцированного микроорганизма в почве и его взаимоотношений с ризосферными
микроорганизмами. Несмотря на постоянный интерес к оценке азотфиксирующей
активности почв агроценозов, состав азотфиксирующих микробных сообществ остается
недостаточно изученным, и существующие сведения единичны и основаны, главным
образом, на результатах использования традиционных методов культивирования. Цель
работы состояла в изучении состава микробных сообществ ризосферы сои в полевых
опытах, заложенных на серой лесной почве (Киевская область, Украина) с помощью
анализа рибосомального гена 16S рРНК и гена nifH, молекулярного маркера
азотфиксации.
С помощью коммерческого набора реактивов Power Soil DNA kit (MO BIO, США)
были получены препараты почвенной ДНК, которые были успешно использованы для
амплификации фрагмента гена 16S рРНК с помощью праймерной системы 341F-GC-907R
и полученная смесь ампликонов была разделена с помощью метода ДГГЭ [1]. Анализ
геномных фингерпринтов выявил доминирование бактерий, относящихся к отделу
Firmicutes. Кроме того, в составе микробных сообществ были обнаружены представители
Acidobacteria.
Для амплификации фрагментов ключевых генов азотфиксации из почвенной ДНК
были протестированы пять праймерных систем [2,3,4,5,6], используемых при изучении
состава почвенных азотфиксирующих сообществ. В ходе исследования были применены
условия, описанные в статьях, где проводилась разработка и тестирование праймеров. В
результате лишь с помощью праймерной системы nifHfor-nifHrev, предложенной Sarita et
al. [6], удалось получить продукты ожидаемого размера, соответствующие 400 п.н., как
для чистых культур диазотрофов (положительный контроль), так и для накопительных
культур и почвенной ДНК. Для разделения фрагментов генов nifH был применен метод
молекулярного клонирования.
Проведенный анализ нуклеотидных последовательностей с помощью программного
пакета BLAST установил, что большинство демонстрируют высокую степень сходства (до
100%) с последовательностями представителей отдела Firmicutes домена Bacteria. Только
один из полученных филотипов был отнесен к отделу Proteobacteria (95% сходства).
Филогенетический анализ, при котором было проведено сравнение полученных
транслированных последовательностей nifH со 160 белковыми последовательностями,
депонированными в базе данных GenBank, показал, что основная часть
последовательностей ДНК образцов почвы и накопительных культур компактно
105
располагается в кластере гена nifH вместе с облигатно и факультативно анаэробными
бактериями (Clostridium, Paenibacillus) (рисунок).
Только представители одного филотипа S2 располагались в кластере альфаProteоbacteria, и ближайшими родственниками были представители родов Leptospirillum,
Derxia, Azohydromonas. Эти азотфиксаторы идентифицированы во всех почвах, кроме
варианта с инокуляций ризобиями. Второй распространенной группой были клоны,
входящие в группу S3, наиболее близкие к Clostridium pasteurianum. Последовательности
этого филотипа проявили высокую степень сходства с последовательностями сиквенстипа 1, полученными при анализе накопительных культур. В кластер анаэробных
азотфиксаторов рода Clostridium входили также представители филотипа S5, а
представители
филотипа
S4
продемонстрировали
идентичность
(100%)
с
последовательностями, полученными при анализе накопительных культур и наиболее
близкими к Spirochaeta stenostrepta. Клоны, входящие в состав группы S1,
продемонстрировали высокий уровень сходства (100%) с последовательностями гена nifH
у Paenibacillus massiliensis, что позволяет идентифицировать этот филотип как
представителя данного вида.
Проведенные исследования показали, что значительная часть азотфиксирующего
сообщества ризосферы сои была представлена микроорганизмами, наиболее близкими к
облигатно и факультативно анаэробным микроорганизмам. Согласно филогении,
основанной на анализе гена nifH, все определенные нами последовательности относятся к
группе анаэробов, куда входят клостридии, сульфатредукторы и метаногены [7].
Доминирование анаэробов в данной ризосферной почве может быть связано со
специфическим составом почвенного органического вещества, механическим составом
почвы или особенностями микробных сообществ этих почв. Полученные нами данные
расширяют представления о биоразнообразии диазотрофов в почвах, которое
исследовалось ранее с помощью методов, основанных на культивировании. Они могут
способствовать
также
выделению
и
описанию
новых
азотфиксирующих
микроорганизмов.
Работа выполнена при финансовой поддержке Договора № 2008 с Украинским
Научно Технологическим Центром (УНТЦ).
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Muyzer G., de Wall E.C., Uitterlinden Q.G. // Appl. Environ. Microbiol.- 1993. – Vol. 59.
– Р. 695–700.
Mehta M.P., Butterfield, D.A., Baross J.A. // Appl. Environ. Microbiol.– 2003.–Vol.69, –Р.
960– 970.
Poly F., Ranjard L., Nazaret S., Gourbière F., Monrozier L.J. // Appl. Environ.
Microbiol.– 2001.– Vol.67, . – Р.2255–2262.
Rösch C., Mergel A., Bothe H. // Appl. Environ. Microbiol.– 2002.– Vol.68, –Р.3818–
3829.
Марусина А.И., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П., Кравченко И.К., Гальченко
В.Ф. // Микробиология.– 2001.–Т.70– С.86–91.
Sarita S., Priefer U. B., Prell J., Sharma P. K. // Current Science.–2008.–Vol.94– Р.109–
115.
Chien Y.-T., Zinder S. H. // J. Bacteriol.–1994.–Vol.176–Р.6590–6598.
106
Филогенетическое дерево, построенное на основе транслированных аминокислотных
последовательностей фрагментов генов nifH, полученных при анализе почвенных образцов и
накопительных культур. Последовательности, полученные в данной работе, выделены жирным
шрифтом. Масштаб соответствует 10 заменам на 100 аминокислотных остатков (эволюционным
расстояниям). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная
с помощью «bootstrap»-анализа 500 альтернативных деревьев
(значимыми признаются значения больше 50).
107
РЕАКТИВАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПАЛЕОПОЧВ
Н. А. Кряжевских1, Е. В. Демкина1, Н. А. Манучарова2
1
2
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия
Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Москва, Россия
Для общей микробиологии, микробной экологии и астромикробиологии большой
интерес представляет изучение бактериальных сообществ, законсервированных в древних
погребенных почвах и мерзлых осадках, являющихся закрытыми системами. Численность
микроорганизмов в таких природных субстратах, определяемая прямым счетом
микроскопически, не соответствует их количеству, реально выявляемому на питательных
средах, что можно объяснить пребыванием микроорганизмов в состоянии покоя и
принципиальной (не)способностью клеток к реактивации и делению. Так как популяции
покоящихся клеток гетерогенны, некоторая часть клеток из природных объектов при
высеве на питательные среды обнаруживает быструю способность ревертировать к росту,
а для клеток другой субпопуляции требуются специальные условия для восстановления
метаболической активности, клеточного роста и деления. В наших экспериментах для
образцов погребенных почв была показана высокая численность клеток, выявляемая по
количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) (до 107кл/г), тогда как для ряда образцов
мерзлых пород рост бактерий на твердой питательной среде отсутствовал.
Так как сохранение жизнеспособности популяций обеспечивается наличием
межклеточных взаимодействий, осуществляемых с помощью секретируемых растениями
и микроорганизмами регуляторных веществ, изучали действие на законсервированные
бактериальные сообщества регуляторов роста: β-индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) и
агглютинина зародышей пшеницы (АЗП), которые могут иметь видонеспецифичный и
дозозависимый характер.
Для образцов мерзлых пород наибольший активирующий эффект достигался при
концентрации ИУК 10-5 М, при которой число КОЕ/г увеличивалось в 2–3 раза, а для
образцов палеопочв и современных почв при концентрации ИУК 10-4 М. Для образца
мерзлых осадков наиболее эффективным было действие АЗП (5 мкг/мл) – прирост КОЕ/г
составил 2 порядка.
Результативность применения низкомолекулярных регуляторов для реактивации ПФ
была подтверждена методом in situ-гибридизации (FISH) с применением зондов,
специальных для доменов Bacteria и Archaea. Проведенным анализом показано, что
численность метаболически активных прокариот размороженного и увлажненного
образца мерзлых осадков без специальной обработки и активации микроорганизмов
достигала 106 кл/г, что соответствует 5% от общего количества бактерий (счет с
акридином оранжевым). В варианте с предварительной пробоподготовкой образца
(прединкубация в воде, 1.5 ч), доля метаболически активных клеток возрастала на 2
порядка, доля метаболически активных эубактерий от всех прокариот составляла около
63%. Наибольшее влияние на реактивацию прокариот оказало воздействие АЗП (5
мкг/мл), доля активных клеток достигла 77% от их общего числа, выявляемого
люминесцентным методом.
108
Таким образом, с помощью культуральных методов и метода FISH показано
положительное, значимое влияние ИУК и АЗП на реактивацию бактерий пермофроста.
Другой важной составляющей биологической активности почв является пул
свободных ферментов, которые не связанны непосредственно с метаболической
активностью клеток, а являются результатом их предшествующей жизнедеятельности.
Имеются данные о сохранении в мерзлых отложениях ферментной активности инвертаз,
протеаз, каталаз, которые определялись сразу после оттаивания образцов. [Vorobyava E.A.
et. al.,1996]
Сохранение каталитической активности свободных ферментов в почве можно
объяснить их стабилизацией в результате иммобилизации на почвенных частицах
[Звягинцев Д.Г., 1979]. В наших исследования была проверена возможность стабилизации
ферментных белков в почвах дополнительным механизмом – модификацией структуры
при действии низкомолекулярных алкилоксибензолов (АОБ), имеющих функции
микробных адаптогенов [Эль-Регистан, 2006].
В модельных экспериментах с β-амилазой (Sigma) выявили концентрационную
зависимость действия АОБ и D-валина на фермент как структурных модификаторов.
В основных экспериментах обнаружена амилолитическая активность в образцах
погребенных палеопочв, вечномерзлых отложений и современных фоновых почв.
Показано, что уровень ферментативной активности в образцах погребенных палеопочв
разного возраста (XVIII в. и I в.н.э.) и вечномерзлых отложений (600 тыс. лет)
существенно ниже (в 3–12 раз), чем в современных фоновых почвах.
Был установлен эффект изменения почвенной амилолитической активности под
действием С12-АОБ. Показано, что С12-АОБ в концентрациях 0,05–0,2 мг/мл стимулировал
активность почвенной амилазы, при дозах 0,2–0,9 мг/мл ингибировал.
Выявлен важный эффект, что стимулирующее действие С12-АОБ на
амилолитическую активность в погребенных палеопочвах, а также вечномерзлых
отложениях было существенно выше (на 150–250%), чем на ферментную активность
современных фоновых почв.
Таким образом, несмотря на то, что исследуемые в работе места обитания
микроорганизмов (погребенные почвы, вечномерзлые отложения) представляют собой
закрытые системы, они обладают высоким микробиологическим потенциалом и пулом
свободных ферментов с легко регулируемой метаболической активностью.
Обсуждается возможность регуляции почвенной ферментативной активности как
еще одной компоненты влияния на биоремидиацию почв за счет имеющегося в них
ферментативного пула.
109
ОСОБЕННОСТИ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ
ПОЧВ ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЯКУТИИ
Н. П. Кузьмина, Т. И. Иванова
Институт биологических проблем криолитозоны СО РАН, Якутск, Россия
Цель исследования. Изучение численности и структуры микробных сообществ, а
также динамики их активности в зависимости от почвенно-экологических факторов в
аласных и дерново-луговых почвах селитебных территорий Центральной Якутии.
Исследования проводили в летне-осенние месяцы 2003–2006 гг. в 10 биотопах
аласов Мюрю и Круглый Лено-Амгинского междуречья Центральной Якутии.
Микробиологический состав изучали в мерзлотных почвах аласа Мюрю: черноземе
маломощном, дерновой остепненной, дерново-луговой, болотной торфянистоперегнойной глееватой, болотной перегнойно-глеевой, таежной палевой осолоделой; и
аласа Круглый: дерновой остепненной, дерново-луговой, дерново-болотной глеевой,
таежной палевой типичной. Исследование дерново-луговых почв селитебных территорий
проводили на территории стационара ФГНУ Института прикладной экологии Севера,
расположенного в 15 км от г. Якутска: чернозем маломощный, лугово-черноземная,
дерново-луговатая глееватая, переходные почвы березового и соснового лесов,
перегнойно-торфянистая глеевая.
Образцы почв для микробиологических исследований из разрезов на аласе Мюрю и
Круглый, вели послойно через 5–10 см до глубины 40 см с учетом границ генетических
горизонтов. Образцы почв из разрезов стационара ИПЭС брали по слоям с глубин 0–15,
15–30, 30–50, 50–70, 70–100 см. Методика отбора, хранения и доставки образцов
исключала возможность их заражения посторонними микроорганизмами. Влажность
почвенных образцов весом 1 г определяли методом горячей сушки (Вадюнина, Корчагина,
1986). Температуру почв определяли в поле цифровым термопарным термометром фирмы
«Hanna instrument HI 93531» (Германия). Численность микроорганизмов определяли
методом посева на плотные питательные среды (Методы почвенной микробиологии и
биохимии, 1991).
Алас – плоские понижения в районах распространения многолетнемерзлых горных
пород, образующиеся в результате протаивания и просадки грунта. Алас Мюрю содержит
все главные типы почв, формирующихся на открытом пространстве в условиях
засушливого климата Лено – Амгинского междуречья (Саввинов, 2008). Алас Круглый
более молодой, чем алас Мюрю. Территория аласа Круглый представляет термокарстовую
котловину с площадью около 20 гектаров (Соловьев, 1959). Благодаря котловинному
характеру местности в аласах, почвенно-растительный покров имеет строго
концентрическое пространственное распределение.
На аласе Мюрю исследования были проведены в крайне увлажненные и теплые 2003
и 2006 гг. Больше всего микроорганизмов было обнаружено в 2003 г (390 млн. КОЕ/г) в
дерново-луговой почве оптимально увлажненного второго пояса аласа Мюрю.
Сравнение микробной численности почв аласов Мюрю и Круглый по степени
обогащенности микроорганизмами проводили по Д.Г. Звягинцеву (1987), учитывая
110
условный критерий. По этому критерию
различающимися в разные годы наблюдений.
аласные
почвы
оказались
заметно
Степень обогащенности микроорганизмами почв аласов Мюрю и Круглый
Центральной Якутии (по численности микроорганизмов на МПА)
Год
Алас
2003
крайне
увлажн.
Мюрю
2005
нормальн
Круглый
2006
крайне
увлажн
Мюрю
Тип почвы
Чернозем
Дерново-луг
Торфя-перегн
Дерново-глее
Дернов.остеп
Палевая
Дернов.остеп
Дерново-луг
Дерново-глее
Палевая
Чернозем
Дернов.остеп
Дерново-луг
Торф-перегн
Палевая
Численность
(КОЕ/г,10 см)
7,1 × 106
3,9 × 108
1,0 × 108
1,0 × 107
3,6 × 108
6,0 × 106
1,7 × 106
6,1 × 105
7,1 × 106
–
1,4 × 106
8,4 × 106
1,9 × 107
6,4 × 106
6,1 × 107
Степень
обогащенности
Богатая
Очень богатая
Очень богатая
Богатая
Очень богатая
Богатая
Бедная
Очень бедная
Богатая
–
Бедная
Богатая
Очень богатая
Богатая
Очень богатая
Численность
(КОЕ/г, 40 см)
2,5 × 108
1,0 × 106
5,0 × 106
3,0 × 106
1,0 × 106
4,0 × 106
1,7 × 104
9,0 × 105
2,0×104
8,6 × 105
3,5 × 105
1,3 × 107
2,9 × 106
9,6 × 106
4,7 × 105
Степень
обогащенности
Очень богатая
Бедная
Средняя
Средняя
Бедная
Средняя
Очень бедная
Очень бедная
Очень бедная
Очень бедная
Очень бедная
Очень богатая
Средняя
Богатая
Очень бедная
Из гидротермических условий на численность микроорганизмов в мерзлотных
аласных почвах наиболее сильное влияние оказала влажность почв. Так в
сильноувлаженные годы (2003 и 2006 гг.), по численности микроорганизмов
исследованные почвы аласа Мюрю были богатыми или очень богатыми. Самыми
бедными по содержанию микроорганизмов оказались почвы аласа Круглый в нормальном,
по гидротермическим условиям, 2005 г (таблица).
В наших экспериментах количество микроорганизмов и влажность находились в
прямо пропорциональной зависимости. Чем выше была влажность в дерново-луговой,
болотной и таежной почвах, тем больше микроорганизмов в них было обнаружено.
Меньшая влажность чернозема и дерновой остепненной почв обусловила и меньшее
содержание микроорганизмов в них.
Численность
микроорганизмов
изменялась
согласно
пространственноконцентрического положения поясов аласа. Так по мере удаления от высоких точек
периферической полосы к средней части аласа происходит постепенное плавное
возрастание численности микроорганизмов, а затем резкое уменьшение их количества по
мере передвижения к низким приозерным участкам аласа.
Селитебные земли («городские земли») – земли, предназначенные для строительства
жилых и общественных зданий, промышленных предприятий, дорог, улиц, площадей в
пределах городов. В шести исследованных дерново-луговых почвах селитебных
территорий в 2006 г преобладали актиномицеты. Численность микроорганизмов в почвах
селитебных территорий в 2006 г колебалось от 103 до 109 КОЕ/г и оказалась на порядок
111
больше, чем в 2005 г (103 – 108). Наиболее богатой по содержанию актиномицетов (2,8 ×
109) была переходная почва под мертвопокровным березняком 11 июня.
Сезонные изменения (лето-осень) микробоценозов исследованных почв стационара
затронули как количественный, так и качественный состав. По максимальному
содержанию микроорганизмов произошло уменьшение на 1 порядок с 2,8 × 109 (июнь –
актиномицеты) до 7,2 × 108 КОЕ/г (октябрь – гетеротрофы) и только в мерзлотной
перегнойно-торфянистой глееватой почве произошло увеличение численности
гетеротрофов на 2 порядка с 6,4 × 106 до 7,2 × 108 КОЕ/г. Изменения по качественному
составу – летом доминировали актиномицеты, а осенью – гетеротрофные бактерии
предположительно, психрофильного типа. В начале лета температура почв уменьшалась с
глубиной прямолинейно, а осенью, напротив, повышалась с глубиной почв. Кривая
изменения влажности по профилю почв имеет S-образный характер. Наблюдались 2 пика
увеличения влажности по профилям почв.
Таким образом, в мерзлотных почвах селитебных территорий в октябре тепло
сохраняется между поверхностными горизонтами и границей вечной мерзлоты (30–70 см),
что способствует не только сохранению жизнеспособности, но и увеличению численности
микроорганизмов, например, таких как гетеротрофные бактерии. Численность
большинства изученных групп микроорганизмов имеет два пика сезонной активности - в
начале и конце периода вегетации. Характерной особенностью мерзлотных почв Якутии
является высокая численность бактерий по всему профилю исследованных почв.
Статистический анализ результатов определения показателей функционального состояния
микробоценозов выявил значительные положительные корреляции между численностью
микроорганизмов и влажностью почвы (r=+1), а также отрицательную корреляцию между
численностью мицелиальных микроорганизмов (актиномицет и грибов) и температурой
почв (r = × –1).
1.
2.
3.
4.
5.
Вадюнина А.Ф., Корчагина З.А. Методы исследования агрофизических свойств почв.
- 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Агропромиздат, 1986.
Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы М.: Изд-во МГУ, 1987. 256 с.
Методы почвенной микробиологии и биохимии. // Под ред. Д. Г. Звягинцева. М.,
Изд-во МГУ, 1991. С.304.
Саввинов Д.Д. и др. Алас Мюрю: научно-популярное издание. Якутск: Изд-во ЯНЦ
СО РАН, 2008
Соловьев П.А. Криолитозона северной части Лено-Амгинского междуречья. - М.:
Изд-во АН СССР, 1959. - 144 с.
112
ОБНАРУЖЕНИЕ ПРОЦЕССА АНАММОКС
В ИММОБИЛИЗОВАННОМ АКТИВНОМ ИЛЕ ИЗ ОЧИСТНЫХ СТАНЦИЙ,
РАБОТАЮЩИХ ПО ТЕХНОЛОГИИ КОМПАНИИ «ЭКОС»
Ю. В. Литти, В. К. Некрасова, Н. В. Григорьева, И. С. Куличевская,
А. Н. Ножевникова
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия
Для обеспечения охраны окружающей среды первоочередной задачей является
проектирование и строительство новых сооружений для очистки бытовых и
промышленных стоков с использованием новейших достижений в области очистки
сточных вод. Основой биологической очистки сточных вод, которая остается наиболее
экономичным и экологичным процессом, является аэробная и/или анаэробная деградация
органических веществ микроорганизмами. Исследование микробиологических аспектов
новых методов биологической очистки является необходимым условием для дальнейшей
интенсификации процессов.
Целью настоящей работы являлось изучение основных анаэробных микробных
процессов в системе комплексной аэробно-анаэробной очистки сточных вод на очистных
станциях (КОС), спроектированных и построенных компанией «ЭКОС» (Олимпийский
проект РЖД). Особое внимание уделено удалению азота с реализацией процесса
АНАММОКС.
В основу технологии, разработанной Компанией «ЭКОС» и примененной на КОС
РЖД, построенных вдоль реки Мзымта в поселках строителей новых железной и
автомобильной дорог, положена схема очистки воды с физико-химической
предобработкой (коагулированием и флотированием) и рециклом водно-иловой массы для
удаления азота в процессах нитри-денитрификации и/или анаммокс (анаэробное
окисление аммония). Основным инженерно-технологическим приемом на КОС РЖД
является использование жесткого гибкого носителя «ерш» для прикрепления
(иммобилизации) микроорганизмов, являющихся основным действующим инструментом
в биологической очистке воды. В локальных зонах «ершей» создаются условия для
развития анаэробных микроорганизмов, включая бактерий и архей, осуществляющих
полную деградацию органических загрязнений, а также бактерий, осуществляющих
образование молекулярного азота в процессах нитри-денитрификации и анаэробного
окисления аммония нитритом (анаммокс).
В результате проведенных исследований активного ила из двух станций очистки
сточных вод, построенных по олимпийскому проекту РЖД на берегах реки Мзымта,
подтверждена высокая активность микробного ила, иммобилизованного на твердом
гибком носителе в виде ершей. На первом этапе работы в активном прикрепленном иле
показано присутствие аэробных и анаэробных микроорганизмов и обнаружено
функционирование метаногенного микробного сообщества, которое осуществляет полную
анаэробную деградацию органических соединений до метана и углекислоты. Это
свидетельствует о наличии в биопленках, развивающихся на ершовом носителе,
анаэробных микро-зон с низким окислительно-восстановительным потенциалом среды,
113
благоприятным для развития разнообразных анаэробных микроорганизмов, включая
анаммокс-бактерий.
Показано, что удаление азота в виде N2 происходит за счет двух анаэробных
процессов - денитрификации и анаэробного окисления аммония нитритом (анаммокс),
функционирование которых показано методами лабораторного культивирования. Пробы
активного ила из анаэробных ступеней очистки исследовали в течение шести-девяти
месяцев в пяти стационарных периодических реакторах, проводя регулярные измерения
потребления нитрата, нитрита и аммония и образования молекулярного азота. В реакторах
регулярно меняли среду, поддерживая необходимую концентрацию нитрита и аммония. В
течение первых четырех-пяти месяцев во всех реакторах превалировал процесс
денитрификации. При этом с самого начала параллельно шло потребление аммония, что
указывало на наличие процесса анаммокс. Однако вклад анаммокс-процесса в
образование молекулярного азота не превышал 20–30% и впоследствии в период
активного разложения биомассы микробного ила он даже уменьшился. Лишь при
исчерпании в реакторах доступных органических веществ стало наблюдаться близкое к
эквимолярному потребление нитрита и аммония, что свидетельствовало о превалировании
анаммокс-процесса.
