Определение мутации BRAF V600E у пациентов с меланомой

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 616.5-006.81-07-091.8
Определение мутации BRAF V600E у пациентов с меланомой кожи:
клинико-морфологические особенности
М.Б. АКСЕНЕНКО1, С.С. БЕКУЗАРОВ2, Т.Г. РУКША1
1
ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России,
Красноярск; 2КГБУЗ «Красноярское краевое патологоанатомическое бюро», Красноярск, Российская Федерация
BRAF V600E mutation detection in melanoma patients: Clinical and morphological
features
M.B. AKSENENKO1, S.S. BEKUZAROV2, T.G. RUKSHA1
1
Professor V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University, Ministry of Health of Russia, Krasnoyarsk; 2Krasnoyarsk Territorial
Pathological Anatomy Bureau, Krasnoyarsk, Russia
Цель исследования — оценить частоту мутации BRAF V600E у пациентов с меланомой кожи и ассоциацию данного вида
мутации с клинико-морфологическими характеристиками заболевания. Материал и методы. Проведен анализ мутации
у 71 пациента с меланомой кожи, находившегося на лечении в КГБУЗ «Красноярский краевой онкологический диспансер». Анализ мутации BRAF V600E осуществляли методом аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени. Перед
выделением ДНК стекла с материалом, полученным от пациентов, окрашенные гематоксилином и эозином, оценивали на
предмет содержания опухолевых клеток в срезе. В дальнейшем проводились выделение геномной ДНК с помощью набора
FFPET DNA-Extraction Kit («Биолинк», Россия) и постановку реакции ПЦР в реальном времени. Результаты. У 40,84% больных наблюдалась мутация V600E гена BRAF, в 59,16% случаев данный вид мутации не определялся. Выявлены особенности
локализации и гистотипа опухоли в зависимости от BRAF-статуса. Заключение. Определение наличия или отсутствия
мутации V600E в гене BRAF у пациентов с меланомой кожи является важным звеном в оценке биологического поведения
опухолевых клеток и реализации ими таких биологически значимых функций, как опухолевая инвазия, метастазирование,
неоангиогенез, что имеет значение для дальнейшей оценки опухолевой прогрессии и последующего прогноза течения
заболевания.
Ключевые слова: меланома кожи, ген BRAF, аллельспецифичная ПЦР.
Objective — to estimate the frequency of BRAF V600E mutation in melanoma patients and to assess an association of this type of
mutation with the clinical and morphological characteristics of the disease. Material and methods. The mutation of BRAF V600E
was analyzed using an allele-specific real-time PCR assay in 71 melanoma patients treated at the Krasnoyarsk Territorial Oncology
Dispensary. Before DNA isolation, the glasses containing the material obtained from the patients and stained with hematoxylin
and eosin were tested for the content of tumor cells in the sections. Later on, genomic DNA was isolated with a FFPET DNAExtraction kit (Biolink, Russia) and the real-time PCR assay was carried out. Results. The BRAF V600E mutation was observed in
40.84% of the patients and was not in 59.16%. There were specific features in tumor location and histotype in relation to the status
of BRAF. Conclusion. To detect whether the V600E mutation is present or absent in the BRAF gene in melanoma patients is an
important component in the evaluation of the biological behavior of tumor cells and their performance of biologically significant
functions, such as tumor invasion and dissemination and neoangiogenesis, which is important for the further assessment of tumor
progression and disease prognosis.
Key words: melanoma, BRAF gene, allele-specific PCR.
