ферменты - Amazon Web Services
реклама
Ферменты_29_11_2011.doc 2.1 MB РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ Е.В. ЛУКАШЕВА, Н.Н. ЧЕРНОВ, Е.А.РЫСКИНА ФЕРМЕНТЫ Учебно-методическое пособие для студентов медицинского факультета Москва, 2011 Утверждено РИС Ученого совета Медицинского факультета РУДН УДК Лукашева Е.В., Чернов Н.Н., Рыскина Е.А. Ферменты Учебно-методическое пособие – М.: ___________________________________ Учебно-методическое пособие предназначено для студентов, клинических ординаторов и аспирантов медицинского факультета. Задача пособия - оказать помощь в овладении весьма сложным материалом курса «Биохимия». При подготовке пособия большое внимание было уделено строению и свойствам ферментов, кинетике ферментативных реакций и путям их регуляции. Использование пособия облегчит студентам освоение основного курса биохимии. Пособие включает краткий теоретический материал, а также тесты для контроля знаний студентов, которые позволят повысить внимание студентов, оттенить наиболее важные моменты изучаемой темы. В конце пособия имеется список использованной литературы, важной для более глубокого изучения заинтересовавших читателей вопросов. Хочется верить, что предлагаемое учебное пособие поможет студентам успешнее освоить материал и лучше сдать экзамены. СОДЕРЖАНИЕ: СОДЕРЖАНИЕ: 3 1. Понятие о ферментах 4 2. Строение ферментов 4 3. Измерение ферментативной активности 7 4. Свойства ферментов 8 4.1. Механизм действия 8 4.2. Специфичность действия 8 4.3. Термолабильность 11 4.4. Зависимость скорости реакции от температуры 11 4.5. Зависимость скорости реакции от рН 11 5. Кинетика ферментативных реакций 13 6. Ингибирование ферментов 16 7. Классификация ферментов 20 8. Внутриклеточная регуляция ферментативной активности 23 9. Использование ферментов в медицине 28 10. Вопросы в тестах 32 Список литературы 40 1. Понятие о ферментах Ферментами (энзимами) называют растворимые или связанные с мембранами белки, наделенные каталитической активностью. (Кроме белков каталитическую активность в организме могут проявлять некоторые РНК (рибозимы) и антитела (абзимы), однако они в тысячи раз менее эффективны, чем ферменты.) Эти названия произошли от латинского «fermentatio» - брожение и греческого «en zym» - внутри закваски. Они напоминают о первых источниках ферментов. Биохимии, которая изучает ферменты, называется энзимология. На схемах и в уравнениях реакций молекулы ферментов обозначают - Е. Вещества, превращения которых катализируют ферменты, называют субстратами (S). Продукты энзиматической реакции обозначают - Р. Так как ферменты являются белками, их получают в гомогенном виде теми же способами, что и другие белки. Для ферментов характерны физикохимические свойства, присущие белкам. Отличие ферментов от неорганических катализаторов: а) ускоряют реакции значительно эффективнее; б) наделены высокой специфичностью действия; в) подвергаются регуляции в физиологических условиях; г) действуют в мягких условиях. 2. Строение ферментов Ферментами могут являться как простые, так и сложные (конъюгированные) белки, в состав которых могут входить липиды, углеводы, ионы металлов, азотистые основания, производные витаминов. В организме ферменты могут функционировать как в растворимом состоянии, так и в виде нерастворимых комплексов или входить в состав биологических мембран. Отличительной особенностью ферментов является наличие активного центра. Активный центр - это уникальная комбинация сближенных в пространстве аминокислотных остатков, которая обеспечивает: а) узнавание молекулы субстрата, б) связывание субстрата с ферментом, в) осуществление каталитического превращения (в случае сложного фермента в акте катализа также принимает участие кофермент, входящий в состав активного центра). Активный центр возникает в тот момент, когда белок сворачивается и принимает свою нативную (активную) конформацию. Структура активного центра может изменятся при взаимодействии с субстратом. По образному выражению Д. Кошланда субстрат подходит к активному центру как рука к перчатке. Одна молекула фермента, особенно если она состоит из нескольких субъединиц, может содержать более одного активного центра. В активном центре имеются два участка. Первый участок отвечает за узнавание и связывание субстрата. Он называется субстратсвязывающим участком или якорной площадкой. Второй участок называется каталитическим, в его состав входят аминокислотные остатки, принимающие участие в акте катализа. Ферменты представляют белки, сильно различающиеся по молекулярной массе и сложности строения. Примером фермента с небольшой молекулой является рибонуклеаза, состоящая из одной субъединицы с молекулярной массой 13700 Дa. (У рибонуклеазы определена аминокислотная последовательность. В 1969 г. рибонуклеаза была синтезирована в лаборатории Б.