Молекулярно-биологическим методом in situ-гибридизации с 16S pРНКспецифичными флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами (FISH) в
биомассе на ершах обнаружены бактерии, относящихся к филогенетической группе
планктомицетов, и в накопительном реакторе идентифицированы бактерии анаммокс,
принадлежащие к этой группе.
Таким образом, нами получены доказательства осуществления процесса анаммокс
при очистке бытовых сточных вод в комбинированной системе физико-химической и
биологической очистки. Осуществление процесса анаммокс обеспечивает удаление азота
при низком содержании органических веществ в очищаемой воде, то есть обеспечивает ее
глубокую очистку.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК
ИЗ КУЛЬТУР ХЕМОЛИТОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
С. В. Рогатых1, И. А. Кофиади1,2
1
Научно-исследовательский геотехнологический центр ДВО РАН,
Петропавловск-Камчатский, Россия
2
ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Москва, Россия
Хемолитотрофные микроорганизмы являются важным компонентом сообществ,
выщелачивающих металлы из сульфидных медно-никелевых руд. Одним из основных
подходов к изучению структуры микробных сообществ является анализ ДНК
микроорганизмов, входящих в их состав. Достоверность молекулярно-биологических
методов, используемых при анализе структуры сообществ хемолитотрофных
микроорганизмов, зависит от качества препарата ДНК и репрезентативности смеси
114
нуклеиновых кислот, полученных в результате очистки. Поэтому целью нашего
исследования стала апробация нескольких способов выделения ДНК и изучение влияния
различных способов воздействия на клетки, на качество и состав получаемой смеси
нуклеиновых кислот.
Анализ эффективности выбранных методик очистки ДНК проводили с
использованием смешанных культур автохтонных сообществ хемолитотрофных
микроорганизмов, выделенных из сульфидных руд месторождения Шануч (полуостров
Камчатка). В сравнении принимали участие 2 типа проб: содержащие микроорганизмы,
прикрепленные к частицам грунта и содержащие преимущественно свободные клетки. По
данным микроскопического анализа в выделенных автохтонных сообществах содержатся
представители родов эубактерий: Acidithiobacillus, Leptospirillum, Alicyclobacillus,
Sulfobacillus, и архей: Ferroplasma [1]. Для оценки эффективности методов выделения
ДНК из смешанных культур нами были отобраны несколько комбинированных
протоколов очистки ДНК, основанных на различных типах воздействия на клетки
микроорганизмов. Были проанализированы методики, основанные на механическом
(перетиран ие клеток с ча стицами SiO 2 [2]), ферментативном (обработка
протеиназой К и лизоцимом [3]) и химическом (обработка гуани дин
тиоцианатом
(GuSCN)
[4],
а
также
обработка
бромидом
цетилтриметила ммония (CTAB) [4]) воздействии на клетки. Кроме того, нами была
разработана методика, основанная на щелочном лизисе (KOH) в присутствии
низкомолекулярного полимера полиэтиленгликоля (PEG-200).
Качество препаратов ДНК определяли с помощью ПЦР в реальном времени. ПЦР
проводили
с
использованием
универсальных
праймеров
upr2d
(ACGAGCTGACGACRGCCATGCA)
и
upr3r
(TGACGGGCGGTGTGTRCAAGG),
комплементарных консервативным участкам гена 16SрРНК большинства эубактерий и
архей. Для подбора универсальных праймеров использовали базу данных GenBank и
алгоритм Blast сервера NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Эффективность ПЦР определяли
методом серийных десятикратных разведений [5], образцов чистых культур
Acidithiobacillus thiooxidans, A. ferrooxidans, Sulfobacillus sp. и Ferroplasma sp.,
предоставленных лабораторией хемолитотрофных микроорганизмов Института
микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Для выбранной пары праймеров
эффективность ПЦР во всех случаях составила > 93 %.
Проанализированные нами методы продемонстрировали значительные отличия в
качестве препарата ДНК, получаемого в ходе выделения. Это может объясняться и
разницей в эффективности очистки от ингибиторов, и различиями в эффективности
лизиса клеток микроорганизмов, относящихся к различным таксономическим группам.
Наилучший результат получен для методики, основанной на лизирующей активности
GuSCN. Эта методика (лизиc при 65°С с последующей очисткой фенолом и хлороформом)
может быть рекомендована при проведении молекулярного анализа структуры сообществ
хемолитотрофных микроорганизмов. Сходный по эффективности результат был получен
для ферментативной методики, однако в данном случае на результат количественной ПЦР
оказали влияние остатки бактериальных нуклеиновых кислот, содержащиеся в
недостаточно очищенных протеолитических ферментах, использованных при выделении
115
ДНК. Показана низкая эффективность методик, основанных на лизирующей активности
CTAB и на физическом воздействии на клетки с помощью частиц SiO2. Для методики,
основанной на лизирующей активности KOH, в присутствии PEG-200 получен средний
результат, однако ее принципиальным недостатком является низкая степень очистки
препарата ДНК от ингибиторов, в частности ионов железа, содержащихся в культурах
A.ferrooxidans. В то же время этот метод показал лучший результат для проб, содержащих
незначительное количество прикрепленных клеток. Значимых отличий между пробами,
содержащими свободные и прикрепленные клетки, обнаружено не было.
1.
2.
3.
4.
5.
Кузякина Т.И., Хайнасова Т.С., Левенец О.О. // Вестник КРАУНЦ. Науки о Земле.
2008. Т. 12. N 2. С. 76-86
Boyle J.S., Lew A.M. // Trends in Genetics. 1995. V. 11. N 1. P. 8
Liu C.Q., Plumb J., Hendry P. // Biotechnology and Bioengineering. 2006. V. 94. N 2. P.
330-336
Bruce K.D., Horns W.D., Hobman J.L., Osborn A.M., Strike P., Ritchie D.A. // Appl.
Environ. Microbiol.1992. V. 58. P. 3413-3416.
Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семенов П.А., Савилова А.М.,
Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. ПЦР «в реальном времени». М.: БИНОМ. 2009.
215 с.
МИКРООРГАНИЗМЫ НЕФТЯНЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ
С КАРБОНАТНЫМИ КОЛЛЕКТОРАМИ
Д. Ш. Соколова1, Н. М. Шестакова1, Н. К. Павлова1, Ю. В. Татаркин1, Т. Л. Бабич1,
В. С. Ивойлов1, М. Р. Хисаметдинов2, Р. Р. Ибатуллин2, А. Б. Полтараус3,
Т. Н. Назина1, С. С. Беляев1, М. В. Иванов1
1
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия
2
ТатНИПИнефть, Бугульма, Россия
3
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва, Россия
Около половины мировых запасов нефти залегает в карбонатных породах, которые
характеризуются
сложными
физико-химическими,
геологическими
и
гидродинамическими условиями, наличием высокосернистой нефти. При этом наиболее
подробно исследованы микробные сообщества нефтяных коллекторов, представленных
песчаниками, в то время как микробиология продуктивных пластов карбонатных
отложений остается малоизученной.
Целью настоящей работы является изучение распространения и геохимической
деятельности микроорганизмов в карбонатных нефтяных коллекторах, а также
определение филогенетического разнообразия подземного микробного сообщества.
В работе исследовали сообщества микроорганизмов залежи 302 Ромашкинского
нефтяного месторождения и Архангельского месторождения НГДУ «Ямашнефть» ОАО
«Татнефть» (РФ). В пробах пластовой воды была определена численность
микроорганизмов и дана количественная оценка скоростей современных процессов
сульфатредукции и метаногенеза.
116
Нефтеносные горизонты залежи 302 башкирских отложений карбона располагаются
на глубине около 500 м ниже уровня моря, имеют температуру 18–20°C. Пластовые воды
относятся к хлоркальциевому и хлормагниевому типу, имеют минерализацию от 18.2 до
28.8 г/л, рН варьирует от 6.8 до 7.9. Залежь 302 представляет собой восстановленную
экосистему (Eh –350 мВ), пластовые воды которой содержат высокие концентрации
сероводорода. Плотность нефти составляет более 0.95 г/см3, а вязкость 83–85 мПа с.
Вследствие высоко восстановленной обстановки микробное сообщество залежи 302
было практически лишено аэробных микроорганизмов. Здесь преобладали анаэробные
бактерии с бродильным типом метаболизма (10–104 кл/мл) и сульфатредуцирующие
бактерии (10–106 кл/мл). Численность метаногенов, растущих на водород – углекислотной
смеси достигала 104 кл/мл, на ацетате − 102 кл/мл. Денитрифицирующие бактерии,
растущие в среде с фенолом и нитратом, выявлены в пробе из скважины 36275; растущие
в среде с бензоатом и нитратом – в пробах из скважин 26426, 26480, 4634, 4647 и 7808. В
пластовых жидкостях из Архангельского месторождения, характеризующихся более
высокой соленостью пластовой воды, также преобладали анаэробные микроорганизмы, но
их численность была ниже, чем в залежи 302.
Высокое содержание сульфатов и сульфатвосстанавливающих бактерий в пластовой
воде и другие экологические условия (pH, Eh, умеренная соленость вод) обусловили
доминирование процесса сульфатредукции (от 2 до 26 мкг S2- л-1 сут-1) в этой экосистеме
(таблица). Образование метана из бикарбоната не было зарегистрировано, скорость
метаногенеза из ацетата варьировала от 0.56 до 39.5 мкг CH4 л-1 сут-1.
Характеристика пластовой воды и скорости процессов сульфатредукции и метаногенеза
в пластовых водах карбонатных отложений Татарстана
№ скважины
26426
26480
35851
36275
4634
7808
Общая
минерализация, г/л
SO42-, г/л
Ацетат,
мг/л
Скорость
Скорость
сульфатметаногенеза из
редукции,
ацетата,
-1
-1
мкг CH4 л сут мкг S2- л-1 сут-1
Залежь 302 Ромашкинского нефтяного месторождения
18.263
3.920
450
39.49
25.80
18.246
4.144
80
0.56
19.60
28.876
1.168
150
1.21
2.28
17.004
1.184
200
1.55
2.90
Архангельское месторождение
73.850
1.504
190
1.23
2.61
122.136
1.488
180
1.29
4.54
Результаты радиоизотопных исследований не соответствовали результатам
микробиологических исследований – метаногены были выявлены на обеих
использованных средах – с H2+CO2 и с ацетатом. Численность метаногенов, растущих в
среде с H2+CO2, была выше таковой на среде с ацетатом. На Архангельском
месторождении метаногенез из меченого бикарбоната также не был зарегистрирован.
Скорости сульфатредукции и метаногенеза из ацетата варьировали в узких пределах от 2.6
до 4.6 мкг S2- л-1 сут-1 и от 1.23 до 1.29 мкг CH4 л-1 сут-1, соответственно.
117
Проведены молекулярно-биологические исследования генов 16S рРНК, полученных
на основе ДНК пластовой воды из добывающей скважины 26480 залежи 302. Среди 67
архейных клонов доминировали филотипы класса Euryarchaeota, близкие к роду
Methanosphaera (56 клонов) порядка Methanobacteriales и роду Methanotorris порядка
Methanococcales. Основным субстратом метаногенеза для метаносфер является метанол
плюс H2+CO2 Отдельно на приведенных субстратах, равно как на ацетате, формиате,
этаноле, изопропаноле они не растут. Выявлены также гены 16S рРНК некультивируемых
эвриархеот. Необходимы дальнейшие исследования биоразнообразия метаногенов и
субстратов-предшественников метана в накопительных культурах и в пластовой воде.
Впервые при исследовании карбонатных нефтяных коллекторов в библиотеке
бактериальных клонов генов 16S рРНК (110 клонов) выявлены гены 16S рРНК
сульфатредуцирующей бактерии Desulfoglaeba alkanexedens, способной расти на
индивидуальных углеводородах и нефти. Филотипы D. alkanexedens (50 клонов), а также
сульфатредуцирующих бактерий родов Desulfomicrobium, Desulfovibrio и Desulfosarcina
(10 клонов) доминировали в составе библиотеки бактериальных клонов (60 из 110
исследованных клонов).
Несмотря на низкую численность аэробных бактерий в пластовой воде, в библиотеке
клонов выявлены гены 16S рРНК представителей аэробных бактерий родов Pseudomonas
(21 клон, 96–99% сходства), Acinetobacter (1 клон, 97% сходства), Brachymonas (1 клон,
97% сходства) и некультивируемых Flavobacteria (6 клонов, 92% сходства). Обнаружены
филотипы, близкие генам 16S рРНК бактерий рода Thauera (8 клонов, 99% сходства),
представители которого способны расти аэробно на широком круге субстратов и
анаэробно на ароматических углеводородах в присутствии нитратов. Однако известно, что
нитраты отсутствуют в пластовых водах. Выявлен ген 16S рРНК аэробной бактерии,
участвующей в цикле серы – Thiofaba tepidiphila (99% сходства). Филотипы анаэробных
органотрофов были мало представлены в библиотеке клонов (7 клонов) и были близки
генам 16S рРНК бактерий порядка Bacteroidetes.
Обнаружена корреляция результатов физико-химических, микробиологических и
молекулярно-биологических исследований, свидетельствующих о возможности
одноступенчатого преобразования нефти сульфатредуцирующими бактериями и
доминировании процесса сульфатредукции в карбонатном нефтяном пласте.
Работа поддержана Программой № 23 Президиума РАН «Научные основы
эффективного природопользования, развития минерально-сырьевых ресурсов, освоения
новых источников природного и техногенного сырья».
118
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИНДЕНТИФИКАЦИЯ
ФИЛЬТРУЮЩИХСЯ ФОРМ БАКТЕРИЙ И АРХЕЙ
В ВОДЕ АЦИДНОГО ОЗЕРА ДУБРОВСКОЕ
А. В. Федотова, С. Э. Белова
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия
Вопрос достаточности природных источников пресной воды, а также качества
последней является одной из наиболее актуальных проблем, встающих перед
человечеством в XXI веке. Важнейшими природными центрами формирования
ультрапресных вод в условиях равнинных ландшафтов, характерных для бореальной зоны
России и других стран Северного полушария, являются болотные экосистемы.
Формирующиеся в
болотах гумусированные ультрапресные воды питают
многочисленные озера и реки северных регионов. Существенная часть микробных клеток
в этих водах представлена ультрамикро-формами, проникающими через «бактериальные»
фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, которые ныне используются для очистки воды от
клеток микроорганизмов.
Целью настоящей работы явилась молекулярная идентификация фильтрующихся
форм бактерий и архей в воде ацидного (рН 4.4) дистрофного озера Дубровское
(Дарвинский заповедник Вологодской области, 58°10’с.ш., 37°33’ в.д.), одного из серии
малых озер, расположенных на заболоченных водосборах Верхней Волги.
Сбор фракции ультра-мелких клеток осуществляли путем пропускания 100 мл воды
через нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм (Millipore) и последующего
осаждения фильтрующихся форм микроорганизмов на фильтре с диаметром пор 0.10 мкм
(Millipore). Выделение тотальной ДНК из собранных на фильтрах клеток производили с
использованием набора «FastDNA SPIN kit for soil» (Biol 101, США). Полученную
тотальную ДНК использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР).
ПЦР-амплификацию фрагментов (~1490 пар нуклеотидов) генов 16S рРНК бактерий
проводили с использованием универсальных бактериальных праймеров 9f и 1492r [1].
ПЦР-амплификацию фрагментов (~900 пар нуклеотидов) генов 16S рРНК архей
проводили с использованием праймеров 109f и 915r [2]. Амплификацию проводили на
амплификаторе PE GeneAmp PCR System 9700 («Perkin-Elmer Applied Biosystems», США).
Полученные ампликоны были клонированы с помощью набора «pGem-T Easy Vector
SystemII» (Promega). Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили с использованием
набора «Wizard® Plus Minipreps DNA Purification System» (Promega). Определение
нуклеотидных последовательностей клонов проводили на секвенаторе ABI 377A («PerkinElmer Applied Biosystems», США). Редактирование полученных нуклеотидных
последовательностей проводили с помощью программы SeqMan (Laser Gene 7.0; DNA Star
Package). Сравнение полученных последовательностей с таковыми в базе данных GenBank
осуществляли с использованием программы Blast2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/blast2/).
В результате работы была сформирована библиотека клонированных нуклеотидных
последовательностей генов 16S рРНК бактерий, состоящая из 24 клонов. Из них 22
последовательности принадлежали представителям Betaproteobacteria и 2 –
представителям Gammaproteobacteria. Клонированные фрагменты генов 16S рРНК бета119
протеобактерий обнаруживали наибольшее сходство (94–99%) с таковыми у известных
представителей родов Herbaspirillum, Janthinobacterium, Mitsuaria и Collimonas, а также у
таксономически
неохарактеризованной
ультрамикро-бактерии
‘Minibacterium
massiliensis’, выделенной из ультрачистой фильтрованной воды, использующейся в
госпиталях для гемодиализа [3]. Часть выявленных в воде озера Дубровское
последовательностей генов 16S рРНК обнаружили высокое сходство (96–98%) с таковыми
у почвенной ультрамикро-бактерии Oxalicibacterium solurbis [4]. Обе клонированные
последовательности генов 16S рРНК гамма-протеобактерий были высоко сходны (99%) с
последовательностями гена 16S pPHK представителей рода Pseudomonas, выделенных из
талых льдов Арктики и речной воды [5].
Полученная нами библиотека клонированных нуклеотидных последовательностей
генов 16S рРНК архей включала 32 последовательности представителей Euryarchaeota. Из
них, только девять обнаруживали высокое сходство (97–99%) с генами 16S рРНК
таксономически описанных организмов (5 клонов – с таковыми у представителей порядка
Methanobacteriales и 4 клона – с представителями Methanosarcinales). Остальные 23
клонированные последовательности были значительно удалены (71–74% сходства) от
таковых у всех ранее охарактеризованных архей. Однако они обнаруживали более
высокое сходство (85–99%) с клонами, полученными ранее из различных экосистем, таких
как минеротрофные и олиготрофное болота, арктические меромиктические озера и реки,
мерзлотные породы, речные осадки, рисовые чеки, хранилища питьевой воды и грунтовые
воды. Примечательно, что нуклеотидные последовательности четырех клонов этой
группы имели высокое сходство (98–99%) с таковыми у некультивируемых ультрамикроархей, выявленных ранее в сфагновом торфе [6].
Полученные данные свидетельствуют о более высоком разнообразии ультрамикроформ среди представителей домена Archaea и об их широком распространении в
различных природных экосистемах.
Работа выполнена при финансовой поддержке проекта «Молекулярная
идентификация и исследование метаболического потенциала ультрамикро-форм и
неизученных филогенетических групп бактерий ультрапресных вод» Программы
Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Weisburg, W.G., Barns, S.M., Pelletier, D.A., Lane, D.J. (1991). J. Bacteriol. V. 173. P.
697–703.
Regine Großkopf, Peter H. Janssen, and Werner Liesack (1998). Appl. Envir. Microbiol.,
64: 960–969.
Audic, S.; Robert, C.; Campagna, B.; Parinello, H.; Claverie, J.M.; Raoult, D.; Drancourt,
M. (2007). Plos Genet. 3(8): 138–e138 .
Iizuka, T.; Yamanaka, S.; Nishiyama, T.; Hiraishi, A. (1998). J. Gen. Appl. Microbiol.
44(1):75–84.
Vardhan Reddy, P.V.; Shiva Nageswara Rao, S.S.; Pratibha, M.S.; Sailaja, B.; Kavya, B.;
Manorama, R.R.; Singh, S.M.; Radha Srinivas, T.N.; Shivaji, S. (2009). Res.
Microbiol. 160(8):538–546
Panikov, N.S. (2005). Adv. Appl Microbiol 57: 243–93.
120
ИЗУЧЕНИЕ ЖЕЛЕЗООКИСЛЯЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ
АВТОХТОННОЙ АССОЦИАЦИИ
ХЕМОЛИТОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Т. С. Хайнасова
Научно-исследовательский геотехнологический центр ДВО РАН, Россия
Одной из задач в области бактериальных технологий извлечения ценных
компонентов из сульфидных руд является поиск микроорганизмов, обладающих высокой
биологической активностью в отношении окисления ионов Fe2+. Образуемое в результате
данного процесса Fe3+ является основным окисляющим агентом в механизме деструкции
сульфидных минералов. В свою очередь способность к активному воспроизводству ионов
Fe3+ определяет успешность процесса разложения сульфидной руды. В связи с этим был
проведен эксперимент по определению железоокисляющей активности автохтонной
ассоциации микроорганизмов. Основная цель исследования состояла в выяснении
железоокисляющей способности, времени полного окисления ионов Fe2+ и влияния
начальной концентрации Fe2+ на скорость его окисления (Vокисл.).
В эксперименте использовали автохтонную ассоциацию хемолитотрофных
микроорганизмов, выделенную из окисленной руды месторождения Шануч (ОБВ-Fe).
Данную ассоциацию, культивируемую в мезофильных условиях в реакторе с
периодическим механическим перемешиванием, предварительно отделив в процессе
центрифугирования и отмыв от субстрата, трижды пересевали в питательную среду
Сильвермана и Люндгрена (9К) с целью выделения железоокисляющей компоненты
микробной ассоциации (Каравайко и др., 1989). В эксперимент брали трехсуточную
культуру из третьего пассажа. В качестве субстрата для определения окислительной
активности использовали среду Сильвермана и Люндгрена (9К) с тремя различными
концентрациями Fe2+ (~4.5 г/л, ~9 г/л, ~18 г/л).
Исследование железоокисляющей активности проводили в периодическом режиме в
колбах Эрленмейера (на 250 мл) на качалках в трех повторах. Рабочий объем составлял
165 мл раствора. Соотношение культуральной жидкости к питательной среде – 1 : 10. Во
избежание образования гидратных форм железа при подщелачивании среды производили
подкисление с помощью 10N H2SO4, доводя уровень рН до ~1,75–1,80. Температурный
режим составлял 30±2°С. В ходе процесса биологического окисления поддерживали
перманентное качание при ~140 об/мин.
В процессе контролировали следующие параметры раствора: уровень рН – с
помощью портативного рН-метра Hanna HI 98103, Eh – с помощью портативного Ehметра HI 98120, численность микроорганизмов в 1 мл раствора – прямым подсчетом при
микроскопировании, концентрацию Fe2+/Fe3+ – комплексометрическим методом с
Трилоном Б (Резник и др., 1970).
В ходе процесса окисления ионов закисного железа при установленных
экспериментальных условиях выяснили, что время полного окисления при начальной
концентрации Fe2+ в среде ~4,5 г/л составило 30 часов. При этом средняя скорость
окисления ионов закисного железа была 0,138±0,007 г/л·ч. При концентрации Fe2+ ~9 г/л –
39 часов. Средняя скорость окисления составила 0,202±0,017 г/л·ч. При концентрации Fe2+
121
~18 г/л время полного окисления – 57–58 часов со средней скоростью 0.272±0.012 г/л·ч.
Изменение концентрации Fe2+ в растворе представлено на рисунке 1.
В ходе окислительных процессов Vокисл. постепенно нарастала, а к концу процесса
подала, что связано с естественными фазами развития микроорганизмов и уменьшением
концентрации Fe2+ – единственного источника энергии в растворе для них. При этом
максимальное значение Vокисл. зависело от начальной концентрации Fe2+. При
концентрации Fe2+ ~4,5 г/л максимальное значение Vокисл. составило 0,226±0,015 г/л·ч, при
~9 г/л – 0,316±0,057 г/л·ч, при ~18 г/л·ч – 0.446±0.086 г/л·ч.