Меланома кожи является новообразованием, развивающимся в результате злокачественной трансформации
меланоцитов и меланобластов [1, 2]. Исследования последних лет в области эпидемиологии меланомы кожи
установили четкий рост заболеваемости меланомой в разных странах мира, в том числе и в России [3], что делает
чрезвычайно актуальной проблему повышения эффективности ее лечения. Молекулярно-биологические исследования клеток меланомы определили, что при меланоме
кожи наблюдается более 40 различных точковых мутаций
в ключевом онкогене BRAF [4]. В 40—60% случаев мелано-
ма кожи ассоциирована с мутациями онкогена BRAF (локализация в геноме клетки 7q34), следствием которых является конститутивная активация серинтреониновой киназы BRAF и соответственно митогенного сигнала по пути MAPK/ERK [5]. Около 90% таких мутаций приводит к
замене глутамата на валин в кодоне 600 (BRAF V600E);
известны и другие активирующие BRAF-мутации (например, BRAF V600K, BRAF V600R) [6]. Одним из наиболее
значимых достижений молекулярной медицины последних десятилетий явилось определение у пациентов с меланомой кожи молекулярно-генетических подтипов и выяв-
© Коллектив авторов, 2014
Аксененко Мария Борисовна — канд. мед. наук, ассистент каф. патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии; 660022
Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1; e-mail: [email protected]
38
АРХИВ ПАТОЛОГИИ, 5, 2014
ление разных механизмов развития меланомы кожи, что
позволило избирательно подходить к лечению пациентов
с таким заболеванием. Вместе с тем это привело к появлению новых нерешенных проблем. Во-первых, отсутствует
терапия BRAF-негативной меланомы кожи. Во-вторых,
несмотря на хорошие результаты проводимой таргетной
терапии у пациентов с BRAF-позитивной меланомой,
спустя 2—18 мес после применения BRAF-ингибиторов,
развивается резистентность к данному виду лечения с быстрым дальнейшим прогрессированием заболевания.
Вместе с тем продукт гена BRAF является наиболее доказанной молекулярной мишенью при лечении меланомы
кожи, и таким образом является оправданным дальнейшее разъяснение механизмов развития меланомы кожи,
формирования особенностей инвазивного роста, метастазирования в зависимости от присутствия или отсутствия
мутации вышеуказанного гена.
Цель — оценить частоту мутации BRAF V600E у пациентов с меланомой кожи и ассоциацию с клинико-морфологическими характеристиками заболевания.
Материал и методы
Анализ данных историй болезней пациентов с меланомой кожи осуществлялся на базе КГБУЗ «Красноярский краевой онкологический диспансер». Биоптаты
больных с меланомой кожи (n=71) получены в КГБУЗ
«Красноярское краевое патологоанатомическое бюро».
Перед выделением ДНК стекла с материалом, окрашенные гематоксилином и эозином, оценивали на предмет
содержания опухолевых клеток в срезе. В дальнейшем
проводили выделение геномной ДНК с помощью набора
FFPET DNA-Extraction Kit («Биолинк», Россия). Анализ
мутации BRAF V600E осуществляли методом аллельспецифичной ПЦР в режиме реального времени. На
первом этапе осуществлялась нормализация концентрации ДНК к концентрации ДНК в отрицательном стандарте: оптимальной является концентрация ДНК в образце, при которой Ct неизвестных образцов в контрольной реакции отличалась от Ct ДНК контроля не более
чем на 2 цикла.
Контрольная реакция проводится для оценки пригодности образцов ДНК для дальнейшего анализа. Определение концентрации ДНК по оптической плотности
при длине волны 260 нм не позволяет выбрать концентрацию, оптимальную для BRAF-теста. Причинами могут
быть частичная деградация или химические модификации ДНК, возникшие при фиксации ткани, которые могут ингибировать или снижать эффективность ПЦР. Качество и количество ДНК оценивается по величине Ct,
которая соответствует количеству циклов ПЦР, при которых кривая флюоресценции пересекает заданный уровень
фона. Различные разведения образцов ДНК сравниваются в контрольной ПЦР с ДНК отрицательного стандарта.
Для дальнейшей аллель-специфичной ПЦР выбирают
разведение образца ДНК, которое имеет наиболее близкую величину Ct относительно отрицательного ДНКстандарта.
На этом этапе выбранные разведения ДНК тестируют
в аллель-специфичной ПЦР. Для этого используют праймеры, специфичные к мутации V600E в гене BRAF. ДНК
BRAF дикого типа (без мутации) амплифицируется в тех
же условиях с увеличением Ct на 5 циклов, что позволяет
отличать ее от мутантной. Для нормировки результатов
АРХИВ ПАТОЛОГИИ, 5, 2014
все образцы тестируют в реакции с контрольной смесью,
также в каждый эксперимент включают ПЦР с положительным стандартом и контролем без матрицы.