Меррифилда в Нью-Йорке.) Многие ферменты состоят из нескольких субъединиц, например, лактатдегидрогеназа состоит из четырех субъединиц двух видов. К настоящему времени известно несколько мультиферментных комплексов, состоящих из десятков различных субъединиц и нескольких типов коферментов. Например, пируватдегидрогеназный комплекс состоит из 60 субъединиц трех типов и пяти типов кофакторов. Молекулярная масса такого комплекса составляет 2,3*106 - 10*106 Дa в зависимости от источника фермента. Молекула фермента может быть меньше, чем молекула субстрата. Например: молекулы ферментов амилазы и рибонуклеазы меньше, чем молекулы их субстратов – крахмала и РНК. Белковая часть сложных ферментов каталитически неактивна и называется апоферментом. Связывание апофермента с небелковым компонентом приводит к образованию каталитически активного фермента (холофермента): Àïîôåðìåíò + Êîôåðìåíò → Õîëîôåðìåí ò (íåàêòèâíûé ) (àêòèâíûé ) (àêòèâíûé ) Многие ферменты содержат в своем составе ион металла, который может выполнять различные функции: ) участвовать в связывании субстрата и процессе его каталитического превращения; ) способствовать присоединению кофермента к молекуле фермента; ) стабилизировать третичную структуру фермента (например Са2+ в амилазе); ) связываясь с субстратом, образовывать истинный субстрат, на который действует фермент. Многие коферменты являются производными витаминов, поэтому нарушение обмена веществ при витаминной недостаточности обусловлено снижением активности определенных ферментов. Некоторые ферменты наряду с активным центром содержат аллостерический (регуляторный) центр - участок белковой глобулы, вне активного центра, где могут связываться вещества, регулирующие ферментативную активность. Эти вещества называют аллостерическими эффекторами (аллостерическими активаторами или ингибиторами). В результате связывания эффектора с аллостерическим центром происходит изменение структуры белка, приводящее к изменению пространственного расположения аминокислотных остатков в активном центре и, в итоге, к изменению ферментативной активности. Ферменты, встречающиеся в одном организме и катализирующие одну и ту же химическую реакцию, но с различной первичной структурой белка, называются изоферментами. Изоферменты отличаются друг от друга по таким физико-химическим свойствам, как молекулярная масса, термостабильность, субстратная специфичность, электрофоретическая подвижность. Природа появления изоферментов разнообразна, но чаще всего обусловлена различиями в структуре генов, кодирующих эти изоферменты или их субъединицы. Например, фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ), катализирующая обратимую реакцию окисления лактата до пирувата, имеет четыре субъединицы двух типов М и Н, комбинация этих субъединиц лежит в основе формирования пяти изоферментов ЛДГ (рис.1). Для диагностики заболеваний сердца и печени необходимо исследование изоферментного спектра ЛДГ в сыворотке крови, поскольку ЛДГ1 и ЛДГ2 активны в сердечной мышце и почках, а ЛДГ4 и ЛДГ5 - а скелетных мышцах и печени. Рис.1 Строение различных изоферментов ЛДГ. 3. Измерение ферментативной активности Определение активности ферментов осуществляется путем измерения скорости катализируемых реакций. Скорость ферментативных реакций измеряют по убыли концентрации субстрата или увеличению концентрации продукта за единицу времени: v = -ΔСS/Δτ , v = ΔCP/Δτ , где ΔСS – изменение молярной концентрации субстрата (моль/л), ΔCP - изменение молярной концентрации продукта реакции (моль/л), Δτ - изменение времени (мин, сек). Кинетические исследования желательно проводить при насыщающей концентрации субстрата, в противном случае фермент не будет иметь возможность проявить максимальную активность. Единицы активности ферментов: Международная единица фермента (U) - это такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 минуту при температуре 25оС и оптимальном рН среды. В системе СИ единицей фермента является катал (кат) –это такое количество фермента, которое катализирует превращение одного моль субстрата за 1 секунду. Нетрудно подсчитать, что: 1 U = (1*10-6М)/60 с = 1,67*10-8 М с-1 = 1, 67 * 10-8кат = 16,7 нкат. Часто определяют удельную активность препаратов фермента делением активности навески препарата фермента, выраженной в (U), на массу навески в миллиграммах: Ауд = U/масса препарата (мг) При очистке ферментов удельная активность увеличивается. По возрастанию удельной активности можно судить об эффективности стадий очистки и чистоте ферментного препарата. Для оценки активности высокоочищенных, гомогенных препаратов ферментов делением числа международных единиц (U) фермента в образце на количество вещества фермента (мкмоль) в этом образце рассчитывают молярную активность (число оборотов). По физическому смыслу молярная активность - это число молекул субстрата, подвергающихся превращению на одной молекуле фермента за 1 минуту или за 1секунду. Например: для уреазы, ускоряющей гидролиз мочевины, молярная активность составляет 30000, трипсина - 102, глюкозоксидазы - 17000 циклов в секунду. 4. Свойства ферментов 4.1. Механизм действия. Ферменты не смещают равновесие катализируемых реакций в сторону образования продуктов, таким образом, константа равновесия реакции остается постоянной. Как и все катализаторы, ферменты лишь уменьшают время достижения этого равновесия. В большинстве случаев ферменты ускоряют реакции в 107 1014 раз. В основе эффективности ферментативного катализа лежит сильное снижение энергии активации реакции за счет превращения субстрата в продукт через переходные состояния. 4.2. Специфичность действия. Специфичность связывания с субстратом и пути протекания ферментативной реакции определяются апоферментом. Специфичность действия ферментов определяет направленный обмен веществ в организме. О ферментах говорят, что они имеют узкую субстратную специфичность, если они действуют на очень небольшой круг субстратов. Иногда можно говорить об абсолютной субстратной специфичности, например, каталаза катализирует только одну реакцию разложение пероксида водорода: Для большинства ферментов характерна относительная (широкая, групповая) субстратная специфичность, когда они катализируют группу однотипных реакций. Например, алкогольдегидрогеназа катализирует превращения спиртов в альдегиды, причем в качестве субстратов могут выступать метанол, этанол, пропанол и другие спирты. Интересным является тот факт, что