Диссертация - Институт химической биологии и

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Институт химической биологии и фундаментальной медицины
На правах рукописи
МАРКОВ АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ
СПЕКТР БИОЛОГИЧЕСКИХ АКТИВНОСТЕЙ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ
ГЛИЦИРРЕТОВОЙ КИСЛОТЫ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИХ ДЕЙСТВИЯ
03.01.04 – Биохимия
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Научный руководитель:
к.б.н. Логашенко Е. Б.
Новосибирск – 2015
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .....................................................................................................................7
ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................................11
ГЛАВА
1.
ТРИТЕРПЕНОВЫЕ
СОЕДИНЕНИЯ
–
ПЛАТФОРМА
ДЛЯ
СИНТЕЗА
ЛЕКАРСТВЕННЫХ АГЕНТОВ: МЕХАНИЗМ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ И
ХИМИЧЕСКИЕ МОДИФИКАЦИИ, ПРИВОДЯЩИЕ К УСИЛЕНИЮ ИХ БИОЛОГИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТИ И БИОДОСТУПНОСТИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) ...............................................15
1.1 Природные тритерпены и их фармакологические свойства .................................................. 15
1.1.1 Противовирусная активность тритерпеноидов ................................................................ 15
1.1.2 Противовоспалительная активность тритерпеноидов ..................................................... 17
1.1.3 Противоопухолевая активность тритерпеноидов ............................................................ 17
1.1.4 Антиангиогенная активность тритерпеноидов ................................................................ 18
1.1.5 Антиметастатическая активность тритерпеноидов ......................................................... 19
1.2 Полусинтетические производные тритерпеноидов ................................................................ 20
1.3 Механизмы клеточной гибели .................................................................................................. 22
1.3.1 Некроз ................................................................................................................................... 22
1.3.2 Аутофагия ............................................................................................................................ 23
1.3.3 Апоптоз ................................................................................................................................ 24
1.3.3.1 Индукторная фаза апоптоза .........................................................................................25
1.3.3.2 Эффекторная фаза апоптоза .........................................................................................26
1.3.3.3 Фаза деградации ............................................................................................................27
1.4 Влияние тритерпеноидов на жизнеспособность опухолевых клеток ................................... 27
1.4.1 Внутриклеточные сигнальные пути, запускаемые действием тритерпеноидов ........... 34
1.4.1.1 PI3K/Akt сигнальный путь ...........................................................................................34
1.4.1.1.1 Протеинкиназа mTOR ........................................................................................... 35
1.4.1.1.2 Транскрипционный фактор NF-kB ...................................................................... 36
1.4.1.1.3 Транскрипционный фактор FOXO3a .................................................................. 38
1.4.1.2 MAP киназный сигнальный путь .................................................................................38
1.4.1.2.1 Протеинкиназа ERK .............................................................................................. 39
1.4.1.2.2 Протеинкиназа p38 ................................................................................................ 40
1.4.1.2.3 Протеинкиназа JNK .............................................................................................. 41
1.5 Пролекарства тритерпеновой природы .................................................................................... 42
1.5.1 Увеличение растворимости тритерпеновых соединений ................................................ 43
3
1.5.1.1 Увеличение гидрофильности тритерпеновых соединений .......................................44
1.5.1.2 Увеличение гидрофобности тритерпеновых соединений .........................................46
1.5.2 Опухоль-направленные пролекарства тритерпеновой природы .................................... 47
1.6 Направленная химическая модификация молекулы ГЛК ...................................................... 50
1.6.1 Модификации кольца А ...................................................................................................... 50
1.6.1.1 Модификация по положению С3 .................................................................................50
1.6.1.2 Изменение структуры кольца А ...................................................................................60
1.6.1.3 Введение дополнительных колец ................................................................................60
1.6.1.4 Введение в кольцо А акцептора Михаэля ...................................................................61
1.6.2 Модификация кольца С ...................................................................................................... 62
1.6.3 Модификация кольца Е ...................................................................................................... 63
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ..................................................................................66
2.1 Материалы и методы.................................................................................................................. 66
2.1.1 Реактивы и препараты......................................................................................................... 66
2.1.2 Обрудование ........................................................................................................................ 67
2.1.3 Клеточные линии................................................................................................................. 67
2.1.4 Лабораторные животные, опухолевые модели и вирусы ................................................ 68
2.1.5 Производные глицирретовой и дезоксихолевой кислот ................................................. 68
2.1.6 Растворы и буферы, использованные в работе ................................................................ 68
2.2 Методы ........................................................................................................................................ 69
2.2.1 Ведение культур клеток ...................................................................................................... 69
2.2.2 Подсчет количества живых клеток при помощи окраски трипановым синим ............. 69
2.2.3 Определение жизнеспособности клеток под действием производных (МТТ тест) ..... 69
2.2.4 Исследование апоптоза клеток с помощью ApopNexinTM FITC Apoptosis Detection Kit
........................................................................................................................................................ 70
2.2.5 Оценка мембранного потенциала митохондрий .............................................................. 70
2.2.6 Исследование клеточного цикла ........................................................................................ 71
2.2.7 Анализ морфологии ядер с помощью флуоресцентной микроскопии .......................... 71
2.2.8 Исследование активации каспазного каскада с помощью CaspACETM FITC-VAD-FMK
In Situ Marker ................................................................................................................................ 72
2.2.9 Полнотранскриптомный анализ экспрессии генов на микрочипах ............................... 72
2.2.10 Приготовление липосом, нагруженных солоксолон метилом ...................................... 73
2.2.11 Исследование цитотоксичности высокодисперсной композиции солоксолон метила с
ПЭГ ................................................................................................................................................ 74
4
2.2.12 Исследование острой токсичность высокодисперсной композиции солоксолон
метила с ПЭГ на мышиной модели in vivo ................................................................................ 74
2.2.13 Приготовление микроэмульсий солоксолон метила с солюбилизаторами Твин-80 и
Кремофор-EL ................................................................................................................................ 74
2.2.14 Исследование влияния солоксолон метила на рост карциномы Кребс-2 ex vivo ........ 75
2.2.15 Исследование противоопухолевой активности in vivo .................................................. 75
2.2.16 Оценка уровня синтеза оксида азота макрофагальными клетками J-774,
активированными липополисахаридом (ЛПС) ......................................................................... 76
2.2.17 Оценка антиэкссудативной активности на модели острого воспаления, вызванного
гистамином ................................................................................................................................... 77
2.2.18 Оценка цитопатического действия вируса гриппа на клетки MDCK-L9 с помощью
технологии xCelligence ................................................................................................................ 77
2.2.19 Определение титра вируса гриппа на клетках по реакции окрашивания
инфекционных фокусов (метод ФОЕ) ........................................................................................ 78
2.2.20 Оценка влияния препарата на репродукцию вируса гриппа А ..................................... 78
2.2.21 Оценка вирулицидного действия..................................................................................... 79
2.2.22 Получение раствора эритроцитов .................................................................................... 79
2.2.23 Титрование вируса гриппа А по реакции гемагглютинации (РГА) ............................. 79
2.2.24 Исследование влияния солоксолон метила на адсорбцию вируса к мембране клетки
........................................................................................................................................................ 79
2.2.25 Исследование активности нейраминидазы вируса гриппа А ....................................... 80
2.2.26 Оценка влияния времени добавления солоксолон метила на репродукцию вируса .. 80
2.2.27 Исследование влияния солоксолон метила на способность вируса гриппа
связываться с клеткой .................................................................................................................. 81
2.2.28 Исследование влияния солоксолон метила на проникновение вируса гриппа в клетки
........................................................................................................................................................ 81
2.2.29 Оценка противовирусной активности in vivo на модели гриппозной пневмонии
мышей ............................................................................................................................................ 82
2.2.30 Определение концентрации ИЛ-6, вырабатываемого клетками A549 в результате
вирусной инфекции ...................................................................................................................... 83
2.2.31 Статистический анализ ..................................................................................................... 83
ГЛАВА
3.
СПЕКТР
БИОЛОГИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТИ
НОВЫХ
ПРОИЗВОДНЫХ
ГЛИЦИРРЕТОВОЙ КИСЛОТЫ (РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ)............................................84
3.1 Оценка цитотоксичности новых производных ГЛК ............................................................... 84
3.1.1 Первичный скрининг производных ГЛК .......................................................................... 84
3.1.2 Анализ взаимосвязи «структура-активность» производных ГЛК .................................. 85
5
3.1.3 Цитотоксичность солоксолон метила в отношении опухолевых клеток различного
гистогенеза .................................................................................................................................... 92
3.2 Механизм гибели опухолевых клеток под действием солоксолон метила .......................... 93
3.2.1 Влияние солоксолон метила на уровень экстернализации фосфатидилсерина ............ 93
3.2.2 Влияние солоксолон метила на мембранный потенциал митохондрий ........................ 95
3.2.3 Влияние солоксолон метила на клеточный цикл ............................................................. 97
3.2.4 Изменение морфологии клеточных ядер при действии солоксолон метила ................. 98
3.2.5 Влияние солоксолон метила на активацию каспаз .......................................................... 99
3.3 Полнотранскриптомный анализ экспрессии генов на кДНК-микрочипах в клетках КВ-3-1,
инкубированных в присутствии солоксолон метила .................................................................. 101
3.3.1 Функциональный анализ выявленных ДЭГ ................................................................... 102
3.3.1.1
Функциональный
анализ
генов,
дифференциально ингибированных
под
действием солоксолон метила ...............................................................................................103
3.3.1.2
Функциональный
анализ
генов,
дифференциально
активированных
под
действием солоксолон метила ...............................................................................................105
3.3.2 Создание модели молекулярного механизма действия солоксолон метила в
отношении опухолевых клеток на основе данных полнотранскриптомного анализа ........ 112
3.4 Увеличение биодоступности солоксолон метила ................................................................. 118
3.4.1 Создание липосомальных композиций солоксолон метила ......................................... 118
3.4.2 Создание высокодисперсной композиции солоксолон метила с ПЭГ ......................... 120
3.4.3 Создание эмульсий солоксолон метила с солюбилизаторами ...................................... 121
3.5. Спектр биологических активностей солоксолон метила .................................................... 124
3.5.1 Противоопухолевая активность солоксолон метила на мышиных моделях ............... 124
3.5.1.1 Противоопухолевая активность солоксолон метила ex vivo ..................................124
3.5.1.2 Исследование токсичности солоксолон метила in vivo ...........................................125
3.5.1.3 Исследование противоопухолевой активности солоксолон метила на моделях
опухолевой прогрессии in vivo ..............................................................................................126
3.5.1.3.1 Противоопухолевая активность солоксолон метила на модели карциномы
Кребс-2 ................................................................................................................................ 126
3.5.1.3.2 Противоопухолевая активность солоксолон метила на модели
гепатоцеллюлярной карциномы HA-1 ............................................................................. 126
3.5.2 Противовоспалительная активность солоксолон метила .............................................. 128
3.5.2.1 Исследование противовоспалительного потенциала солоксолон метила in vitro 128
3.5.2.1.1 Исследование цитотоксичности солоксолон метила в отношении клеток J-774
.............................................................................................................................................. 129
6
3.5.2.1.2 Влияние солоксолон метила на синтез NO макрофагальными клетками J-774,
активированными ЛПС ...................................................................................................... 129
3.5.2.2 Исследование антиэкссудативной активности солоксолон метила на модели
острого воспаления in vivo .....................................................................................................129
3.5.3 Противовирусная активность солоксолон метила ......................................................... 131
3.5.3.1 Исследование цитотоксичности солоксолон метила в отношении клеток MDCK,
MDCK-L9 и A-549 ...................................................................................................................131
3.5.3.2 Исследование влияния солоксолон метила на цитопатический эффект вируса
гриппа А ...................................................................................................................................132
3.5.3.3 Исследование влияния солоксолон метила на репродукцию вируса гриппа А ....133
3.5.3.4 Исследование механизма противовирусного действия солоксолон метила .........134
3.5.3.4.1 Исследование вирулицидного действия солоксолон метила в отношении
вируса гриппа А.................................................................................................................. 134
3.5.3.4.2 Исследование влияния солоксолон метила на активность гемагглютинина
вируса гриппа А.................................................................................................................. 135
3.5.3.4.3 Исследование влияния солоксолон метила на активность нейраминидазы
вируса гриппа А.................................................................................................................. 135
3.5.3.4.4 Исследование влияния времени добавления солоксолон метила на титр
вируса .................................................................................................................................. 136
3.5.3.4.5 Исследование влияния солоксолон метила на связывание вируса гриппа А с
клеточной мембраной ........................................................................................................ 138
3.5.3.4.6 Исследование влияния солоксолон метила на проникновение вируса гриппа
внутрь клеток ...................................................................................................................... 139
3.5.3.5 Исследование противовирусной активности солоксолон метила на модели
гриппозной пневмонии мышей in vivo..................................................................................140
3.5.3.6 Исследование влияния солоксолон метила на синтез ИЛ-6 в клетках, зараженных
вирусом гриппа ........................................................................................................................142
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ...................................................................................................................................144
ВЫВОДЫ .............................................................................................................................................146
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ...........................................................................147
7
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
APAF-1 – апоптотический протеаза-активирующий фактор
CaMKII – кальмодулин-зависимая протеинкиназа II
COX-2 – циклооксигеназа-2
DISC - death-inducing signaling complex
DMEM – среда Игла, модифицированная Дульбеко
EC50 – эффективная концентрация соединения, при которой наблюдается 50% снижение
синтеза провоспалительного медиатора
ERAD – endoplasmic reticulum associated protein degradation
FDA – Food and Drug Administration USA, Управление по контролю качества пищевых
продуктов и медикаментов США
FITC – флуоресцеин изотиоцианат
IC50 – концентрация соединения, при которой наблюдается 50% гибель клеток
IMDM – среда Дульбеко, модифицированная Исковым
iNOS – индуцибельная форма NO-синтазы
JC-1 - йодистый 5,5’,6,6’-тетрахлоро-1,1’,3,3’-тетраэтил бензимидазол карбоцианин
LD – летальная доза
MAPK, MAP киназы – митоген-активируемые протеинкиназы
MMP – матриксные металлопротеиназы
MOI – множественность заражения вирусом
NO – оксид азота (II)
PAMAM – полиаминодиамин
PARP – поли-АДФ-рибозополимераза
PI – йодистый пропидий
8
PI3K – фосфоинозитид-3-киназа
PIP2 – фосфатидилинозитол 4,5-дифосфат
PIP3 - фосфатидилинозитол 3,4,5-трифосфат
SNMC – Stronger Neo-Minophagen
subG1 – пик на ДНК-гистограммах, полученных с помощью проточной цитофлуорометрии,
соответствующий клеткам в стадии апоптоза
tBid – усеченная активная форма проапоптотического белка Bid
uPA – активатор плазминогена урокиназного типа
VEGF – эндотелиальный фактор роста сосудов
Z-VAD-FMK
-
карбобензокси-валил-аланил-аспартил-[О-метил]-флуорометилкетон,
панкаспазный ингибитор
АФК – активные формы кислорода
БК – бетулиновая кислота
ВГА – вирус гепатита А
ВГВ – вирус гепатита В
ВГС – вирус гепатита С
ВИЧ – вирус иммунодефицита человека
ВКСМ – высокодисперсная композиция солоксолон метила
ГАЕ – гемагглютинирующая единица
ГЛЗК – глицирризиновая кислота
ГЛК – глицирретовая кислота
Глц – глицин
ДМСО – диметилсульфоксид
ДМФХ – димиристоил фосфатидилхолин
9
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ДОХК – дезоксихолевая кислота
ДЭГ – дифференциально экспрессирующиеся гены
ИЛ - интерлейкин
ИНХ СО РАН – Институт неорганической химии СО РАН
ИФН-γ – интерферон-γ
ИЦиГ СО РАН – Институт цитологии и генетики СО РАН
кДНК – комплементарная ДНК
ЛД – летальная доза
ЛПС – липополисахарид
ЛС – лидерное соединение, соединение-лидер
ЛФАВ – лаборатория физиологически активных веществ
ЛФИ – лаборатория фармакологических исследований
МПМ – митохондриальный потенциал митохондрий
мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота
МТП – митохондриальная транзиторная пора
МТТ – 2-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилбромид тетразола
мэГЛК – метиловый эфир ГЛК
НИОХ СО РАН – Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН
НМРЛ – немелкоклеточный рак легкого
о.е. – относительная единица
ОК – олеаноловая кислота
ОРДС – острый респираторный дистресс-синдром
ПЭГ – полиэтиленгликоль
10
ПЭМ – просвечивающая электронная микроскопия
РГА – реакция гемагглютинации
РНК – рибонуклеиновая кислота
СМ – солоксолон метил
ТОРС – тяжелый острый респираторный синдром
ТФА - 12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата
УК – урсоловая кислота
ФИ – фосфатидилинозитол
ФНО-α – фактор некроза опухоли α
ФОЕ – фокус-образующая единица
ФСБ – фосфатно-солевой буфер
Хол – холестерин
ЦНС – центральная нервная система
ЭКС – эндотелиальные клетки сосудов
ЭПР – эндоплазматический ретикулум
яФХ – яичный фосфатидилхолин
11
ВВЕДЕНИЕ
На
сегодняшний
день
фармацевтическая
индустрия
испытывает
недостаток
в
эффективных и безопасных лекарственных препаратах нового поколения, в первую очередь для
лечения заболеваний (онкологических, вирусных, нейродегенеративных и др.), приводящих к
инвалидизации, потере качества жизни или к летальному исходу. Препараты, используемые в
настоящее время, были разработаны десятилетия назад и часто не обладают достаточной
активностью для увеличения продолжительности жизни пациента или его полного
выздоровления.
Одним из важных способов поиска и разработки новых эффективных лекарственных
препаратов является синтетическая трансформация молекул природных биологически активных
соединений. Данные соединения характеризуются огромным разнообразием молекулярных
структур,
низкой
токсичностью,
способностью
воздействовать
сразу
на
множество
специфических мишеней внутри клеток, что определяет широкий спектр их нативной
биологической активности. Многие годы природные соединения занимают центральное место в
области разработки лекарственных средств – достаточно сказать, что около 40% всех
лекарственных препаратов, одобренных FDA и вошедших в клиническую практику в период с
1981 по 2010 гг., основаны именно на природных соединениях [1].
Одним из примеров природных метаболитов, использующихся в качестве платформы для
создания новых лекарственных средств, являются растительные тритерпеноиды, для которых
характерны широкий спектр нативной фармакологической активности, низкая токсичность и
обширная сырьевая база. Химическая модификация молекул данных соединений позволяет
получить их синтетические производные, обладающие высокой эффективностью действия [2, 3,
4].
Глицирретовая
кислота
представляет
собой
один
из
самых
распространенных
тритерпеноидов олеанолового ряда. Данное соединение содержится в больших количествах в
корне солодки (Glycyrrhiza glabra L., G. uralensis DC. и др.), где ее содержание может достигать
25-30% сухого веса [4]. Широкий ареал распространения солодки на территории Российской
Федерации и стран СНГ, легкий способ выделения глицирретовой кислоты из растительного
сырья, широкий спектр ее фармакологических активностей делают это уникальное соединение
перспективным в качестве стартовой молекулы для химической трансформации.
В Новосибирском институте органической химии им. Н. Н. Ворожцова СО РАН путем
химической модификации молекулы глицирретовой кислоты (ГЛК) был синтезирован ряд ее
синтетических производных.
12
Целью настоящей работы являлось исследование спектра биологических активностей
синтетических аналогов ГЛК и изучение механизма их действия. В рамках данной работы были
поставлены следующие задачи:
1.
Исследовать влияние синтетических аналогов ГЛК на жизнеспособность опухолевых
клеток человека. Выявить лидерное соединение (ЛС), обладающее наибольшей
цитотоксичностью в отношении опухолевых клеток человека;
2.
Изучить
механизм
гибели
опухолевых
клеток,
вызванной
действием
ЛС.
Исследовать влияние ЛС на изменение паттерна экспрессии генов в опухолевых
клетках человека;
3.
Исследовать противоопухолевую активность ЛС на моделях опухолевой прогрессии
in vivo;
4.
Исследовать
противовоспалительную
активность
ЛС
in
vitro,
оценить
антиэкссудативную активность ЛС на модели острого воспаления in vivo и
исследовать возможный механизм противовоспалительного действия ЛС;
5.
исследовать противовирусную активность ЛС на модели вируса гриппа А in vitro и
in vivo и проанализировать механизм его противогриппозного действия.
Научная новизна полученных результатов. В результате проведенной работы выявлено
новое производное ГЛК – метил 2-циано-3,12-диоксо-18βH-олеан-1(2),11(9)-диен-30-оат
(солоксолон метил), обладающий широким спектром выраженных биологических активностей,
и определены механизмы его действия. Показано, что солоксолон метил обладает высокой
цитотоксичностью в отношении опухолевых клеток, вызывая в них запуск митохондриального
каспаз-зависимого пути апоптоза. Впервые проведен полнотранскриптомный анализ изменения
уровня экспрессии генов в опухолевых клетках человека под действием солоксолон метила и
выявлены доминирующие биологические процессы, запускаемые в результате данного
действия, и потенциальные внутриклеточные мишени солоксолон метила. Выявлены
функциональные группы, введение которых в молекулу ГЛК приводит к усилению
цитотоксичности в отношении опухолевых клеток. Для синтетических аналогов ГЛК,
содержащих 2-циано-1-ен-3-оновую структуру в кольце А, впервые показано, что замена
нативной для ГЛК 11-оксо-12-еновой группировки в кольце C на 12-оксо-11-еновую структуру
приводит к значительному увеличению антипролиферативного действия. В ходе работы изучен
спектр биологических активностей солоксолон метила; в экспериментах in vitro и in vivo
доказаны его противоопухолевая, противовоспалительная и противовирусная активности.
Впервые, для синтетических аналогов тритерпеноидов, содержащих 2-циано-1-ен-3-оновую
структуру в кольце А, показана противогриппозная активность in vitro и in vivo и выяснен
механизм противовирусного действия.
13
Практическая значимость. Полученные результаты могут послужить основанием для
дальнейшей оптимизации структуры синтетических производных тритерпеноидов с целью
создания новых высокоэффективных лекарственных препаратов на их основе. Отобранное в
ходе данной работы соединение солоксолон метил является перспективным для проведения его
доклинических испытаний.
Положения, выдвигаемые на защиту.
1. Новые производные ГЛК обладают токсичностью в отношении опухолевых клеток in
vitro. Наибольшую активность проявляют производные ГЛК, несущие 2-циано-1-ен-3оновую структуру, среди которых выявлено лидерное соединение солоксолон метил
(СМ), обладающее наибольшим уровнем цитотоксичности.
2. СМ вызывает стресс ЭПР и запуск апоптоза в опухолевых клетках.
3. СМ эффективно подавляет рост карциномы Кребс-2 на мышиной модели in vivo.
4. СМ обладает выраженной противовоспалительной и антиэкссудативной активностью на
клеточных и мышиных моделях, соответственно.
5. СМ обладает противовирусной активностью in vitro в отношении вируса гриппа А,
подавляя его проникновение внутрь клеток и ранние стадии жизненного цикла.
6. СМ эффективно подавляет развитие гриппозной пневмонии на мышиной модели in vivo.
Публикации и апробация результатов. По материалам диссертации опубликовано 3
печатные работы в международных рецензируемых журналах и получен Патент РФ. Результаты
работы представлены и обсуждены на конференциях: «Студент и научно-технический
прогресс» (Новосибирск, 2010), «Фундаментальные науки – медицине» (Новосибирск, 2010),
36-ом конгрессе FEBS «Biochemistry for tomorrow’s medicine» (Турин, Италия, 2010), 31-ой
европейской школе по медицинской химии «XXXI Advanced Course of Medicinal Chemistry and
“E. Duranti” National Seminar for PhD Students» (Урбино, Италия, 2010), «Cell Signal-omics 2011:
Integrated cellular pathology Systems biology of human disease» (Люксембург, 2011), 2-ой
международной конференции «Physico-chemical biology dedicated to the 85th anniversary of
academician D.G. Knorre» (Новосибирск, 2011), международной конференции «Mechanisms of
Cell Death: The Command to Die» (Фуэнхирола, Испания, 2013), международной конференции
FEBS EMBO 2014 (Париж, Франция, 2014), 23-ем международном симпозиуме EFMC-ISMC
2014 (Лиссабон, Португалия, 2014), 7-ой международной школе молодых ученых «Systems
biology and bioinformatics» (Новосибирск, 2015), международной конференции «MedChem
2015» (Новосибирск, 2015).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы,
экспериментальной части, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и
14
списка литературы. Работа изложена на 177 страницах, содержит 36 рисунков, 11 таблиц.
Библиография включает 424 литературных источника.