Для всех образцов ДНК результаты ПЦР для мутации
BRAF представляют в виде: dCt = CtAS – CtC,
где CtAS — среднее Ct образца ДНК в ПЦРспецифичной к мутации BRAF, CtC — среднее Ct того же
образца ДНК в контрольной ПЦР. Затем dCt образца
сравнивают с dCt-положительного стандарта, содержащего 1% ДНК с мутацией. Образец является положительным
(содержащим мутацию), если dCt образца равно или
меньше dCt-положительного стандарта. Образец является
отрицательным (без мутации или содержание мутации
менее 1%), если dCt образца больше dCt-положительного
стандарта.
Проверку нормальности распределения выборки
проводили с помощью критерия Колмогорова—Смирнова. Достоверность различий определяли с помощью критерия Манна—Уитни. Для оценки качественных признаков применяли точный односторонний критерий Фишера. При р<0,05 различия признавались статистически
значимыми.
Результаты и обсуждение
Анализ частоты встречаемости мутации V600E гена
BRAF у больных с меланомой кожи выявил наличие данной мутации у 40,84% пациентов, в 59,16% случаев данный вид мутации не определялся (рис. 1, а, б). Не было
выявлено значимых различий между полом пациентов в
зависимости от BRAF-статуса (p>0,05) (табл. 1). В литературе имеются данные о том, что мутация гена BRAF чаще
встречается у женщин [7]. В свою очередь в исследованиях
J. Ellerhorst и соавт. [8] также не было выявлено различий
по полу и возрасту между пациентами с меланомой кожи в
зависимости от их мутационного статуса по BRAF. Средний возраст всей выборки больных составил 58,97±14,15
года. Минимальный возраст пациентов с BRAFположительным статусом составил 34 года, а максимальный возраст — 77 лет. У пациентов с отрицательным статусом он составил 26 и 88 лет соответственно. Средний
возраст манифестации меланомы кожи у пациентов, имеющих мутацию, был меньше, чем у пациентов, которые не
имели данной мутации (см. табл. 1). При этом в исследовании, проводимом W. Liu и соавт. [9], было выявлено,
что мутация гена BRAF V600E чаще встречается у пациентов в возрасте моложе 50 лет по сравнению с пациентами
старше 50 лет, несмотря на то что возраст пациентов с наличием мутации в данном исследовании был меньше, подобной тенденции не наблюдалось. Таким образом, можно отметить, что наблюдается тенденция к наличию
BRAF-позитивных меланом кожи у лиц более молодого
возраста (табл. 2). Преимущественной локализацией у
BRAF-позитивных пациентов была кожа туловища 44,8%,
у пациентов с отрицательным BRAF-статусом данная локализация также являлась преимущественной и составляла 40,4%. Известно, что анатомическая локализация меланомы кожи является одним из прогностических факторов. В частности, установлено, что опухоли, расположенные на туловище, а также в области головы и шеи, имеют
более неблагоприятный прогноз по сравнению с опухолями, расположенными на конечностях. Опухоли нижней
части туловища отличаются лучшим прогнозом, чем верхней [10].
39
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
а
б
Рис. 1. Детекция мутации V600E гена BRAF методом аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени.
а — контрольная ПЦР; б — ПЦР BRAF V600E; ДНК с мутацией (красная линия); ДНК без мутации (синяя линия).
40
АРХИВ ПАТОЛОГИИ, 5, 2014
Таблица 1. Характеристика больных с меланомой
Показатель
Мужчины
Женщины
Возраст, годы:
медиана
средний возраст ± стандартное отклонение
Локализация:
голова и шея
туловище
верхние конечности
нижние конечности
другая локализация
Уровень инвазии по Кларку:
1
2
3
4
5
Фаза роста опухоли:
радиальная
вертикальная
Толщина по Бреслоу, мм:
0,01—1,0
1,01—2,0
2,01—4,0
более 4,0
TILs статус:
Brisk
Non Brisk
Absent
Патоморфологическая форма:
ПРМ
УМ
АЛМ
ЛМ
МС
Гистологический подтип:
эпителиоидно-клеточный вариант
веретеноклеточный вариант
невоклеточный вариант
смешанно-клеточный вариант
Наличие/отсутствие пигмента:
присутствует
отсутствует
Изъязвление:
присутствует
отсутствует
AJCC:
0
I
II
III
IV
АРХИВ ПАТОЛОГИИ, 5, 2014
BRAF-статус
положительный (n=29)
отрицательный (n=42)
абс.
