автореферат_Финкина Екатерина
реклама
УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА РАН На правах рукописи Финкина Екатерина Ивановна ВЫДЕЛЕНИЕ И СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВО-ПЕПТИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ 02.00.10 – Биоорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2011 Работа выполнена в Учебно-научном центре Учреждения Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Научный руководитель: кандидат химических наук Овчинникова Татьяна Владимировна Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН, доктор химических наук Габибов Александр Габибович член-корреспондент РАН, доктор химических наук Кочетков Сергей Николаевич Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук. Защита состоится 30 марта 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997 ГСП-7 Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Автореферат разослан 28 февраля Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук 2011 г. В.А. Олейников ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования Повсеместное присутствие патогенных микроорганизмов является одним из основных неблагоприятных факторов окружающей среды, и способность противостоять их воздействию является ключевым моментом в жизни биологического вида. В ходе эволюции растения и животные выработали ряд эффективных защитных механизмов. Важнейшим компонентом защитной системы высших животных является адаптивный иммунный ответ, который характеризуется специфическим распознаванием микроорганизма и наличием иммунной памяти. Для растений описаны такие характерные только для них защитные стратегии как гиперчувствительный ответ, утолщение клеточной стенки, повышение концентрации фитогормонов, обеспечение локальной и системной резистентности, в том числе путем синтеза белков, связанных с патогенезом (Pathogenesis-Related Proteins или сокращенно PRP), и вторичных метаболитов, обладающих антимикробным действием. Среди всех имеющихся в арсенале у растений защитных механизмов особый интерес у исследователей вызывает синтез PRP. Стресс-индуцируемые белки растений подразделяются на 17 классов и синтезируются только в ответ на воздействие неблагоприятных факторов, таких как присутствие фитопатогенов, дефицит влаги, механическое повреждение, изменение температуры или обработка химическими агентами. Общим для PRP является относительно низкая молекулярная масса, устойчивость к воздействию протеаз и сред с низкими значениями pH, наличие сигнальной последовательности в структуре предшественника, преимущественно внеклеточная локализация и антимикробная активность. На сегодняшний день выделено и охарактеризовано большое число PRP из различных растений. Однако механизмы антимикробного действия большинства растительных антибиотиков до конца не исследованы и находятся в стадии изучения. Интерес исследователей к PRP растений обусловлен возможностью их применения в сельскохозяйственной отрасли, которая несет огромные убытки из-за потери урожая культурных растений, поражаемых патогенными микроорганизмами, вирусами и 1 насекомыми-вредителями. Традиционные методы борьбы, основанные на искусственной селекции растений, в последнее время становятся неэффективными вследствие опережающей автоселекции патогенных микроорганизмов. Применение пестицидов и инсектицидов имеет такие негативные последствия как загрязнение окружающей среды, гибель непатогенной микрофлоры, насекомых и птиц, а также появление устойчивых патогенных микроорганизмов и насекомых. В этой ситуации перспективным представляется создание трансгенных растений, имеющих низкую себестоимость и повышенную устойчивость к фитопатогенам. Второе направление для возможного применения растительных PRP связано с их способностью наряду с фитопатогенами также эффективно подавлять рост патогенных для человека микроорганизмов. Такие характеристики как высокая специфичность действия и отсутствие токсического воздействия на животные клетки также свидетельствуют в пользу того, что растительные антимикробные белки и пептиды могут стать альтернативной заменой современных антибиотиков, эффективность использования которых постоянно снижается в связи со стремительно распространяющейся резистентностью бактерий и грибов. Многие PRP растений имеют аллергенную природу и являются причиной развития аллергических реакций на пыльцу, растительные пищевые продукты и латекс. Обнаружение и изучение свойств новых растительных аллергенов является важным направлением экспериментальной медицины, которое не только способствует пониманию причин и механизмов развития аллергии, но и имеет важное прикладное значение. Широко используемые для проведения аллергодиагностики экстракты растительных тканей представляют собой многокомпонентные смеси, сложность стандартизации которых зачастую является причиной ложно положительных или ложно отрицательных результатов. В то же время, для лечения аллергии используются различные фармакологические препараты, направленные в основном на устранение аллергических симптомов. Природные и рекомбинантные белковые растительные аллергены могут стать основой для создания новых диагностических тест-систем, а 2 также использоваться для специфической аллерговакцинации, направленной на снижение реактивности организма. Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в поиске, выделении и структурно-функциональном исследовании новых белково-пептидных антибиотиков растительного происхождения. В качестве объекта исследования была выбрана распространенная во многих странах, но малоизученная культура - чечевица обыкновенная Lens culinaris subsp. culinaris [семейство – бобовые (Leguminosae, Fabaceae), род – чечевица (Lens)]. Предметом исследования были разработка методик выделения и очистки, изучение структуры и биологических свойств антимикробных белков и пептидов, содержащихся в проращѐнных семенах чечевицы обыкновенной. В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи: - поиск новых антимикробных белков и пептидов; - разработка методик их выделения и очистки; - определение полных аминокислотных последовательностей и структур кДНК, кодирующих предшественники антимикробных белков и пептидов; - функциональная характеристика выделенных веществ. Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящее время выделены и охарактеризованы PRP представителей различных ботанических семейств. Среди бобовых растений наиболее изученными культурами являются горох и фасоль. В ходе проведенной работы нами были обнаружены белковопептидные антибиотики, обеспечивающие устойчивость к заболеваниям малоизученной бобовой культуры - чечевицы обыкновенной. Из проращѐнных семян чечевицы нами были выделены представители двух классов PRP, а именно: новый растительный дефенсин (PRP-12), подавляющий рост фитопатогенных грибов, и восемь новых липидтранспортирующих белков (Lipid Transfer Proteins или сокращенно LTP) (PRP-14), обладающих антимикробной активностью и проявляющих свойства аллергенов. 3 Полученные сведения обогащают наше преставление о врожденном иммунитете растений и могут стать основой для дальнейших структурно-функциональных исследований PRP белков и молекулярных механизмов их действия, а также для более детального изучения их антимикробных и аллергенных свойств с целью практического применения в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве. Апробация работы и публикации. Результаты исследования были представлены на VII и VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2004, 2006); на IV и V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007, 2009); Международной научно-практической конференции “Биотехнология. Вода и пищевые продукты” (Москва, 2008); XVI-XXII зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003-2010); III Российском симпозиуме "Белки и пептиды (Москва, 2007); итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 20072012 годы", конференции по научным направлениям Программы фундаментальных исследований РАН «Фундаментальные науки – медицине» (Москва, 2008), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009). По теме диссертации опубликовано 20 работ. Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 170 страницах; содержит 16 рисунков и , 10 таблиц; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов включающего 378 наименований. 4 и библиографического списка, СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Получение и фракционирование исходного препарата из проращѐнных семян чечевицы обыкновенной Lens culinaris. Растения содержат большое количество различных PRP, активация синтеза которых происходит под воздействием неблагоприятных абиотических и биотических факторов окружающей среды. Аналогичный эффект наблюдается при прорастании семени, когда нарушается целостность кожуры, являющейся эффективным физическим барьером, и молодой проросток оказывается в среде, густо населенной микроорганизмами. В настоящей работе нами был проведен поиск новых защитных белков и пептидов в проращѐнных семенах чечевицы. Исходным препаратом для фракционирования служил суммарный белковый осадок, который был получен в результате гомогенизации проращѐнных в течение трех дней семян, экстракции буферным раствором (10 мM Na2HPO4, 15 мM NaH2PO4, 100 мM KCl, 2 мМ ЭДТА), содержащим поливинилполипирролидон и смесь ингибиторов протеаз, и высаливания белков 75% сульфатом аммония. В качестве первой стадии разделения белков была проведена гель-фильтрация на колонке с Сефадексом G-75, уравновешенной 200 мМ ацетатом аммония с 2 M мочевиной, pH 7,0 (рис. 1). Далее, фракции, содержащие белки с Mr 3-6 и 7-10 кДа, объединяли и подвергали диализу с последующим разделением сначала на катионообменной колонке Mono S HR 5/5, а затем на обращенно-фазовой колонке Luna С18. 2. Выделение и структурно-функциональная характеристика нового дефенсина Lc-def. Новый дефенсин чечевицы, названный Lc-def, был обнаружен и выделен в результате двухстадийного разделения объединенных фракций, полученных после гельфильтрации и содержащих белки с Mr 3-6 кДа. Ионообменную хроматографию проводили на колонке Mono S в линейном градиенте концентрации ацетата аммония, pH 6,0 при умеренном давлении (рис. 2а). Масс-спектрометрический анализ полученных фракций выявил присутствие белка с m/z [M+H]+ 5441,1 в пике 2. Дальнейшая его 5 а б 4 4 кДа 16,9 14,4 10,7 8,1 6,2 2,5 4 Рис. 1. а – Разделение белков на колонке с Сефадексом G-75. б – пептидный ПААГэлектрофорез фракций 1-14 после гель-фильтрации; Cт – смесь белков-стандартов молекулярных масс. 4 Рис. 2. а - Катионообменная хроматография на колонке Mono S объединенных фракций 1214, полученных после гель-фильтрации и содержащих белки с Mr 3-6 кДа. Фракция 2 содержит белок с Mr 5,4 кДа. б - ВЭЖХ на колонке Luna С18 фракции 2, полученной после хроматографии на колонке Mono S. Время выхода с колонки белка с Mr 5,4 кДа соответствует пику 2. 