Эволюция диагностики вирусных гепатитов в Службе крови

Эволюция диагностики
вирусных гепатитов в
Службе крови
Туполева Татьяна Алексеевна
Голосова Татьяна Васильевна
Филатов Феликс Петрович
Успехи клинической трансфузиологии не снижают
опасность передачи с кровью и ее дериватами
возбудителей инфекционных заболеваний.
Среди инфекций передаваемых трансфузионным
путем важная проблема во многих странах - это
вирусные гепатиты.
У нас в стране заболеваемость парентеральными
гепатитами остается по прежнему высокой
( не менее 100000 в год).
40
30
ХВГ
ХГС
20
10
0
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
100
80
60
ОГВ
ОГС
40
20
0
1998
2000
2003
2004
2007
2008
«Вирусные гепатиты в РФ» Справочник 2009 г.
Манефестные формы острых гепатитов
25%
Бессимптомные и стертые формы острых
гепатитов встречаются чаще (75%).
Соотношение различных форм
вирусного гепатита В
16
14
12
10
8
6
4
2
0
субклинический
клинический
При субклиническом течении ВГВ хронизация
процесса наступает в 15% случаев, по сравнению с
клинически выраженными формами (4%).
Снижение риска
заражения
пациентов при
гемотрансфузиях
является одной из
актуальных
проблем
трансфузионной
медицины.
Решение этой проблемы представляется возможным
при создании и внедрении в лабораторную практику
службы крови современных быстрых надёжных и
чувствительных методов обнаружения вирусов в
донорской крови.
Эволюция методов
обследования донорской крови
1960 г
Билирубин
Сифилис
1972 – 74 г
HBsAg
Сифилис
Билирубин
1987 г
HBsAg
Анти-ВИЧ
Сифилис
АЛТ
1994 г
HBsAg
Анти-ВИЧ
Сифилис
АЛТ
Анти HCV
Заболеваемость посттрансфузионными гепатитами в мире
30%
10%
1%
0,6%
Чувствительность различных методов выявления HBsAg
РПГ
ВИЭФ
РПГА
в 10-100 раз
ниже, чем ВИЭФ
1000 нг
5-20 нг
ИФА
ПЦР
0.1-1 нг
10 мол.НК
Reduction of Risk of Transfusion
Transmitted Hepatitis B
Volunteer Donors
HBsAg
HTLV 1.0
% Post-Transfusion
Hepatitis
30
HTLV-I/II
HCV 1.0
25
HIV-1
20
15
10
5
ALT
HIV-1/2
HCV 2.0
HCV/HIV
NAT
CUE
Anti-HBc
HCV 3.0
p24 Ag
HTLV 2.0
WNV NAT
HBsAg 3
Bacterial detection
19
6
19 9
7
19 1
7
19 3
7
19 5
7
19 7
7
19 9
8
19 1
8
19 3
8
19 5
8
19 7
8
19 9
9
19 1
9
19 3
9
19 5
9
19 7
99
20
01
20
03
20
05
0
Chagas?
Babesiosis?
Andromeda strain?
Year of Introduction of Test
After H. Alter
New York Blood Center
В России официальная регистрация ПТГ относится
только к гепатитам В и С.
Известно, что к возникновению гепатитов причастны и
другие вирусы с парентеральным механизмом
передачи инфекции.
ВГВ-25-30%
ВГС-50-60%
ЦМВ-4-6%
Другие
ЭБВ-0,5%
ЦМВ-2-10%
По данным ученых из Голландии
По нашим данным
Молекулярные маркеры вирусов гепатитов и
герпесвирусов в биоптатах печени (n=56)
ДНК ВГВ
N=20
45%
ДНК ВЭБ
N=14
32%
РНК ВГС
N=6
ДНК ЦМВ
N=3
5,3%
?⇒ Нужно смотреть
• серологические
• и молекулярные маркеры
ВЭБ и ЦМВ в донорском материале.
Использование высокочувствительных ИФА-тестов при
обследовании доноров и реализация программ
вакцинопрофилактики ВГВ, несомненно,
способствовали снижению ПТГ.
Тем не менее,
нулевой риск
инфицирования при
переливании
компонентов и
препаратов
донорской крови
остается пока
недостижимой
целью.
Сравнительный анализ структуры
донорских кадров в России
свидетельствует о серьёзных изменениях,
продолжающихся в донорском движении:
• Миграция населения – приток доноров из
энденмичных по вирусным гепатитам
регионов.