алкогольдегидрогеназа может окислять и нелинейные спирты, а также спиртовую группу, входящую в состав сложных молекул, в частности, этот фермент может катализировать превращение ретинола в ретиналь. Естественно, ферменты, наделенные широкой субстратной специфичностью, катализируют превращения субстратов с различной эффективностью. Ферменты наделены также стереохимической специфичностью: их активный центр распознает молекулы субстратов по пространственной конфигурации. Например, оксидазы L-аминокислот активны только в отношении L-аминокислот и совершенно не действуют на их D-аналоги. Для окислительного дезаминирования D-аминокислот в живых организмах имеются оксидазы D-аминокислот, не действующие на Lаминокислоты. Именно способность активного центра связываться с определенными стереоизомерами субстрата лежит в основе функционирования таких ферментов, как рацемазы, которые превращают одни стереоизомеры в другие. Специфичность путей превращения заключается в том, что один субстрат под действием разных ферментов может превращаться в продукты, различающиеся по структуре и роли в метаболизме. Приведем пример: оксидазы L-аминокислот действуют на Lаминокислоты, превращая их в альфа-кетокислоты с образованием аммиака и пероксида водорода. Декарбоксилазы L-аминокислот связываются с теми же субстратами, но катализируют другую реакцию: декарбоксилирование с образованием биогенных аминов и выделением углекислого газа. Еще одним примером является возможность превращения глюкозо-6 фосфата под действием различных ферментов, по одному из возможных метаболических путей: 4.3. Термолабильность. Как и многие белки, при повышении температуры ферменты подвергаются термической денатурации, что приводит к нарушению нативной конформации фермента и изменению структуры активного центра. Ферменты млекопитающих начинают заметно денатурировать при температурах выше 40оС. В связи с вышесказанным, ферментные препараты желательно хранить при пониженных температурах. Одним из лучших путей сохранения ферментов является их лиофилизация (высушивание при о температуре ниже -70 С в вакууме), переведение в частично денатурированное состояние с помощью солей аммония и помещение в холодильник. 4.4. Зависимость скорости реакции от температуры. Скорость ферментативных реакций, как и любых химических реакций, зависит от температуры. При повышении температуры на 10оС скорость реакции увеличивается в 2-4 раза согласно правилу Вант-Гоффа. Однако при температурах выше 40оС существенной становится денатурация ферментов, что приводит к уменьшению суммарной активности (рис. 2): Рис. 2. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры. 4.5. Зависимость скорости реакции от рН. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН имеет колоколообразный вид (рис. 3). Значения рН, при которых наблюдается наиболее высокая скорость ферментативной реакции, называют оптимальными (рНоптимум). Характер кривых и значение рН-оптимума зависит от природы заряженных групп субстрата и заряженных групп фермента (особенно тех, которые входят в активный центр). Оптимум рН для большинства ферментов лежит в пределах от 6,0 до 8,0 (рис. 3). v 5,0 6,0 7,0 8,0 H p Рис. 3. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН. Однако, есть и исключения, например, пепсин наиболее активен при рН 1,5 – 2,0, а щелочная фосфатаза при рН 10,0 – 10,5 (рис. 4) Рис. 4. Зависимости скорости ферментативной реакции (v) от рН среды. При экстремальных (очень низких или очень высоких) значениях рН происходит нарушение третичной структуры молекулы фермента, приводящее к потере ферментативной активности. 5. Кинетика ферментативных реакций Кинетика ферментативных реакций изучает скорости катализируемых ферментами реакций и влияние на них различных факторов. В простейшем случае ферментативную реакцию можно представить как двухстадийный процесс. К настоящему времени многочисленными экспериментами показано, что первая стадия - это образование фермент-субстратного комплекса (ЕS). Вторая стадия - это превращение фермент-субстратного комплекса через ряд промежуточных состояний в комплекс фермент-продукт и распад этого комплекса на свободный фермент и продукт реакции. Наиболее коротким схематическим способом записи этих стадий является: Зависимость скорости реакции v от концентрации субстрата Сs описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, где Км (константа Михаэлиса), а Vмакс (max) - максимальная скорость ферментативной реакции при полном насыщении фермента субстратом: Vmax ⋅ Cs Kì + C s v= Графически зависимость скорости реакции от концентрации субстрата представляет полуветвь гиперболы (рис.5): v Vmax 1 Vmax 2 Kм CS Рис. 5. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата. При полном насыщении фермента субстратом наблюдается ситуация, когда Cs >> Kм, тогда значением Км в знаменателе можно пренебречь, и скорость реакции становится максимальной: v = Vмакс Количество продукта Количество субстрата На графике (рис.5) при этом наблюдается плато при высоких концентрациях субстрата. При полунасыщении фермента субстратом v = Vмакс/2. Подстановка этого значения скорости в уравнение Михаэлиса приводит к значению Км = Cs. Поэтому можно дать следующее определение Км: константа Михаэлиса - это концентрация субстрата, при которой скорость ферментативной реакции равна половине максимальной скорости. Поскольку в ходе ферментативной реакции наблюдается расходование субстрата и накопление продукта, зависимость их концентраций от времени можно выразить следующим образом (рис. 7): Время Время Рис. 7. Графики зависимости концентрации субстрата и продукта ферментативной реакции от