6 5 Рис. 2. а - Катионообменная хроматография объединенных после гель-фильтрации фракций, очистка осуществлялась с помощью ВЭЖХ на колонке Luna С18 в линейном градиенте концентрации ацетонитрила в присутствии 0,1% ТФУ (рис. 2б). Частичная N-концевая аминокислотная последовательность выделенного белка (KTXENLSDSFKGPXIPDGN-), установленная методом автоматического микросеквенирования по Эдману, значительное сходство с соответствующими последовательностями имела дефенсинов бобовых растений. Выделенный дефенсин-подобный белок, названный Lc-def, содержал 8 остатков цистеина, образующих четыре дисульфидные связи, что характерно для растительных дефенсинов. Число цистеиновых остатков и дисульфидных мостиков определяли, используя реакцию алкилирования белка 4-винилпиридином без предварительного восстановления дититреитолом и после него. Для того, чтобы определить полную аминокислотную последовательность Lc-def, нами была выделена суммарная РНК, проведены обратная транскрипция и амплификация 3’- и 5’-концевых фрагментов кДНК, которая проводилась в три этапа. На первом этапе была проведена ПЦР с двумя вырожденными ген-специфическими праймерами, комплементарными консервативным участкам нуклеотидной последовательности дефенсинов бобовых растений. На втором этапе амплификацию проводили с ген-специфическим праймером, комплементарным фрагменту сигнального пептида предшественника Lc-def. На третьем этапе вложенных праймеров, комплементарных использовалась 3’-нетранслируемой области система кДНК. Структура полноразмерной кДНК предшественника дефенсина была установлена путем сопоставления результатов секвенирования 3’- и 5’-концевых фрагментов и зарегистрирована в банке данных по нуклеотидным последовательностям GenBank под номером EF194158 (рис. 3а). Установленная нами нуклеотидная последовательность включает в себя открытую рамку считывания длиной 222 п.о., кодирующую последовательность 74 аминокислотных остатков предшественника дефенсина. Анализ аминокислотной последовательности, последовательности, транслированной с с помощью (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP), показал 7 кодирующей алгоритма высокую нуклеотидной SignalP v.3.0 вероятность наличия Рис. 3. а - Последовательность кДНК, кодирующая предшественник Lc-def, и соответствующая ей аминокислотная последовательность предефенсина. Открытая рамка считывания включает сигнальный пептид (показан светло-серым цветом) и зрелый белок (показан черным цветом). Показаны сайты отжига праймеров, использованных для амплификации концов кДНК. б – Триптические фрагменты восстановленного Lc-def. Серым цветом выделены аминокислотные остатки, по которым происходило расщепление. 10 20 30 40 ..*......|...*.....*...*.....|....*....|*.*...* Lens culinaris, Lc-def KTCENLSDSFKGPCIPDGNCNKHCKEKEHLLSGRCRDDFRCWCTRNC Pisum sativum, Psd2 KTCENLSGTFKGPCIPDGNCNKHCRNNEHLLSGRCRDDFRCWCTNRC 7Phaseolus vulgaris KTCENLADTFRGPCFATSNCDDHCKNKEHLLSGRCRDDFRCWCTRNC Phaseolus limensis, limenin KTCENLADTYKGPCFTTGGCDDHCKNKEHLLSGRCRDDFRCWCTRNC Trigonella foenum-graecum, Tfgd1 –TCENLADTFRGPCFGNSNCNFHCKTKEHLLSGRCRDDFRCWCTKRC Pachyrrhizus erosus, SPE10 KTCENLADTFRGPCFTDGSCDDHCKNKEHLIKGRCRDDFRCWCTRNC Vigna radiata KTCENLVDTYRGPCFTTGSCDDHCKNKEHLLSGRCRDDVRCWCTRNC Vigna radiata, VrD2 KTCENLANTYRGPCFTTGSCDDHCKNKEHLRSGRCRDDFRCWCTRNC Cicer arietinum -RCENLADTYRGPCFTTGSCDDHCKNKEHLVSGRCRDDFRCWCTKNC Medicago sativa, Msdef1 RTCENLADKYRGPCF--SGCDTHCTTKENAVSGRCRDDFRCWCTKRC %И 100 85 79 79 77 77 75 72 70 64 Рис. 4. Сравнение аминокислотных последовательностей Lc-def и других дефенсинов бобовых растений; %И – процент идентичных аминокислотных остатков. Серым цветом выделены консервативные аминокислотные остатки; звездочками отмечены остатки цистеина, расположенные консервативно. Характерная для дефенсинов бобовых растений аранжировка дисульфидных связей представлена в нижней части рисунка. 8 8 характерного для растительных дефенсинов сигнального пептида, отщепляемого по связи Ala27-Lys28 и состоящего из 27 аминокислотных остатков. Соответствие транслированной последовательности кДНК аминокислотной последовательности выделенного Lc-def было подтверждено путем проведения триптического гидролиза восстановленного белка. Рассчитанные с помощью программы Protean (DNASTAR) молекулярные массы триптических фрагментов дефенсина соответствовали массам фрагментов выделенного Lc-def, определенных методом времяпролетной массспектрометрии МАЛДИ (матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации) (рис. 3б). В результате нами была установлена полная аминокислотная последовательность нового дефенсина Lc-def, которая была зарегистрирована в банке данных по аминокислотным последовательностям UNIPROT под номером P85530, а также структура его предшественника. Зрелый Lc-def состоит из 47 аминокислотных остатков и имеет расчетную молекулярную массу 5440,21 Да (EditSeq, DNASTAR), совпадение которой с экспериментальным значением m/z молекулярного иона свидетельствует об отсутствии посттрансляционных модификаций у дефенсина чечевицы. В литературных источниках приводится классификация растительных