Личный вклад автора. Все эксперименты и анализ полученных данных сделаны лично
автором,
за
исключением
кДНК-микрочипирования,
которое
проводилось
в
ЗАО
«Геноаналитика» (Москва), получения высокодисперсной композиции солоксолон метила с
ПЭГ, выполненного к.х.н. Огиенко А. Г. (ИНХ СО РАН), оценки антиэкссудативной
активности солоксолон метила in vivo, которое проводилось совместно с сотрудниками
Лаборатории фармакологических исследований НИОХ СО РАН, оценки противоопухолевой
активности солоксолон метила in vivo, проводившегося совместно с к.м.н. Николиным В. П.,
к.б.н. Калединым В. И., к.б.н. Поповой Н. А. (ИЦиГ СО РАН), и гистологического анализа,
проводившегося к.м.н. Сеньковой А. В. (ИХБФМ СО РАН).
15
ГЛАВА 1. ТРИТЕРПЕНОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ – ПЛАТФОРМА ДЛЯ СИНТЕЗА
ЛЕКАРСТВЕННЫХ АГЕНТОВ: МЕХАНИЗМ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ
И
ХИМИЧЕСКИЕ
МОДИФИКАЦИИ,
ПРИВОДЯЩИЕ
К
УСИЛЕНИЮ
ИХ
БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И БИОДОСТУПНОСТИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1 Природные тритерпены и их фармакологические свойства
Важным направлением медицинской химии является создание новых лекарственных
препаратов на основе природных соединений, обладающих широким спектром нативной
биологической активности и низкой токсичностью. Именно на природных соединениях
основана половина всех лекарственных средств, внедренных в клинику в период с 1981 по 2006
гг. [5]. В последние годы все больший интерес исследователей в данном направлении вызывают
растительные тритерпеноиды.
Тритерпеноиды относятся к самому многочисленному классу природных соединений –
изопреноидам. В природе известно более 4000 тритерпеноидов [6], которые синтезируются
многими растениями путем циклизации сквалена [7] и представлены как в виде свободных
молекул, так и в виде конъюгатов с остатками сахаров (гликозидов, или сапонинов) [6].
Тритерпеноиды характеризуются сходным строением молекулярного остова, состоящего из
шести изопреновых звеньев, которые образуют четыре (ланостановая и дамарановая группы
тритерпеноидов) или пять (пентациклические тритерпеноиды) углеводородных колец [8].
Пентациклические
тритерпеноиды
обладают
широким
спектром
биологической
активности; некоторые из данных соединений с давних пор используются в народной медицине
(в
составе
отваров,
противовоспалительных,
порошков,
настоек
противовирусных,
из
растительного
сырья)
гепатопротекторных,
в
качестве
отхаркивающих,
успокаивающих средств. Наиболее широко представленными тритерпеноидами являются
представители олеананового ряда – олеаноловая кислота (ОК), глицирретовая кислота (ГЛК) и
ее гликозид глицирризиновая кислота (ГЛЗК), и тритерпены урсанового и лупанового типов –
урсоловая (УК) и бетулиновая (БК) кислоты, соответственно (Рис. 1).
Фармакологические свойства данных соединений подробно описаны в литературе (см.
ниже).
Большое
количество
работ
посвящено
изучению
их
противовирусной,
противовоспалительной и противоопухолевой активности.
1.1.1 Противовирусная активность тритерпеноидов
Многолетние исследования доказывают, что растительные тритерпеноиды подавляют
репликацию многих вирусов человека in vitro и in vivo – например, герпесвирусов (вирусов
простого герпеса I типа [9,10], ветряной оспы [11], Эпштейна-Барр [12] и цитомегаловируса
[13]), флавивирусов (вирусов Денге [14], японского и клещевого энцефалита [14] и желтой
16
Рис. 1. Структурные формулы тритерпеноидов. А – олеаноловая кислота; Б – глицирретовая
кислота; В – глицирризиновая кислота; Г – урсоловая кислота; Д – бетулиновая кислота
лихорадки [14]), пикорнавирусов (эховируса [10] и энтеровируса 71 [15]), ротавирусов [9],
коронавируса ТОРС, вызывающего тяжелый острый респираторный синдром [16], и вируса
гриппа А [17].
Есть сообщения о наличии у тритерпеноидов противовирусной активности в отношении
вирусов гепатита. Так, ГЛК ингибирует пролиферацию вируса гепатита В (ВГВ) [18], ОК и УК
активны в отношении вируса гепатита С (ВГС) [19]. Спектр действия ГЛЗК шире – данный
тритерпен подавляет репликацию сразу трех основных вирусов, вызывающих гепатит – вируса
гепатита А (ВГА) [20], ВГB [21, 22] и ВГC [23, 24]. Изучение механизма действия данных
соединений показало, что ОК и УК подавляют активность РНК-зависимой РНК-полимеразы
NS5B ВГС [19], а ГЛЗК ингибирует экспрессию антигена HAV, секрецию поверхностного
антигена HBsAg и экспрессию корового белка ВГА [20], ВГВ [22] и ВГС [24], соответственно.
Кроме того, в ряде работ продемонстрирована способность тритерпеноидов подавлять
репликацию вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1, относящегося к семейству ретровирусов
[25, 26, 27, 28, 29]. Наибольшую активность в отношении ВИЧ-1 проявляла БК. Было показано,
что данное соединение ингибирует проникновение ВИЧ-1 в клетку, мутации вируса и выход
вирусного потомства из клетки [28 ,29].
17
1.1.2 Противовоспалительная активность тритерпеноидов
В многочисленных работах показано, что тритерпены обладают противовоспалительной
активностью [30-54]. Данные соединения эффективно подавляют синтез провоспалительных
медиаторов на моделях макрофагальных клеток RAW264.7, клеток феохромоцитомы крысы PC12 и эпителиальных клеток кишечника HT-29, активированных липополисахаридом E. coli
(ЛПС) [30, 31, 32], перекисью водорода [33] и фактором некроза опухоли-α (ФНО-α) [34],
соответственно.
Тритерпены
ингибируют
экспрессию
провоспалительных
цитокинов
(интерлейкина-1β (ИЛ-1β) [30, 35], ИЛ-6 [30, 33, 35], фактора некроза опухоли α (ФНО-α) [30,
33, 35, 36]), хемокина ИЛ-8 [34], и провоспалительного белка HMGB1 (он же амфотерин) [31].
Также УК подавляет синтез гистамина тучными клетками, активированными конканавалином
А [37].
В настоящее время накоплены доказательства того, что тритерпеноиды вызывают
подавление синтеза вышеуказанных цито- и хемокинов, ингибируя транскрипционный фактор
NF-kB [38], являющийся одним из основных регуляторов экспрессии генов, кодирующих
данные белки [39]. Тритерпеноиды также вызывают снижение экспрессии других NF-kBзависимых белков – индуцибельной NO-синтазы (iNOS) [30, 40, 41] и циклооксигеназы 2 (COX2) [40, 30], осуществляющих синтез провоспалительных медиаторов – оксида азота (II) (NO) и
простагландина Е2, соответственно. При этом ОК и УК оказались селективными ингибиторами
COX-2 [42, 43], а также подавляли активность 5-липоксигеназы – фермента, участвующего в
синтезе провоспалительного лейкотриена В4 [44, 45].
Наличие противовоспалительной активности у тритерпенов было подтверждено in vivo в
экспериментах на лабораторных животных. Было показано, что тритерпены обладают
антиэкссудативным эффектом – инъекции данных соединений приводили к значительному
подавлению отека глаза или уха мышей, вызванного введением кротонового масла [46, 47], 12О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата (ТФА) [45, 48, 49, 50] и этил фенилпропионата [48, 50], и
ингибировали отек лап мышей и крыс, вызванный введением каррагенина [44, 48, 50, 51],
декстрана [44] и серотонина [50]. У ГЛЗК также была отмечена и антиастматическая активность
– данный тритерпен облегчал симптомы астмы, вызванной овальбумином [52] и предупреждал
повреждение легких при аллергической астме, вызванной ЛПС [53]. ОК оказалась эффективной
на модели артрита крыс, вызванного формальдегидом [44], БК обладала обезболивающей
активностью на модели уксусных корчей мышей и при проведении формалинового теста [54].
1.1.3 Противоопухолевая активность тритерпеноидов
В большом количестве работ была показана способность тритерпенов ингибировать
опухолевый рост in vitro и in vivo [55-97].
18
В экспериментах in vitro данные соединения вызывали гибель опухолевых клеток
различного гистогенеза, включая меланому [55-57], опухоли молочной [57-62], поджелудочной
[63], предстательной [57, 64, 65], слюнной [66], щитовидной [57] желез, органоспецифичные
опухоли (гепатоцеллюлярную карциному [67-71], немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) [56,
57, 72-74], овариальную карциному [56, 57, 75-77], рак шейки матки [57, 71, 78], карциному
полости рта [66], карциному прямой кишки [56, 57, 71], рак мочевого пузыря [79], желудка [57,
67, 80, 81]), опухоли мезенхимы (остеосаркома [82]), опухоли ЦНС [56, 57, 83-85] и
гематологические опухоли (лейкемия [57, 67, 81, 86-88], лимфома [88]).
Противоопухолевое действие тритерпеноидов было подтверждено в экспериментах на
моделях индуцированных опухолей у животных – рака кожи мышей, вызванного действием
ТФА [89-91] и 7,12-диметилбенз[а]антраценом [90, 92], опухоли легких, вызванной введением
4-нитрохинолин 1-оксида [93] и карциномы прямой кишки, вызванной действием 1,2диметилгидразина [94]. Также было отмечено, что ГЛК ингибирует рост миеломы ОберлингаГерена у крыс [95], БК подавляет рост in vivo мышиной фибросаркомы Fsall [96], ОК и УК были
эффективны на ксенографтной модели гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 [69] и
меланомы человека MEL-2 [97], соответственно.
Противоопухолевая активность тритерпеноидов выражалась не только в цитотоксическом
действии на опухолевые клетки, но также в ингибировании данными соединениями процессов
ангиогенеза и метастазирования опухолей.
1.1.4 Антиангиогенная активность тритерпеноидов
Ангиогенез представляет собой процесс формирования новых кровеносных сосудов и
играет важную роль во многих физиологических (например, при заживлении ран или
реваскуляризации тканей после ишемии) и патологических (например, при хроническом
воспалении и опухолевой прогрессии) процессах.
При опухолевых заболеваниях ангиогенез способствует интенсификации опухолевого
роста, так как приводит к увеличению притока к злокачественным клеткам питательных
веществ и кислорода [98]. Данный процесс можно условно разделить на пять ключевых этапов
– (1) получение эндотелиальными клетками сосудов (ЭКС) ангиогенного сигнала в виде
сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF; (2) приобретение данными клетками
способности разрушать базальную мембрану и реконструировать внеклеточный матрикс (в
данном процессе важную роль играют матриксные металлопротеиназы MMP-2 и MMP-9); (3)
миграция, инвазия и пролиферация ЭКС и (4) формирование из них трехмерной сети
капилляроподобных трубочек (здесь важную роль играет аминопептидаза N [99]) [100].
В ряде работ было показано, что тритерпеноиды подавляют ангиогенез, ингибируя все
вышеуказанные этапы данного процесса. Тритерпеноиды эффективно подавляют экспрессию
19
опухолевыми клетками ангиогенного фактора VEGF и металлопротеиназ MMP-2 и MMP-9 [68,
101-106]. При этом ГЛК, и УК ингибируют и протеолитическую активность указанных
металлопротеиназ [107, 108]. Инкубация ЭКС в присутствии тритерпенов приводит к
значительному подавлению миграции и инвазии данных клеток [ 103, 100]. При этом эффект
тритерпенов на пролиферацию ЭКС оказался различным – УК и ОК подавляют
жизнеспособность клеток аорты быка BAE и HUVEC [109, 110], в то время как ГЛК и БК
оказались нетоксичными в отношении клеток HUVEC [111, 112]. Тритерпены ингибируют
формирование капилляроподобных структур из ЭКС, что было показано на примере клеток
HUVEC
в
матригеле
[102,
Данному
103].
эффекту
способствовало
и
подавление
ферментативной активности аминопептидазы N, наблюдаемое при действии БК [113]. Наличие
антиангиогенной
активности
у
тритерпеноидов
было
подтверждено
на
модели
хориоалантоисной мембраны куриных эмбрионов 109] и в экспериментах in vivo на примере
аденокарциномы почки RENCA [103], меланомы B16F10 [114] и гепатомы Hepa1-6 [68], где
наблюдалось значительное снижение плотности кровеносных сосудов, вызванное действием
данных соединений.
1.1.5 Антиметастатическая активность тритерпеноидов
Метастазирование представляет собой процесс миграции опухолевых клеток из
первичного опухолевого очага с последующим формированием вторичных очагов (метастазов)
в отдаленных органах. Данный процесс является одной из главных причин смерти у больных
злокачественными новообразованиями [115].
Метастазирование можно условно разделить на следующие этапы – миграцию
опухолевых клеток из места их первичной локализации, их инвазию через базальную мембрану
(здесь важную роль играют протеолитические ферменты, разрушающие указанную мембрану и
внеклеточный матрикс – например, описанные выше ММР-2/9 или активатор плазминогена
урокиназного
типа
uPA),
кровеносных/лимфатических
проникновение
сосудов
опухолевых
(интравазация),
клеток
циркуляцию
данных
в
просвет
клеток
с
кровью/лимфой, выход опухолевых клеток из капилляров в отдаленные ткани (экстравазация),
и формирование в них нового очага злокачественного роста [116].
Было показано, что тритерпеноиды в экспериментах in vitro эффективно подавляют
миграцию и инвазию широкого ряда опухолевых клеток [102, 105, 107, 117-120], экспрессию в
них MMP-2 и MMP-9 [102, 118-122], uPA [118, 119] и адгезионной молекулы ICAM-1 [122],
опосредующей связывание опухолевых клеток с эндотелиальными клетками кровеносных
сосудов непосредственно перед процессом интравазации [123]. Было показано, что ОК и БК
ингибируют эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) клеток гепатокарциномы [124] и
меланомы [125] – процесс, в результате которого эпителиальные клетки получают
20
мезенхимальный клеточный фенотип и приобретают способность к подвижности и инвазии, что
способствует метастазированию указанных клеток [126].
Наличие антиметастатической активности тритерпеноидов было подтверждено in vivo на
мышиных моделях. Было показано, что данные соединения эффективно ингибируют
метастазирование различных видов опухолей в легочную ткань животных. Подавление
метастазирования наблюдалось при действии ГЛК на ксенографт молочной железы MDA-MB231 [107], УК на трансгенную аденокарциному предстательной железы мыши TRAMP [127],
ГЛЗК и УК оказались эффективными на модели меланомы B16 [128, 129], а ОК и БК совместно
с винкристином – на модели меланомы B16F10 [74, 130].
Таким образом, природные пентациклические тритерпеноиды характеризуются широким
спектром нативной биологической активности, что в комплексе с их высокой энантиомерной
чистотой, относительной легкостью получения из растительного сырья и огромной сырьевой
базой делают данные соединения привлекательными для фармацевтической промышленности.
Некоторые из данных соединений уже используются в клинике или проходят клинические
испытания - например, ГЛЗК является основным компонентом лекарственной композиции
Stronger Neo-Minophagen (SNMC), уже более 30 лет использующейся в Японии для лечения
хронических гепатитов [131], моноаммониевая соль ГЛЗК входит в состав отечественного
лекарственного средства Глицирам, использующегося в качестве противовоспалительного и
антиаллергического средства [132], УК благополучно прошла 1 фазу клинических испытаний
на здоровых пациентах и пациентах с прогрессирующими солидными формами опухолей, где
была исследована ее фармакокинетика и системная токсичность соединения [133]. Несмотря на
это, уровень активности большинства тритерпеноидов недостаточен для использования их в
клинике. Для повышения эффективности действия данных соединений в настоящее время
ведется большой объем работ по созданию полусинтетических производных тритерпеноидов
методом направленной химической трансформации их молекулярной структуры.
1.2 Полусинтетические производные тритерпеноидов
Наибольший успех в области химической трансформации тритерпеновых соединений был
достигнут группой исследователей под руководством д-ра M. Sporn из Дартсмутского
медицинского колледжа (Гановер, США). Учеными было синтезировано более 150 химических
производных ОК и УК, было исследовано их противовоспалительное действие in vitro на
модели макрофагов, активированных интерфероном-γ (ИФН-γ), и выявлено лидерное
производное
(2-циано-3,12-диоксоолеана-1,9(11)-диен-28-овая
кислота),
названное
впоследствии CDDO (Рис. 2А), обладающее в 400 000 раз большим уровнем активности по
сравнению с исходной ОК [134]. В продолжении работы были синтезированы метиловый и
21
имидазольный эфиры данного соединения – CDDO-Me и CDDO-Im (Рис. 2Б и В,
соответственно), уровень биологической активности которых оказался еще выше [135]. Было
показано, что указанные производные ОК обладают высоким противоопухолевым потенциалом
in vitro и in vivo - CDDO и его эфиры эффективно подавляли пролиферацию и вызывали гибель
широкого
ряда
опухолевых
культивируемых
клеток
различного
гистологического
происхождения (см. обзор [2]). CDDO и его производные также ингибировали ангиогенез [136]
и способность опухолевых клеток к миграции и инвазии [137]. Противоопухолевое действие
CDDO и его аналогов было подтверждено in vivo на моделях перевиваемых опухолей мыши,
ксенографтов опухолей человека на бестимусных мышах и опухолях, вызванных химическими
канцерогенами (см. обзор [2]). В настоящий момент соединение CDDO-Me (названное
впоследствии бардоксолон метил) благополучно прошло I фазу клинических испытаний по
лечению пациентов с прогрессирующими солидными опухолями и лимфомами [138].
Успех CDDO и его эфиров побудил группу ученых под руководством д-ра S. Safe создать
структурный аналог бардоксолон метила на основе ГЛК [139]. Полученное производное метил
2-циано-3,11-диоксо-18β-олеан-1,12-диен-30-оат было названо CDODA-Me (Рис. 2Г) и
характеризовалось высокой противоопухолевой активностью in vitro. Было показано, что
Рис. 2. Структурные формулы полусинтетических производных тритерпенов. А – CDDO; Б –
CDDO-Me; В – CDDO-Im; Г – CDODA-Me; Д – соединение 1; Е – карбеноксолон; Ж – бевиримат.
22
CDODA-Me вызывает гибель клеток опухоли прямой кишки [139, 140], мочевого пузыря [141],
предстательной [142] и поджелудочной [143] желез и лейкемии [144]. Уровень активности
данного соединения оказался сравнимым с уровнем бардоксолон метила – например, значение
IC50 (концентрация препарата, вызывающая гибель 50% клеток) на клетках опухоли прямой
кишки SW480 для CDODA-Me и бардоксолон метила составили 0,2-0,5 мкМ и ≤0,2 мкМ,
соответственно [139]. Также было показано, что CDODA-Me обладает противоопухолевой
активностью in vivo – данное производное эффективно подавляло рост подкожных
ксенографтов опухоли прямой кишки RKO на бестимусных мышах [140].
Группой д-ра S. Safe был также синтезирован структурный аналог бардоксолон метила на
основе УК (Соединение 1) (Рис. 2Д) [141]. Данное производное оказалось в 2 раза более
активным по сравнению с CDODA-Me на модели клеток опухоли мочевого пузыря и опухоли
предстательной железы. О дальнейших исследованиях данного соединения пока не сообщалось.
Другими известными полусинтетическими производными тритерпеноидов являются
карбеноксолон (3-О-сукцинат ГЛК) (Рис. 2Е), который на протяжении многих лет до появления
антагонистов H2-рецепторов гистамина считался лучшим средством для лечения язв желудка и
двенадцатиперстной кишки [4], и производное БК бевиримат (Рис. 2Ж), благополучно
прошедший II фазу клинических испытаний на больных ВИЧ-1 [3].
1.3 Механизмы клеточной гибели
В настоящее время накоплено множество данных, указывающих на то, что природные
тритерпеноиды и их синтетические аналоги способны вызывать гибель опухолевых клеток (см.
Главы 1.1.3, 1.2). Известно три основных пути клеточной смерти – некроз, аутофагия и апоптоз.
1.3.1 Некроз
Некроз в течение долгого времени рассматривался как патологический нерегулируемый
механизм гибели клеток, запускаемый в ответ на нефизиологические стрессорные воздействия
(травмы, действие бактериальных токсинов и химических соединений, нехватка кислорода и
питательных веществ) [145]. Однако, за последние два десятилетия накоплено множество
доказательств того, что процесс некроза может проходить регулируемым образом [146].
Индукция регулируемого некроза происходит в клетках, в которых нарушена регуляция
апоптоза (апоптоз – еще один путь гибели клеток, о котором более подробно будет рассказано
ниже) в результате связывания рецепторов клеточной смерти семейства Fas, TRAILR и TNFR,
экспонированных на поверхности клетки, с их лигандами FasL, TRAIL и ФНО-α,
соответственно. Данное связывание в нормальных клетках вызывает запуск апоптоза, однако в
клетках,
в
которых
данный
процесс
нарушен,
приводит
к
активации
рецептор-
взаимодействующей протеинкиназы 1 (RIP1) и ее связыванию с RIP3 с образованием
23
некросомы – белкового комплекса, запускающего ряд процессов, приводящих к некротической
смерти клетки [147].
В результате некроза как нерегулируемого, так и регулируемого, происходит округление
клеток,
увеличение
их
объема,
разбухание
цитоплазмы,
нарушение
целостности
цитоплазматической мембраны, сопровождаемое увеличением в размерах и деградацией
органелл клетки с последующим высвобождением лизосомальных ферментов и выходом
цитоплазмы в межклеточное пространство, что влечет за собой воспаление [146].
1.3.2 Аутофагия
Аутофагия представляет собой регулируемый и эволюционно консервативный путь
деградации внутренних компонентов клетки [148]. В процессе аутофагии происходит
образование аутофагосом путем обособления участков цитоплазмы двуслойной мембраной с
последующим слиянием их с лизосомами и ферментативным расщеплением обособленного
материала.
Различают базальную и индуцируемую аутофагию. Базальная аутофагия представляет
собой рутинный (house-keeping) механизм внутриклеточного контроля качества белков
посредством удаления дефектных молекул [149]. Например, именно с помощью процесса
аутофагии расщепляется основная масса долгоживущих клеточных белков, в то время как
протеасомами деградируются преимущественно короткоживущие белки, составляющие в
клетке всего 1% от общего содержания белка [150]. Индуцируемая аутофагия запускается
клеткой в ответ на различные внутренние и внешние стимулы (окислительный стресс,
гипоксия, нехватка питательных веществ, инфекции и т.д.) и в большинстве случаев
способствует выживанию клеток – она принимает форму репаративной аутофагии, в результате
которой происходит удаление дефектных органелл, неправильно свернутых или склонных к
агрегации белков, восполнение энергетического баланса клетки и т.д. [151].
Аутофагия может участвовать также в осуществлении гибели клеток. Например, в случае
сильного или длительного стресса клетка в попытках справиться с ним способна
аутофагоцитировать до половины своей цитоплазмы, что приводит к коллапсу клеточных
функций и смерти клетки [152]. Гибель клеток по пути аутофагии могут также вызывать
некоторые химиотерапевтические препараты, действующие в отношении опухолевых клеток,
характеризующихся нарушениями в регуляции апоптоза [153, 154, 155] (более подробно о
механизме аутофагии можно узнать из обзоров [155-157]).
24
1.3.3 Апоптоз
В настоящее время накоплено множество данных, указывающих на то, что тритерпены и
их синтетические аналоги вызывают гибель опухолевых клеток именно путем активации
апоптоза (см. обзор [158]).
Апоптоз
(Рис.
3)
представляет
собой
энергозависимый
регулируемый
процесс
программируемой гибели клеток, основной функцией которого является удаление дефектных
(поврежденных, инфицированных, мутантных) клеток из организма. Процесс апоптоза можно
условно разделить на три фазы: а) индукторную, в которой происходит рецепция сигнала,
инициирующего апоптоз, и начальные этапы его передачи; б) эффекторную, в которой
происходит активация каскада сложных биохимических реакций, приводящих к необратимым
изменениям в клетке и в) фазу деградации, в которой происходит деструкция клеточного
материала [159].
Рис. 3 Классическая схема апоптоза, изображающая процессы, описанные в разделе 1.3.3.
25
1.3.3.1 Индукторная фаза апоптоза
Индукция апоптоза может осуществляться посредством внешних или внутренних
факторов. Внешний, или рецептор-зависимый путь инициации апоптоза запускается в
результате взаимодействия рецепторов клеточной смерти Fas (APO-1/CD95), TRAIL (DR4 и
DR5) и TNFR1, экспрессирующихся на поверхности клеток, с их специфическими лигандами
FasL, Apo2L/TRAIL и ФНО-α, соответственно. При этом происходит активация рецепторов с
последующим образованием их комплексов с адаптерными белками FADD (в случае с Fas,
DR4/5) [160] или TRADD (в случае с TNFR1) [161]. Адаптерные белки в комплексе с
рецепторами смерти связываются с прокаспазами 8 [162] и 10 [163] с образованием белковых
комплексов, называемых DISC (death-inducing signaling complex), в составе которых в
дальнейшем происходит формирование зрелых каспаз 8 и 10.