времени. Для более удобного графического представления экспериментальных данных Г. Лайнуивер и Д. Бэрк предложили использовать двойные обратные величины 1/v и 1/Cs, поскольку если существует равенство между двумя какими-либо величинами, то и обратные величины также равны. Если построить график зависимости 1/v от 1/Сs, получится прямая линия, отсекающая на оси ординат отрезок 1/Vмакс, а на оси абсцисс – отрезок, равный -1/Км. 1 v 1 Vmax 1 ! Kм 1 C s Рис. 8. График зависимости скорости реакции от концентрации координатах. субстрата, представленный в двойных обратных 6. Ингибирование ферментов Все типы ингибирования ферментов можно разделить на две большие группы: необратимое и обратимое ингибирование. Необратимые ингибиторы прочно связываются с молекулой фермента, и после удаления ингибитора (например, с помощью диализа), активность фермента не восстанавливается. Наиболее известными необратимыми ингибиторами являются фосфорорганические яды, применяемые в качестве инсектицидов и как боевые отравляющие вещества, цианиды и ионы тяжелых металлов, например, ртути, кадмия, меди, свинца, связывающиеся с карбоксильными и сульфгидрильными (- SH) группами в белках. Обратимые ингибиторы отделяются от комплекса фермента с ингибитором при понижении их концентрации, и фермент восстанавливает свою каталитическую активность. По типу воздействия на зависимость ферментативной реакции от концентрации субстрата обратимые ингибиторы делятся на конкурентные, неконкурентные, безконкурентные и смешанные. Конкурентные ингибиторы являются структурными аналогами субстрата и связываются в активном центре фермента, конкурируя с субстратом за место связывания. Они вызывают увеличение (ухудшение) константы Михаэлиса, но не влияют на максимальную скорость реакции (рис.9) V 1 v Vm ax !V i 2 1 1 1 Vmax 2 2 K м K мi 1 1 ! V Vi max 1 1 ! ! K мi Kм Cs 1 Cs б а Рис. 9. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в присутствии конкурентного ингибитора (а) и ее представление в двойных обратных координатах (б). Где 1 – график без ингибитора, 2 - график с ингибитором. Vi – Vмах в присутствии ингибитора. Неконкурентное ингибирование наблюдается, если ингибитор связывается вне активного центра. К неконкурентным ингибиторам относятся, например, тиоловые яды. Неконкурентные ингибиторы не влияют на константу Михаэлиса, но уменьшают максимальную скорость ферментативной реакции (рис.8): V 1 V V max 2 1 1 1 Vl Vl 2 1 Vl 2 1 Vmax 1 V 2 max 1 1 ! !! Kм K мi Сs K м !K м i 1 Сs а б Рис. 10. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в присутствии неконкурентного ингибитора. Обозначения как на рисунке 9. Бесконкурентное ингибирование - ингибитор связывается только с фермент-субстратным комплексом, но не со свободным ферментом, изменяя его конформацию, что затрудняет катализ. Максимальная скорость реакции и константа Михаэлиса уменьшаются в одинаковое количество раз и на графике в двойных обратных координатах наблюдаются параллельные прямые (рис.11). 1 v v 2 1 V max 1 1 V max i V1 2 1 V1 2 1 V 2 max K ì = Kì i 1 V max 1 ! Kмi 1 ! Kм 1 Сs Ñs Рис. 11. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в присутствии бесконкурентного ингибитора. Смешанное ингибирование встречается, если ингибитор связывается как в активном центре, так и вне его, а комплекс ЕI сохраняет частичную активность по сравнению с нативным ферментом. Такие ингибиторы увеличивают константу Михаэлиса и уменьшают максимальную скорость ферментативной реакции. В двойных обратных координатах ситуация выглядит так (рис.12): 1 v 2 1 1 V1 − 1 Kì − 1 V max 1 Kì i 1 Ñs Рис.12. Представление зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в присутствии смешанного ингибитора в двойных обратных координатах. Типы обратимого ингибирования ферментов представлены в таблице. Механизм действия: Тип ингибитора: КОНКУРЕНТНОЕ I связывается в активном центре и конкурирует с субстратом. Vi max = V max ; Км i > Км НЕКОНКУРЕНТНОЕ I связывается вне активного центра. Vi max < V max ; Км i = Км БЕСКОНКУРЕНТНОЕ I связывается не с Е, а с комплексом ЕS. Vi max / Км i = Vmax / Км СМЕШАННОЕ I связывается в активном центре и вне его. Vmax и Км уменьшаются независимо друг от друга. 7. Классификация ферментов Стремительное развитие энзимологии в 20 веке привело к тому, что остро встала проблема разработки единой классификации и унификации названий ферментов. В 1961 г. на V Международном биохимическом конгрессе в Москве была утверждена современная классификация ферментов, в основе которой лежит их разделение на шесть классов в зависимости от типа катализируемой реакции. 1) Оксидоредуктазы катализируют окислительновосстановительные реакции. Пример: исп. В большинстве случаев дегидрогеназы катализируют обратимые реакции 2 ) Трансферазы катализируют реакции межмолекулярного переноса различных групп атомов, AT + E → ET + A B + ET → BT + E где Т - транспортируемая группа, АТ – субстрат – донор, В – субстрат - акцептор транспортируемой группы. Пример 1 – аминотрансферазы, переносят альфа-аминогруппу аминокислот на место альфа-кетогруппы в кетокислотах. На схеме АЛТ – аланинаминотрансфераза. Пример 2 - один из наиболее распространённых видов посттрансляционной модификации белка (синтез фосфопротеинов) — фосфорилирование, которое катализируют фосфотрансферазы (киназы), осуществляющие перенос фосфатной группы от молекулы аденозинтрифосфата (АТФ) на различные субстраты. 