дефенсинов, подразделяющая их на четыре группы на основе особенностей структурной организации и функциональной активности этих белков. Все четыре группы характеризуются наличием консервативных аминокислотных остатков, которые, как предполагают, необходимы для проявления соответствующего спектра антимикробной активности. Однако классификация некоторых дефенсинов растений вызывает затруднения, поскольку их структурные и функциональные характеристики не вписываются ни в одну из ранее упомянутых четырех групп. Поиск в базах данных аминокислотных и нуклеотидных последовательностей (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) показал, что структура выделенного нами полноразмерного дефенсина чечевицы Lc-def имеет наибольшее сходство с неклассифицированными дефенсинами из семян бобовых растений (рис. 4). Дефенсины данного ботанического семейства обладают выраженной противогрибковой активностью и обеспечивают защиту трансгенных растений от 9 фитопатогенных грибов; в более высоких концентрациях они также подавляют рост бактерий. Помимо этого, данные белки ингибируют обратную транскриптазу ВИЧ-1, обладают митогенной активностью в отношении мышиных спленоцитов и антипролиферативной активностью в отношении опухолевых клеток. Высокая степень гомологии и сходная функциональная активность дефенсинов бобовых растений дают основание выделить их в новую, пятую структурную группу, к которой и принадлежит выделенный нами Lc-def. A 620 Таблица 1. Противогрибковое действие Lc-def. 0,7 Фитопатогенные грибы IC50, мкМ/л Aspergillus niger VKM F-2259 10 Aspergillus versicolor VKM F-1114 28,7 Botrytis cinerea VKM F-3700 9,25 Fusarium culmorum VKM F-844 18,5 18,5-37 Fusarium oxysporum ТСХА-4 >37 Neurospora crassa VKM F-184 9,25-18,5 0,6 0,5 0,4 контроль 4,65 мкМ 9,25 мкМ 18,5 мкМ 37 мкМ 0,3 0,2 0,1 0 12 24 36 Время, ч 48 Рис. 5. Влияние Lc-def на рост Neurospora crassa. Антимикробная активность Lc-def определялась методом серийных разведений антибиотика в жидкой питательной среде с9 культурой спор. Противогрибковая активность природного фитопатогенных грибов дефенсина была исследована в отношении двух из отдела аскомицетов Aspergillus niger VKM F-2259 и Alternaria alternata VKM F-3047. Противогрибковая активность рекомбинантного аналога Lc-def, полученного в УНЦ ИБХ РАН в результате гетерологической экспрессии Lc-def в клетках E. coli BL-21 (DE3) в составе гибридного белка с модифицированным тиоредоксином А и октагистидиновой последовательностью, была исследована в отношении еще семи фитопатогенных грибов (Aspergillus versicolor VKM 10 F-1114, Fusarium solani VKM F-142, Fusarium culmorum VKM F-844, Fusarium oxysporum ТСХА-4, Neurospora crassa VKM F-184, Botrytis cinerea VKM F-3700, Ascochyta pisi VKM F-1173). Результаты тестирования показали, что дефенсин чечевицы характеризуется специфичностью действия и ингибирует рост шести использованных тест-культур (табл. 1). Наиболее чувствительными к Lc-def являются возбудители фузариоза и серой гнили бобовых и злаковых растений F. culmorum и B. cinerea, соответственно, а также N. crassa, 100% ингибирование роста которого наблюдается в присутствии Lc-def в коцентрации 37 мкм/л (рис. 5). В тоже время, дефенсин чечевицы не влияет на прорастание спор и рост таких фитопатогенов, как F. solani, A. alternata и A. pisi в максимальной использованной концентрации 37 мкм/л. Характерную для растительных дефенсинов специфичность противогрибкового действия связывают с возможным механизмом их действия. В отличие от большинства катионных АМП дефенсины растений вызывают нарушение проницаемости клеточной мембраны фитопатогенных грибов не в результате электростатического взаимодействия с отрицательно заряженными компонентами мембраны, а в результате взаимодействия с высокоаффинными сайтами связывания на плазматической мембране грибной клетки. Идентифицированные для некоторых растительных дефенсинов сайты связывания представляют собой специфичные для разных видов фитопатогенных грибов кислые и нейтральные гликосфинголипиды. Следствием связывания растительного дефенсина со специфическим рецептором может являться либо встраивание его в мембрану фитопатогена с образованием ион-проницаемой поры, либо активация трансдуцирующих соединений, влияющих на активность ионных каналов или транспортеров. Является ли ингибирование грибкового роста прямым следствием изменения проницаемости мембраны фитопатогена или результатом взаимодействия растительных дефенсинов с внутриклеточной мишенью, пока остается неясным. Помимо антимикробной активности в литературе была описана способность растительных дефенсинов специфически ингибировать активность протеолитических ферментов. Два негомологичных дефенсина из семян кассии трубчатой (Cassia fistula) и вигны початковой (Vigna unguiculata) ингибируют активность трипсина, но не влияют на 11 протеолитические свойства химотрипсина. Авторами было высказано предположение о механизме ингибирования, в основе которого лежит взаимодействие Lys25 дефенсина кассии или Lys11 тионина Cp-1 вигны с трипсином. Учитывая, что выделенный нами дефенсин чечевицы Lc-def содержит оба значимых, по мнению авторов гипотезы, остатков Lys, нами было проведено исследование влияния Lc-def на активность трипсина и химотрипсина c использованием в качестве субстратов L-BAPNA (nнитроанилид-α-N-бензоил-D,L-аргинина) и