Инициация апоптоза может происходить независимо от рецепторов смерти – в ответ на
внутриклеточные стрессорные факторы, такие как повреждение ДНК [164], окислительный
стресс
[165],
повышение
цитоплазматической
концентрации
Ca2+ [166],
накопление
неправильно свернутых белков в просвете эндоплазматического ретикулума [167] и множества
других. Такой путь инициации апоптоза называют внутренним, или митохондриальным.
Центральным событием данного пути является увеличение проницаемости внешней мембраны
митохондрий, приводящее к быстрой потере митохондриального трансмембранного потенциала
∆ψМ, набуханию митохондрий, разрыву их внешней мембраны и, как результат, выходу в
цитоплазму
ряда
проапоптотических
молекул,
содержащихся
в
митохондриальном
межмембранном пространстве. В данном процессе ключевую роль играют проапоптотические
белки семейства Bcl-2 – Bax и Bak, которые, перемещаясь из цитоплазмы в митохондрии,
олигомеризуются и формируют высокопроницаемые каналы в их внешних мембранах [168,
169]. В интактных клетках белки Bax и Bak неактивны – они удерживаются в цитоплазме в виде
комплексов с анти-апоптотическими белками семейства Bcl-2 (например, Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1)
[170].
В
результате
стрессорного
стимула
происходит
инактивация
указанных
антиапоптических белков путем их фосфорилирования [171] или связывания с так
называемыми BH3-only белками (например, Bad, Bid, Bim) [172]. В результате происходит
высвобождение белков Bax и Bak из неактивных комплексов, их транслокация в митохондрии и
формирование каналов, вызывающих пермеабилизацию внешней митохондриальной мембраны.
Это приводит к выходу из межмембранного митохондриального пространства в цитоплазму
цитохрома С, который формирует вместе с апоптотическим протеаза-активирующим фактором1 (APAF-1) и прокаспазой-9 апоптосому – белковый комплекс, в котором происходит АТФзависимое расщепление указанной прокаспазы.
26
Помимо цитохрома С из митохондриального межмембранного пространства в цитоплазму
выходит ряд других проапоптотических белков – Smac/DIABLO и Omi/HTRA2, блокирующих
апоптоз-ингибирующие белки XIAP [173] и сурвивин [174], и флавопротеин AIF, который
перемещаясь в ядро, способен вызывать конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК без
участия каспаз [175] (Рис. 3).
Таким образом, индукторная фаза апоптоза заканчивается либо формированием белкового
комплекса DISC (в случае внешнего пути апоптоза), либо апоптосомы (в случае внутреннего
пути апоптоза).
1.3.3.2 Эффекторная фаза апоптоза
Эффекторная фаза апоптоза связана с активацией каспазного каскада. Каспазы
представляют собой цистеиновые аспартат-специфичные протеазы, присутствующие в клетке в
форме неактивных проферментов – прокаспаз. После сборки белкового комплекса DISC или
апоптосомы происходит активация так называемых инициаторных каспаз: каспазы 8, 10 или 9,
соответственно, которые в свою очередь вызывают частичный протеолиз (отщепление
короткого продомена) прокаспаз 3, 6 и 7, входящих в группу так называемых исполнительных,
или эффекторных каспаз, и тем самым активируют их [176]. Результатом активации
эффекторных каспаз является протеолитическое расщепление более 280 белков-мишеней,
участвующих в поддержании жизнеспособности клеток [177]. Например, одной из главных
мишеней каспазы-3 является ингибиторный белок ICAD, в результате расщепления которого
активируется нейтральная эндонуклеаза CAD. Активированная CAD в свою очередь
осуществляет межнуклеосомную фрагментацию ядерной ДНК [178], которая является одним из
надежных маркеров апоптоза. Также каспазы -3 и -7 приводят к деградации поли-АДФрибозополимеразы (PARP) – фермента, участвующего в процессе репарации ДНК [179].
Снижение уровня PARP внутри клетки также является широко используемым в лабораторной
практике апоптотическим маркером.
Внешний и внутренний пути инициации апоптоза сходятся друг с другом не только на
этапе активации эффекторных каспаз (Рис.
3), но также в результате активации
проапоптотического BH3-only белка Bid. Инициаторные каспазы 8 и 10, активирующиеся в
процессе внешнего пути апоптоза, фрагментируют данный белок, в результате чего образуется
его усеченная форма tBid (truncated Bid), обладающая способностью транслоцироваться в
митохондрии, вызывать конформационные изменения белков Bax и Bak [180], способствуя их
олигомеризации, и запускать тем самым внутренний путь апоптоза.
27
1.3.3.3 Фаза деградации
Завершающим этапом апоптоза является деградация клетки, в ходе которой происходит
конденсация хроматина, межнуклеосомальная фрагментация ДНК, фрагментация клеточных
ядер, транслокация во внешний
слой
плазматической
мембраны фосфатидилсерина,
являющегося сигналом для привлечения фагоцитирующих клеток [181], уменьшение размеров
клетки, ее последующая фрагментация на так называемые апоптотические тельца и их
фагоцитоз макрофагами и соседними клетками. В результате происходит гибель клетки, не
приводящая к индукции воспалительного ответа, так как ее внутриклеточные компоненты не
выходят в межклеточное пространство.
1.4 Влияние тритерпеноидов на жизнеспособность опухолевых клеток
Во многих исследованиях показано, что пентациклические тритерпены вызывают гибель
опухолевых клеток. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что тритерпены
приводят к активации апоптоза данных клеток в основном по внутреннему митохондриальному
пути (Табл. 1).
Изучение механизма гибели показало, что под действием тритерпенов наблюдается выход
проапоптотических белков из межмембранного митохондриального пространства в цитоплазму.
При этом было определено, что данный процесс может проходить независимо от белков Bax и
Bak. В ряде работ описана способность бетулиновой [182, 183], урсоловой [184], глицирретовой
[185] кислот и сукцината глицирретовой кислоты карбеноксолона [186] стимулировать
открытие митохондриальных транзиторных пор (МТП). Классические МТП представляют
собой белковые комплексы, пронизывающие обе мембраны митохондрии и образующие канал,
который в обычном состоянии закрыт [187]. Открытие МТП является регулируемым процессом
и может индуцироваться высокими концентрациями активных форм кислорода (АФК) [188],
выделяющимися в клетке в ответ на действие указанных тритерпенов. К открытию МТП может
также приводить непосредственное взаимодействие тритерпеноидов с ее компонентами, что
было показано для бетулиновой кислоты [189] и карбеноксолона [186], либо транслокация в
митохондрию белка кофилин-1 [190], наблюдаемая при действии урсоловой кислоты [184].
CDDO в отличие от указанных выше тритерпеноидов приводит к формированию
неклассических
МТП
[191].
Данное
соединение
селективно
подавляет
активность
митохондриальной протеазы Lon, главной функцией которой является деградация окисленных
и неправильно свернутых митохондриальных белков. В результате, внутри митохондрий
накапливаются большие белковые конгломераты, формирующие впоследствии открытые
каналы
[192].
В итоге
открытие
МТП приводит
к
утечке
протонов, нарушению
функционирования дыхательной цепи, набуханию митохондрии и, как результат, разрыву ее
внешней мембраны, ведущей к выходу в цитоплазму митохондриальных апоптогенных белков.
28
Таблица 1. Влияние тритерпенов на жизнеспособность опухолевых клеток различного гистогенеза.
Тритерпеноиды
Тип
Название
Тритерпеноиды ГЛК
солодки
Производные
ГЛК
18α-ГЛК
Клеточная линия
r/m HM-SFME-1
NTUB1
PC3
LNCaP;
DU-145
ГЛК
ГЛК
ГЛК
3-ацетил-2-енГЛК
ГЛК
ГЛК
ГЛК
11-дезоксиГЛК
(доГЛК)
ГЛК
ГЛК
r/m HM-SFME-1
LNCaP
T24
MDA-MB-231,
активированные
ФНОα
NCI-H460
A549
К562
MCF-7
A2780
BGC823
SGC7901
HL60
HepG2
Hep3B
ГЛК
ГЛК
Клеточный эффект
Аноикис, ↓F-актина, ↓βIII-тубулина
Апоптоз, ↑p-p53
Путь инициации
апоптоза
митохондриальный
Апоптоз, подавление инвазии, ↓NF-kB(p65), ↓VEGF,
↓MMP-9, ↓HMGB1, ↓ИЛ-6, ↓ИЛ-8, ↑NAG-1
-
↓ пролиферации клеток, ↓GSH, ↑АФК
-
↓ пролиферации клеток, подавление инвазии, ↓MMP-9,
↓VEGF, ↓NF-kB (p50, p65), ↓p-IkB, подавление
связывания NF-kB с ДНК, ↓p-PI3K/Akt
-
Апоптоз, ↓циклин D1, ↓циклин Е, ↓p-PKC α/βII, ↓p-ERK,
↑p-PKC δ, ↑p-JNK
митохондриальный
Апоптоз
митохондриальный
Апоптоз, ↑FOXO3a, ↓p-Akt, ↓p-GSK-3
Апоптоз, ↑Fas, ↑FasL
митохондриальный
Внешний
Апоптоз, остановка клеточного цикла на фазе G2,
подавление роста опухоли на ксенографтной модели in
vivo
Митохондриальный
Апоптоз, ↑CD95 (Fas/APO-1), ↑CD178 (FasL)
Апоптоз, ↑p-ERK, аутофагия
Внешний
Митохондриальный
MMQ
GH3
Апоптоз, остановка клеточного цикла на фазе G0/G1,
↑АФК, ↑Ca2+, ↑p-JNK, ↑p-p38, ↑p-CaMKII, подавление
роста опухоли на ксенографтной модели in vivo
Митохондриальный
BT549
Hs578T
MDA-MB-436
MDA-MB-231
↓ пролиферации клеток, подавление инвазии и миграции
клеток, ↓MMP-2, ↓MMP-9, ↓p-p38 MAPK, ↓ активность
AP1, ↓Fra-1, ↓c-Jun
-
IC50,
мкМ
~6
4,76±1,15
200
(LNCaP)
500 (DU145)
>35
Ссылка
[194,195]
[79]
[102]
[196]
[101]
166
132
84,39
100
10-50
~25, ~32
(ГЛК)
~140,
~150
(доГЛК)
38±11
>60
111,5
(MMQ)
69,6
(GH3)
77,3-120,9
[197]
[198]
[58]
[75]
[80]
[199]
[200]
[201]
[107]
29
Таблица 1. Продолжение
Тритерпеноиды
Тип
Название
Олеаны
ОК
ОК
ОК
ОК
ОК
ОК
ОК
Клеточная линия
SPC-A-1
MG63
Saos-2
U-87 MG
U-251 MG
Первичная
культура глиомы
NB4
HepG2
Рубцовые
фибробласты
A549
BXPC-3
PANC-1
U2OS
ОК
PC-3
MCF-7
OLO-2
ОК
Урсаны
ОК
УК
УК
SMMC-7721
Bel-7402
HepG2
A549
NCI-H460
NCI-H1299
MKN28
HT-29
HCT116
HT29
Caco2
A293
PC3
MDA-MB-231
MCF-7
Клеточный эффект
Апоптоз
Апоптоз, ↓p-p70 S6K1, ↓p-S6, остановка клеточного
цикла на фазе G1, ↓p-Akt,
↓ пролиферации клеток, подавление миграции и инвазии
клеток, остановка клеточного цикла на фазе G0/G1, ↓pMEK,
↓p-ERK,
подавление
эпителиальномезенхимальный перехода
Апоптоз, остановка клеточного цикла на фазе G1,
↓PML/RARα
Апоптоз, остановка клеточного цикла на фазе G2/M,
↑p53, ↑p-ERK
Апоптоз, ↑p-p38, ↑p-JNK
Апоптоз (p38-зависимый), ↑АФК, ↑p-p38, ↑p-JNK, ↑pERK,
↑p-ASK1,
подавление
роста
А549
на
ксенографтной модели in vivo
Путь инициации
апоптоза
-
-
[202]
[203]
[117]
Митохондриальный
>100
Митохондриальный
40-80
Митохондриальный
20-40
[204]
[69]
[205]
Митохондриальный
-
Апоптоз, ядерная транслокация AIF, ↑АФК, ↑p-p38, ↑pJNK
Митохондриальный
Апоптоз, ↑DR4, ↑DR5, ↑p-JNK, ↑ROS,
Ссылка
~80
↓ пролиферации клеток, остановка клеточного цикла на
фазе G0/G1, ↑p-AMPK, подавление биосинтез липидов и
белков, ↓p-mTOR, ↓p-p70S6K, ↓p-4E-BP1, подавление
аэробного гликолиза, подавление роста PC-3 на
ксенографтной модели in vivo
↓ пролиферации клеток, ↑miR-122, подавление роста
первичной опухоли легких на ксенографтной модели in
vivo
Апоптоз, ↑p-JNK, ↓p-Akt
Апоптоз, ↑COX-2, ↑p-p38, ↓p-ERK
IC50,
мкМ
~25
~75
[206]
[207]
1-4
[208]
>130
Митохондриальный
-
Митохондриальный
Внешний
[209]
34,8
20-25
-
[210]
[211]
[212]
30
Таблица 1. Продолжение
Тритерпеноиды
Тип
Название
УК
УК
УК
УК
УК
УК
Клеточная линия
SCC4
KBM-5
HL-60
HT-29
DU145
УК
Бетулин (Б) и
БК
Б
БК
БК
Б
CDDO и его
CDDO
-
Апоптоз, ↓p-ERK, ↓p-p38, ↑DUSP
Митохондриальный
Митохондриальный
↓ пролиферации клеток, остановка клеточного цикла на
фазе G1, аутофагия, ↑p-AMPK, ↓p-Akt, ↓p-mTOR, ↓pp70S6K, ↓p-4E-BP, ↑Ca2+, стресс ЭПР, ↑p-JNK, ↑p-Bcl-2
-
BGC-823
Апоптоз, ↑ митохондриальной транслокации кофилина-1
Митохондриальный
Jurkat
Апоптоз, открытие МТП
Митохондриальный
Jurkat
Апоптоз
CNE2
KM3
HL-60
A549
NCI-292
HL-60
Апоптоз, остановка клеточного цикла на фазе G2/M,
↑АФК, ↓miR-27, ↑ZBTB10, ↓Sp, ↓сурвивин, ↓NF-kB(p65),
↓циклин D1, подавление роста RKO на ксенографтной
модели in vivo
Апоптоз, открытие МТП
Апоптоз, аутофагия
Апоптоз, аутофагия, остановка клеточного цикла на фазе
G2/M
↓ пролиферации клеток, ↑p21, ↑p27, ↓циклин B, D1, E,
↑p-AMPK, ↓p-mTOR, ↓p- p70S6K
Апоптоз, внутриядерная транслокация AIF
IC50,
мкМ
30 (PC3)
>40 (DU145)
40-50
10-20
-
-
U87MG
RKO
SW480
БК
БК
23-гидроксиБК
Апоптоз, ↑P2Y2, ↑p-p38, ↑COX-2
HeLa
УК
Лупаны
-
U937
MCF-7
K562
Путь инициации
апоптоза
Моноцитарная дифференциация, ↑p-ERK
↓ пролиферации клеток, остановка клеточного цикла на
фазе G1, аутофагия, ↑p-Akt, ↑p-mTOR, ↑p-p70S6K, ↑p-4EBP1, ↓циклинов D1, D3, ↓CDK4, ↓p21, ↓p27
Апоптоз, ↓ FoxM1, ↓ циклин D1, ↓ CDK4
Апоптоз, ↑PTEN, ↓p-Akt
остановка клеточного цикла на фазе G1, стресс ЭПР,
аутофагия, ↓p-Akt, ↑p-ERK, ↑p-JNK, ↑Mcl-1 (15-20 мкМ),
↓Mcl-1 (25 мкМ)
Моноцитарная дифференциация, ↑p-Akt
PC3
DU-145
MCF-7
УК
УК
Клеточный эффект
-
Митохондриальный
Митохондриальная
Ссылка
[213]
[214]
[215]
[216]
[217]
[218]
9,54±0,98
(48 ч)
-
[219]
[220]
[221]
40
5-10 (Б)
~10 (БК)
5 (RKO)
5-10
(SW480)
17,36
~50
>5
0,3-1
[184]
[182]
[222]
[223]
[183]
[224]
[225]
[226]
[227]
31
Таблица 1. Продолжение
Тритерпеноиды
Тип
Название
аналоги
CDDO
CDDO-Me
CDDO-Im
CDDO-Me
CDDO
CDDO-Im
Динитрильное
производное
CDDO
CDDO-Me
Клеточная линия
KG-1
U937
THP-1
TF-1
MO7e
Jurkat
I2.1
U-937,
активированные
ФНО-α
HL60
4T1
Ramos
OCI-Ly19
LNCaP
DU145
PC3
CDDO-Me
CDDO-Im
CDDO
CDDO-Me
CDDO-Im
CDDO-Me
CDDO-Me
H157
A549
LiSa-2
LNCaP
ALVA31
DU145
PC3
PPC1
Клетки
немелкоклеточного
рака легкого
PC-3
C4-2
Клеточный эффект
Путь инициации
апоптоза
IC50,
мкМ
Ссылка
↓p-IkBα, ↓p-NF-kB, прямое ингибирование IKKβ
-
Моноцитарная дифференциация, ↑p-ERK, ↑p-Smad
↓ пролиферации клеток, остановка клеточного цикла на
фазе G2/M, ↓инвазии, ↓p-STAT3, ↓p-Akt, ↓p-Src
-
Апоптоз, открытие неклассических МТП
Апоптоз, ↓Akt, ↓mTOR, ↓p-NF-kB
-
Митохондриальный
Митохондриальный
Внешний
Апоптоз, ↓c-FLIP, ↑DR
Внешний
Апоптоз, ↓FAS, ↓Spot14
-
Апоптоз, ↑DR4, ↑DR5, ↑p-JNK, подавление роста DU145
на ксенографтной модели in vivo
Внешний
Апоптоз, ↑CHOP, ↑DR5, стресс ЭПР
Внешний
[228]
~1,5
(CDDO)
<0,5 (Im,
динитрил)
5-20
(CDDO)
1,25-5
(Im)
<1,25
(Me)
<1
-
[229]
[230]
[191]
[135]
[231]
[232]
[233]
Апоптоз, ↓p-Akt, ↓p-Bad, ↓p-FOXO3a, ↓p-mTOR, ↓pS6K1,
↓p-eIF-4E,
↓p-eIF-BP,
↓внутриядерная
-
[234]
0,625-1,25
[235]
32
Таблица 1. Продолжение
Тритерпеноиды
Тип
Название
Клеточная линия
Путь инициации
апоптоза
Клеточный эффект
IC50,
мкМ
Ссылка
транслокация NF-kB, ↓COX-2, ↓VEGF, ↓циклин D1,
подавление роста PC-3 на ксенографтной модели in vivo
CDDO-Me
CDDO-Me
CDDO-Me
CDDO-Me
CDDO
CDDO-Me
CDDO-Me
CDDO-Me
CDDO-Me
CDODA и его
аналоги
CDODA-Me
CDODA-Me
CDODA-Me
CDODA
CDODA-Me
CDODA-Me
KHOS
U02OS
SaOS
LNCaP
PC-3
OVCAR-3
OVCAR-5
SK-OV3
MDAH-2774
HCT-8
HCT-15
HT-29
Colo 205
Клетки лимфом
MiaPaCa-2
Panc-1
MiaPaCa-2
Panc-1
PC-3
SW480
HCT-15
HT29
LNCaP
PC-3
DU145
RKO
SW480
0,15-0,8
Апоптоз, ↓p-STAT3
Митохондриальный
Апоптоз, ↑АФК, ↓GSH, ↓p-Akt,
внутриядерной локализации NF-kB
↓p-mTOR,
↓
Митохондриальный
[236]
-
[237]
1,25-10
Апоптоз, ↓p-Akt, ↓p-NF-kB (p65), ↓p-mTOR
Митохондриальный
Апоптоз, ↓p-Akt, ↓p-NF-kB (p65), ↓p-mTOR, ↑АФК
Митохондриальный
Внешний
[238]
1,25-2,5
Гибель клеток, подавление активность Lon
-
Апоптоз, ↑АФК, ↓p-Akt, ↓p-NF-kB (p65), ↓p-mTOR, ↑pERK
Апоптоз, ↓hTERT, ↓ теломеразной активности hTERT
Митохондриальный
Внешний
-
↓p-Akt, ↓p-NF-kB (p65), ↓p-mTOR, ↓PTEN, ↓PP2A,
↓PHLPP1
Митохондриальный
↓ пролиферации клеток, активация PPARγ, ↑кавеолин-1,
↑KLF-4
-
Апоптоз, активация PPARγ, ↑p21, ↑p27, ↓циклин D1,
↑NAG-1, ↑ATF-3, ↑p-JNK, ↑p-Akt, ↑p-ERK, ↓AR, ↓PSA,
↓FKBP51
Апоптоз, ↓Sp 1, 3, 4, ↓сурвивина, ↓VEGF, ↓VEGFR1,
ⱵG2/M, подавление роста RKO на ксенографтной модели
in vivo, ↓miR-27a, ↑ZBTB10, ↑Myt-1
-
[192]
[240]
[241]
[242]
[139]
10-15
[142]
1-2,5
-
-
HUVEC
Апоптоз,
-
образования
1,25-5
-
↓ пролиферации клеток, ↑p21, ↑p27, ↓циклин D1, ↑Egr-1,
↑NAG-1, ↑ATF3, ↑p-PI3K, ↑p-p38, ⱵG0/G1
подавление
-
0,2-0,5
Panc1
Panc28
↓миграции,
[239]
[140]
7,31, 3,8
(CDODA)
1,21, 1,79
(Me)
5
[143]
[243]
33
Таблица 1. Продолжение
Тритерпеноиды
Тип
Название
Клеточная линия
Клеточный эффект
Путь инициации
апоптоза
IC50,
мкМ
Ссылка
капилляро-подобных структур, ↓VEGFR1/2, ↓p-mTOR,
↓p- p70S6K
CDODA-Me
CF3DODA-Me
CDODA-Me
ARO
DRO
K-18
Hth-74
DU145
PC3
1-5
↓ пролиферации клеток, ↓Sp1, 3, 4, ↓сурвивин, ↓VEGF,
↓PTTG-1, ↓cMyc, ↓FGF-2
-
Апоптоз, ⱵG0/G1, ↓Sp1, 3, 4, ↓miR-106b-25, ↑ZBTB4
-
[244]
-
[245]
34
Тритерпеноиды также способны активировать внешний путь апоптоза. Данный эффект
скорее всего зависит от используемых клеточных линий и описан лишь в нескольких работах
[135, 138, 139, 199, 212, 231, 233]. Было показано, что внешний путь апоптоза активируется при
действии глицирретовой и урсоловой кислот и производных олеаноловой кислоты CDDO и
CDDO-Im, приводящих к усилению экспрессии рецептора смерти Fas и его лиганда FasL [75,
119, 199] и рецепторов смерти DR4 и DR5 [231, 233], соответственно. Также показано, что
тритерпеноиды могут вызывать активацию каспазы-8 [76, 135, 138, 139, 233] и последующую
фрагментацию данным ферментом проапоптотического белка Bid [80, 212], а также подавлять
экспрессию белка c-FLIP [231], являющегося ключевым ингибитором образования DISC [193].
1.4.1 Внутриклеточные сигнальные пути, запускаемые действием тритерпеноидов
Описанные выше события, вызываемые тритерпенами, являются конечным результатом
действия данных соединений на множество внутриклеточных сигнальных путей. Скорее всего,
тритерпены следует рассматривать в качестве первичных химических сигналов, способных
активировать поверхностные клеточные рецепторы или влиять на активность внутриклеточных
ферментов, находящихся на вершине сигнальных каскадов. Взаимодействие тритерпена с его
молекулярной мишенью приводит к генерированию вторичного сигнала, который через
сигнальные пути передается белкам-эффекторам, осуществляющим апоптоз. Было показано,
что эффект тритерпенов на опухолевые клетки в основном обусловлен их влиянием на
сигнальные пути фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) и митоген-активируемых протеинкиназ
(MAP киназ).
1.4.1.1 PI3K/Akt сигнальный путь
PI3K сигнальный путь играет ключевую роль в регуляции выживания клеток и
пролиферации, а также задействован в ряде других клеточных процессов, включающих
миграцию, деление и дифференциацию. Активация данного пути наблюдается в подавляющем
большинстве опухолей человека [246], с ним часто связано развитие лекарственной
устойчивости опухолевых клеток, поэтому PI3K сигнальный путь представляет собой
перспективную мишень для противоопухолевой терапии.