• Увеличение числа доноров из социально
неблагополучных слоев общества
В ряде стран Западной Европы, Северной Америки
молекулярные методы используются в национальных
масштабах для отбора донорской крови в формате минипулов
и даже больших производственных пулов плазмы уже много
лет.
Эти страны характеризуются
• низкими показателями эндемичности по ВГВ и ВГС
• и высококачественной системой отбора доноров
Выявляемость инфицированных ВГВ доноров,
находящихся в периоде
пресероконверсионного «окна», тесно связана
с эндемичностью HBV в регионе.
1 Случай выявления в периоде «окна»:
Эндемичность Низкая
Средняя
Высокая
Число донаций 350000610000
50000
5000
Применение полимеразной цепной
реакции (ПЦР) позволяет сократить
негативное окно для
• ВГВ – в полтора раза,
• а для ВГС – в 3 раза,
соответственно снижая риск
передачи этих вирусов через
донорскую кровь и ее препараты.
?⇒ Нужно смотреть
• ДНК ВГВ
• РНК ВГС
В последние 10 лет внимание трансфузиологов
привлечено к проблеме так называемого «HBsAgнегативного» гепатита, связанного с существованием
латентно текущей (скрытой) НВ-вирусной инфекции.
В этом случае ДНК ВГВ определяется в гепатоцитах
печени, в плазме крови она может содержаться в
очень низких концентрациях (менее 200 МЕ/мл) или
вообще не обнаруживаться.
При серопозитивном варианте
скрытой инфекции в русле крови
циркулируют «изолированные»
анти-НВс или в сочетании с
анти-HBs;при серонегативном –
антительные маркеры
отсутствуют.
Существует несколько механизмов, ответственных за
не обнаруживаемый HВsAg при скрытом гепатите В у
больных с изолированными анти-НВс и позитивных по
HBV ДНК.
• HВsAg может отсутствовать благодаря
мутациям, таким как делеции в пре-S
области, которые могут блокировать
экспорт этого антигена
• мутации главных гидрофильных петель
(аминокислоты 98-156) могут
воздействовать на конформацию
антигена и его связывание со
специфическими антителами
• при наличии циркулирующих иммунных
комплексов, которые формируются за
счет антигенов и их специфических
антител
• может быть благодаря коинфекции HVC,
при которой ядерные протеины HVC
мешают репликации HBV и синтезу
вирусных протеинов.
• Низкая концентрация HВsAg.
Распространенность латентной НВ-вирусной
инфекции среди доноров
США, Канада, страны
Западной Европы,
Япония
Россия
от 0 до 4,6% (среднее
значения 1-1,2%)
от 0,9 до 5,6%
Для Службы крови эпидемиологическое значение
скрытой НВ-вирусной инфекции очевидно, т.к.
вирусная безопасность напрямую связана с
выявлением латентных вирусоносителей среди
доноров.
?⇒ Нужно смотреть
• Анти-НВс
• Анти-НВs
По данным японских ученых
дозы крови с уровнями анти-HВs выше
100 МЕ/мл должны быть безопасны.
Переливание:
• 22 компонентов HBV ДНК – позитивных при
индивидуальном NAT, которые содержали
анти-HВs
нет HBV-трансмиссии.
• 37 компонентов, которые не содержали
анти-HВs
10 случаев возникновения
инфекции.
\F. Blain Hollinger. Hepatitis B virus infection and transfusion medicine: science and the occult. (review).
Transfusion 2008, vol.48, p.1001-1021.
Тесты для обнаружения анти-НВс
вызывают большую дискуссию среди
работников Службы крови из-за
определенного числа доноров, которые
некорректно отстраняются в связи с
ложноположительными результатами.
Ложноотрицательные реакции
Следует осознавать, что обязательный контроль крови и
плазмы, даже при полном соответствии всем требованиям,
оставляет вероятность ложноотрицательной реакции, которая
может быть обусловлена следующими причинами
1.
2.
3.
4.
низкая репликативная активность вируса,
иммунологическое “окно”,
недостаточная чувствительность тест-систем,
человеческий фактор.
Поэтому каждая кровь должна
рассматриваться как потенциально
контаминированная.
Для медицинских работников Службы крови,
которые связаны с безопасностью трансфузий,
главный интерес состоит в идентификации
доноров с HBV-инфекцией, которая может
быть пропущена современными
скринирующими методами.
Повышенная чувствительность и
специфичность этих тестов уменьшила риск,
но не ликвидировала его.
Увеличение числа доноров и реципиентов,
которые были вакцинированы против гепатита
В также способствует этой безопасности.