α-казеина, соответственно. Было показано, что Lc-def не влияет на активность упомянутых протеолитических ферментов. Таким образом, нами установлено, что присутствие в структуре растительных дефенсинов аминокислотных остатков Lys11 и Lys25 не является достаточным условием для проявления способности ингибировать активность трипсина. Все дефенсины растений имеют схожую третичную структуру, представленную тремя складчатыми β-листами и одной α-спиралью (βαββ конфигурация) и стабилизированную четырьмя дисульфидными связями (Cys1-Cys8, Cys2-Cys5, Cys3-Cys6 и Cys4-Cys7). Дисульфидная связь Cys1-Cys8 образована цистеинами, расположенными соответственно в N- и С-концевых участках структуры, что делает дефенсины растений псевдоциклическими белками. Проведенный триптический гидролиз нативного Lc-def позволил получить информацию об организации дисульфидных связей. Ограниченный протеолиз нативного белка привел к образованию девяти пептидов: N-концевого фрагмента I, C-концевого фрагмента XI (рис. 3б) и семи крупных фрагментов, стабилизированных дисульфидными связями, пять из которых характеризовались разрывом одной (Cys1-Cys8) дисульфидной связи. Процент расщепленного белка в данных условиях был очень низким, что свидетельствовало о стабильности структуры и устойчивости нативного дефенсина чечевицы к действию протеолитического фермента. На основании полученных данных нами было выдвинуто предположение, что в структуре выделенного Lc-def присутствует характерная для растительных дефенсинов связь Cys1-Cys8, которая является наиболее лабильной. Разрыв этой связи, по-видимому, приводит к размыканию псевдоцикла и делает более доступными для трипсина N- и Сконцевые участки молекулы Lc-def. 12 3. Выделение и структурно-функциональная характеристика новых липидтранспортирующих белков Lc-LTP. Четыре новых LTP чечевицы были выделены в результате последовательного разделения объединенных после гель-фильтрации фракций, содержащих белки с Mr 7-10 кДа, сначала на катионообменной колонке Mono S, а затем на обращенно-фазовой колонке Luna С18 (рис. 6). Элюирование белков в случае ионообменной хроматографии осуществляли линейным градиентом концентрации ацетата аммония, pH 6,0. Белки с молекулярной массой около 9 кДа были обнаружены в основной фракции 3, которую далее разделяли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в линейном градиенте концентрации ацетонитрила в присутствии 0,1% ТФУ. Масс-спектрометрический анализ полученных после ВЭЖХ фракций выявил присутствие двух молекулярных ионов с m/z [M+H]+ 9121,9 и 9135, во фракции, соответствующей пику 1, и двух молекулярных ионов с m/z [M+H]+ 9269,1 и 9283,1 во фракции, соответствующей плечу 1’. Последовательности первых 24 аминокислотных остатков, установленные методом Nконцевого автоматического микросеквенирования по Эдману, оказались идентичными для всех четырех белков (AISXGAVTSDLSPXLTYLTGGPGP-). аминокислотная последовательность выделенных белков, гомологичная N-Концевая первичной структуре белков подкласса LTP1, была депонирована в базы данных SWISS-PROT и TrEMBL под номером P84255. В результате проведенной реакции алкилирования белков 4-винилпиридином без предварительного восстановления дититреитолом и после него было показано, что каждый из выделенных LTP чечевицы содержит 8 остатков цистеина, образующих четыре дисульфидных связи. С-концевые аминокислотные остатки были определены путем расщепления белков смесью карбоксипептидаз А и В. В гидролизате LTP из фракции 1 были идентифицированы С-концевые аминокислоты Lys>Val>Thr>Asn. В гидролизате LTP из фракции 1’ был обнаружен также типичный для белков подкласса LTP1 остаток фенилаланина: Phe>Lys>Val>Thr>Asn. 13 Рис. 6. а - Катионообменная хроматография объединенных после гель-фильтрации фракций, содержащих белки с Mr 7-9 кДа, на колонке Mono S, и электрофоретический анализ гомогенности фракции 3. б - ВЭЖХ на колонке Luna С18 фракции 3, полученной после катионнообменной хроматографии; Lc-LTP присутствуют во фракциях 1 и 1. На основании того, что разница m/z [M+H]+ для каждой пары выделенных белков 11 (9269,1/9121,9 и 9283,1/9135,9) составляет 147,2 Да, нами было высказано Рис. 2. а - Катионообменная хроматография объединенных после гель-фильтрации фракций, + содержащих белки с Mr 3-6 кДа, на [M+H] колонке Mono S; Lc-def присутствует в пике 2. б- ВЭЖХ предположение, что белки с m/z 9121,9 и 9135,9 отличаются отсутствием Сфракции 2 после хроматографии на колонке Mono S; Lc-def присутствует в пике 2. + концевого остатка Phe от белков с m/z [M+H] 9269,1 и 9283,1, соответственно. Для того, чтобы доказать правильность этого предположения, решено было установить полные первичные структуры LTP чечевицы с помощью молекулярного клонирования 12 и секвенирования кДНК. Для установления структур кДНК использовали метод быстрой амплификации концов кДНК (RACE). Структура вырожденных ген-специфических праймеров для амплификации 3’-концов кДНК на первом этапе была выбрана, исходя из N-концевой аминокислотной последовательности выделенных LTP. На втором этапе для амплификации 5’-концов кДНК были использованы ген-специфические праймеры, 14 комплементарные 3’-нетранслируемым областям кДНК (рис. 7а). В результате клонирования и секвенирования 3’- и 5’-концевых фрагментов нами была установлена структура шести полноразмерных кДНК предшественников LTP. Пять нуклеотидных последовательностей [номера GenBank: AY793553 (Lc-LTP1), AY793554 (Lc-LTP2), AY793555 (Lc-LTP3), AY793558 (Lc-LTP4), AY793557 (Lc-LTP6)] включают в себя открытую рамку считывания длиной 354 п.