%
абс.
%
10
65,5
17
40,5
19
34,5
25
59,5
p
0,397
0,06
54,55
56±13,4
62,50
62,02±13,9
3
13
1
11
1
60
43,4
9,1
54,1
100
2
17
10
13
0
40
56,6
90,9
45,9
0
0,33
0,46
0,04
0,39
0,40
1
3
13
7
5
20
37,5
42,0
46,7
41,7
4
5
18
8
7
80
62,5
58,0
53,3
58,3
0,37
0,60
0,51
0,42
0,57
2
27
20
44,3
8
34
80
55,7
0,14
1
4
12
12
11,2
66,6
38,8
48
8
2
19
13
88,8
33,4
61,2
52
0,08
0,20
0,54
0,32
19
5
5
43,2
45,5
31,3
25
6
11
56,8
54,5
68,7
0,44
0,48
0,36
13
10
0
5
1
33,4
50
0
62,5
100
26
10
3
3
0
66,6
50
100
37,5
0
0,28
0,29
0,22
0,19
2
1
3
22
11,2
14,3
50
56,4
16
6
3
17
88,8
85,7
50
43,6
0,01
0,17
0,47
0,07
27
2
44,3
20
34
8
55,7
80
0,14
16
13
41,1
40,7
23
19
58,9
59,3
0,16
0
1
21
2
4
0
11,2
43,75
50
50
1
8
27
2
4
100
88,8
56,25
50
50
0,60
0,08
0,41
0,53
0,42
41
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Рис. 2. Поверхностно-распространяющаяся меланома.
Рис. 3. Лимфоцитарный инфильтрат по типу Brisk.
Цитологическая характеристика: клеточная атипия, ядерная атипия, гиперхромия ядер. Здесь и на рис. 3—5: окраска гематоксилином и эозином. ×400.
Лимфоциты проникают между опухолевыми клетками.
В настоящем исследовании выявлено значимое увеличение количества пациентов, имеющих отрицательный
BRAF-статус, с локализацией опухоли на верхних конечностях, включая пальцы кисти. Толщина первичной опухоли по Бреслоу в данной выборке варьировала от 0,1 до
8,5 мм, в большинстве случаев она находилась в диапазоне
2,01—4,0 мм. При этом преобладали пациенты, не имеющие изучаемой мутации. Почти в половине случаев
(43,6%) уровень инвазии по Кларку был равен 3 и присутствовало изъязвление опухоли (54,9%), при этом не было
выявлено различий между изучаемыми группами по данному признаку (p=0,16). Наиболее часто встречались поверхностно-распространяющаяся меланома (ПРМ) —
54,9% (рис. 2) и узловая меланома (УМ) — 28,1%. Гистологический подтип меланомы кожи является одним из прогностических признаков, но, как правило, не рассматривается как самостоятельный признак. Известно, что наилучшим прогнозом обладают меланомы, представленные
веретенообразными клетками. При оценке гистологического подтипа исследуемых опухолей преимущественным
был смешанно-клеточный вариант (55,7%). При этом выявлено, что эпителиоидно-клеточный вариант меланомы
значительно преобладал у людей, не имеющих данную
мутацию (p<0,05). Не было установлено различий по содержанию пигмента в зависимости от BRAF-статуса
(p>0,05). У 71 пациента, включенного в исследование,
преобладали следующие стадии по классификации AJCC:
IIb (28,5%) и IIa (22,8%). При оценке TILs-статуса (tumor
infiltrating lymphocytes status) бо́льшую часть составили пациенты с TILs-статусом по типу Brisk (рис. 3), при этом не
было выявлено статистически значимых различий среди
пациентов, имеющих лимфоцитарный инфильтрат по типу Non Brisk (рис. 4) и Absent (рис. 5). Известно, что отсутствие TILs в опухолях толщиной 3,65 мм и больше по
Бреслоу служит отрицательным прогностическим признаком выживаемости больных и положительным в отношении вероятности возникновения висцеральных и кожных метастазов [11]. В исследовании данная категория
пациентов составила 12,6%.
42
Рис. 4. Лимфоцитарный инфильтрат по типу Non Brisk.