Последствия
вакцинопрофикактики ВГВ:
• + снижение числа фульминантных
форм с летальным исходом за счет
дикого штама
• - искусственная селекция скрытого
гепатита за счет мутантных форм
вируса с меньшей репликативной
активностью.
Наши наблюдения:
• Методы диагностики ВГВ в донорской крови
регулярно совершенствуются (ИФА,ПЦР)
• Заболеваемость острым вирусным гепатитом В
населения снижается, но
остается
значительным число хронических
больных.
Вопрос об адекватности –
то ли мы смотрим?
В нашей лаборатории ПЦР диагностика
осуществляется с 1999 года.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВГВ
И ВГС НА СТАНЦИИ ПЕРЕЛИВАНИЯ КРОВИ
ПЦР+ (РНК ВГС)
ИФА
(а-ВГС)
Количество образцов
+
5
3
-
553
1
Всего
558
4
FRT
ИФА
(HBsAg)
Количество образцов
ПЦР+ (ДНК ВГВ)
+
2
1
-
439
9
Всего
441
10
FRT
Результаты тестирования пулированных образцов
плазм доноров на ДНК ВГВ.
Величина пула, содержащего или не
содержащего образец,
контаминированный по ДНК ВГВ
Результат в
АмплиСенс HВVFRT
Результат в АмплиСенс100-R ВГВ-470/770-ВКО
6 (ДНК+)
+
+
6 (ДНК+)
-
-
6
-
-
6
-
-
6
-
-
12 (ДНК+)
-
-
12 (ДНК+)
-
-
12
-
-
12
-
-
12
-
-
всего позитивных по ДНК ВГВ пулов:
1
1
?⇒ Нужно
тестировать в формате
минипулов
• ПЦР-скринирование пулированной плазмы на ВГВ может
быть недостаточно эффективным из-за его низких
концентраций в период серонегативного окна (1-2.400
геном-экв/мл); это обусловлено более продолжительным
временем удвоения ВГВ, составляющим 2,8 дня - по
сравнению с 17 часами для ВГС и 22 часами для ВИЧ-1.
• ПЦР-скринирование в формате минипулов имеет
минимальное преимущество и по сравнению с новыми
ИФА-тестами на ВГВ (на HBsAg).
• В то же время ПЦР индивидуальных образцов
обеспечивает обнаружение ВГВ на 25-36 дней раньше –
и, конечно же, с более высокой чувствительностью,
нежели ИФА-тесты.
Разработана и используется ПЦР в
мультиплексном формате
При проведении ПЦР в мультиплексном
формате возникает ряд трудностей:
• количество одновременно идентифицируемых
мишеней ограничивается возможными
межпраймерными взаимодействиями,
• перекрывание спектров поглощения и
испускания, используемых флуорофоров не
позволяет одновременно регистрировать более
четырёх-пяти продуктов амплификации в одной
реакции.
Применение ПЦР в формате биочипов для
детекции вирусов иммунодефицита (ВИЧ-СПИД)
и гепатитов В и С (ВГВ и ВГС) в донорской крови
Работа выполнена в лаборатории
клинико-вирусологической диагностики
гепатитов и СПИД ГНЦ РАМН
и
в Лаборатории биологических
микрочипов Института молекулярной
биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.
Схема микрочипа для одновременного количественного
определения HIV-1, HBV и HCV. Все ячейки находятся
внутри единой камеры микрочипа объемом 25 мкл,
содаржащей все необходимые реагенты.
Схема второй стадии ПЦР на микрочипе.
В случае применения олигонуклеотидных микрочипов,
благодаря физическому разделению индивидуальных гелевых
ячеек с иммобилизованными в них праймерами, стало
возможным применение одного неспецифичного ДНКсвязывающего флуоресцентного красителя (SYBR Green I) для
одновременного и независимого выявления всех продуктов
мультиплексной ПЦР.
Возможности метода на основе
олигонуклеотидных микрочипов
Качественный и количественный анализ
вирусных маркеров:
• может быть использован в донорстве
• для оценки противовирусной терапии у
больных.
Применение олигонуклеотидных
микрочипов, представляется наиболее
перспективным подходом для
одновременной идентификации и
количественного анализа различных
генетических мишеней.
Методика позволяет
расширять спектр исследуемых
инфекций на одном микрочипе.
Профилактика
посттрансфузионных гепатитов
завтра
• ПЦР- и ИФА-диагностика расширенного
спектра инфекционных агентов в исходном
сырье с применением микрочипов.
• Противовирусная инактивация всех
компонентов и препаратов крови
Спасибо за внимание