3) Гидролазы катализируют расщепление внутримолекулярных связей с присоединением воды по разорванной связи: A − B + H 2O → A − H + B − OH , где А-В - субстрат В качестве примеров гидролаз можно привести протеиназы, катализирующие расщепление белков и пептидов; эстеразы, гидролизующие сложноэфирные связи, гликозидазы, разрывающие гликозидные связи с присоединением воды. Все пищеварительные ферменты относятся к классу гидролаз (некоторые из них: пепсин, трипсин, химотрипсин, амилаза, липаза, рибонуклеаза). 4) Лиазы катализируют разрыв и синтез связей С-О, С-N, С-C, а также обратимые реакции негидролитического отщепления групп с образованием двойной связи. 5) Изомеразы. К классу изомераз относят ферменты, катализирующие обратимые взаимопревращения изомеров. В качестве примера приведем следующую реакцию: 6) Лигазы (синтетазы) катализируют реакции синтеза различных веществ с использованием энергии АТФ или других макроэргических молекул. В качестве примера можно привести синтез карбамоилфосфата. На основании приведенной системы классификации ферментов (КФ) был издан список ферментов, где каждому ферменту присвоен четырехзначный номер (номенклатура ферментов). Первая цифра номера указывает на принадлежность фермента к одному из шести классов. В пределах классов ферменты группируются в подклассы и подподклассы в соответствии с особенностями катализируемых реакций, четвертое число — порядковый номер фермента в его подподклассе. Например, кислая фосфатаза имеет шифр 3.1.3.2; это означает, что она относится к классу гидролаз (3.), подклассу этих ферментов, действующих на сложноэфирные связи (3.1.), к подподклассу ферментов, гидролизующих моноэфиры фосфорной кислоты (3.1.3.), а порядковый номер фермента в данном подподклассе — 2 (3.1.3.2). 8. Внутриклеточная регуляция ферментативной активности Регуляция ферментативной активности за счет изменения количества молекул фермента в клетке путем биосинтеза ферментов de novo и деградации белковых молекул. Если какой-либо белок частично разрушается и не может выполнять свои биологические функции, то с ним связывается небольшой белок убиквитин, который транспортирует дефектный белок внутрь протеасом, где убиквитин отделяется, а белок подвергается гидролизу до свободных аминокислот. Деградация белковых молекул в клетке происходит постоянно, и при замедлении синтеза фермента его внутриклеточная концентрация будет понижаться. Регуляция синтеза ферментов осуществляется теми же путями, что и других белков. Важную роль в регуляции играют гормоны, а также условия, в которых находится организм, в частности, характер питания. Например, при переходе к пище, богатой белками возрастает скорость синтеза ферментов белкового обмена (скорость синтеза гистидазы увеличивается на 20%), а при переходе к бедной жирами диете на 30% быстрее синтезируются ферменты, входящие в комплекс синтеза высших жирных кислот. Количество фермента в клетке зависит и от наличия продукта реакции, катализируемой данным ферментом, причем продукт может вызывать торможение синтеза фермента путем репрессии, а субстрат действует на системы, активирующие синтез. Вышесказанное можно кратко суммировать следующей схемой: Типы регуляции ферментативной активности без изменения количества молекул фермента Эти типы регуляции основаны на изменении активности ферментов, которые могут происходить при воздействии многочисленных факторов, которые будут рассмотрены ниже. Влияние концентрации субстрата При недостатке субстрата фермент не может проявлять свою активность полностью. Скорость ферментативной реакции возрастает с увеличением концентрации субстрата согласно уравнению МихаэлисаМентен. Рост концентрации субстрата в клетке может быть результатом интенсификации его синтеза, увеличения внеклеточных концентраций или действия регулируемых мембранных белков-переносчиков. Иногда субстрат может выступать в роли аллостерического активатора фермента. В этом случае зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата не подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен, а график этой зависимости представляет S-образную кривую. Примером аллостерической активации субстратом является влияние глюкозы на активность гексокиназы: Влияние концентрации кофермента, кофакторов Скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна концентрации фермента. Однако, могут наблюдаться ситуации, когда ферменты не имеют возможности полностью проявлять свою активность. Например, если в организме не хватает витаминов, то не синтезируется достаточное количество коферментов, тогда даже при наличии достаточного количества молекул апофермента будет наблюдаться заниженная ферментативная активность. Такая же ситуация может иметь место при недостаточности ферментов синтеза коферментов из витаминов. Важно помнить также, что для проявления активности многих ферментов необходимо присутствие ионов соответствующих металлов, которые выступают в роли кофакторов. Влияние рН В ряде ситуаций значение рН в клетке изменяется весьма существенно. Например, в мышечных клетках при физической работе происходит расщепление АТФ до АДФ (или АМФ), высвобождается фосфорная кислота и накапливается лактат. В результате накопления лактата рН понижается до 5,0, и в этих условиях фермент креатинкиназа начинает катализировать синтез АТФ, необходимого клетке в этот момент, из креатинфосфата и АДФ: В состоянии покоя рН внутри клеток повышается до 9,0 и реакция протекает в противоположном направлении, приводя к накоплению креатинфосфата. Изменение концентрации ингибиторов и активаторов Иногда в клетке резко изменяются концентрации тех или иных метаболитов, которые могут выступать в роли аллостерических эффекторов. В описанном выше примере работающей мышцы в клетке накапливаются молекулы АМФ, способные аллостерически активировать фосфорилазу b, катализирующую распад гликогена. В