о., кодирующую белки-предшественники, состоящие из 118 аминокислотных остатков. Шестая последовательность [номер GenBank AY793556 (Lc-LTP5)] содержит открытую рамку считывания длиной 348 п.о., кодирующую укороченный на две аминокислоты (в том числе на С-концевой фенилаланин) белок-предшественник, состоящий из 116 аминокислотных остатков. Анализ аминокислотных последовательностей с помощью алгоритма SignalP v.3.0 показал высокую вероятность наличия сигнального пептида, состоящего из 24-25 аминокислотных остатков и отщепляемого по связям Ala25-Ala26 (в случае Lc-LTP1 и Lc-LTP3), Gly25-Ala26 (для Lc-LTP2, Lc-LTP4 и Lс-LTP6) и Gly24-Ala25 (в случае LcLTP5). Три из выделенных LTP чечевицы (Lc-LTP2,4,6) очень близки по своей структуре. Lc-LTP2 и Lc-LTP4 различаются между собой всего двумя аминокислотными остатками: в положении 85 в зрелой части белков (Thr/Ser) и в положении 14 в сигнальном пептиде (Met/Ile). Изоформы Lc-LTP4 и Lc-LTP6 отличаются только на один аминокислотный остаток в положении 77 (Asn/Asp). Наименьшее сходство со структурами других липид-транспортирующих белков чечевицы имеет Lc-LTP1 (рис. 8). Выделенные нами липид-транспортирующие белки из чечевицы обладают высокой степенью гомологии с LTP из семян нута Cicer arietinum: 76% идентичных остатков в случае Lc-LTP2 и 77% для Lc-LTP4. Для того, чтобы соотнести аминокислотные последовательности, транслированные с кодирующих нуклеотидных последовательностей, с таковыми у выделенных LTP, был проведен триптический гидролиз восстановленных и Sпиридилэтилированных белков, который привел к образованию 13 фрагментов (рис. 7б). 15 16 Рис. 7. Последовательность кДНК, кодирующая предшественник Lc-LTP2, и соответствующая ей аминокислотная последовательность пребелка. Открытая рамка считывания включает сигнальный пептид (показан светло-серым цветом) и зрелый белок (показан черным цветом). Показаны сайты отжига праймеров, использованных для амплификации концов кДНК. б – Триптические фрагменты восстановленных Lc-LTP2,4,6. Серым цветом выделены аминокислотные остатки, по которым происходило расщепление. 13 Рис. 8. Сравнение аминокислотных последовательностей предшественников Lc-LTP1-8. Светло-серым цветом выделены сигнальные пептиды, черным – зрелые белки, аминокислотные замены показаны белым цветом. Рассчитанные с помощью программы Protean (DNASTAR) молекулярные массы 14 триптических фрагментов Lc-LTP2,4,6 соответствовали массам фрагментов выделенных LTP, определенных методом времяпролетной масс-спектрометрии МАЛДИ. Принимая во внимание то, что разница между молекулярными массами Lc-LTP4 и Lc-LTP6 составляет всего 1,0 Да, было выполнено микросеквенирование фрагмента XI CGV(N,D)IPYK при помощи тандемной времяпролетной масс-спектрометрии МАЛДИ, которое позволило нам идентифицировать остаток Asn77. В результате нами было установлено, что выделенные LTP чечевицы с m/z молекулярных ионов [M+H]+ 9269,1 и 9283,1 соответствуют зрелым белкам Lc-LTP4 и Lc-LTP2 (расчетные молекулярные массы 9268,7 Да и 9282,7 Да, соответственно; EditSeq, DNASTAR). Выделенные белки с m/z молекулярных ионов [M+H]+ 9121,9 и 9135,9, названные Lc-LTP8 и Lc-LTP7, являются укороченными изоформами Lc-LTP4 и Lc-LTP2 без С-концевого Phe (расчетные молекулярные массы 9121,5 Да и 9135,5 Да, соответственно; EditSeq, DNASTAR, рис. 8). Так как в процессе выделения белков использовался коктейль ингибиторов протеаз, присутствие укороченных изоформ Lc-LTP7,8, возможно, является 17 результатом экспрессии соответствующих генов или ферментативного отщепления Сконцевого остатка непосредственно в растительных клетках. Таблица 2. Антимикробное действие Lc-LTP2/4. А 620 Тест-микроорганизмы IC50, мкМ/л 0,8 Грамотрицательные бактерии 16 Agrobacterium tumefaciens А281 0,7 0,6 27-40,5 0,5 Фитопатогенные грибы Aspergillus niger VKM F-2259 0,4 17,5 0,3 10,85-21,7 0,2 Fusarium culmorum VKM F-844 >21,7 0,1 Neurospora crassa VKM F-184 >21,7 0 Phytophthora infestans de Bary УДАЧА 2 >18,3 Botrytis cinerea VKM F-3700 контроль 13,5 мкМ 27 мкМ 40,5 мкМ 54 мкМ 12 18 24 Время, ч 30 Рис. 9. Влияние Lc-LTP2/4 на рост Agrobacterium tumefaciens. Литературные источники свидетельствуют, что присутствие нескольких изоформ 15 белков в одном растении типично для класса LTP. Представители данного класса обладают антимикробной активностью и способностью связывать и переносить липиды, являются многофункциональными белками и, предположительно, принимают участие в таких биологических процессах в растениях, как синтез кутина, эмбриогенез, адаптация к стрессу (холод, засуха, засоление почвы и т.