К запуску данного пути приводит связывание широкого ряда лигандов (например,
ростовых факторов, цитокинов, инсулина и др.) с расположенными на поверхности клеток
рецепторными тирозинкиназами с последующим автофосфорилированием их внутриклеточных
доменов, присоединением к ним PI3K, изменением конформации данного фермента и, в
конечном итоге, его активации. Активированная
PI3K конвертирует
свой субстрат
фосфатидилинозитол 4,5-дифосфат (PIP2) в фосфатидилинозитол 3,4,5-трифосфат (PIP3),
который, связываясь с фосфоинозитид-зависимой киназой PDK1 и протеинкиназой Akt,
35
стимулирует их прикрепление к клеточной мембране, после чего PDK1 фосфорилирует Akt по
остатку треонина Thr308. Akt также фосфорилируется белковым комплексом mTORC2 по
остатку серина Ser473. Активированная таким образом Akt открепляется от клеточной
мембраны и перемещается в цитоплазму и ядро клетки, где фосфорилирует широкий ряд
ферментов и транскрипционных факторов, регулируя тем самым различные клеточные
функции (Рис.4) [247].
В большом количестве работ показана способность тритерпенов ингибировать PI3K/Akt
сигнальный путь в опухолевых клетках. Данные соединения подавляют активацию PI3K [101] и
вызываемое ею фосфорилирование Akt [58, 101, 135, 203, 210, 215, 217, 218, 221, 230, 235, 237242], однако механизм данного процесса до конца не изучен. Ингибирование PI3K/Akt оси
может быть опосредовано фосфатазами PTEN и PHLPP1, способными конвертитровать PIP3
обратно в PIP2, подавляя, таким образом, активацию Akt, и дефосфорилировать активную
форму Akt, соответственно (Рис. 4). Показано, что уровень экспрессии данных фосфатаз
увеличивается при действии урсоловой кислоты [217] и CDDO-Me [242]. Также активацию
PI3K и Akt может ингибировать кавеолин-1, экспрессия которого увеличивается при действии
олеаноловой кислоты [363]. Наиболее важными эффекторами PI3K/Akt сигнального пути
являются протеинкиназа mTOR и транскрипционные фактор NF-kB и FOXO3a.
Рис. 4. Схематическое изображение PI3K/Akt сигнального пути.
1.4.1.1.1 Протеинкиназа mTOR
Основной физиологической функцией mTOR является стимулирование синтеза белка в
клетках, что приводит к повышению их пролиферации. Активная форма mTOR осуществляет
36
данный эффект, фосфорилируя белок-супрессор 4E-BP1 и рибосомальную киназу p70S6K, что
приводит, соответственно, к протеосомной деградации и активации указанных белков.
Деградация 4E-BP1 влечет за собой высвобождение трансляционного фактора eIF4E из
неактивного
комплекса,
его
связывание
с
5’-кэпом
мРНК
и
активацию
сборки
преинициаторного комплекса трансляции [248]. Активированная киназа p70S6K также
способствует инициации трансляции, фосфорилируя рибосомальный белок S6, входящий в
инициаторный комплекс [249] (Рис.5).
Показано, что тритерпены подавляют фосфорилирование mTOR, причем данный эффект
связан не только с ингибированием PI3K/Akt оси [58, 101, 135, 203, 210, 215, 217, 218, 221, 230,
235, 237-242], но также с активацией протеинкиназы AMPK [207], фосфорилирующей белок
TSC2, который является негативным регулятором mTOR [250]. В результате снижения
активности mTOR наблюдается значительное подавление фосфорилирования mTOR-зависимых
белков [203, 215, 221, 235], что в конечном итоге приводит к торможению процесса трансляции
и пролиферации клеток.
Рис. 5. Схематическое изображение Akt/mTOR сигнальной оси.
1.4.1.1.2 Транскрипционный фактор NF-kB
NF-kB представляет собой транскрипционный фактор, участвующий в запуске быстрого
ответа клеток на инфекции, воспалительные процессы и стрессовые воздействия и
регулирующий пролиферацию и выживание клеток [251]. Данный фактор активирован в
большинстве опухолей и довольно часто способствует формированию у них фенотипа
37
множественной лекарственной устойчивости, вызывая гиперэкспрессию P-гликопротеина –
АТФ-зависимого насоса, выводящего из клеток широкий ряд ксенобиотиков, в том числе
химиотерапевтические препараты [252].
NF-kB
представляет
собой
гетеродимерный
белковый
комплекс,
состоящий
в
большинстве клеток млекопитающих из субъединиц р50 и р65 [253]. В обычных условиях
данный транскрипционный фактор находится в связанном виде с ингибиторным белком IkB,
удерживающим NF-kB в цитоплазме, и неактивен (Рис. 6). Активированная форма Akt
фосфорилирует киназу IkB (IKK), которая, в свою очередь, фосфорилирует IkB, тем самым
вызывая деградацию данного ингибиторного белка по протеасомозависимому пути (Рис. 6). Это
способствует высвобождению NF-kB, его проникновению в ядро и запуску транскрипции
множества генов-мишеней, кодирующих, к примеру, анти-апоптотические белки [254] и белки,
участвующие в воспалении, метастазировании и ангиогенезе [255].
Рис. 6. Схематическое изображение Akt/NF-kB сигнальной оси.
Показано,
что
тритерпеноиды
препятствуют
активации
NF-kB,
ингибируя
фосфорилирование и последующую деградацию IkB [30, 101, 228]. Данный эффект обусловлен
не только подавлением активности протеинкиназ PI3K и Akt [30, 135, 235, 237-242] но и
прямым ингибированием тритерпенами киназы IKK, как это было показано для CDDO-Me [101,
228]. Кроме этого, тритерпеноиды способны подавлять связывание NF-kB с ДНК [101], а также
снижать экспрессию субъединицы p65 NF-kB [101, 102, 223]. Указанные события приводят к
подавлению экспрессии NF-kB-зависимых генов, кодирующих провоспалительные белки iNOS,
COX-2, ФНОα, ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8 [30, 102, 235], белки, участвующие в метастазировании
ICAM-1 [111] и MMP-9 [101, 102], ангиогенезе VEGF [101, 102, 235] и клеточном цикле
(циклин D1) [235], а также антиапоптотические белки сурвивин, XIAP и c-FLIP [212].
38
1.4.1.1.3 Транскрипционный фактор FOXO3a
Вызванное тритерпеноидами ингибирование PI3K/Akt пути может также приводить к
подавлению фосфорилирования проапоптотического транскрипционного фактора FOXO3a [58,
235], что способствует разрушению неактивного комплекса данного белка с ингибиторным
белком 14-3-3 и последующей транслокации FOXO3a в ядро. Данный фактор усиливает
экспрессию ряда проапоптотических генов – например, при действии глицирретовой кислоты
наблюдается
FOXO3a-регулируемое
усиление
экспрессии
гена
Bcl2l11,
кодирующего
проапоптотический белок Bim [58]. Кроме этого, FOXO3a является негативным регулятором
экспрессии онкогенного транскрипционного фактора FOXM1 [256], участвующего в
пролиферации клеток и регуляции клеточного цикла. Показано, что уровень экспрессии
FOXM1 значительно снижается при действии урсоловой кислоты [216].
Таким образом, PI3K/Akt сигнальный путь играет ключевую роль в регулировании
пролиферации клеток и их выживании, а способность тритерпенов вызывать апоптоз
опухолевых клеток, препятствуя активации PI3K/Akt пути, свидетельствует о перспективности
данных соединений для разработки на их основе новых противоопухолевых агентов.
1.4.1.2 MAP киназный сигнальный путь
Сигналы внешних стимулов могут передаваться внутрь клеток эффекторным белкам и по
сигнальному пути
митоген-активируемых
протеинкиназ
(MAP
киназ).
Данный
путь
представляет собой белковый каскад, состоящий из группы протеинкиназ, способных в ответ на
широкий
ряд
стимулов
(ростовые
факторы,
цитокины,
окислительный
стресс,
ультрафиолетовое излучение, действие химических веществ) активировать друг друга путем
последовательного фосфорилирования. В результате происходит активация MAP киназ –
ферментов, способных в активном состоянии фосфорилировать транскрипционные факторы,
регулируя тем самым их активность. В конечном итоге происходит изменение экспрессии
широкого ряда генов, продукты которых опосредуют ответ клеток на полученный внешний
стимул.
MAP киназы включают в себя протеинкиназы семейств ERK (extracellular signal-regulated
kinase), JNK (c-Jun N-terminal kinase) и p38 [257]. В настоящее время накоплено множество
данных, указывающих на то, что протеинкиназы семейства ERK являются важными
регуляторами пролиферации и выживания клеток [258], в то время как протеинкиназы семейств
JNK и p38 играют ключевую роль в регуляции гибели клеток, апоптоза, остановке клеточного
цикла, и ингибировании клеточного роста [259, 260]. Было показано, что тритерпеновые
соединения способны влиять на активацию данных ферментов, однако подробный механизм их
действия на MAP киназный сигнальный путь до сих пор не изучен.
39
1.4.1.2.1 Протеинкиназа ERK
В ряде работ было показано, что действие тритерпеновых соединений может приводить к
изменению активности ERK [69, 117, 142, 197, 200, 206, 211, 213, 218, 220, 229, 240]. При этом
оказалось,
что
тритерпеноиды
способствовали
как
подавлению,
так
и
усилению
фосфорилирования данной протеинкиназы (Табл. 2). По всей видимости, наблюдаемый эффект
зависит как от использованной клеточной линии, так и от вида тритерпеноида.
Глицирретовая [197] и урсоловая [220] кислоты вызывали гибель опухолевых клеток,
подавляя ERK сигнальный путь. Данные тритерпеноиды ингибировали фосфорилирование ERK
разными путями – глицирретовая кислота подавляла активность ее регулятора – протеинкиназы
C α/βII (PKC α/βII) [197], в то время как урсоловая кислота усиливала экспрессию фосфатаз
DUSP, дефосфорилирующих ERK [220] (Рис. 7).
Апоптоз опухолевых клеток, вызываемый олеаноловой кислотой [69] и производным
глицирретовой кислоты CDODA-Me [142], наоборот, зависел от активации ERK сигнального
пути. Было показано, что фосфорилирование ERK данными тритерпеноидами приводило к
увеличению экспрессии проапоптотических белков p53 [69] и NAG-1 [142]. В случае
олеаноловой кислоты активация ERK также вызывала остановку клеточного цикла на фазе
G2/M в результате изменения экспрессии ключевых регуляторов данного процесса –
подавления экспрессии циклина B1 и Cdk1 и увеличения экспрессии p21 [69] (Рис. 7).
Активация ERK сигнального пути в опухолевых клетках под действием тритерпеноидов
стимулирует не только активацию апоптоза, но также ряд других процессов. Например,
подавление фосфорилирования ERK, вызванное олеаноловой кислотой, приводит к снижению
агрессивности опухоли – наблюдалось ингибирование миграции и инвазии опухолевых клеток
вследствие
их
мезенхимально-эпителиальной
трансформации
Рис. 7. Схематическое изображение сигнального пути протеинкиназы ERK.
[117].
Активация
ERK
40
сигнального пути урсоловой кислотой [213] и CDDO-Im [229] приводит к дифференциации
клеток лейкемии HL-60 в моноциты, характеризующиеся нормальным клеточным фенотипом и
чувствительностью
к
апоптозу
[261].
Активация
ERK,
наблюдаемая
при
действии
глицирретовой [200] и урсоловой [218] кислот, вызывает запуск репаративной аутофагии –
защитной реакции клетки на клеточный стресс, вызванный тритерпенами, способствующей
подавлению апоптоза [156].
1.4.1.2.2 Протеинкиназа p38
В ряде работ было отмечено, что тритерпены способны запускать апоптоз в опухолевых
клетках, активируя протеинкиназу р38. Данным эффектом обладали глицирретовая [201] и
олеаноловая [205, 206] кислоты и их полусинтетические производные CDODA-Me [101] и OLO2 [208]
Одной из возможных причин индукции p38 является окислительный стресс [262]. Было
показано,
что
вызываемое
глицирретовой
и
олеаноловой
кислотами
повышение
внутриклеточной концентрации активных форм кислорода (АФК) приводит к активации
кальмодулин-зависимой протеинкиназы II (CaMKII) [201] и протеинкиназы ASK1, являющихся
регуляторами p38 [206], соответственно. Урсоловая кислота вызывала активацию p38 через
индукцию P2Y2 рецептора, приводящую к фосфорилированию киназы Src, которая в свою
очередь является активатором протеинкиназы p38 [214] (Рис. 8).
Зависимость апоптоза опухолевых клеток от активации p38 сигнального пути под
действием тритерпенов была продемонстрирована в работах [143, 206, 208]. В работах [211,
214] данная зависимость не отмечалась – наоборот, было показано, что активация p38 приводит
к
подавлению
апоптоза
вследствие
повышения
уровня
экспрессии
белка
COX-2,
способствующего развитию резистентности опухолевых клеток к апоптотической гибели [263].
Рис. 8. Схематическое изображение сигнального пути протеинкиназы p38.
41
Необходимо отметить, что влияние тритерпенов на активацию p38 зависит от выбора
клеточной линии. Например, глицирретовая кислота может вызывать не только увеличение
уровня фосфорилирования данной протеинкиназы, как было отмечено выше [201], но и
подавлять ее активацию [107]. Снижение степени фосфорилирования p38 отмечено также при
действии урсоловой кислоты [220]. Показано, что данные эффекты не оказывали влияния на
апоптоз, однако в случае глицирретовой кислоты подавление активации p38 приводило к
снижению экспрессии белков Fra-1 и c-Jun, являющихся компонентами транскрипционного
фактора AP-1, в результате чего подавлялась экспрессия AP-1 регулируемых генов MMP2 и
MMP9, кодирующих матриксные металлопротеиназы-2 и -9, которые играют важную роль в
усилении метастазирования и ангиогенеза [107] (Рис. 8).
1.4.1.2.3 Протеинкиназа JNK
Апоптоз опухолевых клеток, вызываемый тритерпенами, может также запускаться в
результате активации протеинкиназы JNK. Взаимосвязь между апоптозом и увеличением
степени фосфорилирования JNK была отмечена для глицирретовой [197, 201], олеаноловой
[205; 210], урсоловой [212] кислот, CDDO-Me [231, 234], CDODA-Me [142] и производного
олеаноловой кислоты OLO-2 [208] на различных линиях опухолевых клеток.
Известно, что протеинкиназа JNK, также как и протеинкиназа p38, может активироваться
в ответ на окислительный стресс [264]. Поэтому не удивительно, что фосфорилирование
данных ферментов зачастую происходит одновременно: в работе [201] показано, что
глицирретовая кислота, вызывая усиление внутриклеточного синтеза АФК, приводит к
активации отмеченной выше протеинкиназы CaMKII (см. главу 1.4.1.2.2), являющейся
регулятором не только p38, но также и протеинкиназы JNK [201]. Также АФК-зависимая
активация JNK была отмечена для урсоловой кислоты – в данном случае повышалась
Рис. 9 Схематическое изображение сигнального пути протеинкиназы JNK
42
экспрессия другого регулятора JNK – протеинкиназы IRE1α [221]. Помимо этого
фосфорилирование JNK может катализироваться протеинкиназой C δ (PKCδ), как это было
отмечено для глицирретовой кислоты [197] (Рис. 9).
Активация протеинкиназы JNK в некоторых опухолевых клеточных линиях может
приводить не только к апоптозу, но также к запуску репаративной аутофагии - например,
данный эффект был показан для урсоловой кислоты на клетках глиомы U87MG [221].
Таким образом, тритерпеноиды, несмотря на значительные различия в их молекулярной
структуре, способны вызывать гибель опухолевых клеток по сходному механизму. Инициация
апоптоза, вызываемая тритерпеноидами, представляет собой сложный комплексный процесс,
включающий воздействие данных соединений сразу на несколько внутриклеточных сигнальных
каскадов. При этом внутриклеточные эффекты тритерпеноидов значительно зависят от
используемых клеточных линий.
Способность тритерпеноидов индуцировать гибель опухолевых клеток вызывает большой
интерес со стороны фармацевтической отрасли. Однако их использование в клинике
затруднительно вследствие низкого уровня их биодоступности и недостаточной для лекарств
биологической активности.
1.5 Пролекарства тритерпеновой природы
Несмотря на успехи современной медицинской химии, большинство разрабатывающихся
и уже применяемых в клинике противоопухолевых препаратов остаются малоэффективными, в
первую очередь, вследствие их низкой биодоступности. В подавляющем большинстве случаев
низкая
биодоступность
фармацевтических
агентов
является
следствием
их
слабой
растворимости в воде. Известно, что данным серьезным недостатком обладают около 40%
вышедших на рынок лекарственных препаратов и свыше 75% препаратов, находящихся в
настоящий момент на стадии исследований [265]. Наряду со слабой водорастворимостью,
низкую биодоступность могут также вызывать быстрый метаболизм лекарственных веществ, их
плохая клеточная проницаемость и быстрое выведение из организма [266].
Для увеличения биодоступности лекарственных веществ в последнее время широко
применяется технология создания пролекарств [267]. Данная технология заключается в
ковалентном присоединении к молекуле, потенциально обладающей терапевтическим
эффектом, различных заместителей, способствующих усилению ее растворимости в воде или
липидных мембранах, либо придающих лекарственным веществам такие дополнительные
свойства, как селективность действия в отношении клеток-мишеней, высокая стабильность в
сыворотке крови и другие. При этом синтезированные конъюгаты остаются фармакологически
инертными до тех пор, пока в организме не произойдет их активация путем химического или
43
ферментативного гидролиза, приводящего к отщеплению заместителя и высвобождению
исходного активного соединения.
Дизайн пролекарств включает в себя выбор оптимального заместителя и ковалентной
связи, соединяющей данный заместитель с молекулой лекарственного соединения. Наиболее
распространенными примерами ковалентных связей, используемых при создании пролекарств,
являются связи, гидролизируемые широко представленными в организме эстеразами, а именно
эфирные [268], амидные, карбонатные и карбаматные [269] связи. В случае амидных связей их
гидролиз также может осуществляться и другими повсеместно распространенными ферментами
– пептидазами и протеазами [270]. Поскольку перечисленные ферменты широко представлены
в организме, пролекарства, содержащие данные связи, не обладают селективностью действия.
Существуют,
однако,
примеры
ковалентных
связей,
способствующих
усилению
направленности действия пролекарств – оксимные связи, гидролиз которых катализируется
печеночными микросомальными цитохромами Р450 [271], и широкий ряд pH-чувствительных
связей [272, 273], способных расщепляться преимущественно в кислых условиях, характерных,
например, для опухолей [274].
Одним из примеров соединений с низкой биодоступностью являются тритерпеноиды.
Вследствие особенностей строения молекулярного скелета, тритерпеноиды являются высоко
гидрофобными – они представляют собой объемные углеводороды, в составе которых часто
отсутствуют полярные или ионизованные группы. В настоящее время ведутся попытки
увеличения биодоступности данных соединений путем создания их пролекарственных форм.
Работа в данной области в основном направлена на увеличение растворимости тритерпеноидов
(см. раздел 1.5.1), однако существует ряд работ, в которых синтез пролекарств нацелен на
усиление их селективности действия (см. раздел 1.5.2).
1.5.1 Увеличение растворимости тритерпеновых соединений
Классический принцип разработки пролекарств заключается в изменении физикохимических свойств молекул лекарственных веществ – в первую очередь, уровня их
гидрофильности или гидрофобности, приводящих, соответственно, к повышению их
растворимости в воде или усилению абсорбции клетками.
Для увеличения гидрофильности лекарственного препарата к его молекуле присоединяют
различные полярные или заряженные функциональные группы, такие как фосфаты, сахара и
аминокислотные
остатки
[275].
При
этом
необходимо
соблюдение
баланса
между
гидрофильностью и гидрофобностью молекулы. Известно, что заряженные молекулы
достаточно сложно проходят сквозь биологические мембраны [276], поэтому избыток
ионизованных групп в составе пролекарства может повлечь за собой снижение его клеточной
44
проницаемости. В случае, когда лекарственные соединения изначально характеризуются
высокой полярностью молекулы, усиление их биодоступности проводится путем маскирования
заряженных групп липофильными заместителями, в основном, с помощью синтеза эфиров
[269].
1.5.1.1 Увеличение гидрофильности тритерпеновых соединений
Повысить растворимость тритерпенового соединения в воде можно путем введения в его
молекулу заряженных заместителей – к примеру, введение в положение С3 глицирретовой
кислоты сукцинильной группы приводит к повышению водорастворимости полученного
пролекарства (1) (Рис. 10) в 105 раз по сравнению с исходным тритерпеноидом [277], что, в
конечном итоге, вызывает усиление биологической активности – в отличие от глицирретовой
кислоты производное (1) используется в клинической практике. Оно известно под названием
карбеноксолон и применяется для лечения язвы пищевода и в качестве противовоспалительного
средства [278].
Увеличения растворимости можно также добиться введением в молекулу тритерпена
полиэтиленгликоля (ПЭГ) – неионного полимера, обладающего высокой растворимостью в
воде. Данный подход, например, использовался для усиления гидрофильности урсоловой [279]
и бетулиновой [280] кислот – молекулы ПЭГ5000 (2) и ПЭГ40000 (3) вводились, соответственно,
через различные линкеры в положение С3. Показано, что данные модификации приводили к
значительному усилению водорастворимости конъюгатов. Например, растворимость конъюгата
(3) выросла в 750 раз по сравнению с исходной бетулиновой кислотой, что коррелировало со
значительным усилением эффективности его противоопухолевого действия в отношении
ксенографтной мышиной модели карциномы легких Льюиса как по показателям выживаемости
животных, так и по значению среднего объема опухоли [280].
В ряде работ [281, 282] для увеличения гидрофильности тритерпенов создавали их
конъюгаты с различными аминокислотами и метиловыми эфирами аминокислот. Данные
заместители вводились через амидную связь в положение С28 бетулиновой кислоты [281] и в
положение С30 олеаноловой кислоты [282]. Указанные модификации приводили к
значительному увеличению растворимости данных соединений, что способствовало заметному
усилению
их
биологической
активности.
Наиболее
активными
оказались
конъюгат
бетулиновой кислоты с аланином (4) и конъюгат уксусного эфира олеаноловой кислоты с
метиловым эфиром глицина (5) – цитотоксичность данных соединений в отношении
опухолевых клеток in vitro увеличилась по сравнению с исходными тритерпенами в 4 и 22 раза,
45
Рис. 10. Структурные формулы пролекарственных форм тритерпеноидов. 1 – карбеноксолон; 2 –
конъюгат УК с ПЭГ5000; 3 – конъюгат БК с ПЭГ40000; 4 - конъюгат БК с аланином; 5 – метиловый эфир
N-[(3β)-3-(ацетокси)-28-оксоолеан-12-ен-28-ил]-глицина; 6 – диэтиловый эфир ГЛЗК; 7 - бутиловый
эфир гинсенозида СК; 8 - октиловый эфир гинсенозида СК; 9 - изопропиловый эфир УК; 10 –
конъюгат ОК с О2-(2,4-динитрофенил)диазенийдиолатом; 11 – 2-[(L-валинил)окси]пропиловый эфир
ОК; 12 - 2-[(L-валинил-L-валинил)окси]пропиловый эфир ОК; 13 - конъюгат ОК с L-валином и
нитратной группой; 14 - конъюгат ОК с L-валин-L-валиновым дипептидом и нитратной группой; 15 –
конъюгат УК и фолиевой кислоты с полиаминодиамином; 16 – 28-О-β-D-глюкуронид БК; 17 – цис-3О-[4-(R)-(3-хлорофенил)-2-оксо-1,3,2-диоксафоринан-2-ил]-18β-ГЛК.
46
Рис. 10. Продолжение.
соответственно. Помимо этого, конъюгат (5) подавлял рост меланомы B16 in vivo в отличие от
исходной олеаноловой кислоты. Следует отметить, что введение метиловых эфиров
аминокислот в молекулу CDDO не приводило к какому-либо заметному усилению
биологической активности данного соединения [283].
1.5.1.2 Увеличение гидрофобности тритерпеновых соединений
Многие тритерпеноиды представлены в растениях в виде гликозидов или сапонинов –
конъюгатов тритерпеновой молекулы с одним или несколькими сахарными остатками. Данные
соединения, как и их агликоны, характеризуются широким спектром биологического действия.
В отличие от тритерпенов сапонины высоко полярны вследствие наличия в их молекулах
сахарных остатков, что, с одной стороны, определяет их высокую степень растворимости в
воде, но, с другой стороны, значительно снижает клеточную абсорбцию данных соединений и,
как результат, приводит к низкой биодоступности при пероральном введении [284].