Таким образом, с увеличением начальной концентрации Fe2+ скорость возможного
его окисления возрастает. Одновременно с этим происходит увеличение времени,
пошедшего на окисление возрастающей концентрации. Выяснение времени возможного
окисления и определение скоростей окисления на этапах развития культуры показало, что
используемая культура после пересева из реакторных условий обладает высокой
железоокисляющей активностью.
1.
2.
Каравайко Г.И., Росси Дж., Агате А., Грудев С., Авакян З.А. (1989)
Биогеотехнология металлов. Практическое руководство. М.: Центр
международных проектов ГКНТ. 375 с.
Резников А.А., Муляковская Е.П., Соколов И.Ю. (1970) Методы анализа природных
вод. М.: «Недра». 488 с.
122
СТРУКТУРА МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ СНЕЖНОГО ПОКРОВА
ЛЕДНИКА МОНБЛАН (ФРАНЦУЗСКИЕ АЛЬПЫ),
СОДЕРЖАЩЕГО СЛОИ ПЫЛИ ПУСТЫНИ САХАРА,
И ЕГО БАКТЕРИАЛЬНАЯ КОЛОНИЗАЦИЯ
М. С. Чувочина1,2, И. А. Алехина1, 2, Ф. Норманн3, Ж-Р. Пети2, С. А. Булат1, 2
1
Петербургский Институт Ядерной Физики им. Б.П. Константинова РАН,
Гатчина, Россия
2
Лаборатория гляциологии и геофизики, CNRS, Гренобль, Франция
3
Отдел экологии микроорганизмов, Университет Лион-1, Лион, Франция
Считается, что в условиях доступности воды и присутствия минеральной пыли на
поверхности ледника можно ожидать развитие микроорганизмов. Периодический перенос
почвенной пыли из пустыни Сахара в Альпы может способствовать формированию
микробиоты снежного покрова ледников за счет дополнительного приноса как
питательных веществ, так и микробных клеток.
Целью данной работы было, используя методы молекулярно-филогенетического
анализа, провести сравнительное изучение структуры микробных сообществ,
сформировавшихся в снежном покрове ледника Монблан (4250 м), содержащего
почвенную пыль пустыни Сахара, осажденную в июне 2006 г., июне и мае 2008 г., и мае
2009 г., а также «чистого» снега, содержащего пыль локального происхождения (2009).
Задачей исследования было оценить вклад членов данных сообществ в формирование
«снежного» микробиома в условиях отрицательных температур (среднегодовая
температура на леднике составляет -11°С). В сравнение были также взяты образцы почвы
Сахары и пыль события мая 2008 г., собранная как в Гренобле (~160 км до Монблана), так
и позднее в снежном покрове ледника.
Исследование микробного разнообразия проводили путем амплификации в ПЦР
двух областей бактериальных генов 16S рРНК: v3-v5 вариабельной области (I-тип) и
полноразмерной последовательности (II-тип). Для образца снега, содержащего пыль
локального происхождения, дополнительно выделяли суммарную РНК и проводили ОТПЦР с теми же праймерами на область v3-v5. Полученные ампликоны клонировали,
клоны риботипировали (три рестриктазы) и представителей рибогрупп секвенировали.
Филотипы определяли как ≥98% сходства клонов по нуклеотидной последовательности.
Всего для 5 образцов снега с пылью и 2-х образцов почвы и пыли пустыни (далее не
рассматриваются) было создано 8 клоновых библиотек I-го типа (одна на основе рРНК) и
4 библиотеки II-го типа (для образцов снежного покрова с пылью Сахары от июня 2006г.,
мая 2008 и мая 2009 гг., и с пылью локального происхождения). Анализ библиотек I-го
типа показал, что структура микробных сообществ снежного покрова с пылью Сахары в
течение 3-х летнего периода наблюдения значительно варьирует и не обнаруживает
единого набора филотипов. Тем не менее, чем ближе события переноса пыли во времени,
тем большее сходство обнаруживается в структуре микробных сообществ. Так, неполное
сходство как по филотипам, так и по основным разделам (Actinobacteria и
Alphaproteobacteria) наблюдали в случае образцов с пылью Сахары в пределах года
(события мая, июня 2008 г. и мая 2009 г.) (по двум библиотекам из трех; таблица).
123
Напротив, крайне отличной от всех оказалась структура микробного сообщества снежного
покрова с пылью Сахары от июня 2006 г., где доминировали бактерии, родственные
Deinococcus–Thermus (43% от общего числа клонов).
Анализ библиотек II-типа показал то же самое – структура микробных сообществ
снежного покрова с пылью Сахары в результате 3-х событий переноса пыли в течение 3-х
летнего периода наблюдения варьирует и не обнаруживает единого набора филотипов.
Общие филотипы были обнаружены только между сообществами мая 2008 и мая 2009 гг.
(таблица).
Примечательно, что в структуре сообществ, анализируемых по I-у и II-у типу
библиотек, общие филотипы были найдены только в случае двух образцов (таблица).
Кроме того, в обоих типах библиотек присутствовали 10 неидентифицируемых филотипов
(<90% сходства с известными таксонами), представляющих, возможно, новые виды
прокариот. Также следует отметить обнаружение 16 филотипов, имеющих отношение к
микробиому человека, и мтДНК печеночника Pleurozia purpurea в образце с пылью
локального происхождения.
Из микробных сообществ снежного покрова с пылью Сахары и пылью локального
происхождения к холодолюбивым филотипам (имеющим потенциал развития в снежном
покрове и определяемым согласно сходству ≥98% с изолятами/клонами из холодных
местообитаний) были отнесены 9 уникальных филотипов из I-го типа библиотек и 5 также
уникальных – из II-го типа библиотек. Первые девять принадлежали разделам
Actinobacteria (Crossiella (96,6% сходства), Modestobacter (95,5%) и Pseudoclavibacter
helvolus (99%)), Proteobacteria (Devosia limi (98,7%), Massilia brevitalea (98,7%),
Sphingomonas dokdonensis и S.echinoides (2 филотипа – 98%)) и Cyanobacteria (Stigonema
(96%) и Anabaena (93%)). Другие пять обнаруживали сходство с представителями
Firmicutes (Clostridium bowmanii (98,9%), Tumebacillus permanentifrigoris (99%)) и
Cyanobacteria (Anabaena (91%), Chamaesiphon (97%) и Phormidium (97%)).
В плане холодолюбивых филотипов особо отметим проведенное сравнение рДНК и
рРНК библиотек на примере образца снежного покрова с пылью локального
происхождения. Несмотря на то, что в обоих библиотеках доминировал один общий
филотип (хлоропластная ДНК папоротника (таблица)), в рРНК библиотеке доминировал
также филотип, родственный (96%) цианобактерии Stigonema ocellatum, необнаруженный
в рДНК библиотеке. Это может свидетельствовать в пользу не только метаболической
активности, но и размножения данной бактерии в образце снега с пылью Сахары. Таким
образом, в качестве наиболее вероятных первичных колонизаторов снежного покрова
следует рассматривать фотоавтотрофных цианобактерий.
Результаты исследования вносят вклад в понимание формирования и
функционирования микробиоты снежного покрова высокогорных ледников, содержащих
пыль из локального окружения, либо из более отдаленных регионов (например, Сахары).
В дальнейшем интерес представляет изучение структуры микробных сообществ и
активности in situ отдельных холодолюбивых филотипов вдоль средового градиента, в
данном случае с глубиной снежного покрова.
124
Общие филотипы, обнаруженные в микробных сообществах
снежного покрова ледника Монблан с пылью Сахары и пылью локального происхождения,
по данным двух типов клоновых библиотек
% сходства с
Библиотека клонов I-го типа
Библиотека клонов II-го типа
известными
Образец снега с пылью Сахары (кол-во филотипов)
Образец снега с пылью Сахары
бактериями (NCBI)
(кол-во филотипов)
Июнь
2006
Май
2008
Июнь
2008
Май
2009
“Чистый” снег
Июнь
2006
(11)
(19)
(13)
(18)
рДНК (8)
(11)
рРНК (14)
Май 2008
(22)
Май
2009
“Чист
ый”
(9)
снег
(13)
Deinococcus-Thermus
89% Deinococcus
MB5-1
5f-3
radiophilus (NR_026402)
(14)*
(11)
94% Deinococcus
radiomollis (EF635405)
MB519 (3)
5f-16
(5)
93% Hymenobacter soli
MB5r-
5f-13
(AB251884)
2 (2)
(2)
84% Flexibacter flexilis
MB5-
5f-6 (7)
subsp. Pelliculosus
18 (3)
Bacteroidetes
(AB078054)
Alphaproteobacteria
92% Gluconacetobacter
MB5-4
sacchari (AF127412)
(5)
5f-1 (5)
≥96.4% Sphingomonas
2SD-4
MB-SD2-
kaistensis (AY769084)
(2)
41 (2)
98% Rubellimicrobium
MB-SD2-
MS5
mesophilum (EF547368)
17 (1)
s-8
(1)
Firmicutes
96% Bacillus niabensis
(AY998119)
2SD-29
(1)
f2SD-4
(1)
97% Bacillus
f2SD-b14
MS5sf-
benzoevorans (Y14693)
(5)
11 (2)
Pinus merkusii
f2SD-a23
MS5f-
(FJ899579)
(5)
31 (23)
Actinobacteria
99% Blastococcus
2SD-21
MS5
saxobsidens (AJ316574)
(6)
s-17
(1)
Хлоропластная ДНК
Thelypteris navarrensis
MS7-2 (4)
MS7r-38 (1)
(DQ629491)
* в скобках приведено количество клонов данного филотипа
125
СЕКЦИЯ III
ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ
МИКРОБНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ
БИОПРЕПАРАТЫ НА ОСНОВЕ МИКРОМИЦЕТОВ–СИМБИОНТОВ
ДЛЯ АКТИВИЗАЦИИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
И ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ
Г. Г. Багаутдинова
Башкирский государственный университет, Уфа, Россия
Симбиотические микроорганизмы играют важную роль в жизни растений,
обеспечивая их минеральное питание, защиту от патогенов и фитопатогенов, а также
адаптацию к различным стрессам. Наибольшее экологическое значение для растений
имеют эндосимбионты – микоризные грибы, обеспечивающие ассимиляцию питательных
(в основном фосфор- и азотсодержащих) веществ из почвы. В настоящее время
многообразные формы взаимоотношений грибов с растениями обусловили их
использование в биотехнологии с целью микоризации растений для повышения их
продуктивности. Среди наиболее перспективных биоагентов для создания
ростостимулирующих
биопрепаратов
значительными
являются
везикулярноарбускулярные микоризные (ВАМ) грибы. Положительное действие ВАМ грибов
проявляется в стимуляции роста сельскохозяйственных растений за счет увеличения
поглощения лимитированных в почве питательных веществ. Эндомикоризные ВАМ
грибы являются также высокоэффективными биоагентами - супрессорами почвенных
фитопатогенов.
Из корней 2–3 летней культуры растений облепихи, выращенной в разных зонах
Республики Башкортостан были выделены микромицеты-симбионты: Scopulariopsis
acremonium (Delacr.) Vuill, Gliomastix murorum (Corda) S. Hughes, Moeszia pernambucensis
Batista, Shome et Maiel.
Чистые культуры грибов-симбионтов, выделенные из корней облепихи,
культивировали в стерильной питательной среде следующего состава: глюкоза – 8 г,
K2HPO4 – 0,6 г, KH2PO4 – 1,8 г, MgSO4 – 0,2 г, K2SO4 – 0,1 г. MnSO4 и FeSO4 – следы,
аспарагин – 20 мг на 1л водопроводной воды. Культивирование грибов производили в
течение 30 сут при 28°С.
Активные вещества гриба извлекались стерильным активированным углем, который
добавляли в колбы после окончания культивирования из расчета 0,5%. Через 3 часа
содержимое колб – уголь и гриб отфильтровывали на стерильный фильтр в вакууме, далее
заливали 70%-ным этиловым спиртом, впоследствии бутилировали и в дальнейшем
использовали как основу биопрепарата для обработки семян сельскохозяйственных
культур.
Семена яровой пшеницы (Triticum aestivum L., сорт Жница) и сахарной свеклы
(Betula vulgaris L., сорт Милан) перед посевом обрабатывали 0,0001% раствором
126
биопрепарата. Через 30 суток после появления всходов растений пшеницы и свеклы
провели опрыскивание растений. С целью оценки влияния биопрепарата на
продуктивность растений в динамике определяли численность некоторых
физиологических групп микроорганизмов в ризосфере и эдафосфере под посевами
растений методом посева почвенной суспензии на твердые питательные среды и
интенсивность микотрофности корней.
Обработка семян биопрепаратом оказала неоднозначное влияние на численность
микроорганизмов
различных
физиологических
групп.
Численность
целлюлозоразрушающих
микроорганизмов
–
основных
гидролитиков
высокомолекулярных соединений – повышалась при обработке семян биопрепаратом как
в фоновой, так и нефтезагрязненной почве. Это свидетельствует об интенсификации
процессов разложения клетчатки и, в конечном счете, улучшении углеводного питания
растений под влиянием метаболитов эндомикоризного гриба, входящих в состав
биопрепарата. Численность бацилл – основных минерализаторов органических
соединений азота – увеличивалась в фоновой почве при внесении биопрепарата.
Таким образом, обработка семян и 30-ти суточных посевов пшеницы биопрепаратом
на основе метаболитов эндомикоризного гриба активизировала биохимические и
микробиологические процессы в черноземе.
Эндомикоризные грибы широко распространены в корнях большинства растений, в
том числе основных сельскохозяйственных культур к которым относятся сахарная свекла
и пшеница. Они не только стимулируют корневое питание растений, но и улучшают
фотосинтез, повышают устойчивость к стрессам, а также корневым гнилям и другим
болезням. Микоризация растений эффективными культурами эндофитов может повышать
урожай яровых зерновых и бобовых. Для создания успешного симбиоза растения с
эндофитами необходимо проводить подбор эндомикоризного гриба для данного вида и
сорта растений при определенных почвенно-климатических условиях.
Обработка растений сахарной свеклы и яровой пшеницы биопрепаратом
способствовала микоризообразованию. Частота встречаемости микоризной инфекции и
интенсивность микоризации коры корня в фоновом варианте опыта (без обработки
препаратом) составляет небольшой процент. При обработке биопрепаратом растений
сахарной свеклы эти показатели увеличились более чем в два раза, а растений пшеницы –
в 2,5 раза, что способствовало улучшению ростовых процессов растений и повышению, в
конечном счете, продуктивности сельскохозяйственных культур. Так, при обработке
семян и растений сахарной свеклы увеличивалась урожайность корнеплодов (на 11% в
сравнении с контрольным уровнем и возрастала сахаристость корнеплодов (на 1,1%), а
при обработке семян и растений яровой пшеницы – урожай составил 28,7 ц/га (в
контрольном варианте 24,1 ц/га).
127
ОПТИМИЗАЦИЯ ПРИМЕНЕНИЯ «АССОЦИАТИВНЫХ» БАКТЕРИАЛЬНЫХ
УДОБРЕНИЙ В СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПРАКТИКЕ
В УСЛОВИЯХ ДЕФИЦИТНОГО УВЛАЖНЕНИЯ
Е. А. Блинков
ФГОУ ВПО РГАУ–МСХА им. К.А. Тимирязева, Москва, Россия
Рост
и
развитие
большинства
современных
(интенсивных)
сортов
сельскохозяйственных растений и формирование ими высоких урожаев невозможны без
применения азотных удобрений как источника азота для белковых соединений [3]. Азот
минеральных удобрений по сравнению с «биологическим» более доступен растениям.
Однако он практически не обладает последействием, так как быстро вымывается и
улетучивается из почвы, а избыток минерального азота ведет к накоплению в растениях
нитратов. Затраты на производство и применение равного количества «биологического»
азота в 20–30 раз меньше «технического», а тонна белка, полученного за счет
азотфиксации, в 9–10 раз дешевле белка, накопленного за счет минерального азота [1].
Поэтому использование экологически чистых и дешевых источников «биологического»
азота в большинстве случаев оправдано не только экологически, но и экономически.
Показано, что путем интродукции в ризосферу азотфиксирующих и
ростстимулирующих бактерий можно достоверно улучшить рост и питание
сельскохозяйственных культур. Установлено, что эффективность функционирования
искусственных растительно-бактериальных ассоциаций в значительной степени зависит
от специфичной реакции различных видов и сортов растений на инокуляцию, от свойств
интродуцируемых штаммов, а также от почвенно-климатических условий выращивания
растений. Так увеличение урожая при инокуляции эффективными штаммами диазотрофов
(Azospirillum lipoferum, Agrobacterium radiobacter, Arthrobacter mysorens, Flavobacterium
sp.) в различных почвенно-климатических условиях составляет 10–30 % для злаковых
культур и 20–40 % для овощных. Инокуляция сельскохозяйственных растений активными
штаммами азотфиксирующих бактерий не только повышает их урожай, но и улучшает
качество растительной продукции. Нерегулярная воспроизводимость результатов
инокуляции, не позволяющая достаточно надежно прогнозировать реакцию растений,
является в настоящее время главной причиной ограниченного применения
«ассоциативных» бактериальных удобрений в сельскохозяйственной практике [3].
Цель наших исследований – изучение влияния дефицита влажности на
ассоциативный симбиоз диазотрофных бактерий и огурца. Объекты исследования:
Klebsiella planticola штамм ТСХА-91 (биопрепарат «Биоплант-К»), Arthrobacter mysorens
штамм 7 (биопрепарат «Мизорин») и растения Cucumis sativus L. гибрид «Рассвет».
Здесь приводим и обсуждаем результаты вегетационного опыта с имитированием
дефицита почвенной влаги. Семена огурца замачивали в воде и проращивали при 25°С в
течение 2 суток. Проросшие семена высевали в вегетационные сосуды объемом 7 литров,
128
наполненные специальным торфяным питательным субстратом для выращивания
овощных культур в закрытом грунте. Повторность пятикратная. Влажность субстрата на
протяжении опыта поддерживалась на уровне около 85–90 % ПВ (район оптимального
увлажнения для растений огурца) и около 45–50 % ПВ (дефицит для огурца).
После появления первого настоящего листа растения огурца инокулировали
суспензией суточной культуры бактерий, разбавленной водопроводной водой 1 : 100. Под
каждое растение вносили 50 мл суспензии. Титр суточной культуры составлял порядка 109
КОЕ/мл, раствора суточной культуры – 107 КОЕ/мл. Контроль не инокулировали.
Для оценки эффективности инокуляции и продуктивности растений измеряли
следующие показатели: концентрацию хлорофилла a и b в листьях (на спектрофотометре с
использованием чистого ацетона в качестве растворителя); интенсивность транспирации
листьев (весовым методом по Иванову); количество листьев, завязей; площадь листьев
(методом интерполяции фигур); высоту растений; продуктивность растений [2].
Установлен факт снижения отрицательного воздействия стрессовых факторов на
растения огурца при инокуляции исследуемых штаммов диазотрофных бактерий.
Физиологические показатели растений огурца в зависимости от внешних условий
повышались на 30–50 %, биометрические – на 10–20 %. Наибольший эффект применения
«ассоциативных» бактериальных удобрений проявился на ранних стадиях роста растений.
Площадь листьев огурца при оптимуме влаги
Площадь листьев, см 2
140
153,2
Площадь листьев, см2
156,3
160
Площадь листьев огурца при дефиците влаги
123,9
120
100
80
60
140
135
123,5
130
125
118,7
120
40
115
20
110
0
140,9
145
105
контроль
K. planticola
A. mysorens
контроль
Вариант опыта
K. planticola
A. mysorens
Вариант опыта
Рис. 1. Влияние инокуляции на площадь листьев
(см2) растений огурца при оптимуме влаги
Рис. 2. Влияние инокуляции на площадь листьев
(см2) растений огурца при дефиците влаги
Площадь листьев является одним из показателей, по которому можно судить о
потенциальной продуктивности растений. Инокуляция растений штаммами Klebsiella
planticola ТСХА-91 и Arthrobacter mysorens 7 повлияла на площадь листьев огурца. Как
при оптимальном увлажнении, так и при дефиците почвенной влаги отмечалось
положительное влияние биопрепаратов: площадь листьев проинокулированных растений
по сравнению с контролем (без обработки биопрепаратами) больше на 4–26 %.
Отмечалась также более высокая урожайность растений огурца в вариантах с
инокуляцией по сравнению с контролем. При оптимальных условиях увлажнения (рис. 3)
больший урожай дали огурцы, проинокулированные штаммом K. рlanticola ТСХА-91. При
дефиците увлажнения (рис. 4) инокуляция огурца штаммами диазотрофных бактерий
привела к примерно одинаковому повышению урожайности растений.
129
Урожайность огурца при оптимуме влаги
Урожайность, г/сосуд
456,7
528,4
Урожайность, г/сосуд
593,6
600
Урожайность огурца при дефиците влаги
500
400
300
200
360,1
370
363,7
360
350
340
330,1
330
320
100
310
0
контроль
K. planticola
контроль
A. mysorens
K. planticola
A. mysorens
Вариант опыта
Вариант опыта
Рис. 3 Влияние инокуляции на урожайность
огурца при оптимуме влаги (85–90 % ПВ)
Рис. 4 Влияние инокуляции на урожайность
огурца при дефиците влаги (45–50 % ПВ)
Снижение стрессового эффекта на растения с помощью внесенных штаммов
бактерий можно объяснить тем, что интродуцируемые микроорганизмы синтезируют и
поставляют растениям различные ростовые вещества и другие органические соединения,
которые повышают их иммунитет. Ассоциативные бактерии быстро колонизируют
ризоплану растений, находя на корнях определенную экологическую микронишу.
Поэтому они менее подвержены воздействию неблагоприятных факторов окружающей
среды и представляют наибольший интерес для разработки новых биопрепаратов.
Результаты проведенных нами исследований позволяют выявить возможность
применения препаратов на основе штаммов Klebsiella planticola ТСХА-91 и Arthrobacter
mysorens при выращивании рассады огурца. Планируя применение «ассоциативных»
бактериальных удобрений, необходимо учитывать характер предполагаемого действия
стрессовых факторов. На наш взгляд применение биопрепарата «Мизорин» на основе
Arthrobacter mysorens 7 наиболее эффективно для снятия водного стресса.
1.
2.
3.
Спайнк Г., Кондороши А., Хукас П. Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий
взаимодействующих с растениями. СПб., 2002. – 558 с.
Третьяков Н.Н. Практикум по физиологии растений: Учеб. пособие для вузов. М.:
ТСХА, 2003. – 156 с.
Умаров М.М., Кураков А.В., Степанов А.Л. Микробиологическая трансформация
азота в почве. М.: ГЕОС, 2007. – 138 с.
130
АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТА
НА ОСНОВЕ КСИЛОТРОФНОГО БАЗИДИОМИЦЕТА
TRAMETES PUBESCENS (SHUMACH.: FR.) PILAT
Н. А. Горяева1, В. А. Чхенкели1,2, А. С. Дядькина1
1
2
Иркутская государственная сельскохозяйственная академия, Иркутск, Россия
Иркутский филиал Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего
Востока СО Россельхозакадемии, Иркутск, Россия
В
биологических
системах
все
большее
место
отводится
цепным
свободнорадикальным реакциям, которые принимают участие в разнообразных и
важнейших процессах жизнедеятельности клетки, являясь общими универсальными, как и
биосинтез белка окислительное фосфорилирование и др. для разных классов живых
организмов. Эти процессы в организме контролируются различными регуляторными
системами с целью поддержания сбалансированного взаимодействия реакции образования
продуктов окисления а также механизмов контроля ведущих к их торможению при
избыточной реакции антиоксидации. Усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ)
установлено при многих патологических процессах, в том числе и при воспалении.