результате в клетке ускоряются гликогенолиз и другие процессы, приводящие к синтезу новых молекул АТФ, необходимых для работы мышцы. В качестве активаторов фермента, как было сказано выше, часто выступают молекулы субстрата. Для многих процессов, включающих последовательные ферментативные реакции, характерным является так называемое ингибирование по типу обратной связи или ретроингибирование, заключающееся в торможении одного из первых ферментов конечным продуктом цепи превращений. Ретроингибирование позволяет затормозить процесс в самом начале, если синтезируемый продукт имеется в достаточном количестве: Часто такое ингибирование происходит по аллостерическому механизму. Пример ретроингибирования – синтез гема. Первую, ключевую реакцию синтеза гема катализирует фермент аминолевулинатсинтаза, аллостерическим ингибитором которого является сам гем. Скорость синтеза глобина (белковой части гемоглобина) также зависит от наличия гема: он ускоряет биосинтез белковых цепей, необходимых для проявления его биологической активности. Изменение четвертичной структуры фермента Для ряда ферментов, наделенных четвертичной структурой, и мультиферментных комплексов наблюдается зависимость ферментативной активности от числа субъединиц. Например, фермент люцифераза, вызывающий свечение светлячков и перспективный для использования в аналитических целях, практически неактивен в виде мономера, умеренно активен в димерной форме и наиболее активен в тетрамерном состоянии. Химическая модификация молекул фермента В клетке наблюдаются многочисленные случаи модификации ферментов с целью регуляции их активности. Приведем два наиболее распространенных примера. Многие ферменты синтезируются в виде проферментов и, в случае необходимости, быстро активируются протеиназами путем частичного прицельного протеолиза (выщепления небольших пептидов из молекулы фермента) и последующего изменения третичной структуры. Для изменения активности ферментов часто используется ковалентная модификация их молекул путем фосфорилирования – образования сложных эфиров фосфорной кислоты с гидрокси-группами таких аминокислот, как серин, треонин, тирозин. Необходимо отметить, что некоторые ферменты более активны в фосфорилированной форме (например, фосфорилаза а), а некоторые - в дефосфорилированной (например, гликогенсинтаза). Дефосфорилирование ферментов катализируют ферменты протеинфосфатазы. Влияние компартментализации на активность ферментов. Появление активаторов, ингибиторов фермента и его субстрата внутри клетки регулируется системами транспорта веществ. Например, скорость проникновения глюкозы в клетки значительно повышается при увеличении в крови концентрации инсулина. В клетке некоторые ферменты находятся в определенных органеллах (компартментах) и пространственно отделены от тех субстратов, на которые они действуют. Например, гидролитические ферменты сосредоточены внутри лизосом, поэтому они не могут подвергать гидролитическому расщеплению цитоплазматические белки. В ядре находятся ферменты, связанные с синтезом молекул ДНК и РНК, а в цитоплазме ферменты гликолиза. Такая локализация ферментов способствует упорядоченности обменных процессов. Некоторые ферменты способны эффективно работать только внутри определенных органелл. Например, если глюкоцереброзидаза не попадает внутрь лизосом, она не осуществляет расщепление обладающих токсическим действием глюкоцереброзидов, в результате чего они накапливаются в тканях и развивается одна из, так называемых, «болезней накопления» - болезнь Гоше. 9. Использование ферментов в медицине В настоящее время медицинская энзимология развивается двумя путями. Один путь – энзимотерапия, другой – энзимодиагностика. Энзимотерапия – использование ферментов в качестве лечебных средств в терапии, хирургии, гинекологии, урологии, стоматологии и многих других областях медицины. Широко распространена заместительная терапия заболеваний желудочно-кишечного тракта, основанная на использовании пищеварительных ферментов амилазы, липазы, протеиназ: пепсина, трипсина, химотрипсина, коллагеназы, эластазы. Известно, что протеиназы легко расщепляют белки мертвых клеток, поэтому их применяют для очистки ран, лечения воспалительных заболеваний, сильных ожогов и обморожений. Ферментативный препарат рибонуклеазу используют при лечении вирусных заболеваний, гиалуронидазу применяют для рассасывания рубцов после операций. Ферменты используют в онкологии, в частности, аспарагиназу, катализирующую расщепление аспарагина, для лечения лейкозов. Энзимодиагностика заключается в уточнении диагноза заболевания на основе определения активности фермента в биологических жидкостях организма. Понижение или повышение активности ферментов в крови, а также появление в крови ферментов, отсутствующих в норме, служит диагностическим критерием при патологии. Для диагностики органических и функциональных поражений органов и тканей применяются ферментные тесты, характеризующиеся относительно высокой чувствительностью и специфичностью. Определение активности ферментов в биологических жидкостях в настоящее время является обязательным компонентом диагностики: - инфаркта миокарда (креатинкиназа, лактатдегидрогеназа и их изоферментный состав); - заболеваний поджелудочной железы (амилаза сыворотки крови и мочи); - патологии печени (аминотранасферазы – аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), щелочная фосфатаза, γ – глутамилтрансфераза); - при карциноме простаты (кислая фосфатаза). При инфаркте миокарда наблюдают достоверные изменения в крови активности ферментов креатинкиназы (КК) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и их изоферментного состава, аминотрансфераз – ACT и АЛТ, которые зависят от времени, прошедшего от начала развития инфаркта и от зоны тканевого повреждения (рис. 13). Обнаружение повышенной активности КК в плазме крови - основной энзимодиагностический критерий инфаркта миокарда. Если у пациента с загрудинными болями не обнаружено изменения в активности КК, диагноз инфаркта миокарда маловероятен. Рис.13 Изменение активности ферментов в плазме крови при инфаркте миокарда. (Северин Е.