Усиления клеточной абсорбции сапонинов можно достичь путем увеличения их
липофильности, этерифицируя карбоксильные группы в составе сахарных остатков. Данный
47
подход был применен в отношении глицирризиновой кислоты [284] и гинсенозида СК [285].
Было показано, что введение этильной группы в состав глицирризиновой кислоты (6)
приводило к трехкратному усилению биодоступности синтезированного пролекарства in vivo
при интрадуоденальном введении по сравнению c исходным сапонином. Наблюдалось
значительное увеличение его кишечной абсорбции и увеличение его концентрации в желчи.
Сходные результаты были получены при этерификации гинсенозида СК – синтезированные
бутиловый (7) и октиловый (8) эфиры данного соединения характеризовались, соответственно,
в 5 и 4 раза большей кишечной проницаемостью in vitro, смоделированной на культуре клеток
Caco-2, по сравнению с исходным гликозидом. Увеличению биодоступности пролекарств (7) и
(8) способствовало также то, что данные конъюгаты, в отличие от гинсенозида СК, не являлись
субстратами для P-гликопротеина – АТФ-зависимого насоса, гиперэкспрессирующегося в
кишечных эпителиоцитах и некоторых опухолевых клетках и отвечающего за выведение
обширного ряда ксенобиотиков и лекарственных соединений [286].
Гидрофобные группы также вводились в молекулы тритерпеновых кислот. Введение
изопропильной группы в положение С28 урсоловой кислоты (9) приводило к значительному
усилению клеточной проницаемости данного конъюгата [287] и, как результат, практически к
четырехкратному усилению его цитотоксичности в отношении опухолевых клеток по
сравнению с исходным соединением [288].
1.5.2 Опухоль-направленные пролекарства тритерпеновой природы
Другим
важным
направлением
при
разработке
пролекарств
является
создание
конъюгатов, селективно действующих на клетки-мишени. При этом большое внимание
уделяется анализу характерных отличий между таргетными и здоровыми клетками, на основе
которого ведется выбор оптимальных заместителей и ковалентных связей. Например, при
синтезе противоопухолевых пролекарств учитываются такие особенности опухолевых клеток,
как экспрессия опухоль-специфических ферментов и мембранных рецепторов и низкое
значение pH в цитоплазме, вызванное метаболической перестройкой в данных клетках и слабой
васкуляризацией опухолевой ткани [289].
На настоящий момент разработан и успешно используется большой ряд лекарственных
веществ, эффективно и специфично подавляющих прогрессию многих типов опухолей и
способствующих значительному увеличению общей выживаемости пациентов и улучшению
качества их жизни [290]. Многие из данных соединений представляют собой традиционные
химиотерапевтические препараты, трансформированные в пролекарства.
Описанный подход применяется также и к соединениям тритерпеновой природы.
Увеличение опухолевой направленности тритерпеновых пролекарств достигается путем
введения в их состав заместителей, являющихся субстратами или лигандами для опухоль-
48
специфичных ферментов или рецепторов. Наибольший успех в данной области был отмечен
при синтезе опухоль-направленных конъюгатов олеаноловой кислоты [294-296]. Увеличение
селективности противоопухолевого действия данного тритерпеноида было достигнуто путем
введения в его молекулу двух заместителей:
(а)
галактозы,
являющейся
лигандом
для
азиалогликопротеинового
рецептора,
гиперэксперссирующегося в клетках гепатом человека [291], через биодеградируемую эфирную
связь в положение С28;
(б) O2-(2,4-динитрофенил) диазенийдиолата через линкер в положение C3. Данный
заместитель обладает в опухолевых клетках синергическим с оленоловой кислотой действием –
глутатион-S-трансфераза π, уровень экспрессии которой довольно часто увеличен во многих
типах опухолей [292], катализирует присоединение к данному заместителю глутатиона, что
приводит к высвобождению высоких концентраций оксида азота (II) (NO), вызывающих
цитотоксический ответ и апоптоз [293].
Синтезированный в результате таких модификаций [294] конъюгат (10) обладал высокой
антипролиферативной активностью в отношении клеточных линий гепатомы человека HepG2,
Bel-7402 и SMMC-7721 (IC50 = 2,05 – 3,97 мкМ) и не вызывал при этом гибель нормальных
клеток печени LO2. Избирательное действие пролекарства (10) было также подтверждено в
экспериментах in vivo – данное соединение, являясь нетоксичным для мышей, обладало
высокой эффективностью на модели солидной формы гепатомы мыши H22.
В работах [295, 296] были сделаны попытки увеличить селективность действия
олеаноловой кислоты путем создания ее форм, являющихся субстратом для пептидного
транспортера PepT1. Данный белок экспрессируется в клетках кишечного эпителия и играет
важную роль в абсорбции аминокислот и олигопептидов [297]. Помимо этого, экспрессия
PepT1
характерна
для
ряда
опухолевых
клеток
[298,
299].
Данные
пролекарства
конструировались введением в положение С28 олеаноловой кислоты ряда аминокислот и
дипептидов через различные линкеры. В результате скрининга были выявлены соединения,
обладающие наибольшей кишечной проницаемостью in vitro, смоделированной на культуре
клеток Caco-2, гиперэкспрессирующих PepT1. Ими оказались конъюгаты, содержащие Lвалиновый (11) и L-валин-L-валиновый (12) заместители; по сравнению с исходным
тритерпеном проницаемость пролекарств увеличилась в 5,3 и 3,3 раза, соответственно. В
экспериментах на крысах данные пролекарства (11), (12) обладали приблизительно в 3,5 раза
большей пероральной биодоступностью, чем олеаноловая кислота. Однако их токсичность в
отношении опухолевых клеток оказалась низкой. С целью усиления антипролиферативной
активности (11) и (12) в положение С3 данных конъюгатов была введена NO-донорная
нитратная группа (13), (14) [300]. Было показано, что такая модификация значительно
49
усиливает цитотоксическое действие пролекарств в отношении ряда опухолевых клеток
(HepG2, MCF-7, A549, HCT-116), причем наибольший эффект наблюдался на клетках A549,
экспрессирующих PepT1 - значения IC50 аминокислотного и дипептидного конъюгата
составляли 2,4 и 7,5 мкМ, соответственно, против 81,4 мкМ для олеаноловой кислоты.
Помимо отмеченных выше азиалогликопротеинового рецептора и транспортера PepT1
мишенью
для
противоопухолевых
пролекарств
может
являться
фолатный
рецептор,
гиперэкспрессирующийся во многих типах опухолей [301]. В лаборатории профессора Gao Y.
[302] был синтезирован конъюгат (15) урсоловой и фолиевой кислот, являющийся лигандом для
данного рецептора, при этом указанные молекулы соединялись не напрямую, а через
полиаминодиамин (PAMAM). Данные модификации привели к повышению растворимости
пролекарства в воде и селективности его действия – на модели клеток HepG2, не
экспрессирующих фолатный рецептор, конъюгат (15) оказался в пять раз менее токсичным по
сравнению с исходной урсоловой кислотой, в то время как на модели клеток HeLa,
гиперэкспрессирующих данный маркер, цитотоксичность пролекарства (15) оказалась в два
раза выше токсичности исходного тритерпена.
В работе [303] описаны результаты по созданию опухоль-направленной пролекарственной
формы бетулиновой кислоты. Был синтезирован конъюгат БК с β-D-глюкуроновой кислотой
(16),
отщепление
которой
осуществляется
β-D-глюкуронидазой
–
ферментом,
гиперэкспрессированным в некротизированных опухолевых тканях [304] и обладающим
максимальной активностью при низком значении pH, характерном для цитоплазмы опухолевых
клеток [305]. К сожалению, синтезированный конъюгат (16) не обладал селективностью
действия in vitro – он оказался нетоксичным как в отношении здоровых, так в отношении
опухолевых клеток. При этом было показано, что глюкуронидация бетулиновой кислоты
приводит к значительному усилению ее водорастворимости.
Опухоль-направленные пролекарственные формы глицирретовой кислоты в литературе до
настоящего момента не описаны. Единственной работой, потенциально связанной с данной
областью, является исследование доктора Peng W.-B. с коллегами [306], в котором к молекуле
глицирретовой кислоты в положение С3 была присоединена 1,3-циклическая пропанилфосфатная группа с арильным заместителем (17). Данная группа является субстратом для
печеночных цитохромов CYP3A4 и CYP2C19, приводящих к ее окислению до свободного
фосфата, который затем дефосфорилируется печеночными микросомальными фосфатазами, что
приводит к высвобождению исходного лекарственного соединения [307]. Описанная
модификация определяла гепато-специфичную доставку глицирретовой кислоты, однако
исследования противоопухолевого действия синтезированного конъюгата (17) не проводилось.
50
1.6 Направленная химическая модификация молекулы ГЛК
Направленная
химическая
модификация
дает
возможность
создания не
только
пролекарственных форм тритерпенов, но также их производных, характеризуемых более
выраженной биологической активностью и эффективностью действия по сравнению с
природными молекулами. В настоящее время накоплено большое количество данных, по
химической модификации тритерпеновых соединений (см. обзоры [287, 308-310]). Данная глава
посвящена химической трансформации ГЛК, приводящей к усилению ее антипролиферативной
активности в отношении опухолевых клеток, хотя работы в данной области ведутся и по
другим направлениям: усилению противовирусной активности [15, 311, 312], усилению
антибактериальных свойств [313], усилению противовоспалительной активности [143] и
другим.
Необходимо отметить, что вновь синтезируемые производные ГЛК тестируются на
различных опухолевых линиях клеток, что значительно усложняет сравнительный анализ
данных, так как известно, что чувствительность разных клеточных линий к одному и тому же
соединению может отличаться [314]. Поэтому в данной главе основное внимание будет
сконцентрировано исключительно на химических трансформациях, приводящих к усилению
цитотоксичности ГЛК, без каких-либо привязок к гистологическому типу используемых
опухолевых клеток.
На основе опубликованных данных (см. Табл. 2) можно выделить несколько сайтов в
молекуле ГЛК, чувствительных к химическим модификациям – положения С2 и С3 в кольце А,
С11 и С12 в кольце С и положение С30 в кольце Е.
1.6.1 Модификации кольца А
Модификация кольца А ГЛК включала введение различных заместителей в положение С3,
изменение структуры кольца А и присоединение к нему дополнительных колец и введение в
кольцо А акцептора Михаэля.
1.6.1.1 Модификация по положению С3
Изначально в молекуле ГЛК (1) к атому углерода С3 присоединена гидроксильная группа,
находящаяся в β-положении. Было показано, что эпимеризация данной группы (2) (замена βположения на α-положение) или ее замена на оксогруппу (3) не приводит к увеличению
цитотоксичности производных [315].
Гидроксильная группа в положении С3 может являться сайтом для введения новых
заместителей через сложноэфирную связь - например, ацетильной группы (4-8), природных (9)
и модифицированных (10, 11) аминокислот. Было определено, что ацетилирование данной
группы не вызывает увеличения цитотоксичности производных (4) [317]. Дальнейшая
51
Таблица 2. Производные ГЛК, полученные путем химической модификации.
Красным цветом выделены модификации, вносимые в структуру молекулы ГЛК.
Значение IC50,
мкМ
Ссылка
76,93 – 84,7
[315]
63,2±3,5
[316]
74,57 – 84,7
[317]
>42,5
[318]
81,43
[319]
37 – 92
[320]
19,5; >21
[321]
~120;~150
[322]
~150
[323]
70,48 – 136,4
[324]
12,22
[325]
2
>30
[315]
3
>30
[315]
4
>30
[326]
№
1
Структурная формула
Таблица 2. Продолжение
52
Значение IC50,
мкМ
Ссылка
5
84,39 (K562)
[198]
6
>30
[326]
7
25,65; >30
[326]
8
11,61 – 19,16
[326]
9
2,27 – 7,04
[319]
10
1,27 – 2,33
[327]
№
Структурная формула
Таблица 2. Продолжение
53
Значение IC50,
мкМ
Ссылка
11
2,07 – 5,14
[215]
12
63,0±5,8
[316]
13
36,1±3,7
[316]
14
24,4±0,2
[316]
15
20,6±2,5
[316]
16
12,03 – 19,10
[315]
№
Структурная формула
Таблица 2. Продолжение
54
Значение IC50,
мкМ
Ссылка
17
2,33 – 3,42
[315]
18
4,46 – 6,44
[315]
19
12,71; >30
[315]
20
24,72; >30
[315]
21
-
[329]
22
-
[329]
№
Структурная формула
Таблица 2. Продолжение
55
Значение IC50,
мкМ
Ссылка
23
>30
[315]
24
13,25 – 33,18
[324]
25
6,32 – 19,78
[324]
26
5,19 – 11,72
[324]
0,7
[142]
0,5
[139]
6 – 48
[320]
№
Структурная формула
27
28
Таблица 2. Продолжение
56
Значение IC50,
мкМ
Ссылка
29
4,54
[323]
30
-
[328]
31
62,78 – 90,5
[317]
32
43,16 – 57.01
[317]
33
23,58 – 34,81
[317]
34
19,42 – 27,54
[315]
№
Структурная формула
Таблица 2. Продолжение
57
Значение IC50,
мкМ
Ссылка
35
22,74 – 28,14
[315]
36
6,15 – 22,69
[315]
37
6,18 – 18,93
[315]
38
1,88 – 23,09
[327]
39
13,76±5,3
[325]
№
Структурная формула
~170 (B16)
[322]
40
~150 (BEL 7402)
Таблица 2. Продолжение
58
Значение IC50,
мкМ
Ссылка
41
4 – 12
[320]
42
0,045 – 0,103
[318]
43
0,6 – 3,1
[321]
№
Структурная формула
Примечание: 1 – ГЛК; 2- (3α)-3-гидрокси-11-оксоолеан-12-ен-30-овая кислота; 3 - 3-оксо-11оксоолеан-12-ен-30-овая кислота; 4 – 3-ацетил-ГЛК; 5 - 3-ацетил-2-ен-ГЛК; 6 - (3β) 3ацетилокси-11-оксо-олеан-12-ен-30-нитрил; 7 - (3β) 3-ацетилокси-11-оксо-олеан-12-ен-30-амид;
8 - (3β) 3-ацетилокси-11-оксо-олеан-12-ен-30-амин; 9 - метил 3β-(глицил)-11-оксо-олеан-12-ен30-оат, метил 3β-(L-аланил)-11-оксо-олеан-12-ен-30-оат, метил 3β-(β-аланил)-11-оксо-олеан-12ен-30-оат; 10 - метил 3β 3-(О-бензил-L-глутамил)-11-оксо-олеан-12-ен-30-оат; 11 - бензил 3β-3([N-(3-аминопропил)глицил]окси)-11-оксо-олеан-12-ен-30-оат; 12 - 3-гидроксимино-11-оксоолеан-12-ен-29-овая кислота; 13 - 3-(метоксимино)-11-оксо-олеан-12-ен-29-овая кислота; 14 - 3(этоксимино)-11-оксо-олеан-12-ен-29-овая кислота; 15 - 3-(n-пропоксимино)-11-оксо-олеан-12ен-29-овая кислота; 16 - метил 3-[6-{(2L)-2-[трет-бутоксикарбониламино]пропаноил}оксиимино]-11-оксо-олеан-12-ен-30-оат; 17 - метил (3α)-3-амино-11-оксо-олеан-12-ен-30-оат; 18
метил
(3β)-3-(L-аланиламино)-11-оксо-олеан-12-ен-30-оат;
19
этил
(7αR,7βS,9αS,12S,13αR,15bS)-5,5,7α,7β,9α,12,15β-гептаметил-3,15-диоксо9α,10,11,12,13,13α,15,15α,15β-икозагидрохризено[2,1-с]оксепин-12-карбоксилат;
20
3[(1S,4αR,4βS,6αS,9S,10αR)-9-(этоксикарбонил)-2-(1-гидрокси-1-метилэтил)-1,4α,4β,6α,9пентаметил-12-оксо-1,2,3,4,4α,4β,5,6,6α,7,8,9,10,10α,12,12α-гексадекагидрохризен-1-ил]
hexadecahydrochrysen-1-yl]пропионовая кислота; 21 - 3,4-лактон 30-метилового эфира 4гидрокси-3,4-секо—11-оксо-18β-олеан-12-ен-3,30-диовой кислоты; 22 - 3,4-секопроизводное
ГЛК; 23 - этил (2α,3α)-2,3-эпокси-11-оксо-олеан-12-ен-31-оат; 24 - пиразольное производное
ГЛК; 25 - пиразольное производное бензилового эфира ГЛК; 26 - пиперидиновое производное
мэГЛК; 27 - CDODA-Me; 28 - метиловый эфир 1,2 дегидро-2-йодо-3-оксо-ГЛК; 29 - 3-оксо-29норолеана-1,9(11),12-триен-20-дикарбонитрил; 30 - 18β-олеан-12-ен-3β,11α,30-триол; 31 - 3β-
59
гидрокси-олеан-12-ен-30-овая кислота; 32 - этил 3β,11β-дигидрокси-олеан-12-ен-30-оат; 33 метил 3β-гидрокси-олеан-9(11),12-диен-30-оат; 34 - метил (3β)-3-гидрокси-11-оксо-олеан-12-ен30-оат (мэГЛК); 35 - этил (3β)-3-гидрокси-11-оксо-олеан-12-ен-30-оат (этиловый эфир ГЛК); 36
- бензил (3β)-3-гидрокси-11-оксо-олеан-12-ен-30-оат (бензиловый эфир ГЛК); 37 - метил 3(изопропоксиимино)-11-оксо-олеан-12-ен-30-оат; 38 - (2Е) 4-бромобут-2-ен-1-ил (3β) 3гидрокси-11-оксо-олеан-12-ен-30-оат; 39 - [1-(2,3,4-три-O-ацетил-α-L-рамнопиранозил)-1H1,2,3-триазол-4-ил]-метил 3-O-[1-(2,3,4-три-O-ацетил-α-L-рамнопиранозил)-1H-1,2,3-триазол-4ил]-метил-18β-глицирретинат; 40 - конъюгат ГЛК с биотином; 41 - N-(2-{3-[3,5ди(трифторметил)-фенилl]уреидо}этил)-глицирретинамид; 42 - конъюгат ГЛК с паклитакселом;
43 - конъюгат ГЛК с дегидроцингероном.
модификация 3-О-ацетата ГЛК (4) путем введения двойной связи в кольцо А (5) [198] или
заменой С30 карбоксильной группы на циано- (6) или амидную (7) группу [317] также не
приводило к усилению цитотоксичности. Наибольшей активностью среди ацетатных
производных ГЛК обладало соединение (8), содержащее в положении С30 аминогруппу –
цитотоксичность данного производного оказалась выше цитотоксичности ГЛК в 5,6 раз [326].
Успешным примером использования С3 гидроксильной группы в качестве сайта для
введения модификаций является присоединение к метиловому эфиру ГЛК (далее мэГЛК)
аминокислот глицина, L- и β-аланина (9). Показано, что данная модификация приводит к
значительному в 32,6, 22,6 и 33 раза, соответственно, увеличению цитотоксичности
производных (9) по сравнению с исходным мэГЛК [319]. Введение модифицированных
аминокислот в указанное положение вызывает также усиление антипролиферативного действия
– присоединение О-бензил глутаминовой кислоты (10) и N-аминопропилглицина (11) к С3
гидроксигруппе метилового и бензилового эфиров ГЛК, соответственно, приводило к усилению
цитотоксичности производных в 14 [327] и 3,5 [315] раза по сравнению с соответствующими
эфирами.
Химические модификации, вводимые в положение С3 молекулы ГЛК, включают не
только присоединение различных заместителей к С3 гидроксогруппе, но также ее замену на
оксимную группу (12-16) и аминогруппу (17, 18). Было показано, что введение оксимной
группы в положение С3 ГЛК не приводит к усилению антипролиферативной активности
производного
(12),
однако
ее
дальнейшее
алкилирование
способствует
увеличению
цитотоксичности, причем данный эффект оказался напрямую зависимым от длины вводимой
алкильной цепи – присоединение метильной (13), этильной (14) и пропильной (15) группировок
к оксиму ГЛК (12) приводило к снижению значения IC50 в 1,8, 2,6 и 3,1 раз, соответственно, по
сравнению со значением IC50 исходного тритерпена [316].
Оксимная группировка может являться сайтом для присоединения других различных
заместителей. Например, синтезирован конъюгат оксима мэГЛК с аланином, защищенным со
стороны аминогруппы трет-бутилоксикарбонильным заместителем (16). Цитотоксичность
60
данного производного оказалась в 5,4 раза выше цитотоксичности ГЛК, однако, по сравнению с
исходным тритерпеном (оксимом мэГЛК) уровень его активности не изменился [315].
Замена С3 гидроксильной группы на аминогруппу может приводить к значительному
усилению антипролиферативного действия производного, как это было отмечено для мэГЛК.
Уровень цитотоксичности синтезированного амина (17) оказался в 9,3 раза выше
цитотоксичности исходного эфира [315]. Введение второго заместителя в аминогруппу снижает
активность производного – цитотоксичность вторичного амина мэГЛК (18), где роль второго
заместителя играет L-аланин, оказалась в 2 раза меньше цитотоксичности первичного амина
(17) [315].
Таким образом, модификация молекулы ГЛК и ее эфиров по положению С3 в кольце А
может способствовать значительному увеличению цитотоксичности производных (например, 9,
10, 11, 17, 18). Гидроксильная и оксимная группы в положении С3 могут рассматриваться в
качестве сайта для введения новых заместителей, например, алкильных цепей или природных
или модифицированных аминокислот.
1.6.1.2 Изменение структуры кольца А
В работе д-ра Csuk R. с коллегами [315] было показано, что усиление цитотоксичности
химических производных ГЛК наблюдается лишь в тех случаях, когда сохранено интактное
кольцо А. Образование вместо него семичленного лактонового кольца (19) или раскрытие
кольца
А
с
образованием
3,4-секо
производного
(20)
не
вызывало
усиления
антипролиферативного действия. Однако было показано, что подобные производные обладают
высоким уровнем антиоксидантной активности – лактоновое производное ГЛК (21)
значительно ингибировало активность ксантиноксидазы, являющейся одним из важных
источников
АФК,
а
3,4-секопроизводное
ГЛК
(22)
эффективно
подавляло
синтез
супероксидных радикалов на модели нейтрофилов крысы, активированных реагентом fMLB/CB
[329].
1.6.1.3 Введение дополнительных колец
Модификация кольца А включала также присоединение к нему дополнительных
эпоксидного (23) и пиразолового (24, 25, 26) колец. Было показано, что введение эпоксидного
кольца в структуру этилового эфира ГЛК (23) не влияет на его цитотоксичность [315], в то
время как присоединение пиразолового кольца к кольцу А ГЛК в комплексе с метилированием
С30 карбоксильной группы (24) приводит к 3,5 кратному увеличению его активности по
сравнению с исходной ГЛК [324]. Дальнейшее повышение гидрофобности молекулы путем
замены метильной группы в положении С30 на бензильную (25) привело к практически
двукратному увеличению цитотоксичности производного [324].
61
NH-группа пиразолового кольца может использоваться в качестве сайта для введения
дополнительных заместителей. Так, был синтезирован ряд пиперидиновых производных ГЛК, в
которых пиперидин присоединялся к пиразоловому кольцу с помощью линкеров различной
длины, среди которых наибольшей активностью обладало производное (26) – уровень его
цитотоксичности превышал данный показатель исходного производного (24) в 3,2 раза и ГЛК в
11 раз [324].
1.6.1.4 Введение в кольцо А акцептора Михаэля
Как уже было отмечено в разделе 1.2, наиболее удачным в настоящее время примером
создания химических производных природных тритерпеноидов являются производные ОК -–
CDDO и его эфирные аналоги CDDO-Me (бардоксолон метил) и CDDO-Im (Рис. 11А) (см обзор
[2]). Показано, что данные соединения в крайне низких концентрациях (от нМ до десятых долей
мкМ) цитотоксичны в отношении широчайшего ряда линий опухолевых клеток и эффективны
на опухолевых моделях in vivo [2]. При этом у данных производных есть ряд других
активностей – например, противоспалительная [330, 331], противоишемическая [322],
нейропротекторная [333] и другие.
Было показано, что высокую активность этих соединений определяет наличие в кольце А
2-циано-1-ен-3-оновой структуры (Рис. 11). В молекуле CDDO и его аналогов две α,βненасыщенные углеродные связи, находящиеся в кольцах А и С, конъюгированы с сильными
электрон-акцепторными циано- (кольцо А) и кето- (кольца А и С) группами, вызывающими
поляризацию двойных связей и снижение электронной плотности в β положении (на атомах С1
и С9), формируя, таким образом, сайты для нуклеофильной атаки (Рис. 11Б). Данные сайты
называют акцепторами Михаэля, они представляют собой мягкие электрофилы, способные
присоединять мягкие нуклеофилы – преимущественно тиолы (например, аминокислоту
цистеин) и в значительно меньшей степени азот- или кислород-содержащие аминокислоты,
такие как лизин или серин [334].