В настоящее время все большее внимание исследователи уделяют изучению
биологически активных веществ высших базидиальных грибов – ксилотрофов,
механизмам их действия на организм человека и животных. В Иркутском филиале ГНУ
ИЭВСиДВ Россельхозакадемии разработан препарат Леван-2, получаемый с
использованием методов биотехнологии, на основе дереворазрушающего гриба Trametes
pubescens (Shumach.: Fr.) Pilat.
Цель работы состояла в проведении сравнительных исследований влияния препарата
Леван-2 и пробиотического препарата Интестевит (на основе лиофилизированных
штаммов бифидобактерий Bifidobacterium globosum, энтерококков Enterococcus faecium и
спрообразующих бактерий Bacillus subtilis), применяемых для лечения желудочнокишечных болезней животных, на процессы перекисного окисления липидов при
экспериментальном колибактериозе.
Эксперименты проводили на половозрелых белых нелинейных крысах массой
180,5±10,6 г, содержавшихся в условиях вивария на стандартной диете (ГОСТ Р 50258-92)
с соблюдением правил лабораторной практики при проведении доклинических
исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 1000.4-96), а также правил и Международных
рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых
при экспериментальных исследованиях (1997).
Моделирование колибактериоза у крыс осуществляли путем введения 1 мл
суспензии биомассы (на физ. растворе) патогенного штамма Escherihia coli ТИ,
выделенного из патологического материала в ФГУ «Иркутская межобластная
ветеринарная лаборатория», внутрикожно (в дозе 1 млрд. микробных тел).
Было сформировано 6 групп по 8 животных: 1 группа – контроль; 2 группа контроль (с заражением); 3 группа – 3 дня вводили препарат Леван-2 в дозе 2,5 мл на 1 кг
живой массы, проводили заражение и пропаивали Леваном-2 еще 5 дней 1 раз в сутки; 4
группа – зараженные животные, пропаивали 8 дней препаратом Леван – 2 дня; 5 группа –
131
3 дня вводили per os Интестевит в дозе 5 мг на 1 кг живой массы, заражали и пропаивали
препаратом еще 5 дней; 6 группа – зараженных животных пропаивали препаратом
Интестевит в течение 8 дней.
Для оценки действия препаратов проводили гематологический анализ крови по 18
параметрам на автоматическом гематологическом анализаторе Mek-64109 («Nihoncodon»,
Япония).
Эффективность препаратов как ингибиторов свободнорадикальных реакций
оценивали по изменению как первичных – диеновых коньюгатов, так и промежуточных
продуктов ПОЛ (малонового диальдегида) в сыворотке крови крыс.
Через сутки после последнего введения изучаемых препаратов производили убой
животных, забор крови и определяли концентрацию продуктов ПОЛ. Для определения
интенсивности процессов перекисного окисления липидов в сыворотке крови определяли:
содержание малонового диальдегида (мМ/л) (И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили, 1977),
диеновых конъюгатов (ед.опт.пл./мг липидов) (И.К. Шилина с соавт., 1978)
спектрофотометрическим методом на спектрофотометре СФ-46 («Ломо», Россия).
Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице.
Влияние препаратов Леван-2 и Интестевита
на образование первичных и промежуточных продуктов перекисного окисления липидов
Содержание
продуктов
ПОЛ в
сыворотке
крови
Диеновые
коньюгаты,
D232/мг
липидов
Малоновый
диальдегид,
мкМ/л
Группы животных
3
4
*опыт
**опыт
1
контроль
2
контроль
(заражение
)
0,122±
0,010
0,408±
0,015
0,235±
0,012
1,39±
0,015
2,69±
0,39
1,55±
0,010
5
***опыт
6
****опыт
0,305±
0,024
0,362±
0,017
0,385±
0,013
2,22±
0,041
2,03±
0,018
2,17±
0,016
Примечание: *опыт – животным вводили 3 дня препарат Леван-2, заражали и вводили
препарат еще 5 дней; **опыт – зараженных животных пропаивали препаратом Леван-2 в течение 8
дней; *** животным вводили 3 дня препарат Интестевит, заражали и вводили препарат еще 5
дней; 4**** опыт – зараженных животных пропаивали препаратом Интестевит в течение 8 дней.
Установлено, что при ведении препаратов Леван-2 и Интестевит за 3 дня до
экспериментального заражения животных уровень диеновых коньюгатов снижается на
42,4 и 11,3 %, соответственно, малонового диальдегида – на 25, 3 и 5,6 %. При введении
препаратов per os сразу после заражения в течение 8 дней уровень диеновых коньгатов
снижался на 25,2 и 3,2%, малонового диальдегида – на 24,5 и 19,3 %.
Таким образом, показано, что препарат на основе ксилотрофного гриба T. pubescens
обладает антиоксидантными свойствами, что приводит к значительному снижению
образования как первичных (ДК), так и промежуточных продуктов (МДА) перекисного
132
окисления липидов при его использовании
экспериментального колибактериоза.
для
профилактики
и
лечения
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОБНО–РАСТИТЕЛЬНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
КАК ОДНОГО ИЗ НАПРАВЛЕНИЙ СОВРЕМЕННОЙ ЭКОБИОТЕХНОЛОГИИ
А. С. Григориади, Б. Ф. Багаутдинова
Башкирский государственный университет, Уфа, Россия
Загрязнение окружающей среды нефтью и нефтепродуктами, в том числе почвы,
является актуальной проблемой современности и остро встает вопрос сохранности
сельскохозяйственных угодий и восстановления почвенного плодородия. Для восстановления
нарушенных экосистем в настоящее время разрабатываются различные методы
рекультивации почв. Особую роль среди них занимает фиторемедиация. На сегодняшний
день выделяют несколько направлений фиторемедиационных мероприятий, в зависимости
от механизма, направленного на удаление поллютанта: фитоэкстракция – поглощение,
транслокация и аккумуляция загрязнителя в растении. Для рекультивации окружающей
среды этим методом применяют растения-гипераккумуляторы; фитоста билизация –
перевод веществ из растворимой зоны в нерастворимую в корневой зоне растений;
фитодегра дация – «внутреннее» разрушение углеводородов растением при участии
растительных ферментов; фитоиспар ение – экстракция поллютанта из грунта и
выделение его в газообразной форме; ризодеграда ция – разложение поллютантов
микроорганизмами в прикорневой зоне растений. В процессе фиторемедиации
ризодеградации является преимущественным при элиминации органических поллютантов
из загрязненной почвы (Joner et al., 2002; Турковская, Муратова, 2005). Принцип этого
механизма состоит в том, что разложение загрязняющих углеводородов производится не
непосредственном самим растением, а микроорганизмами, обитающими в
непосредственной близости к его корням, т.е. в ризосфере. Растения влияют на
численность, разнообразие и активность микроорганизмов за счет биологически активных
корневых выделений (Jones et al. 2004; Kirk et al. 2005). Микроорганизмы ризосферы более
многочисленны, чем микроорганизмы почвы, лишенной растительности. Из-за более
благоприятных условий обитания в ризосфере часто активнее развиваются и
микроорганизмы, обладающие ферментами, необходимыми для деструкции поллютантов.
Целью данной работы было изучение растений-фиторемедиантов на состояние
нефтезагрязненной почвы по микробиологическим показателям.
Исследования проводились на образцах темно-серой лесной почвы (гумус 7,8; рНводн.
6,3; Nобщ. 4520 мг/кг), искусственно загрязненной нефтью и дизельным топливом в
концентрациях 1, 3 и 6% масс. В качестве объекта исследования выступали декоративные
и дикорастущие растения: бархатцы (Tagetes erecta L.) и дягиль лекарственный
(Archangelica officinalis L.). В качестве контроля использовали растения, произрастающие
на незагрязненной фоновой почве. Биологическая активность загрязненной почвы
оценивалась по изменению численности таких физиологических групп микроорганизмов:
гетеротрофов,
целлюлозолитиков,
азотфиксаторов,
микромицетов,
133
углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ). Учет численности ризосферных
микроорганизмов проводили через 14, 30 и 60 сут с момента загрязнения по
общепринятой методике посева почвенной суспензии на соответствующие агаризованные
питательные среды (Методика., 1991). Статистическую обработку проводили с помощью
пакета компьютерных программ Statistica V 6,0.
Одним из главных показателем, по которым определяется степень эффективности
проведения рекультивационных работ, является содержание остаточных нефтепродуктов
под посевами растений. Выращивание фиторемедиантов на почвах, загрязненных нефтью
и
нефтепродуктами,
способствовало
интенсификации процессов
деградации
углеводородов в почве. Под посевом дягиля происходила деградация около 40%
углеводородов при начальной концентрации загрязнителя в почве 1–3% и 20% – при 6%
спустя 60 сут с начала эксперимента. Снижение остаточных углеводородов происходило
примерно одинаково как под посевами дягиля, так и под посевами бархатцев.
Важной характеристикой почвенной микробиоты является общая численность
гетеротрофных микроорганизмов и УОМ. При нефтяном загрязнении почвы в первые 14
суток в ризосфере растений численность гетеротрофных микроорганизмов снижалась.
Спустя 30 суток этот показатель возрастал в несколько раз (2–5) в ризосфере всех видов
растений. Однако, высокие (6%) концентрации нефти ингибировали этот процесс в
ризосфере дягиля. При загрязнении дизельным топливом в ризосфере бархатцев в течение
60 суток наблюдалось постоянное увеличение численности гетеротрофов при
концентрациях поллютанта 3–6%. Однако к концу эксперимента в пробах с минимальным
загрязнением (1%) показатель снижался и приближался к фоновым значениям, что может
быть обусловлено снижением токсичности почвы в результате разложения компонентов
дизельного топлива.
Анализ результатов исследований в лабораторных условиях показал, что в
присутствии фитомелиорантов в нефтезагрязненной почве происходило постепенное
увеличение численности УОМ в течение всего периода исследования. Было показано,
численность УОМ в ризосфере дягиля увеличивалась в 30–35 раз (в условиях 3% и 6%ного уровня нефтяного загрязнения соответственно) по сравнению с численностью УОМ в
ризосфере растений, произрастающих на чистой почве. Через 30 суток эта величина
составляла 74, 141, 170 × 103 КОЕ/г почвы для 1, 3 и 6% загрязнения соответственно, что в
4 раза превышало показатели, полученные при анализе растений, отобранных спустя 14
сут с момента загрязнения. При этом численность УОМ в ризосфере растений превышала
значение данного показателя в эдафосфере (зоне, находящейся вне влияния корней
растений) в 2 раза, что может служить доказательством интенсификации растениями
протекания микробиологических процессов в прикорневой зоне и непосредственное
доказательство протекания процессов ризодеградации нефтяных углеводородов. В целом,
на протяжении всего периода исследований, численность УОМ под растениями дягиля
была выше, чем под бархатцами.
Также нашими исследованиями было показано, что с течением времени возрастала
доля целлюлозолитиков в ризосфере дягиля и бархатцев при всех концентрациях
поллютантов, хотя первоначально наблюдалось ингибирование развития данной группы
микроорганизмов. Аналогичная закономерность выявлена и для микромицетов. Однако
134
важно отметить, что рост численности микроскопических грибов был значительно
активнее, т.к. среди них выявлены активные деструкторы нефтяных углеводородов. К
примеру, при 6%-ном нефтяном загрязнении в ризосфере дягиля данный показатель в
промежуток времени с 14 до 30 суток вырос в 13 раз.
Особую роль в круговороте азота в почве играют азотфиксирующие бактерии –
микроорганизмы, превращающие азотсодержащие соединения в доступные для растений
формы и обеспечивающие плодородие почв. Результаты исследований показали, что
загрязнение почвы дизельным топливом ингибировало развитие этих микроорганизмов.
Однако в ходе эксперимента наблюдалась положительная динамика численности
азотфиксирующих бактерий при всех концентрация поллютанта.
В заключение следует отметить, что растения проявили устойчивость к таким
концентрациям поллютанта, при которых целесообразно проводить фиторемедиацию (до
5-6% масс.). Загрязнение почвы нефтяными углеводородами приводило к увеличению
численности микроорганизмов, способных к окислению нефтяных углеводородов в
ризосфере растений (гетеротрофных, УОМ и микроскопических грибов). Таким образом,
в работе наглядно показано, что растительно-микробное взаимодействие способствовало
стимуляции деградации углеводородов нефти.
ИССЛЕДОВАНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ GLUCONOBACTER
ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ГЛИЦЕРИНОВОМ БИОТОПЛИВНОМ ЭЛЕМЕНТЕ
А. Е. Китова1, Л. Г. Томашевская1, С. Ю. Поздина2 , А. А. Баринова2,
А. Н. Решетилов1
1
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино, Россия
2
Тульский государственный университет, Тула, Россия
Gluconobacter считают важным кандидатом на роль биокатализатора в микробном
биотопливном элементе (МБТЭ) в связи с обилием дегидрогеназ в периплазме клеток, что
облегчает передачу электронов из реакций окислительно-восстановительного
метаболизма клеток в электрохимическую цепь непосредственно или с участием
медиаторов – дополнительных акцепторов электронов [1].
В последнее десятилетие глицерин все больше привлекает внимание как обильный
и недорогой побочный продукт промышленного производства биодизеля [2]. Начаты
работы по созданию глицериновых биотопливных элементов (БТЭ) на основе ферментов
[3] и микроорганизмов [4].
Эффективным методом исследования окислительной способности клеток G.
oxydans по отношению к глицерину является использование биосенсора на основе
кислородного электрода.
Цель работы заключалась в сравнительной оценке операционной стабильности и
воспроизводимости биосенсора на основе различных штаммов Gluconobacter и
эффективности работы данных штаммов в БТЭ при окислении глицерина в присутствии
2,6-дихлорофенолиндофенола (ДХФИФ).
135
Штаммы были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ИБФМ
РАН, Пущино, Россия)
Эксперимент осуществляли по следующей схеме. В измерительную кювету
биосенсора на основе кислородного электрода и исследуемого штамма вносили глицерин
(в концентрации 0.5 мМ) в течение 6–7 часов измерений. Время отклика составляло 200 с,
время отмывки буферным раствором – 8–12 мин. В качестве базового раствора
использовали натрий-фосфатный буфер, рН 6, 30 мМ.
Как видно из рис. 1, наибольшей активностью по отношению к глицерину обладал
штамм G. oxydans subsp. industrius VKM B-1280. При этом снижение активности
происходило на 50% в течение 6 ч измерений. Штаммы G. oxydans subsp. melanogenes
VKM B-1227, и G. cerinus VKM B-1283 имели более низкую активность по отношению к
глицерину, но при этом обладали большей стабильностью, падение величины ответа
сенсора составляло 13–25%.
0.8
0.18
0.7
G.oxydans 1280
G.oxydans 1227
G.cerinus 1283
0.14
Отклик сенсора, нА/с
Отклик сенсора, нА/с
0.16
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.02
0.00
0.6
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
№ измерения
Рис. 1. Операционная стабильность штаммов
G.oxydans по отношению к глицерину
0.0
0
1
2
3
4
5
6
Глицерин, мМ
Рис. 2. Калибровочная зависимость для
детекции глицерина для штамма
G. oxydans 1227
Для штамма G. oxydans 1227, характеризующегося наибольшей стабильностью,
была построена калибровочная зависимость (рис. 2). Диапазон детекции составил 0.25–5
мМ. При построении калибровочной зависимости после измерения каждой концентрации
проводили измерение контрольной концентрации глицерина (0.5 мМ). Калибровочная
зависимость построена с учетом снижения величины контрольного отклика сенсора.
Таким
образом,
полученная
калибровочная
зависимость
обладает
удовлетворительными параметрами для детекции изменения концентрации глицерина в
БТЭ.
Параметры БТЭ с различными штаммами Gluconobacter оценивали с помощью
потенциостата IPCMicro (Кронас, Россия), совместимого с ПК. При физиологических
условиях (28°C, аэробно) инкубировали суспензию клеток в буфере (10 мг сырого
веса/мл) in vitro в течение 14 мин с глицерином (5 мМ) и еще 6 мин с ДХФИФ (0.3 мМ)
для адаптации клеток. Смесь разводили в 4 раза буфером, добавляли глицерин (5 мМ) и
переносили в анодную камеру (0.8 мл) биотопливной ячейки, катодная камера которой
содержала раствор окислителя катода - гексацианоферрата(III) калия (30 мМ) в буфере
(0.8 мл) и исследовали вольт-амперные характеристики полученного макета МБТЭ. ЭДС в
БТЭ данного типа достигает 300 мВ [5], поэтому сканировали циклично потенциал (E)
136
анода относительно катода со скоростью 10 мВ/сек в интервале от –300 мВ до 0 мВ.
Данный режим имитирует условия разрядки БТЭ с нагрузкой переменной величины в
интервале от холостого хода до короткого замыкания. Результаты исследования
вольтамперных зависимостей для биотопливных ячеек с различными штаммами
представлены на рисунке 3. Как видно на рисунке, форма кривых идентична, но токи
пиков кривых и стабильные токи разрядки различаются у разных штаммов. Штамм 1280
развивает токи вдвое большие, чем 1227 и 1283.
Данные условия измерений дают завышенные величины тока по сравнению с
разрядкой биотопливной ячейки с реальными нагрузками, но предпочтительные для
экспресс-оценки. В качестве интегральной характеристики МБТЭ сравнили величины
условной мощности P = UI, где I – ток, регистрируемый при напряжении U = –E. Для
оценки использовали часть кривой в области положительных токов в интервале
сканирования от -300 до 0 мВ (Рис. 4). Максимальную мощность (4.04 мкВт), развитую
наиболее активным штаммом 1280, приняли за 100%.
0.02
4
P, мкВт
I, мА
0.01
0.00
1280
1227
1283
-0.01
-0.02
-300
-200
-100
1280
1227
1283
3
2
10 мВ/с
1
0
-300
0
E, мВ
-200
-100
0
E, мВ
Рис. 3. Вольтамперные характеристики
разрядки БТЭ с различными штаммами
Gluconobacter
Рис. 4. Изменение мощности при разрядке
БТЭ в режиме имитации переменной
нагрузки
Таким образом, можно сделать вывод, что штамм 1280 наиболее эффективен для
использования в качестве биокатализатора окисления глицерина в МБТЭ. Установление
стабильных токов, индивидуальных для каждого из штаммов, по-видимому, отражает
адекватность макета БТЭ для выявления свойств биокатализатора, когда лимитирующим
фактором биоэлектрохимической реакции является только скорость восстановления
ДХФИФ в процессе окисления глицерина бактериальными клетками.
Авторы благодарят за частичную финансовую поддержку ФЦП «Научные и
научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 – 2013 годы (ГК НК-№
97П(1) П551).
1.
2.
3.
4.
Ikeda T., Kano K. //Biochimica et Biophysica Acta. 2003. V.1647. P. 121-126.
Appanna V. // Keynote lecture at the Session 3. BIOFUELS of the Int. Conf. MEC-2007,
Moscow, Russia, October, 1-3, 2007.
Arechederra R., Treu B., Minteer Sh. // J. Power Sources. 2007. V. 173(1). P. 156-161.
Китова А.Е., Томашевская Л.Г., Решетилов А.Н. // Сб. тез. Второго м/н конгресса
«ЕвразияБио-2010» Москва, 13 – 15 апреля 2010, с. 92.
137
5.
Tomashevskaia L.G, Alferov S.A., Tomashevskii A.A., Reshetilov A.N. // Proc. Int. Conf.
MEC-2007, Moscow, Russia, October, 1-3, 2007, 55-59.
ТРАНСФОРМАЦИЯ ПЕСТИЦИДОВ ПОЧВЕННОЙ МИКРОФЛОРОЙ
А. В. Колупаев, А. А. Широких, И. Г. Широких
Лаборатория биомониторинга Коми НЦ УрО РАН и ВятГГУ, Киров, Россия
Важным компонентом биогеоценозов, который с успехом можно использовать для
биоиндикации загрязнения почв, является микробная система почвы и, в частности,
почвенные микроскопические грибы (Терехова, 2007). Целью нашей работы являлось
изучение реакции Trichoderma viridе на различные концентрации симазина в жидких
средах. Объектом исследования служили природные изолят T.viridе дерново-подзолитых
почв (гумус 1,5–2,3%, рНKCl 4,1–5,9) Кильмезкого захоронения пестицидов.
Для постановки модельных экспериментов использовали изолят с максимальной
скоростью роста (Kr=1,6±1,15 мм/ч) T. viride S11. Наблюдали за накоплением грибной
биомассы и изменениями в морфобиологической структуре T. viride S11 при росте в
жидкой питательной среде Чапека с добавлением 0,1; 0,2, 0,4, 1 и 2 мкг/мл симазина, что
соответствует 0,5; 1; 2, 5, 10 ПДК для почвы. Биомассу определяли на седьмые сутки
инкубации гравиметрически после фильтрования через бумажный фильтр и высушивания
до воздушно-сухого состояния. Остаточную концентрацию симазина в аликвоте
культуральной жидкости каждого из вариантов опыта определяли методом хроматомассcпектрометрии (Shimadzu GCMS-QP2010 Plus EI, Япония). В результате было
установлено, что в вариантах с различным содержанием симазина снижение в накоплении
грибом биомассы (3,4–4,3 г/л) по сравнению с контролем (4,5 г/л) находится в пределах
статистической ошибки (таблица). Степень разложения пестицида составила 100; 60,7;
70,0; 82,9 и 86,3% соответственно в вариантах 0,5; 1; 2, 5, 10 ПДК. Погрешность
измерения не превышала 2,0%. Методом прямого счета определяли плотность мицелия и
спор в единице объёма жидкости. Для каждого варианта готовили по 3 препарата для
микроскопии. На каждом просматривали не менее 30 полей зрения.
Метод микроскопии позволил выявить характерную морфобиологическую реакцию
гриба на возрастание в среде концентрации симазина, заключающуюся в формировании
мицелиальных конгломератов различной плотности. С увеличением степени коагрегации
мицелия доля не ассоциированного мицелия соответственно снижалась, а скорость
биотрансформации симазина T. viride, наоборот, возрастала от 0,59 до 10,27×10-3 мкг/час.
Это говорит о существенной роли процессов агрегации гиф в увеличении устойчивости
популяции микромицета к загрязнителю, а также косвенно свидетельствует о повышении
экзогидролазной активности T. viride в результате формирования мицелиальных
конгломератов.
138
Биомасса и показатели биоморфологической структуры T.viride S11
в зависимости от концентрации симазина в среде
Вариант
Биомасса, г/л
Контроль
0,5 ПДК
1 ПДК
2 ПДК
5 ПДК
10 ПДК
4,5±0,55
3,4±0,72
3,4±0,85
4,2±0,83
4,3±0,93
3,8±0,83
Средняя длина
не ассоциированного
мицелия, мм/мл
58.6±29.0
52.3±25.9
66.9±33.9
35.5±20.1
46.8±18.6
24.8±17.6
Концентрация
спор,
×103 шт/мл
3252±1061
5685±1417
2321±569
12405±2801
1759±562
1174±313
Удельная
продукция спор,
шт/мм
55,1
108,7
34,7
351,4
37,6
47,3
Из представленных в таблице данных видно, что существенная перестройка в
биоморфологической структуре T. viride, заключающаяся в четырёхкратном увеличении
концентрации спор при одновременном снижении длины мицелия в 1,6 раза, выявлена в
варианте 2 ПДК. Это повлекло за собой существенное возрастание удельной продукции
спор, что можно рассматривать как попытку гриба сохранить популяционную плотность в
условиях резко неблагоприятных условий среды. При дальнейшем увеличении исходной
концентрации симазина в среде (вариант 5 ПДК) удельная продукция спор резко
снижается, а затем (при 10 ПДК) происходит и существенное по сравнению с контролем
снижение в плотности неассоциированного мицелия (в 2,4 раза) и концентрации спор (в
2,8 раза), что может свидетельствовать об истощении адаптационного потенциала
популяции.
В результате исследования можно сделать следующие выводы:
1.