д.), защита растений от фитопатогенов. Различные изоформы LTP, как полагают, выполняют различные функции в растениях, и уровень их экспрессии зависит от условий окружающей среды. В подтверждение присутствия в семенах чечевицы множественных изоформ LTP нами были обнаружены мРНК шести белков Lc-LTP1-6, которые, по-видимому, синтезируются на разных стадиях развития растения. Синтез изоформ Lc-LTP2,4,7,8 выделенных нами из проращѐнных в течение трех дней семян чечевицы, происходит на ранней стадии развития проростков и, возможно, обусловлен участием этих белков в борьбе с 18 инфекциями и мобилизации липидов при переходе эмбриональных клеток из фазы покоя в фазу активного метаболизма при прорастании семян. Защитная функция выделенных LTP была подтверждена наличием антимикробной активности, которую определяли, как и в случае дефенсина, методом серийных разведений антибиотика в жидкой питательной среде. Антимикробная активность природных LTP чечевицы была исследована в отношении двух фитопатогенных грибов - Aspergillus niger VKM F-2259 и Alternaria alternata VKM F3047, а также в отношении грамотрицательной бактерии Agrobacterium tumefaciens А281. Исследование влияния природных LTP чечевицы на рост оомицета Phytophthora infestans (Mont.) de Bary УДАЧА 2, возбудителя фитофтороза, было проведено в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН. Противогрибковая активность рекомбинантного аналога Lc-LTP2, полученного в УНЦ ИБХ РАН в результате его гетерологической экспрессии в клетках E. coli BL-21 (DE3) в составе гибридного белка с модифицированным тиоредоксином А и октагистидиновой последовательностью, была также исследована в отношении еще семи фитопатогенных грибов (Aspergillus versicolor VKM F-1114, Fusarium solani VKM F-142, Fusarium culmorum VKM F-844, Fusarium oxysporum ТСХА-4, Neurospora crassa VKM F-184, Botrytis cinerea VKM F-3700, Ascochyta pisi VKM F-1173). Результаты тестирования показали, что LTP чечевицы обладают как антибактериальной, так и противогрибковой активностью и ингибируют рост шести использованных тест-культур (табл. 2). Наиболее чувствительными к LTP чечевицы являются возбудители аспергиллезной и серой гнили растений A. niger и B. cinerea, соответственно, а также почвенная бактерия A. tumefaciens, вызывающая опухоли у растений (рис. 9). В тоже время, LTP чечевицы не влияют на прорастание спор и рост таких фитопатогенов, как A. versicolor, A. alternata, A. pisi, F. oxysporum и F. solani в максимальной использованной концентрации 21,7 мкм/л. Установлено, что представители класса LTP так же, как и многие другие PRP, являются растительными аллергенами, участвующими в развитии аллергических реакций на пыльцу, растительные продукты и латекс. Чечевица является основным 19 ES1 ES2 ES3 NL4 NL5 NL6 NL7 кДа бобовым растением, вызывающим аллергические реакции у детей, живущих в странах Средиземноморского бассейна и в Индии. Ранее в семенах чечевицы были обнаружены всего два 17 аллергена: субъединица γ-вицилина Len c 1 (47 17 14 6 кДа) и специфический Рис.10. Иммуноблоттинг Lc-LTP2/4 с сыворотками пациентов с пищевой аллергией из Испании (ES) и Нидерландов (NL). Детектирование специфичных IgE проводили авторадиографией, используя 125Iмеченные овечьи антитела. семян биотинилированный белок Len c 2 (66 кДа). Совместно с отделом иммунологии 3 для экспериментальной Академического медицинского центра г. Амстердама (Нидерланды) нами было проведено исследование взаимодействия природных LTP чечевицы и рекомбинантного аналога Lc-LTP2 с IgE из сывороток пациентов с пищевой аллергией. Результаты иммуноблоттинга (рис. 10) и иммуноферментного использованием тест-системы анализа с ImmunoCap показали, что в сыворотках пациентов с пищевой аллергией на чечевицу, горох, орехи, фрукты и другие продукты присутствуют IgE, специфичные к LTP чечевицы. Анализ полученных данных позволил прийти к выводу о том, что LTP чечевицы являются перекрестными аллергенами и имеют наибольшее сходство с Ara h 9 из арахиса. LTP чечевицы были внесены нами в базу данных по аллергенам (www.allergen.org) Международного союза иммунологических обществ (IUIS) под аббревиатурой Len c 3. Таким образом, чечевица является третьим после арахиса и стручковой фасоли бобовым растением, из которого были выделены LTP, охарактеризованные как новые аллергены. 20 ВЫВОДЫ 1. В семенах чечевицы Lens culinaris обнаружено 9 новых PRP, выполняющих защитную функцию в растениях, а именно: новый растительный дефенсин Lc-def и подсемейство из 8 новых липид-транспортирующих белков Lc-LTP1-8. Разработаны методики выделения растительного дефенсина Lc-def и четырех липид-транспортирующих белков из проращѐнных семян чечевицы Lens culinaris. Определены полные аминокислотные последовательности выделенных PRP. 2. Установлены структуры полноразмерных кДНК, кодирующих белки- предшественники дефенсина Lc-def и шести изоформ липид-транспортирующих белков из семян чечевицы Lens culinaris, и соответствующие им полные аминокислотные последовательности предшественников этих белков. 3. Проведено исследование функциональной активности выделенных PRP. Показано, что дефенсин чечевицы Lc-def обладает противогрибковой активностью и характеризуется специфичностью действия в отношении ряда фитопатогенных грибов. Показано, что липид-транспортирующие белки чечевицы обладают антибактериальной активностью и ингибируют рост фитопатогенных грибов. 4. Установлено, что липид-транспортирующий белок чечевицы Lc-LTP2 является новым пищевым аллергеном. Lc-LTP2 внесен в международную базу данных по аллергенам как Len c 3. 21 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 1. Финкина Е.И., Баландин С.В., Серебрякова М.В., Потапенко Н.А., Тагаев А.А., Овчинникова Т.В. Выделение и первичная структура новых липид-транспортирующих белков из проращѐнных семян чечевицы (Lens culinaris) // Биохимия. – 2007. - Т.72. - №4. - С.533-543. 