Действительно, в работе [335] было показано, что CDDO образует аддукты с тиолсодержащими глутатионом и дитиотреитолом (Рис. 11В), причем такое присоединение является
обратимым. Нуклеофильное присоединение дитиотреитола в основном происходит по
положению С1 – нуклеофильная атака атома С9 затруднена вследствие больших стерических
препятствий [335]. Предполагается, что данное свойство CDDO и его аналогов определяет их
высокий уровень биологического действия – данные соединения могут взаимодействовать
внутри клетки с SH-группами белков, регулируя тем самым их активность. Например, в работе
[336] было показано, что структурный аналог CDDO TP-225 (Рис. 12), связываясь с остатками
цистеина белка Keap1, приводит к высвобождению транскрипционного фактора Nrf2,
запускающего антиоксидантный ответ в макрофагах мышей in vitro.
62
А
Б
В
Рис. 11. А – структурная формула CDDO, CDDO-Me (бардоксолон метила) и CDDO-Im.
Красным пунктиром отмечена 2-циано-1-ен-3-оновая структура, определяющая высокую
активность данных соединений. Б – схема смещения электронных плотностей в молекуле CDDO;
В – реакция присоединения дитиотреитола к молекуле CDDO.
В работе [139] 2-циано-1-ен-3-оновая структура,
определяющая высокую активность CDDO и его
аналогов, была введена в молекулу мэГЛК. Полученное
производное CDODA-Me (27) обладало значительно
более высокой активностью: его цитотоксичность
увеличилась в 174 [335] и 195 раз [142] в отношении
Рис. 12. Структурная формула ТР-225
клеток
опухолей
прямой
кишки
SW480
и
предстательной железы DU145, соответственно.
Было показано, что цианогруппа, входящая в состав кольца А CDODA-Me, крайне важна
для усиления биоактивности молекулы - ее замена на более слабый электрон-акцепторный
заместитель йод (28) вызвала снижение цитотоксичности производного практически в 75 раз
[320]. Введение второй цианогруппы в кольцо Е в комплексе с диеновой структурой в кольце С
(29) не приводило к дальнейшему усилению биоактивности молекулы [323].
1.6.2 Модификация кольца С
Из данных, представленных в литературе видно, что основной объем химических
модификаций ГЛК приходится на кольцо А. Существует лишь пара работ, в которых
исследуется трансформация кольца С данного тритерпена [317, 328].
63
Было показано, что кето-группа ГЛК, находящаяся в положении С11 кольца С,
взаимодействует с Fe/S центром митохондриального комплекса I, приводя к нарушению работы
дыхательной цепи, увеличению синтеза кислородных радикалов, биоэнергетическому коллапсу
клетки и, как результат, открытию МТП и апопотозу [337]. Замена данной группы на
гидроксигруппу (30) приводила к значительному уменьшению синтеза кислородных радикалов
[328].
Однако, в дальнейших работах взаимосвязь между наличием в молекуле ГЛК С11 кетогруппы и запуском апоптоза была опровергнута [317] – производное (31), у которого
отсутствовал
кислородный
заместитель
в
кольце
С,
обладало
сравнимой
с
ГЛК
цитотоксичностью. Замена кето-группы на гидроксигруппу (32), либо введение в кольцо С
диеновой
группировки
(33)
приводило к
усилению
антипролиферативного действия
производных в 1,6 и 2,6 раз, соответственно, по сравнению с исходным тритерпеном [317].
1.6.3 Модификация кольца Е
Основной мишенью для химической трансформации в кольце Е является С30
карбоксильная группа. Химические заместители присоединяются к ней либо через
сложноэфирную [315, 321, 325, 326], либо через амидную [318, 320, 322] связи. Показано, что
этерификация данной группы приводит к увеличению цитотоксичности производных. Наиболее
распространенным является введение в данное положение метильной (34), этильной (35) или
бензильной (36) групп, увеличивающих гидрофобность молекулы и цитотоксический эффект.
Показано, что цитотоксичность метилового, этилового и бензилового эфиров ГЛК превышает
данный показатель исходного тритерпена в 3,4, 3,1 и 6,3 раза, соответственно [315].
Другим примером усиления цитотоксичности производных, вызванного этерификацией
С30 карбоксильной группы, является метиловый эфир оксима ГЛК (37) – значение его IC50
оказалось в 3,1 раз выше IC50 оксима ГЛК (12) [315, 316].
Введение в положение С30 ненасыщенного 4-бромобут-2-енильного заместителя также
приводило к повышению антипролиферативного действия соединений: производное (38)
оказалось в 7 раз более токсичным, чем исходная ГЛК [326].
С30 карбоксильная группа является сайтом и для присоединения более объемных
заместителей. Так были синтезированы (Табл. 2): гликозилированное триазоловое производное
(39) [325], конъюгаты ГЛК с биотином (40) [322] и 3,5-бис(трифторметил)-фенилдиамидной
группой (41) [320]. Было показано, что антипролиферативная активность (39) и (40) осталась на
прежнем уровне. Введение биотина в состав молекулы ГЛК по положению С30 значительно
усиливало ее стабильность в водном растворе и культуральной среде, а также позволило
исследовать внутриклеточные мишени ГЛК с помощью технологии фагового дисплея [322].
Цитотоксичность производного (41) оказалась в 11,4 раза выше цитотоксичности исходной
64
ГЛК:
с
помощью
молекулярного
докинга
бис(трифторметил)-фенилдиамидный
было
заместитель
показано,
является
что
введенный
селективным
3,5-
ингибитором
протеасомы, что и определяет наблюдаемое увеличение антипролиферативного действия
производного [320].
Путем модификации С30 карбоксильной группы ГЛК возможно создание так называемых
колекарств – конъюгатов ГЛК с фармакологически активными соединениями. Например, были
синтезированы
конъюгаты
ГЛК
с
широко
используемым
в
клинике
цитостатиком
паклитакселом (42) [318] и известным природным фенольным соединением дегидроцингероном
(43) [321] обладающим противовоспалительной, антиоксидантной и противоопухолевой
активностями [338]. В случае производного (42) было показано, что основной вклад в его
цитотоксичность вносит не тритерпен, а паклитаксел – присоединение к данному цитостатику
молекулы ГЛК не вызывает, как предполагалось, усиления антипролиферативной активности, а,
наоборот, снижает данный показатель в 37 раз [318]. В случае конъюгата (43) было показано,
что ГЛК и дегидроцингерон обладают синергическим действием – цитотоксичность данного
производного (43) превышала цитотоксичность как исходной ГЛК, так и свободного
дигидроцингерона в 11,5 и более чем в 30,6 раз, соответственно [321].
Таким образом, с помощью химических трансформаций возможно значительное
увеличение цитотоксичности ГЛК. Основываясь на приведенных выше данных, можно
выделить
основные
заместители
и
структуры
в
молекуле
ГЛК,
влияющие
на
антипролиферативную активность молекулы:
1.
Для проявления цитотоксичности производных ГЛК необходимо интактное
кольцо А;
2.
К значительному усилению цитотоксичности приводят:
А) этерификация С30 карбоксильной группы;
Б) введение в положение С3 природных и модифицированных аминокислот и
аминогруппы;
В) присоединение к кольцу А дополнительного пиразольного кольца и его
дальнейшая модификация;
Г) введении в кольцо А 2-циано-1-ен-3-оновой структуры.
3.
Положения С3 в кольце А и С30 в кольце Е можно рассматривать в качестве
сайтов для направленной химической модификации. Возможно создание конъюгатов
ГЛК с фармакологически активными соединениями, либо присоединение по данным
положениям
различных
заместителей
с
интересуемыми
характеристиками
65
(заместители,
способствующие
направленность действия и др.).
усилению
растворимости
или
определяющие
66
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Материалы и методы
2.1.1 Реактивы и препараты
В работе использовали трипсин («ICN Biomedical Inc.», Германия), TPCK-Трипсин
(«Sigma-Aldrich», США), ФСБ («ICN Biomedical Inc.», Германия), среды DMEM («Sigma –
Aldrich Inc.», США), RPMI-1640 («Sigma – Aldrich Inc.», США), IMDM («Sigma – Aldrich Inc.»,
США) и Opti-MEM («Gibco», США), эмбриональную телячью сыворотку («Биолот», Россия),
пенициллин, стрептомицин, амфотерицин В («MP Biomedicals», США), МТТ («Sigma-Aldrich
Inc.», США), генцианвиолет, Hoechst 33258 («Sigma-Aldrich Inc.», США), DAPI/Antifade
Solution («Chemicon Int.», США), йодистый пропидий PI («Invitrogen», США), краситель JC-1
(«Invitrogen», США), формальдегид («Sigma-Aldrich Inc.», США), Тритон Х100 («West
Germany», Germany), FITC Apoptosis Detection Kit («Chemicon Int.», США), CaspACETM FITCVAD-FMK In Situ Marker («Promega Inc.», США), Griess Reagent System («Promega», США),
NA-FlourTM Influenza Neuraminidase Assay Kit («Applied Biosystems», США), набор реагентов
для иммуноферментного определения концентрации интерлейкина-6 в сыворотке крови (ЗАО
«Вектор-Бест», Россия), гистамина дигидрохлорид («Sigma-Aldrich Inc.», США), индометацин
(«Sigma-Aldrich Inc.», США), римантадин («Sigma-Aldrich Inc.», США), рибавирин («SigmaAldrich Inc.», США), ДМСО («Лаверна», РФ), параформальдегид («Pancreac Quimica SA»,
Испания), Tween-80 («Sigma-Aldrich Inc.», США), Cremophor-EL («Sigma-Aldrich Inc.», США),
DAE-Dextran («Sigma-Aldrich Inc.», США), HEPES Buffer («Sigma-Aldrich Inc.», США), ЭДТА
(«Sigma», США), TRIzol Reagent (Ambion, США), РНКазу А 20 мг/мл («Sigma-Aldrich Inc.»,
США),
фосфатидилхолин,
выделенный
фосфатидилинозитол, выделенный
из
S.
из
яичного
желтка
cerevisiae («Реахим»,
(«Реахим»,
Россия),
Россия), димиристоил
фосфатидилхолин («Sigma-Aldrich Inc.», США), диметилформамид («Sigma-Aldrich Inc.»,
США), холестерин, ацетон, хлороформ, этиловый спирт, перекись водорода, 2,2,2трибромэтанол («Sigma-Aldrich Inc.», США), 2-метил-2-бутанол («Sigma-Aldrich Inc.», США),
натрия хлорид, натрия ацетат, натрия цитрат.
В работе использовали мышиные антитела, специфичные к белкам вируса гриппа А
нуклеопротеину (NP) («Millipore», США), конъюгат биотинилированных антител против
мышиных моноклональных антител IgG («Sigma-Aldrich Inc.», США), стрептавидинпероксидазный комплекс («Sigma-Aldrich Inc.», США), 3-амино-9-этилкарбазол (AEC, «Acros
Organics», США)
67
Производные
глицирретовой
и
дезоксихолевой
кислот
были
синтезированы
в
Лаборатории фармакологически активных веществ НИОХ СО РАН под руководством д.х.н.,
проф. Салахутдинова Н. Ф.
2.1.2 Обрудование
В работе использовали установку для отчистки воды MilliQ («Millipore», США),
многоканальный
спектрофотометр
Multiscan
RC
(«Thermo
LabSystems»,
Финляндия),
проточный цитофлуориметр Beckman Coulter Cytomics FC 500 («Beckman Coulter», США),
центрифуги «Eppendorf 5810 R» («Eppendorf», Германия) и «Eppendorf minispin plus»
(«Eppendorf», Германия), шейкер Heidolph REAX top («Heidolph», Германия), инвертированный
микроскоп БИОЛАМ П2-1 («ЛОМО», Россия), инвертированный микроскоп Primo Vert
(«Zeiss», Германия), флуоресцентный микроскоп «Axiostar Plus» («Zeiss», Германия),
оснащенный
CCD-камерой
(«Zeiss»,
Германия),
вакуумный
концентратор
Eppendorf
Concentrator 5301 («Eppendorf», Германия), ультразвуковая баня Ultrasonic cleaner («ColeParmer», США), спектрофотометр СФ-256УВИ («ЛОМО Фотоника», Россия), роторный
вакуумный испаритель («Heidolph», Германия), гомогенизатор T10 basic ULTRA-TURRAX
(«IKA», Германия), гематологический анализатор MicroCC-20Plus(V) («High Technology, Inc.»,
США), клеточный анализатор в режиме реального времени xCelligence RTCA DP («ACEA
Bioscience Inc.», США), боксы микробиологической безопасности EN12469 («Clean Air»,
Голландия) и GELAIRE LAMINAR AIR FLOW CLASS 100 («Gelaire», Италия), CO2-инкубатор
(«Sanyo», Япония), мини-экструдер («Avanti Polar Lipids», США)
В работе использовали культуральную пластиковую посуду («Costar», США; «TPP»,
Швейцария), пластиковые планшеты для иммунологических реакций («Медполимер», Россия).
Для обработки полученных результатов использовали GeneXplain («GeneXplain»,
Германия), RTCA Software 2.0, СХР Analyze.
2.1.3 Клеточные линии
В экспериментах были использованы опухолевые клеточные линии человека эпидермоидной
карциномы
КВ-3-1,
эпидермоидной
карциномы
шейки
матки
HeLa,
нейробластомы SK-N-MC, аденокарциномы молочной железы MCF-7, гепатоцеллюлярной
карциномы HepG2, аденокарциномы прямой кишки HuTu-80, аденокарциномы легких A549
полученные из коллекции Института Цитологии РАН (Санкт-Петербург), эпидермоидной
карциномы KB-8-5, любезно предоставленной профессором M. Gottesman (Национальный
Институт Здоровья, США). Также использовались клеточные линии млекопитающих –
гепатомы мыши MH-22a, почки собаки MDCK, MDCK-L9 и макрофагальная мышиная
клеточная линия J-774 (Институт Цитологии РАН (Санкт-Петербург)).
68
2.1.4 Лабораторные животные, опухолевые модели и вирусы
В работе использовали 2-3 месячных мышей линий A/Sn, DD, беспородных мышей ICR
развода вивария ИЦиГ СО РАН, CBA развода НЦКЭМ СО РАМН и 6-8 недельных мышей
линии Balb-C развода питомника ГНЦ ВБ «Вектор». Животных содержали по 5-10 особей в
клетке в хорошо освещенном помещении. Мыши имели свободный доступ к пище и воде.
Для экспериментов использовали модель перевиваемых опухолей карциномы Кребс-2 и
гепатоцеллюлярной карциномы HA-1. Штаммы вышеприведенных опухолей поддерживаются в
виварии ИЦиГ СО РАН путем регулярного пассирования на мышах.
Вирус гриппа, лабораторный штамм А/WSN/33 (H1N1), был любезно предоставлен д.б.н.,
проф. Н. В. Кавериным (Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, Москва).
Наработка вируса гриппа на куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK, определение титров
в наработанной вирусной суспензии проводилась инженером Ивановой Г.А. (ИХБФМ СО
РАН).
2.1.5 Производные глицирретовой и дезоксихолевой кислот
Производные глицирретовой и дезоксихолевой кислот были получены в виде
кристаллических порошков. В качестве растворителя использовали раствор ДМСО, так как
данный апротонный растворитель в концентрации до 1% не приводит к гибели клеток.
Вещества растворяли до концентрации 10-2 М и хранили при температуре -20°С.
2.1.6 Растворы и буферы, использованные в работе
Фосфатно-солевой
(ФСБ)
Буфер А
буфер
1.47 мМ KH2PO4, 4.29 мМ Na2HPO4.7H2O, 137
мМ NaCl
Фосфатно-солевой буфер с 0,1% Triton X100,
РНКазой А 100 мкг/мл, йодистым пропидием (PI) 40
мкг/мл
Буфер Б
Фосфатно-солевой
буфер
с
0.25%
лимоннокислым натрием
Для приготовления буфера и реакционных проб использовали воду, очищенную на
установке MilliQ («Millipore», США). Буферы подвергали стерилизации автоклавированием.
69
2.2 Методы
2.2.1 Ведение культур клеток
Клетки культивировали в среде DMEM, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью
сыворотку, антибиотики (100 ед/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина) и антимикотик
амфотерицин (0,25 мкг/мл), в атмосфере 5%-ного СО2 при 37°С в объеме среды 5 мл в
пластиковых культуральных флаконах или пластиковых чашках Петри с площадью дна 25 см2.
Культуры пересевали через каждые два – три дня, поддерживая численность клеток не менее 1
млн. клеток.
Для получения суспензии клеток среду во флаконе или чашке Петри отбирали и дважды
промывали клетки 1 мл ФСБ. Затем во флакон или чашку Петри добавляли 150 мкл трипсина и
инкубировали при 37°С в течение 2 минут, наблюдая степень открепления клеток под
микроскопом. После открепления клеток, добавляли 1 – 1,5 мл среды DMEM, содержащей
сыворотку, антибиотики и антимикотик.
Концентрацию клеток в полученной суспензии рассчитывали, используя камеру Горяева.
Часть клеточной суспензии отбирали для посадки клеток на культуральные планшеты. Объем,
необходимый для поддержания роста культуры (106 клеток), оставляли во флаконе, либо чашке
Петри, добавляли к нему 4 мл среды DMEM, содержащей сыворотку, антибиотики и
антимикотик, и возвращали клетки в СО2-инкубатор.
2.2.2 Подсчет количества живых клеток при помощи окраски трипановым синим
Суспензию клеток добавляли к 100 мкл среды DMEM, содержащей 10%-ную сыворотку и
раствор антибиотиков и антимикотика, добавляли равный объем 0,5% раствора трипанового
синего, перемешивали с помощью пипетки и подсчитывали количество живых клеток по
формуле:
Nживых клеток = Nвсех клеток – Nокрашенных клеток, соответствующих мертвым клеткам
2.2.3 Определение жизнеспособности клеток под действием производных (МТТ тест)
Влияние производных глицирретовой кислоты на жизнеспособность клеток определяли с
помощью МТТ теста. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты в концентрации
5×103 кл/лун (HeLa, HepG2, HuTu-80), 7×103 кл/лун (KB-3-1, KB-8-5, MCF-7), 8×103 кл/лун
(MH22a), 11×103 кл/лун (MDCK, MDCK L9), 104 кл/лун (A549), 3×104 кл/лун (SK-N-MC), 105
кл/лун (J-774) в среде DMEM, содержащей 10% сыворотку и антибиотики/антимикотик. Через
24 ч в лунках меняли среду на среду DMEM без сыворотки и добавляли раствор исследуемого
соединения в ДМСО (10-2 М) до конечной концентрации от 10-9 до 10-5 М (опыт) или ДМСО до
концентрации 0,1% (контроль). Клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 5% CO2 в течение
исследуемого времени. По окончании инкубации, к клеткам без смены среды добавляли
70
раствор соли тетразола (МТТ) в ФСБ до концентрации 0,5 мг/мл и инкубировали еще в течение
3 ч в тех же условиях. Среду удаляли, к клеткам добавляли по 100 мкл ДМСО, в котором
происходит растворение образовавшихся в живых клетках кристаллов формазана, и измеряли
оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре на длинах волн 570 нм и 630 нм,
где А570 – поглощение формазана, а А630 – фон клеток. Далее вычисляли процент живых клеток
в опыте по формуле: (A570опыт – А620опыт)/(А570контроль – А620контроль)×100%. На основе полученных
данных строили кривые зависимости относительного количества живых клеток в опыте от
концентрации исследуемого соединения, на основе которых методом интерполяции данных
вычисляли значение IC50 - концентрацию соединения, приводящее к гибели 50% клеток в опыте
по сравнению с интактным контролем.
2.2.4 Исследование апоптоза клеток с помощью ApopNexinTM FITC Apoptosis
Detection Kit
Клетки КВ-3-1 высаживали в 6-луночный планшет в концентрации 3×105 кл/лун в среде
DMEM с сывороткой. Через 24 часа среду меняли на среду без сыворотки и добавляли раствор
солоксолон метила в ДМСО до концентрации 1 и 0,3 мкМ в течение 4, 18 и 24 ч. По окончании
инкубации среду переносили в пробирки и центрифугировали при 400 g в течение 10 минут.
Клетки в лунках промывали 1 мл ФСБ, механически открепляли от дна планшета скребком в 1
мл ФСБ, добавляли к полученному при центрифугировании клеточному осадку и снова
центрифугировали при 400 g 10 минут. Осадок промывали 1 мл ФСБ, повторяли
центрифугирование при 400 g 10 минут.
Процедуру окрашивания клеток с использованием ApopNexinTM FITC Apoptosis Detection
Kit проводили согласно протоколу производителя: после удаления супернатанта осадок
суспендировали в 1Х Binding Buffer до концентрации 106 кл/мл. Добавляли раствор FITC – из
расчета 1,5 мкл на 105 клеток и 100Х PI до 1Х раствора. Инкубировали 15 минут в темноте при
комнатной температуре. После инкубации пробирки переносили на лед и измеряли
флуоресценцию на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter Cytomics FC 500. Для
каждого образца набирали по 10000 событий.
2.2.5 Оценка мембранного потенциала митохондрий
С помощью проточной цитофлуориметрии
Клетки КВ-3-1 высаживали в среде DMEM с сывороткой на 24-луночный планшет в
концентрации 105 кл/лун и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% CO2 в течение 24 ч. Далее
производили замену культуральной среды в лунках на среду без сыворотки, содержащую
солоксолон метил в концентрации 1 мкМ (опыт) или 0,1% ДМСО в отсутствие исследуемого
соединения. Клетки инкубировали в течение 6 ч, после чего механически открепляли от дна
71
планшета скребком, инкубировали в среде DMEM с сывороткой в темноте при 37°С в
присутствии катионного красителя JC-1 в концентрации 5 мкг/мл в течение 15 мин, после чего
клетки дважды промывали охлажденным ФСБ, ресуспендировали в ФСБ в объеме 400 мкл и
измеряли флуоресценцию на канале FL2 проточного цитофлуориметра Beckman Coulter
Cytomics FC 500. Для каждого образца набирали по 10000 событий.
С помощью флуоресцентной микроскопии
Клетки КВ-3-1 высаживали на покровные стекла в 24-луночный планшет в среде DMEM с
сывороткой в концентрации 105 кл/лун и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% CO2 в течение
24 ч, позволяя клеткам прикрепиться к стеклам. Далее клетки инкубировали в присутствии
солоксолон метила в концентрации 1 мкМ (опыт) или 0,1% ДМСО и в отсутствие исследуемого
соединения (контроль) в течение 6 ч. После инкубации удаляли среду из лунок и добавляли
реагент JC-1 (5 мкл), растворенный в ФСБ. Клетки инкубировали при 37°С в 5% CO2 в течение
15 мин, после чего анализировали на флуоресцентном микроскопе.
2.2.6 Исследование клеточного цикла
Клетки КВ-3-1 высаживали в среде DMEM с сывороткой в 6-луночный планшет в
количестве 5×105 клеток на лунку. Через 24 часа в лунках меняли среду на среду без сыворотки,
добавляли раствор солоксолон метила до конечной концентрации 0,3 мкМ и инкубировали в
течение 18 ч. По окончании инкубации среду переносили в пробирки и центрифугировали при
400 g в течение 10 минут. Клетки в лунках промывали 1 мл ФСБ, механически открепляли от
дна планшета скребком в 1 мл ФСБ, добавляли к полученному осадку и центрифугировали при
400 g 10 минут. Осадок промывали 1 мл ФСБ, повторяли центрифугирование при 400 g 10
минут. Осадок фиксировали в пятикратном объеме 70% этилового спирта 30 минут. После
фиксации клетки осаждали центрифугированием при 400 g 8 минут, промывали клетки 1 мл
ФСБ. Добавляли по 600 мкл буфера А, содержащего 0,1% Triton X100, РНКазу А в
концентрации 100 мкг/мл и раствор PI в концентрации 40 мкг/мл. Пробирки инкубировали при
37°С 15 минут в темноте. После инкубации исследовали полученные образцы на проточном
цитофлуориметре Beckman Coulter Cytomics FC 500.
2.2.7 Анализ морфологии ядер с помощью флуоресцентной микроскопии
Для формирования 80% монослоя клетки КВ-3-1 высаживали в среде DMEM с
сывороткой в 24-луночный планшет на покровные стекла (0,3×10 5 клеток в 500 мл среды
DMEM на лунку) и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% CO2. Через 24 ч меняли среду и
добавляли солоксолон метил до концентрации 1 мкМ. Клетки инкубировали в присутствии
соединения в течение 6, 18 и 24 ч. После окончания инкубации клетки промывали 0,5 мл ФСБ и
затем фиксировали в 0,5 мл 4%-ного раствора формальдегида в ФСБ в течение 10 минут, после
72
чего клетки промывали 0,5 мл ФСБ. Для визуализации ядер клетки окрашивали раствором
Hoechst 33258 в ФСБ (200 нг/мл) в течение 20 мин в темноте, промывали 0,5 мл ФСБ и
переносили покровные стекла из планшета на предметные стекла в каплю ФСБ : глицерин,
взятых в соотношении 1:1 (об.). Препараты анализировали с помощью флуоресцентного
микроскопа при увеличении ×200.