В модельном опыте показана способность изолята T. viride S11 к разложению
симазина. При этом скорость разложения данного вещества прямо пропорциональна
степени коагрегированности мицелия. Варианты с различным содержанием симазина
существенно не различались по накоплению биомассы микромицета, что свидетельствует
об устойчивости штамма T. viride S11 к данному ксенобиотику.
2.
В зависимости от исходной концентрации пестицида наблюдаются изменения в
биоморфологической структуре T.viride. При этом в варианте с максимальной исходной
концентрацией симазина плотность неассоциированного мицелия и концентрация спор
более чем в 2 раза меньше, по сравнению с контрольным вариантом. Возможным
объяснением тому является усиленное формирование мицелиальных агрегатов, как способ
адаптации гриба к присутствию ксенобиотика.
3.
Полученные данные дают основание считать, что штамм T. viride S11 обладает
биодиагностическим потенциалом в отношении выявления пестицидного загрязнения.
139
ДВУХСТАДИЙНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ БИОВЫЩЕЛАЧИВАНИЯ НИКЕЛЯ
ИЗ СУЛЬФИДНОЙ РУДЫ
О. О. Левенец
Научно-исследовательский геотехнологический центр ДВО РАН,
Петропавловск-Камчатский, Россия
Для изучения процесса биовыщелачивания никеля создана модель двухстадийной
технологии. На первой стадии происходит химическое окисление сульфидной медноникелевой руды раствором Fe3+, полученным при помощи железоокисляющих бактерий.
На второй стадии руда, выщелоченная раствором Fe3+, подвергается биологическому
доокислению хемолитотрофными бактериями. Цель работы заключалась в исследовании
процесса первой стадии и определении влияния присутствия бактерий в рабочем растворе
на степень извлечения никеля, исследовании процесса биоокисления химически
выщелоченной руды, а также в определении влияния способа химического
выщелачивания на дальнейшее биоокисление руды.
Материалы и методы исследования
Сульфидная медно-никелевая руда. В работе использована сульфидная кобальтмедно-никелевая руда, полученная из месторождения Шануч (Западная Камчатка).
Содержание рудных минералов – 60–65%, из которых 85–90% – пирротин, 5–6% –
пентландит, 2–5% – халькопирит, 0,2–0,5% – виоларит. Содержание металлов: Ni – 6,73%,
Cu – 0,83%, Со – 0,16%. Степень измельчения ~44 мкм.
Культуры микроорганизмов. В процессе наработки раствора биогенного Fe3+ в
качестве инокулята была использована микробная культура ОК-Fe – мезофильная
ассоциация хемолитотрофных микроорганизмов, выделенная из окисленной сульфидной
медно-никелелвой руды месторождения Шануч, выращенная в питательной среде
Сильвермана-Люндгрена 9К (Каравайко и др., 1989) с 11 г/л Fe2+. В процессе
биологического доокисления остатка после первой стадии была использована микробная
культура ОК-БО - мезофильная ассоциация хемолитотрофных микроорганизмов,
выделенная из окисленной сульфидной медно-никелелвой руды месторождения Шануч,
выращенная в питательной среде Сильвермана-Люндгрена 9К без железа в присутствии
руды (3% твердого).
Наработка Fe3+. Наработку Fe3+ для первой стадии проводили в стеклянных
емкостях при принудительном аэрировании и температуре 28±1°С. Пульпа состояла из
микробной культуры и свежей питательной среды Сильвермана-Люндгрена 9К с 11 г/л
Fe2+ в соотношении 1:10.
Очищение раствора Fe3+ от бактериальных клеток осуществляли путем
центрифугирования его при 5,5 тыс. об/мин в течение 15 мин. Во избежание появления
микрофлоры в очищенном растворе в него вносили бактерицидную смесь (2% тимол +
этанол в соотношении 1:1) из расчета 2 мл смеси на 100 мл раствора.
140
Окисление сульфидного концентрата раствором биогенного Fe3+ (первая
стадия). Химическое окисление руды раствором биогенного Fe3+ проводили в трех
повторах в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на качалке (≈120 об/мин) при
температуре 28±1°С, объеме пульпы 150 мл, плотности пульпы т:ж = 1:10. При
восстановлении Fe2+ в растворе производили смену рабочего раствора. Пульпу не
подкисляли.
Биологическое доокисление остатка сульфидного концентрата после
окисления раствором биогенного Fe3+ (вторая стадия). Биологическое доокисление
остатка концентрата проводили в колбах на качалке (≈120 об/мин) при температуре 26–
28°С, плотности пульпы т:ж = 1:10. Жидкая фаза пульпы состояла из инокулята и
питательной среды 9К без железа в соотношении 1:4. Пульпу не подкисляли.
Аналитические методы. Количество бактериальных клеток в растворе
определяли методом прямого подсчета при микроскопировании. рН и Eh среды измеряли
с помощью рН-метра Hanna HI-98103 и Eh-метра Hanna HI-98120 соответственно.
Концентрацию Fe3+/Fe2+ в жидкой фазе определяли комплексометрическим методом с
трилоном Б (Резников и др., 1970). Концентрацию никеля, меди, кобальта в жидкой и
твердой фазе определяли на атомно-абсорбционном спектрофотометре 6200 Shimadzu.
Результаты и обсуждение
В ходе первой стадии выщелачивания произвели 4 смены раствора Fe3+. При
использовании рабочего раствора с бактериями количество бактериальных клеток
увеличивалось с каждой сменой раствора. В первой смене наблюдали минимальное
количество клеток и максимальную скорость восстановления Fe3+ до Fe2+. В последующих
сменах происходит рост микробной биомассы, которая начинает вновь окислять железо в
растворе, регенерируя основной окисляющий агент (Fe3+) и способствуя более полному
извлечению никеля. Становится невозможным добиться полного или почти полного
восстановления Fe3+ до Fe2+, продолжительность смен раствора увеличивается.
При использовании обоих растворов Fe3+ (с бактериями и без) основной выход
никеля происходит в I смену, после чего значительно снижается (рис. 1). Однако в
присутствии бактерий в рабочем растворе он стабильно в 2,2–2,4 раза выше, чем при
использовании очищенного Fe3+. В данном случае интенсификация выщелачивания
происходит по двум причинам. Во-первых, железоокисляющие бактерии в растворе
регенерируют Fe3+, которое может вновь окислять руду. Во-вторых, к непрямому
выщелачиванию ионами Fe3+ добавляется контактное окисление руды самими
бактериями.
На второй стадии степень извлечения никеля выше из рудного концентрата,
выщелоченного раствором Fe3+ с бактериями (в 2,3 раза – рис. 2). Следовательно,
бактерии, присутствующие в окисляющем растворе, способствуют более полному
разрушению руды, что облегчает ее доокисление на второй стадии.
141
Рис. 1. Выход никеля в раствор на
первой стадии
2+
Ni , мг/л
800
600
с бактериями
400
без бактерий
200
0
I
II
III
IV
Смена раствора
2+
Ni , мг/л
Рис. 2. Выход никеля в раствор на
второй стадии
1200
1000
800
600
400
200
0
I стадия с
бактериями
I стадия без
бактерий
0
1
3
8
14
Время, сут
1.
2.
Каравайко Г.И., Росси Дж., Агате А. и др. Биогетехнология металлов. Практическое
руководство. – М.: Центр международных проектов ГКНТ, 1989. 375 с.
Резников А.А., Муликовская Е.П., Соколов И.Ю. Методы анализа природных вод. –
М.: изд-во «Недра», 1970. 140 с.
142
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
НА ОСНОВЕ СПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS
И BACILLUS LICHENIFORMIS ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ПЛОДОРОДИЯ ПОЧВ
А. А. Леляк 1,2, А. И. Леляк 2
1
Научно-производственная фирма «Исследовательский центр», Россия
2
Новосибирский государственный аграрный университет, Россия
Одним из способов управления микробным составом почвы с целью увеличения ее
плодородия является внедрение в технологию возделывания сельскохозяйственных
культур биологических препаратов на основе штаммов бактерий, обладающих
выделенным свойством: создавать в процессе жизнедеятельности благоприятные условия
для развития нормофлоры почвы, которая является одной из главных составляющих
почвенного плодородия.
В рамках осуществления попытки разработать технологию управления микробным
сообществом почвы, нами созданы препараты, в которых в качестве действующего начала
использованы микроорганизмы, обладающие следующими свойствами: они безвредны
для окружающей среды, в процессе жизнедеятельности эти микроорганизмы выделяют в
окружающую среду вещества, подавляющие рост и развитие патогенной, условно –
патогенной, гнилостной микрофлоры. Следствием внесения таких микроорганизмов в
почву является сдвиг ее микробного состава в сторону эволюционно нормального, и ,как
следствие, увеличения ее плодородия.
Цель исследований – изучить влияния препаратов, в которых в качестве
действующего начала использованы бактерии рода Bacillus: Bacillus subtilis штамм
ВКПМ В 7092, Bacillus subtilis штамм ВКПМ В 7048, Bacillus licheniformis штамм ВКПМ
В 7038, на состав микробного ценоза и качественной структуры индикаторных групп
микроорганизмов в почве.
Материалы и методы исследований
В 2009 году был проведен мелкоделяночный опыт на территории ФГУ
«Госсортсеть» (Новосибирский район, с. Верх – Тула). В опыте использовались две
препаративные формы: культуральная жидкость после выращивания указанных выше
бактерий, с титром живых микробных клеток не менее 1 × 108 КОЕ/мл и гранулы с
различными наполнителями и титром живых микробных клеток не менее 1 × 104 КОЕ/г.
Для посева на экспериментальном участке использовали семена первой
репродукции сорта яровой мягкой пшеницы Баганская-95, среднеспелый
(продолжительность вегетационного периода 90–96 дней), разновидность лютесценс,
районированный с 2007 года по Западно-Сибирскому региону РФ.
Варианты опыта:
1. Контроль; 2. Контроль + азотное удобрение (аммиачная селитра, 100 кг/га); 3.
Обработка семян химическим протравителем (Виал ТТ, вск); 4. Обработка семян Фитоп 8.67,
10 мл/т.; 5. Подкормка азотным удобрением (аммиачная селитра, 100 кг/га); 6. Подкормка
Фитоп 8.67, 10 мл/га; 7. Обработка семян Фитоп 8.67 + подкормка Фитоп 8.67, 10 мл/тонну
+ 10 мл/га; 8. Фитоп 8.66 (наполнители – мел, гумат натрия), 30 кг/га при посеве; 9. Фитоп
143
8.61 (наполнители – мел, Криал), 30 кг/га при посеве; 10. Фитоп 8.62 (наполнители – мел,
Азофит), 30 кг/га при посеве; 11. Фитоп 8.63 (наполнители – мел, Криал, Азофит), 30 кг/га
при посеве; 12. Фитоп 8.64 (наполнители – мел, гумат натрия, Азофит), 30 кг/га при посеве;
13. Фитоп 8.65 (наполнитель – мел), 30 кг/га при посеве.
Повторность опыта трехкратная, площадь одной делянки составила 100 м2.
Фитоп 8.67, концентрат суспензии вносили в почву путем предпосевной обработки
семян, остальные препараты в виде гранул вносили при посеве зерна – туковой сеялкой.
Образцы почвы для проведения микробиологического анализа отбирали дважды за
вегетационный период: в середине лета, в фазу цветения пшеницы, и в начале осени,
после сбора урожая.
Учет численности микроорганизмов в почве проводили методом посева
последовательных разведений суспензии на дифференциальные питательные среды
(Теппер, 2004).
Результаты исследований
В результате микробиологического анализа образцов почвы выявлено, что наиболее
благоприятные условия для формирования сбалансированного состава микробного ценоза
и качественной структуры индикаторных групп микроорганизмов складывались при
внесении при посеве гранулированных удобрений на основе трех штаммов с различными
наполнителями. Так, нами отмечено достоверное увеличение по сравнению с контролем
(вариант 1) содержания микроскопических грибов, а также спорообразующих бактерий
рода Bacillus, являющихся универсальными индикаторами благоприятного трофического
режима почв, в вариантах опыта 8 и 9 (Фитоп 8.66 и Фитоп 8.61).
Кроме грибов спорообразующих бактерий, в процессах деструкции органического
вещества в почве, а именно минерализации азотсодержащих органических веществ,
участвуют микроорганизмы – аммонификаторы, утилизирующие их с образованием
аммиака и аммонийных соединений, и нитрификаторы, завершающие минерализацию
органических
соединений
азота,
начатую
аммонификацией.
Количество
аммонифицирующих и нитрифицирующих микроорганизмов увеличивалось в вариантах
опыта 7 (обработка семян Фитопом 8.67 и подкормка вегетирующих растений Фитопом
8.67), а также в вариантах с 8 по 12 (внесение гранулированных препаратов при посеве).
О направленности процессов гумусообразования в почве можно судить по индексу
гумификации, который представляет собой соотношение зимогенной, участвующей в
синтезе гумуса, и автохтонной, разлагающей гумус, групп микроорганизмов. Чем этот
показатель выше, тем активнее идет синтез гумуса.
Индекс гумификации почвы, %
144
Как видно из рисунка, индекс гумификации к моменту уборки урожая достоверно
увеличился относительно контроля в вариантах с применением препаратов Фитоп 8.61 (на
11,9 %), Фитоп 8.63 (на 47,3 %), Фитоп 8.62 (на 45,3 %), Фитоп 8.66 (на 17,8 %) и в
варианте с применением подкормки вегетирующих растений Фитоп 8.67 (на 33,9 %).
Выводы
1.
Спорообразующие бактерии Bacillus subtilis и Bacillus lichenifromis являются
перспективными для повышения биологической активности почв агроценозов.
2.
Среди изученных биологических препаратов, действующим началом которых
был консорциум бактерии Bacillus subtilis и Bacillus lichenifromis, наибольшее
положительное влияние на показательный состав микрофлоры почвы оказал препарат
Фитоп 8.67 в виде концентрата суспензии спор, использованный для обработки семян и
подкормки вегетирующих растений, а также гранулированные Фитоп 8.66 и Фтоп 8.61.
1.
2.
3.
Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: Изд-во МГУ, 1989. - 336 с.
Теппер Е.З. Практикум по микробиологии: Учебное пособие для вузов / Е.З. Теппер,
В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева. – М., 2004. – 256 с.
Звягинцев Д.Г., Добровольская Т.Г., Бабьева М.П. Роль микроорганизмов в
биогеоценотических функциях почв / Почвоведение. - 1992. - № 6.
НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТА ПРОТЕИНАЗ – АКТИВАТОРОВ
ПРОТЕИНА С ПЛАЗМЫ КРОВИ КУЛЬТУРЫ ASPERGILLUS OCHRACEUS 247
А. А. Осмоловский
Кафедра микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова
Способность микроскопических грибов образовывать протеолитические ферменты
с антикоагулянтными свойствами впервые была показана сотрудниками кафедры
микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова в последние годы прошлого века (Ландау и
др., 1998). В результате проведенного скрининга был отобран активный продуцент
протеиназ с антикоагулянтной активностью – микромицет Aspergillus ochraceus. Было
высказано предположение о том, что данные ферменты могут являться активаторами
протеина С (РС) – одного из наиболее значимых белков системы гемостаза.
Существует целый ряд причин, как наследственных, так и приобретенных,
приводящих к уменьшению содержания протеина С в плазме крови. Поэтому особо
актуальным представляется создание препаратов, позволяющих быстро и качественно
оценить содержание данного белка в крови. Из всех доступных современной медицине
средств наиболее простым в применении является диагностический препарат,
содержащий специфические протеиназы – активаторы РС, выделенные из яда южноамериканского щитомордника. В связи с этим поиск альтернативных продуцентов
подобных ферментов среди микроорганизмов, в частности мицелиальных грибов,
представляется весьма актуальным, поскольку микробные ферменты, проявляющие
145
антикоагулянтные свойства по типу активаторов протеина С могут оказаться более
доступными и дешевыми.
Для получения и последующего изучения комплексных препаратов белков
культуральной жидкости микромицета Aspergillus ochraceus 247 проводили высаливание
внеклеточных белков культуральной жидкости сульфатом аммония до степени насыщения
0,8 после 4-х суток культивирования. Выпавшие осадки белков темно-бурого цвета
растворяли в буфере, подвергали диализу и затем лиофильно высушивали. В результате
был получен лиофилизированный препарат, представляющий рассыпчатый порошок
коричневатого цвета. Значение удельной активаторной к РС активности было примерно в
109 раз выше по сравнению с культуральной жидкостью.
В препарате белков культуральной было жидкости обнаружено два белка,
способных осуществлять активацию РС плазмы крови. Изоэлектрические точки обоих
белков оказались близки по значению: pI 5,5 для первого белка и pI 5,8 для второго белка.
Электрофоретический анализ полученных активных фракций показал, что они
содержат белковые зоны, соответствующие таким же зонам комплексного белкового
препарата из культуральной жидкости A. ochraceus 247.
Обе фракции, полученные в результате изоэлектрофокусирования, были
подвергнуты ингибиторному анализу. Нами были использованы ингибиторы, влияющие
на основные классы протеиназ (металлопротеиназ, цистеиновых протеиназ и сериновых
протеиназ) и ингибиторы протеиназ с разной субстратной специфичностью (трипсиновых,
химотрипсиновых и субтилизиновых протеиназ).
Показано, что протеиназы, содержащиеся в обеих фракциях, полностью
ингибируются PMSF – ингибитором сериновых протеиназ. Частичное ингибирование
активности ЭДТА и п-ХМБ – ингибиторов металлопротеиназ и цистеиновых протеиназ,
соответственно, указывает на роль ионов двухвалетных металлов, возможно Ca2+, и
тиоловых групп, необходимых для поддержания структуры этих ферментов.
Обе фракции практически полностью ингибируются соевым ингибитором
трипсина. Это подтверждает сделанные ранее предположения о негативном влиянии
соевой муки в составе ферментационной среды для получения данных протеиназ.
Ингибитор трипсиноподобных ферментов TLCK практически не влияет на
активность первой фракции и в большей степени влияет на активность второй фракции, а
ингибитор химотрипсиноподобных протеиназ – ТPCK влияет на активность обоих
фракций в более значительной степени.
Суммируя полученные данные ингибиторного анализа можно считать, что
протеиназы – активаторы РС, образуемые микромицетом A. ochraceus (исходя из
видоспецифичности в отношении РС изученных штаммов) являются трипсино- или
химотрипсинподобными тиолзависимыми протеиназами серинового типа. Такие данные
согласуются с данными, полученными для протеиназ – активаторов РС, выделенными из
яда южно-американского щитомордника.
146
АКТИНОБАКТЕРИИ РОДА RHODOCOCCUS, ПРОДУЦЕНТЫ АМИДАЗ
Ю. А. Павлова 1,2, А. Н. Неустроева 2 , А. Ю. Максимов 1,2
1
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь
2
Пермский государственный университет, Пермь
Исследования в области бактериального метаболизма и биотрансформации
различных соединений являются одним из важнейших направлений современной
микробиологии. Среди биогенных органических соединений широко распространена
амидная связь, являющаяся основой структуры различных биологически-активных
веществ, пептидов и белков.
Гидролиз амидов с образованием соответствующих карбоновых кислот и аммония
катализируют ферменты – амидазы. У прокариот, том числе у актинобактерий рода
Rhodococcus, их активность часто сопряжена с метаболизмом нитрилов [1–3]. Известны
два пути гидролиза этих соединений: двустадийный, в котором участвуют ферменты
нитрилгидратаза (КФ 4.2.1.84) и амидаза (КФ 3.5.1.4) и одностадийный, осуществляемый
нитрилазой (КФ 3.5.5.1). Однако амидазная активность встречается и у бактерий,
обладающих нитрилазой или не способных трансформировать нитрилы [2–4].
В Единой классификации, основанной на катализируемых реакциях и природе
субстрата, объединены ферменты, различающиеся по структурной организации,
молекулярному механизму действия, термодинамическим свойствам, некоторым аспектам
субстратной специфичности. Исследование первичной структуры ферментов,
расщепляющих С–N связи, позволило выделить четыре структурных семейства,
включающие амидазы [4, 5]: I. – Ферменты, содержащие в первичной структуре GGSSмотив; II. – Нитрилазы/ цианидгидратазы; III. – Ацилтрансферазы; IV – Уреазы.
К первому семейству, относятся амидазы, первичная структура которых включает в
себя инвариантный GGSS-мотив, названный консенсусом амидаз, характерные для R.
rhodochrous J1, Rhodococcus sp. R12, Sulfolobus solfataricus и др. Эти ферменты имеют
четвертичную структуру и, как правило, представляют собой гомодимеры и
гомооктамеры, обладают широкой специфичностью, активны в отношении алифатических
и ароматических амидов, амидов α-замещенных карбоновых кислот, проявляют
стереоспецифичность. В три последних семейства амидазы входят вместе с ферментами,
осуществляющими другие реакции [5]. Ферменты разных семейств существенно
различаются по стабильности и субстратной избирательности, поэтому их структурная
характеристика на уровне генетической и аминокислотной последовательности
характеризует перспективы использования его продуцента [6].
Бактерии, обладающие высокой амидазной активностью, представляют интерес для
биокаталитического получения различных карбоновых кислот [1, 5]. Успешное
применение микроорганизмов в биокаталитических процессах зависти от их
физиологических и энзиматических свойств: скорости гидролиза субстрата, pH- и
термостабильности фермента, состава реакционной среды.
В результате селекции из образцов почв нами выделено более 400 культур
грамположительных бактерий, активно метаболизирующие амиды и нитрилы, из них 38,
обладающих детектируемой амидазной активностью более 5 мкмоль/мг/мин,
147
превышавшей нитрилгидратазную в широком интервале температур. Методами
полифазной таксономии, а также анализа генов 16S рРНК изоляты идентифицированы как
R. erythropolis, R. rhodochrous, R. ruber.
Исследовано проявление активности ферментов в зависимости от стадии роста.
Показано, что уровень экспрессии амидаз у большинства изолятов наиболее высок
середине экспоненциальной фазы роста. Причем повышение амидазной активности
происходило одновременно с ростом активности нитрилгидратазы, что, вероятно,
свидетельствует о координированной экспрессии этих двух ферментов.
Показано, что исследуемые культуры родококков способны использовать широкий
спектр алифатических незамещенных амидов и соответствующих им нитрилов как в
качестве источника азота, так и углерода и энергии. Все штаммы были резистентны к
высоким концентрациям этих соединений в среде (до 1% для ацетонитрила). Замещенные
(лактамид, лактонитрил, акриламид, 3-гидроксипропионитрил), ароматические и
гетероциклические субстраты, а также динитрилы использовались частью штаммов
Rhodococcus лишь в качестве источника азота.
Большинство амидаз Rhodococcus были высокоактивны при повышенной
температуре (50°С), что важно для биокаталитических процессов. Исследована
трансформация нитрилов и амидов, включая алифатические, разветвленные,
непредельные, гидроксилированные и ароматические амидов выделенными штаммами.
Установлено, что наилучшими субстратами для ферментов большинства штаммов
являются ацетамид и пропионамид (наиболее простые по структуре и легкометаболизируемые субстраты). Однако некоторые штаммы, селекционированные на
изобутиронитриле и изобутирамиде предпочитали именно изобутирамид, доступ к
амидной группе которого пространственно затруднен. Никотинамид и бензамид
гидролизовались с меньшей скоростью.
Разработаны праймеры для ПЦР-анализа, специфичные к генам амидаз 5-ти
различных структурных типов.