2. Finkina E.I., Shramova E.I., Tagaev A.A., Ovchinnikova T.V. A novel defensin from the lentil Lens culinaris seeds // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2008. – Vol.371(4). – P.860865. 3. Овчинникова Т.В., Финкина Е.И., Баландин С.В. Плазмидный вектор pE-Lc-LTP, штамм бактерии Escherichia coli для экспрессии липид-транспортирующих белков чечевицы Lens culinaris и способ получения указанных белков // Заявка на патент РФ №2009129838 (041521) от 04.08.2009. 4. Баландин С.В., Финкина Е.И., Овчинникова Т.В. Рекомбинантная плазмидная ДНК pE-Trx-Lc-def, штамм Escherichia coli для экспрессии антимикробного пептида дефенсина чечевицы Lens culinaris и способ получения указанного пептида. Заявка на патент № 2010154169 от 30.12.2010г. 5. Финкина Е.И., Овчинникова Т.В. Выделение белково-пептидных антибиотиков из семян чечевицы Ervum lens // Тезисы докладов и стендовых сообщений XVI зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". - М., 2004., С. 43. 6. Финкина Е.И., Баландин С.В., Овчинникова Т.В. Структура мРНК, кодирующих новые липид-транспортирующие белки из семян чечевицы обыкновенной Lens culinaris // Тезисы докладов и стендовых сообщений VII чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова. - М., 2004. - С. 45. 7. Финкина Е.И., Серебрякова М.В., Потапенко Н.А., Баландин С.В., Овчинникова Т.В. Аминокислотные последовательности новых липид-транспортирующих белков из семян чечевицы обыкновенной Lens culinaris // Тезисы докладов и стендовых сообщений XVII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". - М., 2005., С. 51. 8. Финкина Е.И., Баландин С.В., Овчинникова Т.В. Новый дефенсинoподобный белок из семян чечевицы Lens culinaris // Тезисы докладов и стендовых сообщений XVIII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". – М., 2006., С.53. 22 9. Финкина Е.И., Баландин С.В., Овчинникова Т.В. Новый дефенсин из семян чечевицы Lens culinaris // Тезисы докладов и стендовых сообщений VIII чтений, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова. – М., 2006., С. 70. 10. Финкина Е.И., Овчинникова Т.В. Новый дефенсин из семян чечевицы Lens culinaris // Тезисы стендовых сообщений III российского симпозиума "Белки и пептиды". - Пущино, 2007., С. 20. 11. Т.В. Овчинникова, С.В. Баландин, А.А. Василевский, Ц.А. Егоров, С.А. Козлов, К.А. Плужников, Е.А. Рогожин, А.А. Тагаев, Е.И. Филясова, Е.И. Финкина, З.О. Шенкарев, Е.В. Гришин. Антимикробные пептиды природного происхождения: поиск, структурный анализ, биологические свойства, методы получения и применение для конструирования лекарственных средств нового поколения // Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы". - М., 2007., С. 45. 12. Финкина Е.И., Овчинникова Т.В. Выделение и первичная структура нового дефенсина из проращѐнных семян чечевицы Lens culinaris // Тезисы Четвертого Московского Международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития". - М., 2007., С. 308. 13. Т.В.Овчинникова, С.В. Баландин, А.А. Тагаев, Е.И. Финкина, З.О. Шенкарев, З.А. Якименко. Создание лекарственных средств нового поколения на основе природных антимикробных пептидов. Тезисы докладов на конференции по научным направлениям Программы фундаментальных исследований РАН «Фундаментальные науки – медицине», Москва, 2008, с. 158-159. 14. Финкина Е.И., Овчинникова Т.В. PR-белки из семян чечевицы Lens culinaris // Тезисы докладов и стендовых сообщений XX зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". - М., 2008., С. 23. 15. Финкина Е.И., Овчинникова Т.В. Структурно-функциональная характеристика PRбелков из проращѐнных семян чечевицы Lens culinaris // Тезисы Международной научно-практической конференции “Биотехнология. Вода и пищевые продукты”. - М., 2008., С. 227. 16. Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Баландин С.В., Овчинникова Т.В. Получение рекомбинантного липид-транспортирующего белка чечевицы обыкновенной Lens culinaris // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXI зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". – М., 2009., С.66. 23 17. Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Баландин С.В., Овчинникова Т.В. Изучение нового липид-транспортирующего белка чечевицы Lens culinaris // Тезисы Пятого Московского Международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития".– М., 2009., С.338. 18. Алексеева Е.А., Финкина Е.И., Баландин С.В., Овчинникова Т.В. Исследование нового дефенсина из семян чечевицы Lens culinaris // Тезисы Пятого Московского Международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития".– М., 2009., С.294. 19. Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Баландин С.В., Овчинникова Т.В. Гетерологическая экспрессия липид-транспортирующего белка чечевицы в клетках E. coli // Тезисы Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова. – М., 2009., С.137. 20. Алексеева Е.А., Финкина Е.И., Баландин С.В., Овчинникова Т.В. Получение рекомбинантного дефенсина чечевицы Lens culinaris // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". – М., 2010., С.90. 24 Напечатано с готового оригинала-макета ООО «Документ сервис «ФДС»» ИНН 772801001 Подписано к печати 25.02.2011 г. Тираж 100 экз. Заказ 463. Тел. 935-00-89. Тел./Факс 432-99-96 119421, г. Москва, Ленинский проспект, д. 99.