2.2.8 Исследование активации каспазного каскада с помощью CaspACETM FITCVAD-FMK In Situ Marker
С помощью проточной цитофлуориметрии
Клетки КВ-3-1 высаживали в 24-луночный планшет в концентрации 0,7×105 клеток на
лунку в среде DMEM с сывороткой и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% CO2. Через 24
часа среду меняли и добавляли солоксолон метил до концентрации 0,3 и 1 мкМ. Клетки
инкубировали в присутствии соединения 18 часов. По окончании инкубации клетки открепляли
от дна планшета с помощью пипетирования, дважды промывали 0,5 мл ФСБ, суспендировали в
ФСБ в объеме 0,5 мл, после чего добавляли CaspACETM FITC-VAD-FMK In Situ Marker до
конечной концентрации 10 мкМ, клетки осторожно перемешивали пипеткой и инкубировали в
темноте при комнатной температуре в течение 20 минут. После окончания инкубации клетки
дважды промывали ФСБ, центрифугировали, клеточный осадок ресуспендировали в ФСБ в
объеме 0,5 мл, после чего исследовали полученные образцы на проточном цитофлуориметре
Beckman Coulter Cytomics FC 500. Для каждого образца набирали по 10000 событий.
С помощью флуоресцентной микроскопии
Клетки КВ-3-1 высаживали в 24-луночный планшет на покровные стекла в количестве
0,7×105 клеток на лунку в среде DMEM с сывороткой и инкубировали при 37°С в атмосфере 5%
CO2. Через 24 часа среду меняли и добавляли солоксолон метил до концентрации 0,5 мкМ.
Клетки инкубировали в присутствии соединения при 37°С в атмосфере 5% CO2 в течение 18
часов. По окончании инкубации клетки дважды промывали 0,5 мл ФСБ, добавляли CaspACE TM
FITC-VAD-FMK In Situ Marker до конечной концентрации 10 мкМ и инкубировали в темноте
при комнатной температуре в течение 20 минут. Далее клетки промывали 0,5 мл ФСБ и
фиксировали 4% раствором формалина в ФСБ в течение 30 минут, после чего клетки
однократно промывали 0,5 мл ФСБ и переносили покровные стекла из планшета на предметные
стекла в каплю DAPI/Antifade Solution (3-4 мкл), использующегося для визуализации ядер.
Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа при увеличении ×200.
2.2.9 Полнотранскриптомный анализ экспрессии генов на микрочипах
Для полнотранскриптомного анализа экспрессии генов клетки KB-3-1 высаживали на 6
луночные планшеты в концентрации 3,5×105 кл/лун в среде DMEM с сывороткой и
73
инкубировали при 37°С в атмосфере 5% CO2 в течение 24 ч. По окончании инкубации
надклеточную среду меняли на свежую, содержащую солоксолон метил в концентрации 1 мкМ.
В качестве контроля использовали лунки, инкубированные в отсутствие солоксолон метила, но
в присутствии 0,1% ДМСО. Клетки инкубировали в течение 1, 2, 3, 4, 6 или 10 ч. По окончании
инкубации клетки промывали 1 мл ФСБ, лизировали путем добавления в каждую лунку 500 мкл
Trizol Reagent («Ambion», США) и переносили полученную суспензию в пробирки. Пробы
замораживали при -70°С и отправляли в ЗАО «Геноаналитика» (Москва) для анализа на
микрочипах HumanHT-12 v4 BeadChip («Illumina», США). Анализ данных микрочипирования
проводили с помощью биоинформатической платформы GeneXplain («GeneXplain», Германия).
Массивы данных нормализовали с помощью стандартных протоколов, после чего с помощью
гипергеометрического анализа определяли относительные изменения уровней экспрессии генов
в опыте по сравнению с контролем при (p≤0,001). На основе полученных данных выявляли
дифференциально экспрессирующиеся гены – гены, достоверно изменившие уровень
экспрессии в 2 или более раза (p<0.001) по сравнению с контролем, которые затем были
проаннотированы в базе данных Gene Ontology (Gene Ontology Database) по словарю
«Биологические процессы», и подвергнуты функциональному анализу в базе данных GeneCards
и по литературным данным.
2.2.10 Приготовление липосом, нагруженных солоксолон метилом
Яичный
фосфатидилхолин
(яФХ),
фосфатидилинозитол
(ФИ),
димиристоил
фосфатидилхолин (ДМФХ), холестерин (Хол) и солоксолон метил (СМ) растворяли в
хлороформе в концентрациях 40, 10, 40, 5 мг/мл и 10 мМ, соответственно, и хранили при 4°С в
качестве стоковых растворов.
Липидная пленка была получена путем соупаривания аликвот стоковых растворов в смеси
хлороформ-метанол (1:1) в круглодонной колбе на ротационном испарителе с последующей
лиофилизационной сушкой в течение 30 мин при 5 Па. Всего было приготовлено три конечные
композиции, состоящие из смесей: (1) яФХ:ФИ:СМ, взятых в соотношении 8:1:1 (мол.); (2)
яФХ:ФИ:Хол:СМ (7:1:1:1 (мол.)) и (3) яФХ:ФИ:ДМФХ:СМ (4:1:4:1 (мол.)). Пленку
гидрировали в течение 2 ч при комнатной температуре в 0,5 мл ФСБ. После встряхивания
суспензию подвергали пятикратному циклу «замораживания-оттаивания» (жидкий азот/40°С) и
затем экструдировали 20 раз через поликарбонатные мембранные фильтры («Nucleopore»,
США) с размером пор 100 нм на мини-экструдере («Avanti Polar Lipids», США) для получения
прозрачной липосомальной дисперсии. Концентрацию СМ в липосомных композициях
определяли после растворения липосом в 20-кратном объеме этанола, регистрируя УФ-спектр
на спектрофотометре СФ-256УВИ («ЛОМО Фотоника», Россия) и вычисляли максимум
абсорбции (λmax 242 нм, ε ~21600). Количество СМ, осевшего на фильтрах, оценивали после
74
вымачивания мембран в этаноле и определения концентрации в полученных растворах с
помощью спектрофотометрии. Указанная работа проводилась совместно с к.х.н. Онищенко
(Кузнецовой) Н. Р. (Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова РАН).
2.2.11 Исследование цитотоксичности высокодисперсной композиции солоксолон
метила с ПЭГ
Высокодисперсная композиция солоксолон метила (ВКСМ) с ПЭГ была приготовлена
к.х.н. Огиенко А. Г. (НИОХ СО РАН) и передана нам на испытание. Данная композиция
получена методом лиофилизации из трет-бутанола смеси ПЭГ4000:β-глицин:СМ, взятых в
соотношении
5:1:4
(вес.).
В
качестве
композиции-контроля
была
приготовлена
высокодисперсная композиция, состоящая из ПЭГ4000: β-глицин, взятых в соотношении 8,3:1,7
(вес).
Для определения цитотоксичности ВКСМ клетки КВ-3-1 высаживали в 96-луночные
планшеты в концентрации 7×103 кл/лун в среде DMEM с сывороткой и инкубировали 24 ч при
37°С в 5% CO2. Через 24 ч проводили замену среды в лунках на среду без сыворотки,
содержащую ВКСМ в концентрациях 1-10 мкМ и контрольную композицию в концентрациях 1100 мкМ в пересчете на солоксолон метил. Клетки инкубировали в присутствии
ВКСМ/контрольной композиции в течение 24 ч при 37°С в 5% CO2, после чего определяли
жизнеспособность клеток при помощи МТТ-теста (глава 2.2.3).
2.2.12 Исследование острой токсичность высокодисперсной композиции солоксолон
метила с ПЭГ на мышиной модели in vivo
Для оценки острой токсичности ВКСМ на мышиной модели in vivo мышей линии CBA
распределяли на 8 групп (по 3 мыши в каждой). ВКСМ растворяли в среде Opti-MEM («Gibco»,
США) в концентрации 0.25 мг/мл и вводили мышам в дозе 5 мг/кг. Мыши группы 1 получали
инъекции препарата внутривенно, группы 2 – внутрибрюшинно, группы 3 – подкожно, группы
4 – перорально. Группы 6-8 являлись соответствующими контролями для групп 1-4 и получали
инъекции композиции, содержащей только ПЭГ и глицин (ПЭГ4000: β-глицин в соотношении
8,3:1,7 (вес)). ВКСМ вводили три раза с перерывом в 1 сутки, ежедневно контролируя вес
подопытных животных. На 6 сутки мышей выводили из эксперимента и отбирали пробы крови,
в которых далее оценивали состав форменных элементов крови на гематологическом
анализаторе MicroCC-20Plus(V) («High Technology, Inc.», США).
2.2.13 Приготовление микроэмульсий солоксолон метила с солюбилизаторами Твин80 и Кремофор-EL
Микроэмульсии с Твин-80
75
К раствору солоксолон метила в ДМСО в концентрации 2,5 мг/мл добавляли
солюбилизатор Твин-80 (10% от конечного объема) с последующим удалением ДМСО на
вакуумном концентраторе Eppendorf Concentrator 5301 («Eppendorf», Германия). Далее
полученную пленку, содержащую солоксолон метил с Твин-80, растворяли в ФСБ до конечной
концентрации 2,5 мг/мл в перерасчете на исследуемое соединение, перемешивали 5 мин на
вортексе. Полученную эмульсию подвергали воздействию ультразвука на ультразвуковой бане
Ultrasonic cleaner при комнатной температуре в течение 10 мин, после чего вводили мышам.
Микроэмульсии с Кремофор-EL
Микроэмульсию солоксолон метила на основе Кремофор-EL готовили последовательным
смешиванием раствора солоксолон метила, Кремофор-EL и физиологического раствора, взятых
в объемном соотношении 1:1:8 до конечной концентрации солоксолон метила 2,5 мг/мл.
Полученную эмульсию подвергали воздействию ультразвука на ультразвуковой бане Ultrasonic
cleaner при комнатной температуре в течение 10 мин, после чего вводили мышам.
2.2.14 Исследование влияния солоксолон метила на рост карциномы Кребс-2 ex vivo
Клетки карциномы Кребс-2 выделяли из асцитной жидкости мышей-опухоленосителей.
Для этого асцитную жидкость в объеме ~ 1 мл отбирали с помощью шприца, разводили в 10 раз
в физиологическом растворе, центрифугировали при 300 g в течение 5 минут, после чего
удаляли супернатант, а клеточный осадок суспендировали в 3 мл физиологического раствора и
подсчитывали в полученной клеточной суспензии количество живых клеток с помощью
окраски трипановым синим (глава 2.2.2).
Далее отбирали клеточные суспензии, содержащие по 2×106 живых клеток, в отдельные
пробирки и инкубировали в присутствии солоксолон метила в концентрации 10 мг/мл (опыт)
или в 0,1% растворе ДМСО в физиологическом растворе (контроль) в течение 1 ч при 37°С.
После инкубации клеточные суспензии транспланитровали внутримышечно самкам мышей
линии A/Sn по 0,1 мл клеточной суспензии, содержащей 0,2×106 живых клеток. Когда опухоли
начинали пальпироваться, через каждые 2-3 дня измеряли объем опухолей с помощью
штангенциркуля. На 15 сутки после трансплантации опухоли мышей выводили из эксперимента
и определяли массу опухолевого узла как разницу между массой лапы с опухолью и
противоположной лапы без опухоли.
2.2.15 Исследование противоопухолевой активности in vivo
Карцинома Кребс-2
2-3 месячным мышам линии DD (50 шт) внутрибрюшинно прививали опухоль путем
введения суспензии клеток карциномы Кребс-2 в объеме 200 мкл, содержащую 2×105 клеток.
76
Через 24 часа после перевивки опухоли мышей-опухоленосителей делили на 5 групп – 1 группа
была контрольной и получала внутрибрюшинные инъекции физиологического раствора, 2 и 3
группы мышей получали внутрибрюшинные инъекции 10% растворов Твин-80 и Кремофор-EL,
соответственно, 4 и 5 группам внутрибрюшинно инъецировали солоксолон метил в 10%
растворе Твин-80 и 10% растворе Кремофор-EL соответственно, в дозе 50 мг/кг. Препараты
вводили ежедневно за исключением выходных 9 раз. На 14 сутки после трансплантации
опухоли мышей взвешивали, выводили из эксперимента, вскрывали брюшную полость,
полностью отбирали асцитную жидкость с помощью шприца в отдельные пробирки, снова
взвешивали мышей и определяли среднее содержание клеток в асцитных жидкостях с помощью
подсчета клеток на камере Горяева. Массу асцита определяли по формуле:
mасцита= mмыши до отбора асцитной жидкости – mмыши после отбора асцитной жидкости.
Гепатоцеллюлярная карцинома HA-1
2-3 месячным мышам линии A/Sn (22 шт) внутривенно прививали суспензию клеток
гепатоцеллюлярной карциномы HA-1 в физиологическом растворе в объеме 0,5 мл,
содержащем 5×104 кл. Через 24 часа после трансплантации опухоли мышей-опухоленосителей
делили на 2 группы – 1 группа была контрольной и получала внутривенные инъекции 10%
Твин-80 в физиологическом растворе, 2 группа была опытной и получала внутривенные
инъекции солоксолон метила в 10% растворе Твин-80 в дозе 50 мг/кг. Инъекции проводили
ежедневно в течение 3 суток, после чего определяли среднюю продолжительность жизни
мышей.
2.2.16 Оценка уровня синтеза оксида азота макрофагальными клетками J-774,
активированными липополисахаридом (ЛПС)
Макрофагальные клетки мыши J-774 высаживали в 96-луночные планшеты в
концентрации 105 кл/лун и инкубировали в среде DMEM с сывороткой при 37°С в атмосфере
5% CO2. Через 24 ч меняли среду в лунках на свежую среду, содержащую ЛПС E. coli (серотип
055:В5, «Sigma-Aldrich», США) в концентрации 10 мкг/мл в присутствии или в отсутствие
солоксолон метила (0,01-1 мкМ), бардоксолон метила (0,01-1 мкМ) или референсного препарата
индометацина (1-50 мкМ). Далее клетки инкубировали в тех же условиях в течение 24 ч, после
чего определяли в надклеточной жидкости количество синтезированного NO с помощью
коммерческого набора Griess Reagent System («Promega», США), согласно протоколу
производителя.
Для этого 50 мкл надклеточной среды переносили в новый 96-луночный планшет и
инкубировали с 50 мкл раствора сульфаниламида в течение 10 мин при комнатной температуре,
защищая планшет от света. Далее в лунку добавляли 50 мкл N-1-нафтилэтилендиамин
77
гидрохлорида и инкубировали в тех же условиях в течение 10 мин. После чего определяли
оптическую плотность в лунках на многоканальном спектрофотометре на длине волны 570 нм.
Концентрацию NO определяли с помощью построения калибровочной кривой. Далее строили
график зависимости эффекта соединения от его концентрации и методом интерполяции данных
на данном графике определяли значение EC50NO, представляющее собой концентрацию
соединения, приводящую к снижению синтеза NO на 50% по сравнению с контролем.
2.2.17 Оценка антиэкссудативной активности на модели острого воспаления,
вызванного гистамином
Оценку
антиэкссудативной
активности
проводили
совместно
с
сотрудниками
Лаборатории фармакологических исследований НИОХ СО РАН.
Для индукции отека аутбредным мышам линии ICR (самцы) массой тела 25-28 г под
плантарный апоневроз правой задней лапы вводили по 0,05 мл 0.1% раствора гистамина в
физиологическом растворе (опытная лапа), в левую заднюю лапу вводили столько же
физиологического раствора без гистамина (контрольная лапа). Солоксолон метил вводили
внутрижелудочно через зонд в концентрации 50 мг/кг в 10% растворе Твин-80 за 1 час до
введения гистамина. В качестве референсного препарата использовали индометацин в дозе 20
мг/кг. Через 5 часов после введения гистамина мышей выводили из эксперимента и оценивали
антиэкссудативный эффект соединения по формуле:
% отека = (1 -
(Мпр – Мл)контроль – (Мпр – Мл)опыт
(Мпр – Мл)контроль
)× 100
где Мпр – средная масса опытной лапы, Мл – средняя масса контрольной лапы.
2.2.18 Оценка цитопатического действия вируса гриппа на клетки MDCK-L9 с
помощью технологии xCelligence
Пролиферацию клеток MDCK L9, зараженных вирусом гриппа А в присутствии или в
отсутствие солоксолон метила оценивали в режиме реального времени с помощью технологии
xCelligence на приборе RTCA DP Instrument («ACEA Biosciences», США), как было описано
ранее [339]. Клетки MDCK L9 сажали в 16-луночные E-планшеты («ACEA Biosciences», США)
в концентрации 7×103 кл/лун в среде IMDM с сывороткой. Клетки инкубировали при 37°С в
атмосфере 5% CO2 в течение 30 ч, после чего промывали 2 раза ФСБ, заражали вирусом гриппа
и добавляли солоксолон метил в концентрациях 0,5 и 1 мкМ в среде IMDM без сыворотки.
Затем клеточную пролиферацию оценивали по изменению Клеточного индекса (единица
измерения о.е.), фиксируемого прибором через каждые 10 мин в течение 47 ч.п.и.
78
2.2.19 Определение титра вируса гриппа на клетках по реакции окрашивания
инфекционных фокусов (метод ФОЕ)
Титры вируса гриппа определяли с помощью метода фокус-образующих единиц (ФОЕ) на
клетках MDCK. Исследуемый вирус-содержащий материал (например, вирусный сток или
надклеточная среда, содержащая вирус) вносили в 96-луночный планшет к монослою клеток
MDCK. Данный раствор последовательно десятикратно разбавляли инфекционной средой
(средой IMDM, содержащей TPCK-трипсин в концентрации 2 мкг/мл и антибиотики) и
инкубировали с клетками MDCK в течение 24 ч при 37°С в атмосфере 5% CO2. По окончании
инкубации клетки дважды промывали ФСБ и фиксировали охлажденным 80% раствором
ацетона в воде (100 мкл/лун) в течение 15 мин при комнатной температуре. Лунки дважды
промывали ФСБ и добавляли 50 мкл раствора моноклональных антител, специфичных к NP
белку вируса гриппа А (антитела разводили в ФСБ в соотношении 1:2000 (об.)), планшет
инкубировали 1 ч при 37°С, по окончании инкубации клетки отмывали от неприкрепившихся
антител ФСБ 10 раз (в объеме 200 мкл). Далее в лунки вносили 50 мкл раствора в ФСБ
биотинилированных IgG козы против мышиных моноклональных антител в разведении 1:3000,
планшет инкубировали 30 мин при 37°С, по окончании инкубации клетки десятикратно
промывали ФСБ в объеме 200 мкл/лун. К клеткам добавляли 100 мкл стрептавидинпероксидазного комплекса в разведении 1:2000 в ФСБ, инкубировали в течение 30 мин при
37°С, после чего клетки вновь десятикратно промывали ФСБ.
Непосредственно
перед
окрашиванием
готовили
раствор
хромогена
3-амино-9-
этилкарбазола (AEC) в диметилформамиде в концентрации 8 мг/мл. Смешивали 500 мкл AEC с
10 мл H2O, 200 мкл ацетата натрия, pH 5.8, 50 мкл 3% H2O2. В лунки вносили по 100 мкл
готового раствора, выдерживали 30 мин в темноте, промывали ФСБ. Подсчет окрашенных в
розовый (красный) цвет инфекционных фокусов проводили под микроскопом БИОЛАМ П2-1
(«ЛОМО», Россия) либо микроскопом Primo Vert («Zeiss», Германия). За 1 ФОЕ (фокусобразующую единицу) принимали окрашенную клетку или группу клеток, отстоящую от
других окрашенных фокусов на 2 неокрашенные клетки.
2.2.20 Оценка влияния препарата на репродукцию вируса гриппа А
Клетки MDCK выращивали на 24-луночном планшете до полного монослоя в среде
IMDM с сывороткой и антибиотиками. Лунки промывали ФСБ и заражали вирусом гриппа А
(множественность заражения (MOI) = 0,1 ФОЕ/кл) в присутствии (опыт) либо отсутствие
(контроль) солоксолон метила в концентрации 1 мкМ при 37°С в атмосфере 5% CO2 в течение 1
ч. Далее удаляли вирусный инокулят, дважды промывали клетки ФСБ и покрывали свежей
инфекционной средой в присутствии (опыт) или отсутствие (контроль) солоксолон метила в
концентрации 1 мкМ. Клетки далее инкубировали при при 37°С в атмосфере 5% CO2 в течение
79
24 ч, после чего подвергали их одному циклу замораживания-оттаивания и определяли вирус
гриппа с помощью метода ФОЕ (см. главу 2.2.19).
2.2.21 Оценка вирулицидного действия
Прямой эффект солоксолон метила на вирусные частицы вируса гриппа А оценивали in
vitro при инкубации вирусной суспензии (9,5×105 ФОЕ) с равным объемом раствора солоксолон
метила в концентрации 1 мкМ в течение 1, 2 и 4 часов при 37°С. Параллельно аналогичное
количество вируса гриппа инкубировалось в отсутствие солоксолон метила (контроль).
Остаточная после инкубации инфицирующая способность вируса была определена методом
ФОЕ, описанным выше (2.2.19).
2.2.22 Получение раствора эритроцитов
Кровь петуха, полученную в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (Новосибирск), в
объеме 1 мл смешивали с 7 мл буфера А и центрифугировали при 200 g в течение 10 мин, после
чего удаляли супернатант и повторяли промывку еще один раз. Клеточный осадок считали
100% препаратом эритроцитов. Для получения 1% раствора к осадку добавляли 99 объёмов
буфера Б.
2.2.23 Титрование вируса гриппа А по реакции гемагглютинации (РГА)
Вируссодержащий материал (по 50 мкл) титровали в лунках планшета с U-образным дном
буфером Б двукратным шагом. К образцу каждого разведения добавляли равный объём (по 50
мкл) 0,5% или 1%-го раствора эритроцитов петуха. Планшет инкубировали 40 минут при 4˚С
без перемешивания. По результатам реакции оседания эритроцитов определяли, при каком
разведении вирусной пробы не регистрируется агглютинация эритроцитов с вирусом.
Наибольшее разведение вируса, агглютинирующее эритроциты в 50% случаев, определяли как
титр вируса (единица измерения – гемагглютинирующая единица (ГАЕ)/мл)
2.2.24 Исследование влияния солоксолон метила на адсорбцию вируса к мембране
клетки
Влияние солоксолон метила на адсорбцию вируса гриппа определяли с помощью РГА, как
было описано ранее [340]. Последовательные двукратные разведения солоксолон метила (0,098100 мкМ) смешивали с равными объемами вирусной суспензии (25 мкл/лун, 4 ГАЕ) и
инкубировали в течение 1 ч при 4°С в планшетах с U-образным дном. После инкубации в лунки
добавляли 0,5% раствор эритроцитов петуха и инкубировали при 4°С в течение 40 мин, после
чего определяли наличие РГА.
80
2.2.25 Исследование активности нейраминидазы вируса гриппа А
Активность нейраминидазы оценивали с помощью коммерческого набора NA-Fluor™
Influenza
Neuraminidase
Assay
Kit
(Applied
Biosystems,
USA)
согласно
протоколу
производителя. Вирусную суспензию смешивали с серией десятикратных разбавлений
солоксолон метила и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Далее добавляли Substrate
working solution, перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Реакцию тормозили
введением Стоп-реагента, после чего измеряли флуоресценцию (возбуждение 360 нм,
излучение 450 нм).
2.2.26 Оценка влияния времени добавления солоксолон метила на репродукцию
вируса
А) Схема 1
Клетки MDCK выращивали на 24-луночном планшете до полного монослоя, лунки
промывали ФСБ и заражали вирусом гриппа (MOI = 0,01 ФОЕ/кл) в течение 1 ч при 37°С, после
чего удаляли надклеточную жидкость, содержащую вирусный инокулят, клетки промывали
ФСБ и добавляли свежую инфекционную среду. Солоксолон метил добавляли к клеткам MDCK
в концентрации 1 мкМ:

за 5 часов до заражения, перед внесением вирусного инокулята клетки отмывали от
солоксолон метила ФСБ;

во время заражения (вместе с вирусом), через 1 час инкубации при 37°С удаляли
смесь вирусного инокулята с солоксолон метилом, клетки промывали ФСБ,
заливали свежую инфекционную среду и инкубировали при 37°С в атмосфере 5%
CO2 до конца эксперимента;

сразу после отмывки от вируса или через 8 часов после инфицирования (ч.п.и.),
клетки инкубировали в присутствии солоксолон метила до конца эксперимента.