Методом ПЦР получены фрагменты ДНК штаммов Rhodococcus, родственные генам
амидаз трех типов: R. erythropolis (AY026386, Genbank), R. erythropolis (M88614,
Genbank), Rhodococcus sp. N-771, R. rhodochrous J1. Нуклеотидные последовательности
определены с помощью ДНК-секвенирующей системы MegaBase1000. Проведено
сравнение нуклеотидных последовательностей и филогенетичский анализ. Показано, что
геномы изолятов Rhodococcus содержат преимущественно гены амидаз двух типов и
секвенированные фрагменты гомологичны соответствующим последовательностям генов
амидазы Rhodococcus sp. N-771 - на 83–98,7%, R. rhodochrous J1- на 95–99% и R.
erythropolis (M88614, Genbank) на 93–99,2%. Гены других амидаз встречались со
значительно меньшей частотой. Установлено, что изолированные Большинство штаммов
также содержали последовательности, соответствующие генам α- и β- субъединиц Feсодержащей нитрилгидратазы.
Работа поддержана ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной
России на 2009 - 2013 годы» (ГК№ 02.740.11.0078), АВЦП «Развитие научного
потенциала высшей школы (2009–2010 годы)» и программой Президиума РАН
«Биологическое разнообразие».
148
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Banerjee, A., Sharma, R., Banerjee, U.C. The nitrile-degrading enzymes: current status and
future prospects // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2002. – V.60. – P. 33–44.
Cowan, D., Cramp, R., Pereira, R. et al. Biochemistry and biotechnology of mesophilic
and thermophilic nitrile metabolizing enzymes // Extremophiles. – 1998. – V. 2, N. 3.
–P. 207–216.
Демаков В.А., Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Ремезовская Н.Б.,
Максимова Ю.Г. Биологическое разнообразие нитрилметаболизирующих
бактерий антропогенно-измененных почв Пермского края // Экология. – 2007. –
№3. – С. 1–6.
Fournand, D., Arnaud, A. Aliphatic and enantioselective amidases: from hydrolysis to acyl
transfer activity // J.Appl.Microbiol. 2001, 91, 381–393.
Перцович С.И., Гуранда Д.Т., Подчерняев Д.А., Яненко А.С., Швядас В.К.
Алифатическая амидаза из Rhodococcus rhodochrous- представитель семейства
нитрилаз/цианидгидратаз // Биохимия. – 2005. – Т.70. – С.1556–1565
Asano, Y. Overview of screening for new microbial catalysts and their uses in organic
synthesis - selection and optimization of biocatalysts // J. Biotechnol. – 2002. –V. 94.
– P. 65–72.
АНАЛИЗ ПРОЦЕССА ОБЕССЕРИВАНИЯ СЫРОЙ НЕФТИ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АССОЦИАЦИЙ
Е. В. Перушкина, Л. М. Хасанова, З. О. Садыкова, Л. Ф. Мубаракшина,
А. С. Сироткин
ГОУ ВПО «Казанский государственный технологический университет», Казань, Россия
Повышение экологической безопасности продуктов нефтепереработки является
одной из первостепенных задач во всем мире. Особое значение она приобретает для
Республики Татарстан (РТ), где добывается нефть с высоким содержанием сернистых
соединений. Необходимо отметить, что в зависимости от массового содержания серы (S,
%) различают нефть малосернистую (0≤S≤0,5), средней сернистости (0,5<S≤1), сернистую
(1<S<3) и высокосернистую (S>3) (Ластовкин, 1986).
В настоящее время для снижения концентрации соединений серы в продуктах
нефтепереработки применяется способ гидроочистки, который представляет
каталитический процесс преобразования серы органических соединений в сероводород в
результате реакций между фракциями нефти и водородом при высоких значениях
давления и температуры.
Известно, что распределение соединений серы по отдельным фракциям нефти
зависит от их структуры и физико-химических свойств, а также от природы нефти.
Органические соединения серы в ниже кипящих фракциях, например, бензиновой,
представлены главным образом тиолами, сульфидами и тиофенами. Однако фракции
среднего продукта перегонки, например, дизеля, содержат существенное количество
бензотиофенов и дибензотиофенов, которые являются значительно более трудными для
удаления их гидроочисткой. Среди самых невосприимчивых из этих соединений –
149
дибензотиофены с замещенной серой. Как правило, содержание серы возрастает от
низших фракций к высшим, наибольшее количество серы приходится на долю
высококипящих фракций и остатка перегонки (Гуревич, 1952).
Высокая стоимость и химические ограничения, присущие гидроочистке, а также
строгие требования на пониженное содержание серы в топливе определяют возможность
поиска альтернативных технологий, в частности основанных на использовании
микроорганизмов. Биообессеривание нефти в настоящее время изучается как альтернатива
гидроочистке для удаления органической серы из топлив.
В последние годы особое внимание авторов уделяется проблеме подбора
микроорганизмов для эффективного снижения концентрации соединений серы в нефти.
Бактерии рр. Pseudomonas, Rhodococcus, Mycobacterium, толерантные к присутствию
органических растворителей, принято считать наиболее оптимальными для обессеривания
нефти, вследствие высоких показателей их роста, метаболического разнообразия,
возможности осуществлять биотрансформацию органических соединений в двухфазных
системах. Однако эти микроорганизмы относятся к неспецифическим сероокисляющим
бактериям, у которых удаление серы из молекул углеводородов является побочным
процессом в разрушении (окислении) углеводородов, что может приводить к снижению
энергетической составляющей топлива. В настоящей работе для биообессеривания нефти
предлагается использование микробных ассоциаций, которые представляют собой
консорциум автотрофных и факультативно гетеротрофных сероокисляющих бактерий.
Это позволяет повысить эффективность биообессеривания нефти и сократить степень
деструкции углеводородных компонентов.
Цель настоящей научно-исследовательской работы заключается в изучении
аэробного процесса биологического снижения концентрации соединений серы в составе
сырой нефти, а также выбор наиболее активных ассоциаций микроорганизмов для его
осуществления.
Объектом исследований являлась высоковязкая с содержанием воды 20±2%,
сернистая с содержанием серы 3–4% нефть, предоставленная ОАО «Татекс» (МНК, г.
Альметьевск) с Омбийского месторождения РТ (ДНС-10). Для экспериментальных
исследований использовали ассоциации сероокисляющих микроорганизмов ЕА1, ЕА2,
ЕА3 и SA. Ассоциации ЕА1, ЕА2 и ЕА3 выделены авторами из активного ила,
функционирующего при очистке промышленных серусодержащих сточных вод.
Ассоциация SA выделена из почвы болотистых мест Республики Башкортостан
(Г.Г.Ягафарова, С.В.Леонтьева, А.Х.Сафаров).
Периодическое аэробное культивирование микроорганизмов проводили на
элективных питательных средах, в которых источником соединений серы является
сернистая нефть в количестве 10% (об.). Биоокислительную активность ассоциаций
оценивали по изменению концентрации конечного продукта окисления – сульфатов,
ферментативной активности клеток при утилизации тиосульфата натрия и глюкозы.
Предварительные исследования сероокисляющих микроорганизмов в составе
ассоциаций позволили сделать вывод о том, что ассоциации ЕА1, ЕА2, ЕА3 и SA
отличаются по морфологическому составу и обладают различными окислительными
свойствами. Результаты лабораторных экспериментов демонстрируют разную скорость и
150
полноту микробного окисления серусодержащих компонентов нефти. Высокая
биоокислительная активность ассоциаций ЕА2 Δ(SO42-)=121 мг/дм3 и SA Δ(SO42-)=226
мг/дм3 отмечена уже на 7 сутки культивирования. Микробные ассоциации ЕА1 и ЕА3
проявляют способность к окислению соединений серы нефти лишь на 14 сутки
эксперимента, что сопровождается низкой степенью превращения их до сульфатов
(Δ(SO42-)=60 мг/дм3). Этот факт позволяет сделать вывод о нецелесообразности их
применения в технологии обессеривания нефти.
Дегидрогеназная активность микробных клеток при утилизации тиосульфата натрия
достигает максимума на 7 сутки эксперимента, затем отмечено снижение этого
показателя, что прекращает накопление сульфатов в культуральной жидкости. Это может
быть связано с недостаточным доступом кислорода к микробным клеткам, вследствие
концентрации их на границе раздела фаз нефть-питательная среда.
Необходимо отметить, что за этот период отмечен минимальный прирост клеточной
биомассы, так как сероокисляющие микроорганизмы являются медленно растущими.
Однако для ассоциаций ЕА1 и SA, в отличие от остальных, характерно дальнейшее
увеличение концентрации белка микробной биомассы до конечного значения Сбелок=100–
131 мг/дм3. Это можно объяснить тем фактом, что в составе рассматриваемых ассоциаций
сероокисляющих микроорганизмов отмечены микроорганизмы, способные к
трансформации углеводородных компонентов нефти.
Использование в технологии биообессеривания нефти микроорганизмов,
обладающих высокой способностью утилизации органических субстратов, отрицательно
для ведения процесса, так как указанные микроорганизмы могут осуществлять
деструкцию углеводородов нефти. По результатам контрольных высевов микробных
ассоциаций на МПА установлено присутствие в их составе факультативно автотрофных и
гетеротрофных микроорганизмов (0,65–1,83 млн КОЕ/см3), что соответствует
ферментативной активности образцов биомассы при утилизации глюкозы (0,4–3,0 мкг
формазана/см3).
Анализ результатов ферментативной активности клеток и окисления
серусодержащего компонента гетеротрофными микроорганизмами в процессе их
культивирования свидетельствуют о том что, все установленные физиологические группы
микроорганизмов в составе ассоциаций способны к окислению соединений серы, что
благоприятно для осуществления процесса биообессеривания в промышленном масштабе.
Таким образом, наиболее эффективными окислителями серусодержащих
компонентов нефти являются ассоциации EA2 и SA. Ассоциации EA1 и ЕА3 проявляет
низкую биоокислительную активность на 14 сутки культивирования, слишком долгий
период выхода в лог-фазу отрицателен для промышленной технологии. Проведение
процесса биообессеривания нефти для исследуемых ассоциаций предпочтительно
проводить в течение 7 суток, дальнейшее осуществление процесса является
неоправданным и нерентабельным для промышленной реализации.
151
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МАЛДИ–ВП МАСС–СПЕКТРОМЕТРИИ
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ
БАКТЕРИЙ РОДА THALASSOSPIRA (СЕМЕЙСТВА RHODOSPIRILLALES)
Н. В. Присяжная1, E. В. Арискина2, О. А. Малошицкая1, Л. Н. Ананьина3
1
2
Химический факультет, МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва, Россия
Всероссийская Коллекция Микроорганизмов (ВКМ), Институт биохимии и физиологии
микроорганизмов им Г.К. Скрябина, РАН, Пущино, Россия
3
Институт экологии и генетики микроорганизмов, УрО РАН, Пермь, Россия
МАЛДИ-ВП масс-спектрометрия бактериальных клеток – новый быстрый и
эффективный метод, используемый в таксономии для идентификации и классификации
бактерий, в особенности на видовом уровне. В основе метода лежит ионизация ряда
доступных и легкоионизируемых белков микроорганизмов. Согласно литературным
данным, многие из регистрируемых сигналов соответствуют белкам, присутствующими в
клетке в больших количествах, в том числе, рибосомальным.
Нами были получены и изучены МАЛДИ-ВП спектры бактериальных клеток 4
штаммов рода Thalassospira: Thalassospira permense SMB34T, Thalassospira xiamenensis M5T, Thalassospira profundimaris WP0211T и Thalassospira tepidiphila 1-1BT. Штаммы для
анализа были выращены на двух средах: морском агаре (МА) и R2A (“Difco”) с
добавлением 3% NaCl (R2A+NaCl) при 28°C в течение 24 часов.
Спектры снимали в диапазоне от 3000 до 11000 m/z (масса/заряд) и учитывали пики
с относительной интенсивностью >1%. Ошибка прибора составляла ±1 Да. В полученных
спектрах воспроизводилось больше 80% пиков для каждого из повторов на обеих средах.
Влияние среды выращивания на внешний вид спектра было незначительным. В целом
спектры штаммов, выращенных на МА, содержали меньшее количество пиков и были
более сходны, чем спектры штаммов, выращенных на среде R2A+NaCl.
Однако, вне зависимости от среды выращивания, спектры штаммов T. permense и T.
xiamenensis демонстрировали высокую степень схожести, в то время как спектры T.
profundimaris всегда были более сходны с таковыми T. tepidiphila. Кластерный анализ с
использованием программы BioTyper Bruker Daltonics МАЛДИ-ВП спектров клеток,
выращенных на обеих средах, соответствовал филогенетической группировке (16S рРНК
гены).
При сравнении спектров, полученных в результате 5 повторных экспериментов,
было выявлено, что количество общих пиков для T. permense и T. xiamenensis,
выращенных на R2A, сотавляет 86,6%, а для T. profundimaris и T. tepidiphila 73% и 87%
соответственно. Следует отметить, что некоторые пики (m/z 4912, 5138, 6754, 6812, 7253)
с разной абсолютной интенсивностью присутствовали в спектрах всех штаммов
Thalassospira на обеих средах (таблица). Эти пики, по-видимому, могут служить
биомаркерами организмов этого рода или, по крайней мере, рассматриваемой группы
видов. Кроме того, на среде R2A были выявлены уникальные для каждого из
рассмотренных видов пики (таблица).
152
Полученные данные демонстрируют, что анализ фингерпринтых спектров может
служить для идентификации микроорганизмов данной группы на видовом и, возможно, на
родовом уровне.
Работа поддерживается грантом
«Молекулярная и клеточная биология».
РФФИ и
программой
президиума
РАН
Значения m/z для 4 штаммов Thalassospira (от 3000 до 11000 Да)
1-1BT WPO211T M-5T SMB34T
6318
3626
6754
6754
6754
6754
6811
6811
6812
6811
7253
7254
7255
7253
7264
7265
7273
7273
7368
7368
7508
7510
9217
9217
9261
9261
3625
3635
3653
3654
3685
3684
4402
4464
4466
7309
7310
4477
4481
4520
4629
7516
4629
4636
4637
4912
4912
4912
4911
5138
5139
5139
5138
5159
5160
5223
5172
5173
M-5T
SMB34T
6307
6307
9277
*Подчеркнуты значения, соответствующие
пикам, которые воспроизводились во всех
пяти экспериментах.
5223
WPO211T
9277
10350
6147
1-1BT
7517
6303
6314
153
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МАЛДИ–ВП МАСС–СПЕКТРОМЕТРИИ ЦЕЛЫХ КЛЕТОК
ДЛЯ КЛАССИФИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ФИТОПАТОГЕННЫХ
АКТИНОБАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА MICROBACTERIACEAE
Н. В. Присяжная1, Л. В. Дорофеева2
1
2
Химический факультет, МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва, Россия
Всероссийская Коллекция Микроорганизмов (ВКМ), Институт биохимии и физиологии
микроорганизмов им Г.К. Скрябина, РАН, Пущино, Россия
В настоящее время МАЛДИ-ВП масс-спектрометрия целых бактериальных клеток
является одним из новых перспективных методов в таксономии микроорганизмов. Этот
метод используется для идентификации и классификации бактерий, в особенности на
видовом уровне. Одними из основных его достоинств являются быстрота (менее 1
мин/образец), минимальные объемы исследуемых веществ (менее 1 мкл) и проведение
анализа на основе такой объективной величины как молекулярный вес компонентов образца.
Согласно литературным данным, сигналы (пики) в исследуемом диапазоне от 2000 до 11000
m/z (отношение массы иона к его заряду) масс-спектров бактерий соответствуют
бактериальным белкам, в т.ч., рибосомальным.
Нами были получены и изучены МАЛДИ-ВП спектры бактериальных клеток 24
штаммов рода Rathayibacter и 52 штаммов рода Clavibacter, включающие типовые и
референтные штаммы.
Традиционно считается, что каждый вид бактерий родов Rathayibacter и Clavibacter
является фитопатогеном. Микроорганизмы вызывают заболевания определенных видов
растений, таких как различные виды злаков (Rathayibacter и Clavibacter), пасленовые и
бобовые (Clavibacter).
Кластерный анализ с использованием программы BioTyper (Bruker Daltonics) бактерий
рода Rathayibacter выявил наличие хорошо обособленных групп штаммов, принадлежащих к
определенным видам рода. Сравнение полученных спектров бактерий показало, что
микроорганизмы, относящиеся к одному виду, имеют ряд общих пиков. Штаммы ВКМ Ac2121, DL-577 и DL-642, выделенные из таких источников как Stipa sp., Lavatera thuringiaca и
Galatella punctata соответственно, обособлялись от известных представителей этого рода. По
всей вероятности, эти штаммы относятся к новым видам. Изолят DL-627 из Anemone
sylvestris, наиболее сходный по спектру с типовым штаммом R. festucae, идентифицирован
как R. festucae.
Кластерный анализ бактерий рода Clavibacter также выявил наличие хорошо
обособленных групп штаммов, принадлежащих к определенным видам рода. Однако, ряд
штаммов, условно отнесенных к определенному виду (с учетом источника выделения и
фенотипических характеристик), не попали в «свой» вид по результатам анализа МАЛДИВП спектров. Например, C. michiganesis ssp. michiganesis ICMP-8034 оказался в группе C.
michiganesis ssp. sepedonicus. C. michiganesis ssp. michiganesis ICMP-1144 и C. michiganesis
ssp. sepedonicus ICMP-2537 на основании кластерного анализа были обособлены от других
представителей данных видов. Штаммы ВКМ Ac-1790 и ВКМ Ac-1792, выделенные из
нематодных галлов на полевице Agrostis sp., оказались наиболее сходными по спектрам с
154
типовым штаммом вида С. michiganesis ssp. michiganesis и идентифицированы как С.
michiganesis ssp. michiganesis.
Для установления видовой принадлежности микроорганизмов, отличных от известных
видов, необходимо провести дальнейшие исследования на геномном и фенотипическом
уровне.
Работа поддерживается программой президиума РАН «Молекулярная и клеточная
биология».
СПОРООБРАЗУЮЩИЕ БАКТЕРИИ РОДА BACILLUS
КАК ОСНОВА ЛЕЧЕБНО–ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА
ПРОТИВ ГНОЙНО–НЕКРОТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
И. А. Проскурнина1, М. С. Колосовская1, Н. В. Сверчкова1, Т. В. Романовская1,
Э. И. Коломиец1, Ю. В. Ломако2, Э. И. Веремей3
1
Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь
Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского, Минск, Беларусь
3
Витебская ордена «Знак почета» государственная академия ветеринарной медицины,
Витебск, Беларусь
2
Одной из важных задач современного животноводства является борьба с
заболеваниями инфекционной этиологии [1–3]. Серьезную проблему представляет собой
массовость гнойно-некротических заболеваний крупного рогатого скота, которая наносит
значительный экономический ущерб животноводству как у нас в стране, так и за рубежом.
Так, при отсутствии лечения от некротических поражений дистального отдела конечностей
или при его неудовлетворительной организации преждевременно выбраковывается на убой
до 70% больных животных, что приводит к снижению производства молока и мяса [4].
Приоритетной тенденцией в профилактических и терапевтических мерах, применяемых
сегодня в сельском хозяйстве, является переход от использования химических средств к
внедрению в практику животноводства экологически безвредных биологических средств
защиты нового поколения.
С этой точки зрения особый интерес представляют пробиотические препараты,
разрабатываемые на основе микроорганизмов и продуктов их метаболизма. В качестве
перспективной основы при разработке экологически безопасного препарата против гнойнонекротических заболеваний показана целесообразность использования бактерийантагонистов рода Bacillus [5–8].
В Институте микробиологии НАН Беларуси выделены штаммы спорообразующих
бактерий рода Bacillus, обладающие высокой антимикробной активностью в отношении
возбудителей гнойно-некротических заболеваний животных – Escherichia coli А-20,
155
Staphylococcus albus, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella dublin,
Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus.
Максимальной антагонистической активностью к указанным тест-объектам
характеризовался штамм Bacillus sp. I 22 (таблица), обладающий также высокой
протеолитической активностью.
Антимикробная активность штаммов-антагонистов в отношении патогенов животных
(метод лунок [9])
Штаммы–
Диаметр зоны задержки роста патогена, мм
антагонисты
1
2
3
4
5
6
7
8
Bacillus
21,0±1,2 20,0±1,1 21,0±1,0 22,0±1,0 10,0±0,4 23,0±1,2
–
17,5±0,8
subtilis 9/9
Bacillus
24,0±2,2 19,0±1,0 18,0±0,5 21,0±0,5 11,0±0,5 24,0±1,1
–
19,5±1,0
subtilis II-10
Bacillus sp. 26,0±1,1 22,0±2,0 24,0±0,9 22,0±0,3 20,5±1,0 13,0±0,4 14,0±0,2 23,0±0,5
I 22
Примечание: 1 – Esсherichia coli A-20; 2 – Staphylococcus aureus; 3 – Staphylococcus albus;
4 – Salmonella dublin; 5 – Klebsiella pneumonia; 6 – Pseudomonas aeruginosa; 7 – Micrococcus luteus; 8 –
Proteus vulgaris
Он и был отобран для дальнейшей работы по созданию пробиотического препарата для
лечения гнойно-некротических заболеваний.
При разработке технологии получения на его основе пробиотического препарата для
наружного применения особое внимание уделялось соотношению компонентов в смеси. В
качестве гелевой основы был использован карбомер 934, который является гидрофильным, и
диспергирующимся в воде полимером. Обладая высокой осмотической активностью, он не
оказывает повреждающего действия на здоровые ткани и избирательно поглощает экссудат,
а также ограничивает всасывание основного действующего вещества в системный кровоток,
за счет чего их действие проявляется непосредственно в очаге поражения с максимально
щадящим эффектом. Для стабилизации его формы использовался триэтаноламин, в качестве
консервирующей добавки – бензоат натрия. Высокая антимикробная активность препарата
обеспечивается введением основного компонента – бактериальной суспензии Bacillus sp. I
22.
Испытания биопрепарата в гелевой форме проводили в условиях СПК «Ольговское»
Витебского района, где были сформированы 2 группы крупного рогатого скота по 50 голов.
Препарат применяли наружно с интервалом 3–5 дней в дозе 5–15 г на одну обработку до
полного клинического выздоровления животного. Перед нанесением препарата производили
хирургическую обработку патологических поверхностей, промывку 3% перекисью водорода,
водным раствором фурацилина и высушивали раны тампонированием. После нанесения геля
накладывали защитную бинтовую повязку. Для лечения контрольной группы использовали
линимент Вишневского.
156
В ходе испытаний установлено, что пробиотический препарат в гелевой форме
действует асептически на болезнетворную микрофлору, присутствующую на раневых
поверхностях, и способствует активному заживлению ран.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Шахов, А.Г. Комплексная экологически безопасная система ветеринарной защиты
здоровья животных. / Бузлама В.С., Самохин В.Т., Аргунов М.Н. и др. //М.: ФГНУ
«Росинформагротех». 2000.
Проблема заболеваний крупного рогатого скота, вызываемых условно патогенной
микрофлорой// Актуальные проблемы эпизоотологии на современном этапе: Мат.
Междунар. науч.-произв. конф. - СПб., 2004. - С. 103-104.
Малик, Н.И. Пробиотики и биобезопасность / Н.И. Малик, А.Н. Панин// Пробиотики,
пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные
и клинические аспекты: Материалы Международного конгресса.- СанктПетербург, 2007.- C. 51-52.
Препарат для борьбы с гнойно-некротическими заболеваниями дистального отдела
конечностей крупного рогатого скота «Процеол» :пат. РФ № 2015697/
Серафимович А.Ю., Козлов Е. М., Синица О. Н.и др.; заявл. 07.08.92; опубл.
15.07.94. - Бюл. № 15
Штаммы бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, используемые в качестве
компонентов препарата против вирусных и бактериальных инфекций, и препарат
на основе этих штаммов: пат. РФ № 2142287, кл. А61К35/74, С12N1/20, C12R1:07,
C12R1:10, C12R1:125 / Щелкунов С.Н., Петренко В.А., Рязанкина О.И. и др.;
заявитель ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», ТОО НПФ
«Исследовательский центр»; заявл. 16.12.1997;опубл. 10.12.1999.