С. 2009). Обозначения ферментов даны в тексте. Креатинкиназа имеет 3 изофермента – ВВ, МВ, ММ. Изофермент ВВ находится преимущественно в головном мозге, ММ – в скелетных мыщцах и МВ – в сердечной мыщце. При инфаркте миокарда происходит повышение количества МВ – изоформы. Одним из распространенных и часто используемых методов в энзимодиагностике является иммуноферментный анализ (ИФА), в котором ферменты выступают в качестве неотъемлемого компонента тест-системы. Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антитела и антигена с последующем присоединением к полученному комплексу конъюгата (антивидового иммуноглобулина, меченного ферментом). Фермент вызывает разложение хромогенного субстрата с образованием окрашенного продукта, который выявляется либо визуально, либо фотометрически. Получение иммобилизованных (закрепленных) ферментов, значительно расширило сферу применения биокатализаторов. Сущность иммобилизации ферментов — прикрепление их в активной форме к нерастворимой основе или заключение в полупроницаемую мембранную систему за счет чего резко повышается стабильность фермента. Прикрепление фермента к носителю осуществляется адсорбционно, химической связью или путем механического включения фермента в органический или неорганический гель. В медицине иммобилизованные ферменты открыли путь к созданию лекарственных препаратов пролонгированного действия со сниженной токсичностью и аллергенностью. Иммобилизационные подходы способствуют решению проблемы направленного транспорта лекарств в организме. Ряд иммобилизованных ферментов с успехом применяются в медицине: - использование тампонов, бинтов с иммобилизованными на них протеиназами для заживления ран и ожогов; - создание протезов кровеносных сосудов и сердечных клапанов из тромборезистентного материала на основе полимеров с иммобилизованными на них тромболитическими ферментами; - использование иммобилизованных ферментов в экстракорпоральных реакторах (уреазы, фенилаланиламмиклиазы – в лечении соответственно почечной недостаточности, фенилкетонурии). Иммобилизованная пенициллинамидаза служит для выработки 6аминопенициллановой кислоты, используемой в синтезе полусинтетическиъх пенициллинов из природного пенициллина, а иммобилизованная β-галактозидаза – для получения диетического безлактозного молока. Кроме того, ферменты используют, как избирательные реагенты для количественного определения нормальных или патологических компонентов сыворотки крови, мочи, желудочного сока и др. Так, глюкозооксидазу применяют для количественного определения глюкозы в моче, а фермент уреазу для определения мочевины в крови и моче. При определении содержания холестерина в сыворотке крови используют несколько ферментов: холестеринэстераза расщепляет сложноэфирную связь в эфирах холестерина (форма депонирования холестерина), полученный свободный холестерин окисляется холестериноксидазой до кето-формы холестерина и пероксида водорода, последний под действием пероксидазы окисляет фенол до окрашенного соединения (оптическую плотность которого определяют фотометрически). 10. Вопросы в тестах. Вашему вниманию предлагаются тесты по теме пособия. Правильные ответы (один или несколько) можно проверить в конце каждого вопроса. 1. Синтез фосфопротеинов катализируют 1 гидролазы 2 трансферазы 3 оксидоредуктазы 4 изомеразы 5 лиазы /2 2. Фосфат отщепляется от фосфопротеинов в результате действия 1 протеиназ 2 фосфатаз 3 протеинкиназ 4 фосфорилаз 5 оксидаз /2 4. Ферменты, расщепляющие белки, относятся к классу 1. оксидоредуктаз 2. трансфераз 3. гидролаз 4. лиаз 5. изомераз /3 5. Активность фермента определяют 1. по массе фермента 2. по изменению концентрации субстрата за единицу времени 3. по изменению концентрации продукта за единицу времени 4. по изменению температуры в ходе реакции /2,3 6. Конкурентный ингибитор 1. связывается в активном центре 2. связывается обратимо 3. не изменяет максимальную скорость реакции 4. снижает Км 5. повышает Км /1,2,3,5 7. Для фосфорилирования белков под действием киназ необходимо наличие 1. фосфат-ионов 2. хлорид-ионов 3. АДФ 4. АТФ /4 8. Фосфопротеины образуются из синтезированных на рибосомах белков в результате 1. ограниченного протеолиза 2. действия протеинфосфатаз 3. действия протеинкиназ 4. метилирования /3 9. Присоединение воды по двойной связи к молекуле субстрата катализирует фермент из класса 1. оксидоредуктаз 2. трансфераз 3. гидролаз 4. лиаз 5. изомераз /4 10. Неконкурентный ингибитор 1. связывается в активном центре 2. снижает максимальную скорость реакции 3. не изменяет максимальную скорость реакции 4. повышает Км 5. не изменяет Км /2,5 11. Ферменты 1. сдвигают равновесие реакции в сторону образования продуктов 2. катализируют как прямую, так и обратную реакцию 3. термолабильны 4. всегда растворимы 5. всегда состоят из нескольких субъединиц /2,3 12. Название небелковой группы, прочно связанной с белковой частью фермента 1. шаперон 2. холофермент 3. апофермент 4. простетическая группа /4 13. Общие свойства ферментов и неорганических катализаторов 1. не сдвигают равновесия реакции 2. термолабильность 3. не расходуются в процессе реакции 4. физиологические условия протекания реакций /1,3 14. Ферменты из класса оксидоредуктаз осуществляют 1. перенос электронов 2. перенос групп атомов 3. реакции гидролиза 4. присоединение групп по двойным связям 5. расщепление по двойным связям /1 15. Скорость ферментативных реакций зависит от 1. концентрации субстрата 2. концентрации фермента 3. молекулярной массы фермента 4. температуры /1,2,4 16. Небелковой частью ферментов могут быть 1. липиды 2. углеводы 3. ионы металлов 4. азотистые основания 5. витамины /1,2,3,4,5 17. Изоферменты – это множественные формы ферментов, которые: 1. катализируют разные реакции 2. катализируют одну и ту же реакцию 3. различаются по физико-химическим свойствам 4. не различаются по физико-химическим свойствам 5. кодируются разными генами /2,3,5 18. Как ферменты влияют на энергию активации реакции? 