Лимфоциты образуют фокальные очаги вблизи опухоли, между
клетками не проникая (на фото представлен фокальный очаг).
Рис. 5. Лимфоцитарный инфильтрат по типу Absent.
Лимфоциты отсутствуют в опухолевом узле.
АРХИВ ПАТОЛОГИИ, 5, 2014
Таблица 2. BRAF-статус в зависимости от возраста пациентов с меланомой
BRAF-статус
Положительный
Отрицательный
р=0,08
Возраст до 50 лет
абс.
10
7
Таким образом, резюмируя данную работу, можно отметить, что BRAF-позитивные пациенты в исследуемой
выборке характеризуются преимущественным расположением меланомы в области участков тела, не подверженных воздействию ультрафиолетового излучения, и тенденцией к развитию в более молодом возрасте.
Заключение
%
34,5
16,7
Возраст старше 50 лет
абс.
%
19
65,5
35
83,3
54
звеном в оценке биологического поведения опухолевых
клеток и реализации ими таких биологически значимых
функций, как опухолевая инвазия, метастазирование, неоангиогенез, что имеет значение для дальнейшей оценки
опухолевой прогрессии и последующего прогноза течения
заболевания.
Исследование выполнено в рамках гранта Фонда
Президента РФ для молодых ученых (Т.Г.Р., MД
901.2013.7).
Одной из приоритетных задач изучения механизмов
развития различных онкологических патологий является
выявление спектра мутаций и различных вариантов регуляции экспрессии генов как в норме, так и при развитии
злокачественных новообразований. В связи с этим определение наличия или отсутствия мутации V600E в гене
BRAF у пациентов с меланомой кожи является важным
Конфликт интересов отсутствует.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: М.Б.А., Т.Г.Р.
Сбор и обработка материала: М.Б.А., С.С.Б.
Написание текста: М.Б.А.
Редактирование: Т.Г.Р., С.С.Б.
ЛИТЕРАТУРА
1.
Goodson A.G., Grossman D. Strategies for early melanoma
detection: Approaches to the patient with nevi. J. Am. Acad.
Dermatol. 2009; 60: 719—35.
7.
Shinozaki M., Fujimoto A., Hoon D.S. Incidence of BRAF oncogene mutation and clinical relevance for primary cutaneous melanoma. Clin. Cancer Res. 2004; 10 (5): 1753—7.
2.
Гаврилюк Д.В., Дыхно Ю.А., Хлебникова Ф.Б. Редкая локализация меланомы. Сибирское медицинское обозрение. 2013;
5: 82—4.
8.
Ellerhost J.A. Clinical correlates of NRAS and BRAF mutations in
primary human melanoma. Clin. Cancer Res. 2011; 17: 229—35.
9.
3.
Закурдяева И.Г. Метастатическая меланома кожи (обзор литературы). Сибирский онкологический журнал. 2010; 6: 57—
62.
Liu W., Kelly J.W., Trivett M. et al. Distinct clinical and pathological features are associated with the BRAF (T1799A (V600E)) mutation in primary melanoma. J. Invest. Dermatol. 2007; 127: 900—
5.
4.
Davies H., Bignell G.R., Cox C. et al. Mutations of the BRAF gene
in human cancer. Nature. 2002; 417: 949—54.
5.
Curtin J.A., Fridlyand J., Kageshita T.N. Distinct sets of genetic
alterations in melanoma. N. Engl. J. Med. 2005; 353: 2135—47.
6.
Ascierto P.A., Kirkwood J.M., Grob J.J., Simeone E., Grimaldi A.M.,
Maio M. et al. The role of BRAF V600 mutation in melanoma.
J. Transl. Med. 2012; 10: 85.
10. Day C.L., Sober A.J., Kopf A.W. et al. A prognostic model for clinical stage I melanoma of the lower extremity. Surgery. 1981; 89:
599—603.
11.
Day C.L., Lew R.A., Mihm M.C. Jr. et al. A multivariate analysis of
prognostic factors for melanoma patients with lesions greater than
or equal to 3,65 mm in thickness: the importance of revealing alternative. Cox models. Ann. Surg. 1982; 195: 44—9.
Поступила 10.02.2014
АРХИВ ПАТОЛОГИИ, 5, 2014
43