Грачева Н.М., Бондаренко В.М. Пробиотические препараты в терапии и профилактике
дисбактериоза кишечника // Инфекц. бол. – 2004. – № 2. – С. 53 -58.
Donohue D. C., Salminen S. Safety of probiotic bacteria // Asia Pac. J. Clin. – 1996. - № 5 –
Р. 25–28.
Casula, G., and S. M. Cutting. 2002. Bacillus probiotics: spore germination in the
gastrointestinal tract. Appl. Environ. Microbiol. 68:2344-2352.
Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках / Н.С. Егоров. – М.: Высшая школа, 1986.
– 448 с.
157
СКРИНИНГ МИКРОБНЫХ БИОПРЕПАРАТОВ
В ОТНОШЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ КОРНЕВОЙ ГНИЛИ ГАЗОННЫХ ТРАВ
О. Н. Усова, М. В. Штерншис
Новосибирский государственный аграрный университет, Новосибирск, Россия
Особые условия произрастания газонных трав приводят к тому, что актуальной
проблемой становится защита газона от болезней, вредителей и сорняков. В мировой
практике особое внимание уделяется грибным болезням газона, являющимся
лимитирующим фактором их поддержания. Основными считаются корневые гнили. Эта
проблема характерна и для Сибири, так как газонные травы широко распространены в
данном регионе. Выращивание газонов входит в эру, когда проблемы здоровья растений и
почвы могут быть решены микробными технологиями.
В связи с этим, целью нашей работы явилась оценка и выявление наиболее
эффективных микробных биопрепаратов в отношении возбудителя корневой гнили газонных
трав.
Для проведения данного исследования были взяты патогенный гриб Fusarium
oxysporum, выделенный в чистую культуру при оценке почвенных образцов, а так же
биологические препараты Бактофит, Гамаир, Фитоспорин-М на основе разных штаммов
бактерии Bacillus subtilis и Бинорам на основе бактерии Pseudomonas spp. Концентрации и
нормы расхода препаратов определялись согласно таковым на других культурах,
относящихся к сем. Злаковых. Скрининг проводился методом агаровых блоков.
В результате проведенных исследований выявлено, что наиболее эффективными
являются препараты Бактофит и Гамаир (табл.1).
Влияние биопрепаратов на размер колонии Fusarium oxysporum
Временной
период, сутки
3-е
5-е
7-е
Контроль
3,9×3,8
8,4×8,6
9,0×9,0
Варианты*
Бактофит
1,3×1,4
1,6×1,7
1,8×1,8
Фитоспорин
1,3×1,3
1,6×1,6
2,8×2,9
Гамаир
1,3×1,3
1,3×1,4
1,6×1,7
Бинорам
2,8×3,0
7,0×7,3
9,0×9,0
*Размер колоний гриба указан в см.
Из данных таблицы видно, что в вариантах с препаратами Гамаир и Бактофит рост
колонии Fusarium oxysporum сдерживается на протяжении всего учетного периода, по
сравнению с вариантами контроль и Бинорам. В этих же вариантах наблюдалось
формирование четкой зоны лизиса. Кроме того, данные препараты повлияли и на характер
роста мицелия Fusarium oxysporum. Он развивался очень слабо, тогда как в других вариантах
гриб давал плотный мицелий.
Таким образом, в лабораторных условиях при воздействии разных микробных
препаратов на культуру гриба Fusarium oxysporum, выделенную с пораженных участков
газона, наиболее эффективными являются Гамаир на основе Bacillus subtilis штамм М-22
ВИЗР и Бактофит на основе Bacillus subtilis штамм ИПМ-215.
158
БАКТЕРИИ PAENIBACILLUS EHIMENSIS – НОВЫЙ ИСТОЧНИК
ЦИКЛОДЕКСТРИНГЛЮКАНОТРАНСФЕРАЗ
П. Ю. Федорова, Е. А. Гильванова, Н. Г. Усанов
Институт биологии Уфимского научного центра РАН, Уфа, Россия
Циклодекстрины (ЦД) относятся к макроциклическим соединениям углеводной
природы, получаемые методами ферментативной конверсии крахмала [1]. Источниками
ферментов (циклодекстринглюканотрансфераз, ЦГТаз, К.Ф.2.4.1.19), катализирующих
образование ЦД, являются исключительно прокариоты, при этом системный поиск и
выделение новых штаммов продуцентов является серьезной проблемой. На настоящий
момент с использованием филогенетических подходов идентифицировано лишь несколько
видов аэробных спорообразующих бактерий циклодекстриногенного типа, принадлежащих к
роду Paenibacillus Ash et al. 1994 emend. Shida et al. 1997. В частности, это бактерии видов
P.macerans, P. illinoensis, P. chibensis, P. graminis, P. stellifer и P.campinasensis. Обнаружение
новых генетических разновидностей ферментов, трансформирующих крахмал в циклические
декстрины, является важной и актуальной задачей, так как открывает возможности
получения различных гомологов ЦД и повышения эффективности существующих
технологий.
Впервые нами обнаружена способность продукции циклодекстринов бактериями
Paenibacillus ehimensis (Kuroshima et al. 1996) Lee et al. 2004 [2] в группе из трех культур,
включая типовую DSMZ 11029Т, депонированную в немецкой коллекции микроорганизмов,
а также двух собственных изолятов: IB-739 и IB-G2P. Первый был выделен [3] из серой
лесной среднегумусовой почвы в 1990 г., обладал выраженной антифунгальной [4] и
хитинолитической активностью [5]. Культура IB-G2P была высеяна в середине 90-х годов на
агаре с хитином из биомассы базидиомицетов.
Все три культуры P. ehimensis, использованные в экспериментах, продемонстрировали
хорошо детектируемый уровень внеклеточной ЦГТазной активности (2÷3 ед/мл) в КЖ,
определенной фенолфталеиновым методом [6]. Было показано, что оптимальный
температурный режим циклизации наблюдается при рН=6,0 и 50°С, при этом добавление
катионов двухвалентного кальция (5÷15 мM) стабилизирует фермент.
В нашей работе были проанализированы практически полные нуклеотидные
последовательности генов, кодирующего 16S рРНК штаммов IB-739 и IB-G2P.
Филогенетичекие взаимоотношения этих штаммов с известными культурами P. ehimensis
(включая типовую) и наиболее характерными видами Paenibacillus представлены в виде
древа на рис. 1.
159
Рис. 1. Филогенетическая позиция изолятов IB-739 и IB-G2P
среди представителей других видов рода Paenibacillus
Ближайшей родственной культурой для изолятов IB-739 и IB-G2P, выделенных в
нашей лаборатории (номера последовательностей в Генбанке FN582329.1 и FN582330.1),
оказался типовой штамм P. ehimensis DSM 11029T (AB073192) с наблюдаемой гомологией
генов 16S рРНК более 99%. Сравнительный филогенетический анализ структуры генов 16S
рРНК показал, что описываемые культуры P. ehimensis находятся в одном кластере при
высоких значениях «bootstrap-анализа» и, по всей видимости, ЦГТазная активность является
системно-типовым физиологическим признаком вида P. ehimensis.
Характерной особенностью ЦГТаз изученной выборки штаммов P .ehimensis являлся
необычный характер специфичности, не наблюдаемый у циклизующих ферментов бактерий
других видов. В частности, результатом увеличения удельной дозировки фермента по
отношению к субстрату (крахмалу), являлось смещение равновесия реакции в сторону
образования гамма-ЦД, не наблюдаемое ни с одним из известных типов ЦГТаз. Полученные
зависимости могут быть проиллюстрированы графиками, связывающими относительный
выход индивидуальных ЦД с удельной дозировкой ЦГТаз, представленными в
логарифмических координатах.
160
Рис. 2. Зависимость выхода различных ЦД от концентрации ЦГТаз P. ehimensis
Обнаружено, что ЦГТазы типовой культуры DSMZ 11029T и изолята IB-739 (равно
как и IB-G2P для которой график не представлен) имеют весьма схожие кинетические
характеристики. Нам представляется интересным не описанный ранее факт обнаружения
циклизующей активности у бактерий вида P. ehimensis, равно как и атипичное повышение
генерации гамма-ЦД по отношению к бета-ЦД в процессе ферментативной трансформации
крахмала при увеличении удельных дозировок ЦГТазы.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Усанов, Н. Г. Циклодекстрины: биотехнология и применение // «Биотехнология
биологически активных веществ». Москва, Издательство НПО «Элевар», 2006, C.
89-122.
Kuroshima, K. I. и др. Bacillus ehimensis sp. nov. and Bacillus chitinolyticus sp. nov., new
chitinolytic members of the genus Bacillus. // International Journal of Systematic
Bacteriology, 1996 – V. 46, №1. Р. 76–80.
Усанов, Н. Г., Логинов, О. Н., Мелентьев, А. И. Синтез циклодекстринглюканотрансфераз микроорганизмами, утилизирующими циклодекстрины в
качестве единственного источника углерода // Доклады АН СССР, 1989 – Т. 310,
№6. С.1489–1492.
Авторское свидетельство СССР № 1743019
Патент Российской Федерации № 2213773
Усанов, Н. Г. и др. Усовершенствованный метод фотометрического определения
активности циклодекстринглюканотрансферазы // Прикладная биохимия и
микробиология, 2007 – Т.43, №1. С. 118–124.
161
ПАТОГЕННАЯ НАГРУЗКА И ПРОДУКЦИЯ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ
ФЕРМЕНТОВ В КЛУБНЯХ КАРТОФЕЛЯ ПРИ ХРАНЕНИИ
А. В. Широков 1, Л. И. Пусенкова 1, Е. Ю. Лобастова 1, Т. С. Тропынина 2
1
2
ГНУ Башкирский НИИСХ Россельхозакадемии, Уфа, Россия
Учреждение РАН Институт биологии УНЦ РАН, Уфа, Россия
Актуальной проблемой современного сельского хозяйства является сохранность
выращенной продукции и семенного материала. Для картофельного хозяйства эта проблема
стоит особенно остро, т.к. во время хранения потери товарного продукта могут достигать 15–
25%.
Основными вредителями картофеля, поражающего вегетирующие растения и
формирующиеся клубни, являются патогенные микромицеты. Как показали результаты
исследований, патогенные грибы рода Fusarium являются наиболее распространенной
инфекцией. Они за счет комплекса гидролитических ферментов разрушают защитную
оболочку (кожуру) клубней, а также проникают внутрь через корневую систему растения.
Эффективным способом борьбы с патогенными и сапротрофными грибами является
использование биофунгицидов различного происхождения. Это могут быть живые клетки и
споры бактерий, а также их метаболиты. Применение биопрепаратов на основе
антагонистических бактерий (бацилл и псевдомонад) существенно снижает прессинг
патогенов в период вегетации и позволяет сохранить большую часть урожая.
Целью нашей работы является оценка биологической эффективности биопрепаратов
различных классов, таких как Альбит, Фитоспорин и других в подавлении комплекса
микромицетов, поражающих клубни картофеля при хранении, а также установление
корреляции между патогенной нагрузкой (количество грибов, колонизирующих внутренние
ткани и клубни растения) и уровнем синтеза гидролитических ферментов.
В результате проведенных экспериментов показано, что значительный уровень синтеза
гидролитических ферментов в клубнях картофеля при хранении соответствует высокой
патогенной нагрузке (до 107 КОЕ/г массы картофеля) микромицетов, колонизирующих
данные клубни. Кроме того, биологические препараты на основе живых клеток и спор
бактерий – Фитоспорин после контакта с пестицидами в баковых смесях оказываются менее
эффективными по сравнению с метаболитными препаратами (Альбит). Однократной
обработки биопрепаратами в течение полевого сезона оказывается недостаточно.
Следствием вышесказанного является необходимость разработки продуманной стратегии
применения биопрепаратов различных классов для борьбы с фитопатогенами.
162
О ПРИМЕНЕНИЕ КИНЕТИЧЕСКОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
ДЛЯ РАЗРАБОТКИ МЕТОДИК ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ГОРОДСКИХ ЭКОСИСТЕМ,
БОЛОТ, ИЗУЧЕНИЯ ЗООМИКРОБНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ
И ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ АГРЕГАТНОГО СОСТАВА
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ПОЧВ
А. В. Якушев
Факультет почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова, Москва, Россия
На современном этапе развития почвенной микробиологии достигнуты большие успехи
в определение таксономического состава микробных сообществ почв и почвоподобных
субстратов (классические методы посева почвенных суспензий на питательные среды,
современный молекулярно-генетические: создание библиотек клонов, денатурирующий
градиентный гель-электрофорез и т.д.). Тем не менее, проблема оценки физиологического
состояния и активности микроорганизмов не столь хорошо проработана. Следует
подчеркнуть, что именно от физиологического состояния микроорганизма, а не только от
количества зависит его вклад в микробиологические процессы, проводимые микробным
комплексом исследуемой почвы. Имеющиеся подходы, основанные на определение
ферментативной активности почв, на дифференцирующем окрашивание живых и мертвых
клеток микроорганизмов (красители Leaf-dead и т.д.) не дают достаточной информации о
физиологическом состояние различных групп микроорганизмов, поэтому необходимо
дальнейшее совершенствование методов исследования.
В основе предлагаемого метода лежит тот давно известный факт о том, что
продолжительность лаг-фазы микроорганизмов определяется не только параметрами
питательной среды и условиями инкубирования, но и предысторией культуры
микроорганизмов, отражающейся в физиологическом состоянии. Предполагается, чем
короче лаг-фаза роста микроорганизма в питательной среде, тем, с одной стороны, в более
активном состоянии находился организм в природной среде и тем больше, с другой стороны,
его ферментная система готова к потреблению органического субстрата, находящегося в
питательной среде. Последнее зависит от того потребляли этот органический субстрат
микроб в природе до того как попал на искусственную питательную среду. Суть метода
заключается в определении физиологического состояния микроорганизмов по кривой
начального роста (лаг-фаза и фаза нелимитированного роста) на жидких питательных средах.
Теоретическим основание для данного подхода является предложенный классиком
почвенной микробиологии С.Н. Виноградским метод спонтанной почвенной микробной
культуры, кинетический метод определения микробной биомассы в почве по С.Н. Паникову,
математическое описание роста заимствуется из синтетической хемостатной модель (СХМ),
163
упрощенной для описания лаг-фазы и фазы нелимитированного роста периодической
культуры микроорганизмов (Паников, 1991). Уравнение роста имеет вид:
х(t)=х0(1-r0+r0exp(µmt)),
где х – биомасса микроорганизмов (оптические единицы) в момент времени t (ч), х0 –
биомасса в начальный момент времени. µm-максимальная удельная скорость роста (ч-1), r0 –
переменная физиологического состояния микроорганизмов в нулевой момент времени, т.е. в
почве на момент проведения эксперимента. Увеличение численного значения r0
свидетельствует о большей активности микроорганизмов. Поскольку на жидких
питательных средах вырастали смешанные популяции, то получаемые параметры
получаются усредненными для всего сообщества, растущего на той или иной среде.
Технические реализация метода заключается во внесении почвенной суспензии
микроорганизмов (бактерий) в лунки 96-луночной планшеты для иммунологических тестов,
содержащий набор питательных сред, с последующей инкубацией в течение определенного
времени (до 250 часов). Поскольку регистрация роста проводится оптическим методом,
применимом только для бактерий, подавление роста грибов достигается внесением
нистатина в исходную почвенную суспензию. Регистрация роста проводится в
автоматическом режиме в динамике на иммуноферментном анализаторе Sunrise фирмы
Tecan. Органические субстраты для выращивания микроорганизмов подбираются по их
функциональной значимости для микробного сообщества. Это распространенные
биополимеры: крахмал, целлюлоза, хитин, казеин, пектин, ксилан, твин 20, мономеры –
сахара, аминокислоты, так же некоторые органические кислоты; список субстратов
определяется конкретными задачами эксперимента.
Для апробации метода были поставлены следующие задачи и выбраны следующие
объекты: 1)Установить физиологическое состояние бактерий и их готовность потреблять
биополимеры в верховых торфах в сравнение с низинными. 2) Проследить изменение,
активности бактерий – полимероразлагателей при пассаже их через пищеварительный тракт
дождевых червей Eisenia foetida andrei (Bouche, 1972) на основе анализа корма червей и
свежих копролитов 3) Исследовать различные типы хозяйственного использования
чернозема (пашня-лесополоса) на физиологическое состояние бактерий в различных
фракциях водопрочных агрегатов чернозема Курская обл. 4) Определить состояние бактерий
для оценки экологического состояния городских почв.
Результаты, полученные в ходе экспериментальной работы и частично представленные
на рисунке, свидетельствуют о том, что использование нового технологического метода
предполагает и иной уровень обработки данных, который основывается на методах
непараметрической статистики, так как распределение частот встречаемости значений в
пределах выборки не подчиняется гаусовскому распределению. Поэтому для представления
результатов были применены медиана и квартили. Результаты носили закономерный не
164
случайный характер. Так для торфов отмечена четкая трофическая адаптация бактериального
блока к условиям среды. Для бактерий низинного торфа характерна готовность потреблять
растительный полимер крахмал. Для верхового – ацетат и пектин.
Физиологическое состояние бактерий, растущих на спектре органических субстратов (медиана,
квартили) в торфе (а), в различных фракциях водопрочных агрегатов курского чернозема (б, в).
Несмотря на снижение поступления растительных биополимеров под пашней бактерий
полимероразлагателей в агрегатах чернозема сохраняются в активном состояние (рисунок, б,
в). Зарегистрирована большая метаболическая готовность бактерий (выше r0) потреблять
большинство полимеров и мономеров во фракции <0.1 мм под лесополосой по сравнению с
аналогичной фракцией пашни. Возможно именно в эту фракцию поступает свежее
органическое вещество, доступное для микробного разложения.
При пассаже через пищеварительный тракт дождевых червей наблюдается резко
снижение готовности потреблять пектин, крахмал, глюкозу. Специфика в спектре
ассимиляции прослеживается и у городских почв по градиенту загрязнения от автодороги.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ № 08-04-00786-a, № 1004-00415, № 08-04-00656 и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной
России»
на
2009-2013
годы,
госконтракт
П1325
от
11
июня
2010г.
165
ПОЛУЧЕНИЕ МЕДИ ИЗ СЛОЖНОГО МЕДНОГО КОНЦЕНТРАТА
С ПОМОЩЬЮ ДВУХСТАДИЙНОГО БАКТЕРИАЛЬНО–ХИМИЧЕСКОГО
ВЫЩЕЛАЧИВАНИЯ
М. И. Муравьев, Н. В. Фомченко, Т. Ф. Кондратьева
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия
Традиционными способами переработки концентратов цветных металлов являются
пирометаллургические, включающие обжиг и плавку. При обжиге в атмосферу
выбрасывается диоксид серы, а при плавке – пыли и углекислый газ, являющийся
парниковым.
Биовыщелачивание (биоокисление) сульфидных концентратов и промпродуктов может
являться экологически чистой и перспективной альтернативой традиционным
пирометаллургическим процессам. При этом возможно также значительное снижение затрат
на процессы обогащения сульфидных руд, а также эффективная комбинация
пирометаллургических и биогидрометаллургических процессов.
Основным недостатком известных биогидрометаллургических технологий является их
низкая интенсивность при продолжительности выщелачивания металлов 5–10 суток в
зависимости от состава сырья. Поэтому интенсификация процесса биоокисления
сульфидного сырья цветных и благородных металлов является наиболее актуальной задачей.
На основании проведенных фундаментальных исследований в лаборатории
хемолитотрофных микроорганизмов ИНМИ РАН предложена новая технологическая
концепция биовыщелачивания сульфидного сырья. На основании этой концепции была
разработана двухстадийная технология бактериально-химического выщелачивания
сульфидных концентратов, промпродуктов и богатых руд цветных металлов.
Одним из видов перспективного сырья для переработки по предложенной технологии
являлся богатые сульфидно-окисленные медные концентраты.
Медные концентраты были получены флотационным обогащением сложной
сульфидно-окисленной руды месторождения Удокан и содержали 27–37% меди. В
настоящее время не имеется эффективной технологии переработки богатых медных
концентратов, так как их биовыщелачивание в традиционном одностадийном процессе не
осуществимо вследствие токсичности высоких концентраций ионов меди для применяемых в
подобных процессах микроорганизмов.
Двухстадийная технология выщелачивания концентратов цветных металлов основана
на сочетании первой стадии высокотемпературного химического выщелачивания
биораствором, содержащим трехвалентное железо, и стадии биоокисления продуктов
химического выщелачивания. При этом на первой стадии создаются условия,
интенсифицирующие процесс окисления сульфидных минералов и увеличивающие его
эффективность – повышенная температура, высокое содержание твердой фазы в суспензии,
низкие значения pH. На стадии последующего биоокисления суспензии создаются условия
170
для эффективного окисления двухвалентного железа в жидкой фазе и элементной серы,
образующихся на первой стадии, а также доокисления сульфидных минералов. При этом
задается температура, оптимальная для бактерий, а также более высокие значения pH и
низкое содержание твердой фазы в суспензии. Это обеспечивает на стадии биоокисления
относительно низкие концентрации токсичных для микроорганизмов ионов меди.
Так как в состав используемых медных концентратов входили в значительном
количестве окисленные минералы меди (брошантит и малахит), а также кислоторастворимые
минералы пустой породы (кальцит и др.), то перед предлагаемым двухстадийным процессом
биовыщелачивания введена стадия сернокислотной обработки концентратов. Первая серия
исследований проводилась в периодическом режиме на концентрате с содержанием меди
37,4 %.
Изучено влияние значениий pH суспензии на интенсивность и эффективность
извлечения меди в раствор при сернокислотной обработке в периодическом режиме.
Показано, что наилучшим являлся режим кислотной обработки при pH 1,2,
характеризующийся достаточно глубоким извлечением меди в раствор с высокой скоростью
выщелачивания (1,38 г/л∙час) и умеренным расходом серной кислоты (313 г/кг моногидрата).
Обработка медного концентрата в данных условиях позволяла выщелочить свыше 40% меди
в течение 22 часов, причем основное количество меди растворялось в течение первых 4-х
часов.
Изучено влияние режимов кислотной обработки концентрата на эффективность его
последующего химического выщелачивания в периодических условиях. Химическое
выщелачивание проводилось циклически биораствором, содержащим трезвалентное железо
в концентрации около 30 г/л, при температуре 80°С и содержании в твердого в суспензии
9%. Наиболее благоприятным продуктом для химического выщелачивания являлся
концентрат, обработанный при pH 1,2, общее извлечение меди в раствор из которого
составило 94,5% после 7 часов выщелачивания при конечном содержании меди в осадке
3,0%. Средняя удельная скорость выщелачивания меди в первые два часа процесса составила
77 и 43 г/кг∙час в первом и втором циклах соответственно. Кроме того, не наблюдалось
выпадения основного окислителя сульфидных минералов – трехвалентного железа – в
осадок.
Биоокисление полученного осадка в присутствии 17 г/л двухвалентного железа в
жидкой фазе при использовании умеренно-термофильной ассоциации микроорганизмов
(40°С) в периодическом режиме в течение 7 суток снижало содержание меди в осадке до
1,41%. При этом средняя удельная скорость выщелачивания меди с первых по третьи сутки
процесса составила 0,14 г/кг∙час, а скорость накопления ионов трехвалентного железа в среде
в логарифмической фазе – 1.0 г/л∙час. Общее извлечение меди по двухстадийной технологии
составило 98,0 %.
Испытания по двухстадийному выщелачиванию в полунепрерывном режиме проводили
на опытной установке на концентрате, содержащем 27,0 % меди. Установка включала
реактор химического выщелачивания с объемом суспензии в нем 0,68 л, вертикальный
отстойник объемом 3 л и биореактор объемом 22 л с системой аэрации.