1. увеличивают 2. снижают 3. не изменяют 4. сначала увеличивают, а потом снижают /2 19. Как ферменты влияют на константу равновесия катализируемой реакции? 1. увеличивают 2. снижают 3. не изменяют 4. сначала увеличивают, а потом снижают /3 21. Реакции образования новых связей, сопряжённые с расходованием АТФ катализируют: 1. оксидоредуктазы 2. трансферазы 3. гидролазы 4. лиазы 5. лигазы /5 22. Все ферменты содержат 1. простетическую группу 2. аллостерический центр 3. активный центр 4. субстрат-связывающий участок /3,4 23. Ионы металлов в ходе ферментативной реакции могут 1. поддерживать нативную конформацию фермента 2. участвовать в акте катализа 3. входить в состав субстрата 4. тормозить реакцию /1,2,3,4 24. Отличия ферментов от неорганических катализаторов 1. ускоряют реакцию 2. снижают энергию активации реакции 3. термолабильны 4. имеют активный центр /3,4 26. Нуклеиновые кислоты разрушаются под действием 1. оксидоредуктаз 2. трансфераз 3. гидролаз 4. лигаз 5. лиаз /3 27. При взаимодействии субстрата с ферментом 1. они подходят друг к другу как «ключ к замку» 2. их пространственная структура не изменяется 3. они взаимодействуют как «рука с перчаткой» 4. субстрат связывается в активном центре /3,4 28. Протомеры это 1. предшественники активных ферментов 2. субъединицы олигомерных белков 3. протеолитические ферменты 4. белки, связывающиеся с НК /2 29. Катал – это количество фермента, превращающее за 1 сек 1. 1 моль субстрата 2. 1 ммоль субстрата 3. 1 мкмоль субстрата 4. 1 нмоль субстрата /1 30. Е активности фермента – это количество фермента, нарабатывающее 1. 1 моль продукта за 1 минуту 2. 1 мкмоль продукта за 1 минуту 3. 1 мкмоль продукта за 1 секунду 4. 1 моль продукта за 1 секунду 5. 1 грамм продукта за 1 час /2 31. Апофермент – это 1. небелковая часть сложного фермента 2. фермент, связанный с субстратом 3. белковая часть сложного фермента 4. инактивированный фермент /3 32. 1.Удельная активность фермента выражается в 1. U/мг белка 2. моль/(л·мин) 3. моль/л 4. U/моль фермента /1 33. Каталитической активностью в организме могут обладать 1. белки 2. РНК 3. антитела 4. углеводы 5. липиды /1,2,3 34. Срок хранения ферментных препаратов можно увеличить путем 1. лиофилизации ферментов 2. хранения в холодильнике 3.добавления в раствор фермента высоких концентраций сульфата аммония 4. тепловой стерилизации /1,2,3 36. В организме человека активность ферментов может регулироваться: 1. специфическим гидролизом пептидных связей (прицельным протеолизом) 2. с помощью белков-активаторов или белков-ингибиторов 3. путем отделения регуляторных субъединиц от каталитических субъединиц фермента 4. фосфорилированием молекулы фермента /1,2,3,4 37. Ретроингибирование ферментов заключается в: 1. связывании отдаленного продукта цепочки превращений с регуляторным центром первого фермента 2. денатурации фермента 3. связывании с ферментом вторичного посредника 4. присоединении ингибитора в активном центре фермента /1 38. Скорость ферментативной реакции измеряется в 1. мин-1 2. моль/(л·мин) 3. моль/(л·сек) 4. моль/л /2,3 39. Лактатдегидрогеназа относится к классу 1. оксидоредуктаз 2. трансфераз 3. гидролаз 4. лиаз 5. изомераз 6. лигаз /1 40. Трипсин относится к классу 1. оксидоредуктаз 2. трансфераз 3. гидролаз 4. лиаз 5. изомераз 6. лигаз /3 41. Амилаза относится к классу 1. оксидоредуктаз 2. трансфераз 3. гидролаз 4. лиаз 5. изомераз 6. лигаз /3 42. К гидролазам относятся 1. амилаза 2. лактатдегидрогеназа 3. алкогольдегидрогеназа 4. пепсин /1,4 43. Лактатдегидрогеназа 1. состоит из 4 субъединиц 2. катализирует обратимую реакцию 3. имеет 6 изоферментов 4. используется для энзимодиагностики /1,2,4 44. Алкогольдегидрогеназа относится к классу 1. оксидоредуктаз 2. трансфераз 3. гидролаз 4. лиаз 5. изомераз 6. лигаз /1 45. Алкогольдегидрогеназа 1. превращает альдегиды в кислоты 2. относится к оксидоредуктазам 3. имеет широкую субстратную специфичность 4. может окислять ретинол /2,3,4 46. На графиках изображены 4 типа ингибирования ферментов. Найти соответствие: 1. А. Конкурентное 2. Б. Неконкурентное 3. В. Безконкурентное 4. Г. Смешанное /1Б/2А/3В/4Г Список литературы 1. Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. Биологическая химия: Учебник. - 4-е издание - М.: Медицина, 2007. 2. «Биохимия. Руководство к практическим занятиям» под редакцией Н.Н. Чернова. М.2009. 3. Н.Н. Чернов «Ферменты в клетке и пробирке» Соросовский образовательный журнал, №5, 1996. 4. Сборник тестов по биохимии: Учебное пособие / Под ред. Н.Н. Чернова. - М.2005. - 92 с. 5. Биологическая химия. Е.С. Северин и др. 2011. 6. Биохимия с упражнениями и задачами. Под ред. Е.С. Северина. М.: Гэотар-мед, 2008. Для студентов, обучающихся по специальности "Стоматология". 7. Биохимия. Под ред. Ф. Н. Гильмияровой, Самара: Офорт, 2008.