Продолжительность выщелачивания составляла 20 часов при протоке суспензии через
биореактор от 2,1 до 1,2 л/ч. Содержание твердой фазы в суспензии на стадии химического
171
выщелачивания составляло 33% при концентрации Fe3+ на входе около 10 г/л. Биоокисление
проводилось при температуре 40°С при использовании умеренно-термофильной ассоциации
микроорганизмов. Показано, что исследуемая культура способна активно расти в
присутствии 5 г/л ионов меди в среде 9К с кукурузным экстрактом, окисляя двухвалентное
железо со скоростью до 0,4 г/л·ч.
В процессе испытаний были получены следующие экспериментальные данные.
Конечная концентрация меди в биореакторе составила 3,8 г/л. Всего выщелочено меди из
концентрата – 83,6 г при общем количестве меди в исходном концентрате 91,6 г. Выход
твердой фазы из аппарата на первой стадии составил 29,4% при содержании в нем меди
7,7%. Потери меди с этим продуктом составили 8,4 %. Выход твердой фазы из второй стадии
процесса составил около 20% при содержании в нем меди 2.1%. Потери меди с этим
продуктом составили 1.55%. Таким образом, в процессе выщелачивания растворилось около
50% исходного концентрата. Общее извлечение меди в раствор за 20 часов составило
90.05%.
Таким образом, показана принципиальная возможность эффективного извлечения меди
из сложного богатого медного концентрата Удоканского месторожения с применением
двухстадийного бактериально-химического выщелачивания.
172
СОЗДАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОГО КОНСОРЦИУМА,
СПОСОБНОГО МЕТАБОЛИЗИРОВАТЬ ГЛИФОСАТ
И СТИМУЛИРОВАТЬ РОСТ РАСТЕНИЙ.
Е. В. Крючкова, Г. Л. Бурыгин, Е. Е.Фёдоров
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН,
Саратов, Россия
Глифосат широко применяемый во всем мире фосфорорганический гербицид. Наличие
большого количества трансгенных устойчивых к глифосату сельскохозяйственных культур
позволяет многократно использовать его без ущерба для урожая. В процессе применения
гербицид неизбежно попадает в почву. Между тем рядом исследователей показано, что
присутствие глифосата в почвенном профиле влияет на состав микробных сообществ. В
частности, отмечен всплеск фитопатогенных грибов и уменьшение численности некоторых
групп бактерий [1–3].
В последнее время в мире большое внимание уделяется биологическим способам
очистки и восстановления загрязнённых почв. Перспективными в этом отношении показали
себя бактерии, сочетающие свойства деградации ксенобиотиков и стимулирования роста и
развития растений. Их интродукция в места загрязнений позволяет одновременно снизить
токсическую нагрузку почвы, уменьшить численность фитопатогенных грибов и обеспечить
растения дополнительными источниками питания [4].
В настоящем исследовании мы попытались создать бактериальный консорциум,
состоящий из штаммов Acinetobacter sp. K7 и Azospirillum brasilense Sp245. Штамм
Acinetobacter sp.K7 выделен нами с ризопланы топинамбура и частично охарактеризован. Он
обладает высокой деструктивной активностью в отношении глифосата и стимулирует рост
растений [5]. Бактерии рода Azospirillum хорошо зарекомендовали себя в многочисленных
полевых исследованиях, демонстрируя положительный эффект на растения, независимо от
климатических условий и типа почвы [4].
Данный этап работы заключался в выяснении способности исследуемых штаммов
использовать глифосат в качестве источника фосфора, не ингибируя рост друг друга при
совместном культивировании, а также проявлять активность в отношении растений.
Бактерии выращивали на безфосфорной модифицированной синтетической среде (МС)
[6] с добавлением витаминов. Источниками углерода являлись глутамат натрия и яблочная
кислота. Глифосат вносили в составе коммерческого препарата «Раундап» до конечной
концентрации в среде 3 мМ. Контролями служили культуры, выращенные на МС без
фосфора и с добавлением неорганического фосфата (Р). Учёт численности и качественное
определение бактерий в консорциуме определяли методом ИФА с помощью
штаммспецифичных антител. Примеси в среде культивирования неорганического фосфора
анализировали общепринятым методом Морфи и Райли [7]. Инокуляцию поверхностно
стерилизованных растений подсолнечника производили бактериальными суспензиями
каждого штамма и их смесью в концентрации 1´108 кл/мл.
173
На рис. 1 приведены кривые роста бактерий на МС с глифосатом. Наиболее слабый
рост отмечен для штамма А. brasilense Sp245.
0,8
1
2
0,7
ОП660 нм
0,6
0,5
0,4
3
0,3
0,2
0,1
0
0
1
2
3
4
5
Время, сутки
Рис. 1. Кривые роста исследуемых штаммов на безфосфорной МС с добавлением 3 мМ
глифосата; 1 - Acinetobacter sp. K7, 2 - консорциум штаммов, 3 - Azospirillum brasilense sp245.
Иммуноферментный анализ бактериальной суспензии консорциума (МС + Р) показал
наличие обоих штаммов примерно в равном соотношении друг к другу: А. brasilense Sp245 –
6,41×109 кл/мл и Acinetobacter sp. K7 – 6,38×109 кл/мл. В варианте с добавлением в МС
глифосата на вторые сутки роста доминирующим стал штамм Acinetobacter sp. K7 – 1,6×109
кл/мл по сравнению с А. brasilense Sp245 – 3,99×108 кл/мл. Вероятно это связано с более
долгой лаг-фазой и низкой скоростью роста на глифосате штамма А. brasilense Sp245.
Поскольку количество клеток азоспирилл в МС с глифосатом в консорциуме (3,99×108
кл/мл) и при отдельном культивировании (0,5×108 кл/мл) примерно одинаковое, мы
связываем это с токсическим действием гербицида и исключаем ингибирующее влияние
бактерий Acinetobacter sp. K7.
Отсутствие примесей фосфатов в культуральной жидкости позволяет нам делать
вывод о том, что рост бактерий связан с деструкцией гербицида и использованием его в
качестве источника Р. На безфосфорной среде не было зафиксировано роста ни у одного из
исследованных бактериальных штаммов в течение 6 суток.
Нами отмечен положительный эффект от инокуляции проростков подсолнечника
консорциумом (рис. 2). У инокулированных проростков длина корня на 35 % превысила
контроль и наблюдалось более интенсивное развитие боковых корней по сравнению с
другими вариантами. Значения сырой массы контрольных и инокулированных (4 вариант)
проростков отличались на 19 %, а сухая масса инокулированных растений превышала
контрольную на 3 %.
174
1
2
3
4
Рис. 2. Влияние бактериальной инокуляции на морфометрические показатели растений
подсолнечника. Возраст растений 5 суток. 1 - контроль без инокуляции; далее
инокулированные растения 2 - Acinetobacter sp. K7, 3 - А. brasilense sp245, 4 - консорциум
Таким образом, создан консорциум из ризосферных бактерий, способных к
совместному росту на глифосате и стимулирующими рост растений.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Araujo A.S., Monteiro R.T., Abarkeli R.B. Effect of glyphosate on the microbial activity of
two Brazillian soils // Chemosphere – 2009 – Vol. 52, № 5. - P. 799 – 804.
Kremer R.J., Means N.E., Kim S. Glyphosate affects soybean root exudation and rhizosphere
microorganisms // Int. J. Environ. Anal. Chem. – 2005. - Vol. 85, № 15. - P. 1165 –
1174.
Lancaster S.H. et. al. Effect of repeated glyphosate application on soil microbial community
composition and the mineralization of glyphosate // Pest. Manag. Sci. - 2010. - Vol.52,
№ 5. - P. 799 – 804
Somers E., Vanderleyden J. Rhizosphere bacterial signalling: a love parade beneath our feet //
Crit. Rev. Microbiol. - 2004. - Vol. 30. - P. 205 – 240.
Крючкова Е.В. и др. Метаболизм глифосата ризосферным штаммом Acinetobacter sp. K7
// Сб. тез. V Молод. школа-конф. с межд. участ. «Актуальные аспекты
современной микробиологии». 2009. – С. 34-35.
Ермакова И.Т., Шушкова Т.В., Леонтьевский А.А. Микробная деградация
органофосфонатов почвенными бактериями // Микробиология. - 2008. – Т. 77, №
5. - С. 689 — 695.
Morphy J. and Riley J.P. Modified single solution method for the determination of phosphate
in natural waters // Anal. Chim. Acta. - 1962. - Vol. 27, № 1. - P. 31-36.
175
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ЭЛЕКТРООПТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА КЛЕТОЧНЫХ
СУСПЕНЗИЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ
О. И. Гулий, О. А. Караваева, О. В. Игнатов
Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии растений
и микроорганизмов РАН, Саратов
Препараты бактериофагов имеют большие возможности для использования в качестве
антибактериальной терапии. Первый известный науке отчет об успешной фаготерапии был
сделан в 1921 г. Брийонгом и Майсином, при использовании стафилококкового бактериофага
для лечения заразных болезней кожи. В 20-е годы фаги активно использовались при лечении
различных заболеваний, однако в 40-е годы они были потеснены антибиотиками. В
настоящее время интерес к фагам появился вновь в связи с увеличением числа устойчивых к
антибиотикам микроорганизмов. Основным условием успешного применения бактериофагов
является чувствительность возбудителя к соответствующему фагу. Процедура определения
фагочувствительности культуры клеток достаточно длительна, поэтому создание метода
экспрессного анализа чувствительности микробных клеток к используемому бактериофагу
является чрезвычайно важным. Ранее нами было показано, что в результате действия
бактериофага на чувствительные к нему микробы наблюдаются изменения
электрооптических (ЭО) параметров суспензий клеток. Механизм воздействия
бактериофагов на микробные клетки обусловлен адсорбцией фага на клеточной поверхности,
последующим проникновением фага в клетку, размножением бактериофагов, разрывом
оболочки клетки и выходом фага из клетки. Изменение морфологии клеток и нарушения
клеточной стенки у чувствительных к бактериофагу микроорганизмов приводят к изменению
их электрофизических (ЭФ) свойств. Мы предположили, что изменение ЭО параметров
клеточных суспензий при их инфекции бактериофагами может быть использовано для
оценки чувствительности исследуемых клеток к бактериофагу. Целью данной работы
являлось изучение возможности использования ЭО анализа клеточных суспензий для
определения чувствительности или устойчивости микробных клеток E. coli к фаговой
инфекции.
Изучены изменения ЭФ свойств клеточных суспензии E. coli XL-1, E. coli BL-Ril, E.
сoli TG-1 и E.coli BL-21 (DE) при их инфекции бактериофагом М13К07 с помощью метода
электрооптического анализа клеточных суспензий. ЭФ свойства клеток оценивали по
ориентационным спектрам клеточных суспензий - зависимостям изменений оптической
плотности, обусловленных электроориентацией клеток, от частоты ориентирующего поля в
интервале 740, 1000 1450, 2000 и 2800 кГц. В результате проведенных исследований было
показано, что специфические изменения ЭФ свойств клеточных суспензий под действием
фага М13К07 происходят только у микробных клеток E. coli штаммов TG-1 и XL-1, у
суспензий клеток E. coli BL-Ril и E. сoli BL-21 (DE) значительных изменений ЭФ свойств
под действием фага не происходит. Полученные результаты подтверждены в контрольных
экспериментах инфицирования клеток бактериофагом с помощью стандартных методов
высева клеток исследуемых штаммов на плотные питательные среды. Таким образом,
показана возможность использования метода ЭО анализа клеточных суспензий для
176
определения устойчивости микробных клеток по отношению к бактериофагам.
Традиционные микробиологические методы определения фагочувствительности микробных
клеток путем анализа фагов по способности развиваться на газоне тесторных бактерий
длительны и трудоемки, поэтому использование метода ЭО анализа клеточных суспензий
для оперативного решения данного вопроса имеет большие перспективы.
Работа была частично поддержана грантом РФФИ №09-02-12442-офи_м.
177
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИФРАКРАСНОЙ ЭМИССИОННОЙ
ФУРЬЕ–СПЕКТРОСКОПИИ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
ПО ЛИПИДНЫМ КОМПОНЕНТАМ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН
С. Е. Терпугова1, Д. И. Никитин2, В. В. Савранский1, Е. Л. Терпугов3
1
Центр естественно-научных исследований Института общей физики им. А.М. Прохорова
РАН, Москва, Россия
2
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия
3
Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Россия
Как известно, цитоплазматическая мембрана бактерий содержит большое количество
протеинов (50–70%) и липидов (15–30%). Липидный состав мембран непостоянен в
качественном и количественном отношении. У одного и того же вида бактерий он
изменяется в зависимости от условий ее культивирования на питательной среде и возраста
культуры. Разные виды бактерий также отличаются друг от друга по липидному составу
своих мембран. Поэтому очень важным представляется возможность идентификации и
прижизненного контроля липидного состава бактерий с помощью чувствительного метода.
В исследованиях клеток микроорганизмов и их составляющих активно используются
спектроскопические методы, среди которых наиболее важными являются инфракрасное (ИК)
поглощение и комбинационное рассеяние света (КР). Спектры КР и ИК-поглощения
являются самой детальной характеристикой химического соединения. Однако в сложных
системах использование данных методов зачастую затруднено из-за сильного влияния
растворителя или фона, сильно снижающих их разрешающую способность.
Данная работа посвящена исследованию возможности применения нового
высокочувствительного и избирательного метода эмиссионной инфракрасной ИК-Фурье
спектроскопии для изучения состава клеточных мембран бактерий.
В работе использовались бактерии Arc (Arcocella aquatica), Deinococ (Deinococcus
radiodurans), H-160 (Hyphomicrobium vulgare), Vp-2 (Hyphomonas jannaschiana) и Cydobacter
(Cyclobacterium marinus) и набор модельных липидов, синтезированных в ИБХ им. Баха.
Спектральные измерения проводились на основе ИК-Фурье спектрофотометра ФС-02
(Россия) с использованием охлаждаемого МСТ приемника в отсутствие стандартного ИК источника (детали см. в [1]).
Кратко, метод основан на возбуждении с помощью низкоинтенсивного (менее 1Вт)
полихроматического света вторичного ИК-излучения в образце, которое регистрируется в
виде спектров ИК-эмиссии, имеющих высокое спектральное разрешение. В регистрируемом
ИК-отклике содержится важная информация о структуре и свойствах исследуемых молекул.
При этом отклик является специфичным по отношению к молекулярной группе или
отдельной компоненте сложной смеси. Такая специфичность достигается выбором длины
волны возбуждающего света, которая обеспечивает соответствующее усиление сигнала от
выбранной компоненты.
В данной работе проведено измерение спектров ИК-эмиссии образцов при широком
варьировании спектрального состава и мощности возбуждающего света. Определены
условия, при котором в регистрируемых спектрах максимально проявляются полосы,
178
относящиеся к липидным группам. В этих условиях проведены сравнительные исследования
разных образцов бактериальных клеток и модельных соединений липидов. Показано, что
независимо от содержания хромофора в плазматической мембране при воздействии
видимого света бактерии генерируют достаточно интенсивный ИК-сигнал. При этом
установлено, что интенсивность и вид спектров исследованных видов бактерий, так же как
набор спектральных линий сильно различаются между собой (в качестве примера см.
рисунок).
Спектры ИК-эмиссии бактерий Arc (Arcocella aquatica), Deinococ (Deinococcus radiodurans),
H-160 (Hyphomicrobium vulgare), Vp-2 (Hyphomonas jannaschiana) и Cydobacter
(Cyclobacterium marinus) представлены в диапазоне 3000–500 см-1 без вычета базовой линии.
Спектры записаны при комнатной температуре с использованием возбуждающего видимого
света в диапазоне 340–480 нм мощностью 320 мВт.
179
Сопоставление спектров с литературными данными, а также со спектрами ИКпоглощения и ИК-эмиссии модельных соединений показало, что большинство полос в
наблюдаемых спектрах может быть идентифицировано. Среди наблюдаемых спектральных
линий в спектрах ИК-эмиссии бактерий видов Arcocella aquatica, Deinococcus radiodurans,
Hyphomicrobium vulgare, Hyphomonas jannaschiana и Cyclobacterium marinu обнаружены
липидные полосы, принадлежащих разным группам липидов, которые отражают
существующее разнообразие в составе липидов у данных видов.
Коллектив авторов выражает огромную благодарность С.Г. Батракову за
предоставленные образцы липидов.
1.
Терпугов Е.Л., Дегтярева О.В. Биохимия, 66 (2001) 1315.
180
АЛФАВИТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ ИМЕН
Григориади А.С. 133
Григорьева Н.В. 113
Гулий О.И. 176
А
Автух А.Н. 3
Алехина И. А. 102, 123
Алешкевич И.И. 30
Алещенкова З.М. 70
Ананьина Л.Н. 152
Анисимова Л.Г. 93
Арискина Е.В. 3, 152
Д
Даминова А.Г. 73
Демкина Е.В. 108
Джур С.В. 11, 22
Долгих Н.П. 14
Дорофеева Л.В. 154
Думова В.А. 14
Дьяконова А.Т. 41
Дядькина А.С. 17, 131
Б
Бабич Т.Л. 116
Багаутдинова Б.Ф. 133
Багаутдинова Г.Г. 126
Баринова А.А. 135
Барышникова Л.М. 3
Батыр Л.М. 22
Белова С.Э. 119
Беляев С.С. 116
Бивол Ч.М. 22
Блинков Е.А. 128
Бойко А.С. 4, 28, 77
Бонч-Осмоловская Е.А. 54
Брюханов А.Л. 33
Булаев А.Г. 94
Булат С. А. 102, 123
Бурыгин Г.Л. 88, 173
Буторова О.П. 97
Е
ЕвтушенковА.Н. 86
Егорова Д. В. 99
Егорова М.А. 20
Еленчук Д.И. 22
Еренко Л.Н. 97
Ефремова Н.В. 22
Ж
Жарикова Н.В. 93
Журавлева А.Е. 20
Журенко Е.Ю. 93
Журина М.В. 75
З
Забудченко О.В. 97
Захарова Е.Е. 33, 99
Захарюк А. Г. 99
Зеленкова Н.Ф. 3
Зосим Л.С. 22
В
Васина Е.В. 7
Веремей Э.И. 155
Ветчинкина Е.П. 9
Винокурова Н.Г. 3
Г
Гамьян А. 25
Гильванова Е.А. 159
Гоголев Ю.В. 46, 73
Головнева Н.А. 90
Горшков В.Ю. 73
Горяева Н.А. 17, 131
И
Ибатуллин Р.Р. 116
Иванов М.В. 116
Иванов Р.С. 24
Иванова Т. И. 110
Ивойлов В.С. 116
181
Линькова Ю.В. 41
Литти Ю.В. 113
Лобастова Е.Ю. 162
Ломако Ю.В. 155
М
Максимов А.Ю. 14, 147
Малошицкая О.А. 152
Манучарова Н.А. 108
Маракаев О.А. 51
Маркушева Т.В. 93
Микулинская Г.В. 79
Миллер А.А. 96
Минайчева П.Р. 43
Моммаева М.С. 46
Морозова А.Н. 48
Мубаракшина Л.Ф. 149
Муравьев М.И. 170
Мухамедова Л.Н. 46
Игнатов В.В. 4, 28, 77
Игнатов О.В. 176
Ижик А.В. 25
К
Каневский М.В. 28
Кантерова А.В. 30
Караваева О.А. 176
Карлов Д. С. 102
Карначук О. В. 97
Картыжова Л.Е. 7, 70
Кизилова А. К. 33, 105
Кирияк Т.В. 22
Кирсанова Л.А. 32
Китова А.Е. 43, 135
Козлова А.В. 97
Коломиец Э.И. 155
Колосовская М.С. 155
Колупаев А.В. 138
Кондакова Т.В. 75
Кондратьева Т.Ф. 94, 170
Коннова А.С. 77
Коннова С.А. 4, 28
Корнеева В.А. 33
Коробов В.В. 93
Косолапов Д.Б. 59
Котова И.Б. 41
Кофиади И.А. 114
Кравченко И. К. 33, 105
Круглов Ю.В. 15
Крючкова Е.В. 173
Кряжевских Н.А. 108
Кубланов И.В. 54
Кузьмина Н.П. 110
Куликова И.А. 41
Куличевская И.С. 113
Купряшина М.А. 36
Н
Назина Т.Н. 116
Некрасова В.К. 113
Нетрусов А.И. 41
Неустроева А.Н. 147
Никитин Д.И. 178
Никитина В.Е. 9, 36
Новаковская И.В. 82
Новик Г.И. 25, 30, 67
Ножевникова А.Н. 113
Норманн Ф. 123
О
Октябрьский О.Н. 61
Олан О.П. 22
Осипов Г.А. 51
Осмоловский А.А. 145
П
Павлова Н.К. 116
Павлова Ю.А. 147
Пасцяк М. 25
Патыка Н.В. 15
Первушина К.А. 51
Л
Лаврентьева Е.В. 54
Левенец О.О. 140
Леляк А.А. 38, 143
Леляк А.И. 38, 143
182
Терпугов Е.Л. 178
Терпугова С.Е. 178
Тетеря Н. 22
Титова Л. В. 104
Томашевская Л.Г. 43, 135
Тропынина Т.С. 162
Тульская Е.М. 3
Перушкина Е.В. 149
Пети Ж-Р. 123
Петрова О.Е. 73
Пивоварова Т.А. 94
Пименов Н.В. 33
Подосокорская О.А. 54
Поздина С.Ю. 135
Полтараус А.Б. 116
Присяжная Н.В. 152, 154
Проскурнина И.А. 155
Пусенкова Л.И. 162
У
Усанов Н.Г. 64, 159
Усова О.Н. 158
Ф
Федоненко Ю.П. 4
Федоренчик А.А. 84
Федоров Е.Е. 173
Федорова П.Ю. 159
Федотова А.В. 119
Фомченко Н.В. 170
Фролкова К.С. 14
Р
Раднагуруева А.А. 56
Решетилов А.Н. 43, 135
Рогатых С.В. 114
Романовская Т.В. 155
Румянцева Е.В. 59
С
Савранский В.В. 178
Садыкова З.О. 149
Самойлова З.Ю. 61
Сапунова Л.И. 86
Сверчкова Н.В. 155
Селиванов Н.Ю. 36
Семенова Е.А. 64
Семенова И.В. 66
Сидоренко А.В. 67
Сироткин А.С. 149
Смирнова Г.В. 61
Соколова Д.Ш. 116
Соловьева Е.А. 70
Сорокина Ю.В. 73
Стрелкова Е.А. 75
Суворова Е.В. 75
Суркина А.К. 4, 77
Х
Хайнасова Т.С. 121
Хасанова Л.М. 149
Хисаметдинов М.Р. 116
Холмогоров С.В. 51
Хусаинов И.Ш. 73
Ц
Цаплина И.А. 20
Ч
Чувочина М. С. 102, 123
Чхенкели В.А. 17, 131
Ш
Шашков А.С. 3
Шестакова Н.М. 116
Шеховцова Н.В. 51, 59
Широких А.А. 138
Широких И.Г. 138
Широков А.В. 162
Шляхотко Е.А. 86
Т
Таран С.А. 79
Тарасова Н.Б. 46
Татаркин Ю.В. 116
Темралеева А.Д. 82
183
Штерншис М.В. 158
Шувалова Э.В. 88
Щ
Щетко В.А. 90
Я
Якушев А.В. 163
Ясаков Т.Р. 93
184
СОДЕРЖАНИЕ
СЕКЦИЯ I
РАЗНООБРАЗИЕ И ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ …….…………….....… 3
СЕКЦИЯ II
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭКОЛОГИЯ И ГЕОХИМИЧЕСКАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ
МИКРООРГАНИЗМОВ………………………………………………………………..…..… 94
СЕКЦИЯ III
ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ МИКРОБНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ…….... 126
УКАЗАТЕЛЬ ИМЕН……………………………………………………………….……..… 181
185