В качестве контроля использовали зараженные вирусом клетки MDCK, инкубированные
по вышеприведенной схеме в отсутствие солоксолон метила, но в присутствии 0,1% ДМСО.
Через 24 ч.п.и. монослой клеток замораживали при -20°С и подвергали одному циклу
замораживания-оттаивания, после чего определяли титры вирусов методом ФОЕ, описанным
выше (2.2.19).
Б) Схема 2
Клетки MDCK выращивали на 24-луночном планшете до полного монослоя, лунки
промывали ФСБ и заражали вирусом гриппа (MOI = 0,001 ФОЕ/кл) в течение 1 ч при 4°С для
синхронизации инфекции. Далее удаляли надклеточную жидкость, содержащую вирусный
инокулят, клетки отмывали 3 раза ФСБ от не прикрепившихся вирусных частиц, в лунки
81
добавляли инфекционную среду и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% CO2 (временная
точка «0»). Инфекционную среду, содержащую солоксолон метил в концентрации 1 мкМ
(опыт) или 0,1% ДМСО (контроль) добавляли во временных промежутках (-1)-0 ч (вместе с
вирусом), 0-2 ч, 2-4 ч, 4-6ч, 6-8 ч или 8-10 ч. После завершения инкубационного периода клетки
промывали три раза ФСБ и инкубировали со свежей инфекционной средой при 37°С в
атмосфере 5% CO2. Через 10 ч.п.и. клетки замораживали при -20°С и подвергали одному циклу
замораживания-оттаивания, после чего определяли титры вирусов методом ФОЕ, описанным
выше (2.2.19).
2.2.27 Исследование влияния солоксолон метила на способность вируса гриппа
связываться с клеткой
Влияние солоксолон метила на способность вируса гриппа связываться с клетками
хозяина проводили по методу, описанному ранее [341]. Клетки MDCK выращивали на 24луночном планшете до полного монослоя, инкубировали на льду (4°С) в течение 1 ч, после чего
вносили вирусный инокулят (MOI = 0,01 ФОЕ/кл) вместе с солоксолон метилом в
концентрациях 0,75, 1 и 1,5 мкМ. Клетки инкубировали на льду (4°С) в течение 3 ч, позволяя
вирусу гриппа прикрепиться к клеточной мембране. Среду, содержащую вирус и солоксолон
метил, удаляли, не прикрепившиеся вирусные частицы два раза отмывали ФСБ и добавляли
свежую инфекционную среду. Клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 5% CO2 в течение 24
ч, после чего клетки замораживали при -20°С, подвергали одному циклу замораживанияоттаивания и определяли титры вирусов методом ФОЕ, описанным выше (2.2.19).
2.2.28 Исследование влияния солоксолон метила на проникновение вируса гриппа в
клетки
Оценку способности солоксолон метила ингибировать проникновение вируса в клетку
проводили по методике [342]. Клетки MDCK выращивали на 24-луночном планшете до полного
монослоя, инкубировали на льду (4°С) в течение 1 ч, затем заражали вирусом гриппа А (MOI =
0,1 ФОЕ/кл) при 4°С в течение 3 ч, позволяя вирусу гриппа лишь адсорбироваться на клетках.
Далее удаляли надклеточную жидкость, содержащую вирусный инокулят, клетки промывали
ФСБ и добавляли к ним солоксолон метил в концентрациях 1 и 1,5 мкМ, после чего переносили
клетки в CO2 – инкубатор на 37°С, запуская тем самым процесс эндоцитоза вируса в клетки.
Клетки инкубировали при 37°С в течение 3 ч, после чего удаляли среду и заливали в лунки
кислый ФСБ (pH 3) на 1 мин для инактивации не проникших внутрь клетки вирусных частиц.
Затем нейтрализовали буфер путем добавления щелочного ФСБ (pH 11), клетки дважды
промывали обычным ФСБ (pH 7,4) и приливали к ним свежую инфекционную среду.
82
В качестве контроля использовались инфицированные вирусом гриппа клетки,
инкубированные по вышеприведенной схеме в отсутствие солоксолон метила, но в присутствии
0,1% ДМСО. Клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 5% CO2 в течение 24 ч, после чего
замораживали их при -20°С, подвергали одному циклу замораживания-оттаивания и
определяли титры вирусов методом ФОЕ, описанным выше (2.2.19).
2.2.29 Оценка противовирусной активности in vivo на модели гриппозной пневмонии
мышей
Мышей инбредной линии Balb/c массой 16-20 гр получали из Питомника ФГУН ГНЦ ВБ
«Вектор» Роспотребнадзора (Новосибирск) и содержали на стандартном рационе в
регламентированных условиях вивария ИХБФМ СО РАН. До начала испытаний животные
находились под наблюдением 3 суток.
Для заражения животных использовали аллантоисную жидкость куриных эмбрионов,
содержащую вирус гриппа А/WSN/33 (H1N1), полученную инженером Ивановой Г.А. (ИХБФМ
СО РАН).
Перед заражением 10 мышей наркотизировали путем введения внутрибрюшинных
инъекций трибромэтанола (Avertin ®) в дозе 250 мг/кг, после чего интраназально вводили вирус
гриппа в дозе 0,5LD50 (600 ФОЕ) [LD50 - доза вируса, вызывающая гибель 50% животных,
значение LD50 для используемого вирусного штамма было определено ранее к.б.н. Гончаровой
Е. П. (ИХБФМ СО РАН) и составляло 1200 ФОЕ]. Солоксолон метил в 10% растворе Твин-80
вводили животным интраназально за 6 ч до заражения, во время заражения и через 24, 48, 72 и
96 ч после заражения в дозе 5 мг/кг. Контрольным животным вводили 10% раствор Твин-80 по
указанной выше схеме. Через 5 суток после заражения животных выводили из эксперимента,
извлекали легкие и разделяли их на две фрагмента:

один фрагмент гомогенизировали в 2 мл ФСБ, подвергали одному циклу
замораживания-оттаивания и определяли титры вируса в гомогенатах с помощью
метода ФОЕ, описанного выше (2.2.18);

второй фрагмент фиксировали 10% забуференным формалином и использовали для
гистологического анализа (гистологический анализ проводился к.м.н. Сеньковой А.
В. (ИХБФМ СО РАН).
О противовирусной активности судили по снижению титра вируса в легких и подавлению
воспалительных изменений в ткани легкого, вызванного вирусом гриппа.
83
2.2.30 Определение концентрации ИЛ-6, вырабатываемого клетками A549 в
результате вирусной инфекции
Клетки A549 выращивали на 24-луночном планшете до полного монослоя, лунки
промывали ФСБ и заражали вирусом гриппа (MOI = 0,1 ФОЕ/кл) в течение 1 ч при 37°С, после
чего удаляли вирусный инокулят. Далее клетки промывали два раза ФСБ и добавляли свежую
инфекционную среду в присутствии солоксолон метила в концентрациях 0,1, 0,5, 0,75 или 1
мкМ (опыт) или в отсутствие солоксолон метила, но в присутствии 0,1% ДМСО (контроль).
Клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 5% CO2 в течение 24 ч, после чего определяли
концентрацию ИЛ-6 с помощью набора А-8768 Интерлейкин-6 – ИФА – БЕСТ (ЗАО «ВекторБест», Новосибирск) согласно протоколу производителя.
2.2.31 Статистический анализ
Для статистической обработки данных, полученных in vitro (уровень цитотоксичности,
синтез NO и ИЛ-6, титры вируса) и in vivo (количество клеток в асците, масса асцита, уровень
отека, титры вируса в легких), использовали t-тест Стьюдента; значение p<0,05 отражало
статистически достоверные данные. Для статистического анализа использовали Microsoft Excel
2010.
84
ГЛАВА 3. СПЕКТР БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ
ГЛИЦИРРЕТОВОЙ КИСЛОТЫ (РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ)
Важным направлением медицинской химии является создание синтетических аналогов
биологически активных биогенных соединений. В последние годы все больший интерес в
данной области вызывают природные тритерпеноиды. Данные соединения характеризуются
широким спектром биологического действия, однако их активность недостаточно высока для
использования в клинической практике. Ввиду этого для усиления их фармакологических
свойств используется подход, связанный с химической трансформацией молекул данных
соединений.
Ранее в Новосибирском институте органической химии им Н. Н. Ворожцова СО РАН в
Лаборатории физиологически активных веществ (далее ЛФАВ) путем направленной
химической модификации структуры ГЛК (Рис. 13) был синтезирован ряд синтетических
аналогов данного тритерпена. Всего на испытания было передано 40 производных ГЛК.
Химической модификации подвергались кольца A, C, D и E данного соединения (Табл. 3).
Полученные производные были условно разделены на 7 групп в зависимости от строения их
колец С, D и Е (Табл. 3). В качестве заместителей выступали ацето-, оксо-, циано-,
оксиметиленовые и метильные группы, также в структуру углеводородного остова ГЛК
вводили двойные связи, оксазольное или циклопропановое кольца.
IC50а) > 100 мкМ
Рис. 13. Структурная формула ГЛК.
а)
концентрация вещества, при которой происходит гибель 50%
клеток КВ-3-1 по сравнению с контролем (см. раздел 3.1.1)
3.1 Оценка цитотоксичности новых производных ГЛК
3.1.1 Первичный скрининг производных ГЛК
Для скрининга цитотоксичности новые производные ГЛК растворяли в ДМСО до
концентрации 10-2 М и хранили в виде стоковых растворов при -20°С до использования. Ввиду
того, что из 40 полученных соединений 9 не растворимы в ДМСО, апротонном растворителе,
наиболее совместимом с работой с живыми клетками, в скрининг включили 31 производное
85
(Табл. 3). Скрининг проводили in vitro на клетках эпидермоидной карциномы ротовой полости
человека КВ-3-1, цитотоксичность соединений оценивали с помощью МТТ теста (см. раздел
2.2.3).
Клетки KB-3-1 инкубировали в среде DMEM в присутствии исследуемых соединений,
взятых в концентрации от 10-9 до 10-5 М, в течение 24 ч, после чего определяли долю живых
клеток по отношению к контролю – клеткам, инкубированных в отсутствие соединений, но в
присутствии 0,1% ДМСО. Для каждого производного определяли значение IC50 –
концентрацию вещества, при которой наблюдается гибель 50% клеток. Полученные данные
представлены в Табл. 3.
Как видно из приведенных данных, ГЛК малотоксична в отношении клеток КВ-3-1:
значение IC50 составило >100 мкМ. Наблюдаемый уровень токсичности ГЛК согласуется с
литературными данными – ранее было показано, что данный тритерпен обладает слабой
токсичностью в отношении опухолевых клеток слюнной железы А253 (IC50 = 80,8 мкМ) и кожи
A431 (IC50=79,6 мкМ), относящихся, как и КВ-3-1, к эпидермоидному типу [315].
Производные ГЛК по уровню токсичности в отношении клеток КВ-3-1 можно условно
разделить на три группы – (1) высокотоксичные производные 1А, 1Д, 4Б, 5Г, 6Б-1, 6В
(солоксолон метил), 6Г, 6Ж (IC50 = 0,1-10 мкМ), (2) производные с умеренной токсичностью
1В, 2Г, 3Б, 3Г, 3Д, 4В, 4Е, 6А, 7А, 7В (IC50 = 10-50 мкМ) и (3) малотоксичные производные1Б,
3В, 4Г, 5В, 5Е, 6Б-2, 6Е-1, 7Б, 7Г, 7Е, 7Ж (IC50 > 50 мкМ) (Табл. 3). Наибольшей
цитотоксичностью среди всех синтезированных производных ГЛК обладало соединение 6В
(метил 2-циано-3,12-диоксо-18βH-олеан-1(2),11(9)-диен-30-оат, позже получившее название
солоксолон метил) – значение его IC50 составило 0,3±0,1 мкМ, что в 330 раз ниже
соответствующего значения у ГЛК.
На основании полученных данных был проведен анализ взаимосвязи «структураактивность» синтезированных производных ГЛК.
3.1.2 Анализ взаимосвязи «структура-активность» производных ГЛК
При анализе взаимосвязи «структура-активность» в ряду изучаемых производных ГЛК
были выявлены следующие закономерности:

показано, что этерификация карбоксильной группы, находящейся в положении С30
ГЛК, приводит к значительному усилению цитотоксичности – производное 1А,
представляющее собой метиловый эфир ГЛК, обладало в >14,5 раз большей
цитотоксичностью в отношении клеток КВ-3-1 по сравнению с исходным
тритерпеном. Данный факт согласуется с литературными данными, где было
показано, что присоединение метильной группы к С30 карбоксильной группе ГЛК
способствует увеличению ее антипролиферативного действия [315]. Необходимо
86
отметить, что соединение 1А (IC50 = 6,8±0,5 мкМ) оказалось одним из наиболее
токсичных производных. Лишь 5 соединений из всех исследованных были более
цитотоксичными, чем 1А (6Б-1, 6В, 6Г, 6Д, 6Ж), 3 обладали сходным уровнем
цитотоксичности (1Д, 4Б, 5Г), а остальные характеризовались значительно
меньшей активностью.

удаление кето-группы из кольца С приводит к снижению растворимости
производных в ДМСО, как это было отмечено для соединений 1Е, 3Е, 1-5Ж.

замена С3 гидроксильной группы в кольце А ГЛК на кето-группу может приводить
к снижению цитотоксичности производных. Так, в группах В, Г и Д при введении
данной модификации значение IC50 соответствующих производных увеличилось в
9,1, 1,5 и 3,7 раза, соответственно.

удаление кратной связи из кольца С вызывает усиление антипролиферативной
активности: насыщение 9,11-еновой структуры в соединениях 1В и 3В приводит к
увеличению их цитотоксичности в 1,6 и более чем в 4 раза, соответственно.

наличие в кольце А 2-циано-1-ен-3-оновой структуры обеспечивает наибольшую
цитотоксичность, что согласуется с литературными данными. Ранее было показано,
что данная структура определяет высокую биологическую активность производных
ОК CDDO и его аналогов (бардоксолон метила и CDDO-Im) [335]. Циано- и кетогруппы, входящие в данную структуру оттягивают электронную плотность
двойной связи, приводя к формированию в положении С1 сайта, чувствительного к
нуклеофильной атаке (так называемого акцептора Михаэля) (см. раздел 1.5.1.1.4).
Таким образом, молекула, содержащая 2-циано-1-ен-3-оновую структуру способна
присоединять по положению С1 различные нуклеофилы – например, SH-группы
внутриклеточных ферментов, регулируя тем самым активность последних [336].
Действительно, нами было показано, что положение С1 в данной структуре играет
ключевую роль – введение в данное положение метильной группы (6Б-2),
блокирующей нуклеофильную атаку, приводило к более чем 25-кратному
снижению цитотоксичности производного 6Б-1. Удаление из кольца А акцептора
Михаэля путем насыщения двойной связи и формированием на ее месте
циклопропанового
кольца
также
вызывало
значительное
снижение
цитотоксичности производных: значения IC50 соединений 7Б, 7В, 7Г, 7Е, 7Ж
превышали данный показатель соответствующих производных 6Б, 6В, 6Г, 6Е, 6Ж
в 100 раз и более. Низкая токсичность была также отмечена для производного 6E1, представляющего собой неразделенную смесь соединений X и Y (Рис. 14), также
87
Таблица 3. Структурные формулы новых производных ГЛК и значение IC50 для клеток КВ-3-1
А
Б
В
Г
Д
Е
Ж
1
IC50 = 6,8±0,5 мкМ
2
--
IC50 > 100 мкМ
--
IC50 = 10,9±2,3 мкМ
IC50 = 10,7±1,7 мкМ
--
IC50 > 100 мкМ
IC50 = 16,1±3,7 мкМ
--
Не растворяется
Не растворяется
--
IC50 = 25,2±0,6 мкМ
Не растворяется
Не растворяется
-IC50 = 6,3±0,2 мкМ
5
Не растворяется
-IC50 =27,0±1,2 мкМ
4
Не растворяется
-IC50 = 47,0±16,18 мкМ
3
IC50 = 6,8±3,5 мкМ
IC50 = 18,1±1,5 мкМ
IC50 > 100 мкМ
--
IC50 = 40,0±0,7 мкМ
Не растворяется
IC50 > 100 мкМ
Не растворяется
-IC50 > 100 мкМ
IC50 = 8,1±0,7 мкМ
88
Таблица 3. Продолжение
А
Б
6
Г
Д
Солоксолон метил
1
IC50 = 20±0,6 мкМ
В
IC50 = 4,0±0,2 мкМ
Е
Ж
1
IC50 = 1,0±0,1 мкМ
IC50 = 5,5±0,7 мкМ
IC50 = 80,0±0,9 мкМ
IC50 = 2,2±0,3 мкМ
IC50 =0,3±0,1 мкМ
2
2
IC50 > 100 мкМ
Не растворяется
--
7
IC50 = 43,4±2,7 мкМ
IC50 > 100 мкМ
IC50 = 29,5±1,3 мкМ
IC50 > 100 мкМ
IC50 > 100 мкМ
IC50 > 100 мкМ
Примечание: Производные ГЛК распределяли по группам в зависимости от строения их кольца А (ряды 1-7) и колец C, D, E (столбцы АЖ).
89
не имеющих в кольце А сайта для нуклеофильной атаки. Таким образом, введние в состав
молекулы ГЛК 2-циано-1-ен-3-оновой структуры приводит к значительному усилению
антипролиферативного действия такого производного, а дальнейшая модификация данной
структуры вызывает снижение цитотоксичности соединений.
6Е-1 =
+
Рис. 14. Состав производного 6E-1
Отметим, что в ряду производных 6А, 6Б, 6В, 6Г, 6Д, 6Ж, содержащих 2-циано-1-ен-3оновую структуру, наименьшей активностью обладало соединение 6А, описанное ранее как
CDODA-Me [139] – значение IC50 6А составило 20±0,6 мкМ, что в 5 раз ниже
соответствующего значения у исходной ГЛК (Рис. 13). Цитотоксичность CDODA-Me,
определенная в нашем эксперименте (IC50 = 20±0,6 мкМ), оказалась несколько ниже данного
показателя, определенного в работах [139, 140, 142, 143, 244] (IC50 = 0,2-15 мкМ). Данный факт,
возможно, связан с различиями в используемых линиях опухолевых клеток.
Мы показали, что введение дополнительной двойной связи в кольцо Е (6В), удаление 11оксо-группы из кольца С и формирование 11(12),18(26)-диеновой структуры (6Ж), либо замена
нативного 11-оксо-12-енового фрагмента на 12-оксо-11-еновый фрагмент (6Б) приводит к
усилению цитотоксичности производного 6А. Как уже говорилось выше, наибольшей
активностью среди всех исследованных в данной работе производных обладало соединение 6В
(солоксолон метил) (IC50 = 0,3±0,1 мкМ). Необходимо отметить, что значительный вклад в
активность данного производного вносит акцептор Михаэля не только в положении С1 (IC507В =
29,5±1,3 мкМ), но и в положении С9, а удаление данного акцептора вследствие насыщения
двойной связи в кольце С (6Д) приводит к снижению цитотоксичности производного в ~18 раз.
Таким образом, в результате проведенного скрининга производных ГЛК было выявлено
лидерное соединение солоксолон метил, высокую цитотоксичность которого определяло
наличие в кольцах А и С 2-циано-1-ен-3-оновой и 12-оксо-11-еновой структур, соответственно.
Интересным представлялось проанализировать эффект введения данных модификаций в
полициклическую молекулу нетритерпеноидной природы. В качестве данной полициклической
молекулы была использована дезоксихолевая кислота (далее ДОХК) – биогенное соединение со
стероидным остовом, относящееся к классу желчных кислот, которое синтезируется в природе,
также как и ГЛК, путем биоциклизации сквалена [343] и, согласно литературным данным,
90
обладает нативной токсичностью в отношении ряда опухолевых клеток [344, 345, 346, 347,
348]. В ЛФАВ НИОХ СО РАН был синтезирован ряд химических производных ДОХК,
структуры которых представленны в Табл. 4. Мы оценивали цитотоксичность данных
соединений на клетках КВ-3-1, использовавшихся для скрининга производных ГЛК, а также на
клетках опухоли двенадцатиперстной кишки человека HuTu-80 и клетках гепатоцеллюлярной
карциномы человека HepG2 и мыши MH-22a, так как известно, что желчные кислоты, в том
числе ДОХК, участвуют внутри организма в энтерогепатической (кишечно-печеночной)
циркуляции [349].
ДОХК и ее производные оказались нетоксичными в отношении клеток КВ-3-1 в
исследуемых концентрациях – значение их IC50 превышало 100 мкМ (Табл. 4). Наибольшей
цитотоксичностью в отношении клеток HuTu-80, HepG2 и MH-22a обладало производное А,
содержащее характерные для солоксолон метила 2-циано-1-ен-3-оновую структуру в комплексе
с 12-оксо-11-еновым фрагментом – введение данных модификаций в молекулу ДОХК
приводило к усилению цитотоксичности в 4.5, 5.1 и 1.7 раз, соответственно, по сравнению с
исходной молекулой (Табл. 4). Тем не менее, соединение А, характеризующееся значительным
сходством с солоксолон метилом в строении колец А и С, оказалось значительно менее
цитотоксичным, а его значения IC50 для клеток HuTu-80, HepG2 и MH-22a превышали
соответствующие показатели для солоксолон метила в 26.1, 8.2 и 12.4 раза, соответственно, что
свидетельствует о важной роли тритерпенового остова в проявлении цитотоксической
активности солоксолон метила и других производных ГЛК.
В результате анализа взаимосвязи «структура-активность» производных ДОХК было
установлено, что значительный вклад в их цитотоксическую активность, так же, как и у
солоксолон метила, вносят акцепторы Михаэля в положениях С1 и С9, о чем свидетельствуют
следующие закономерности:
- снижение электрофильности на атоме углерода С1 вследствие удаления электроноакцепторной цианогруппы из положения С2 приводило к уменьшению токсичности
производного С в отношении клеток HuTu-80 и HepG2 в 2,4 и 5,1 раз, соответственно, по
сравнению с производным А, обладающим нативной 2-циано-1-ен-3-оновой группировкой.
Последующее смещение акцептора Михаэля из положения С1 в положение С5 (производное Е)
вызывало дальнейшее снижение цитотоксичности – значение IC50 производного Е на клетках
HuTu-80 и MH-22a оказалось в 1,3 и 2,2 раза выше соответствующего значения производного С,
содержащего акцептор Михаэля в положении С1, что, возможно, связано с наличием
стерических препятствий для нуклеофильной атаки по атому углерода С5.
- удаление акцептора Михаэля из положения С9 вследствие насыщения кратной связи
(производное B) приводило к снижению цитотоксичности в отношении клеток HuTu-80 и
91
Таблица 4. Структурные формулы и значения цитотоксичности новых производных ДОХК в
отношении ряда опухолевых клеточных линий.
IC50KB-3-1
IC50HuTu-80
IC50HepG2
IC50MH-22a
0,3±0,1
0,7±0,2
2,4±0,4
2,5±0,2
ДОХК
>100
82,9±1,9
>100
51,8±0,6
A
>100
18,3±0,4
19,6±0,5
31,1±1,4
>100
94,2±0,9
>100
51,5±0,1
>100
43,3±5,8
>100
23,2±0,4
>100
37,2±4,8
>100
43,1±2,5
>100
55,7±3,6
>100
51,5±1,4
>100
39,9±4,2
>100
33,8±1,6
Соединение
Солоксолон метил
B
C
D
E
F
92
HepG2 в 5,1 раз и MH-22a в 1,7 раз по сравнению с производным А. На примере производных С
и D, содержащих 1-ен-3-оновую группировку, показано, что насыщение двойной связи в кольце
С либо также способствовало снижению цитотоксичности (в 1,9 раз на клетках MH-22a), либо
практически не влияло на нее (HuTu-80). Интересно, что удаление акцептора Михаэля из
кольца С производного Е, содержащего 4-ен-3-оновую структуру, приводило, наоборот, к
усилению цитотоксичности – значение IC50 производного F оказалось ниже соответствующего
значения производного E на клетках HuTu-80 и MH-22a в 1,4 и 1,5 раза, соответственно.
Таким образом, в результате проведенного анализа было показано, что введение 2-циано1-ен-3-оновой структуры в комплексе с 12-оксо-11-еновым фрагментом способствует усилению
цитотоксичности производных не только тритерпеновой, но и стероидной природы. Внесение
модификаций в любую из указанных группировок, влияющих на электрофильность акцепторов
Михаэля в положениях С1 и С9, приводит к снижению уровня цитотоксичности производных.
На основании данных, полученных при скрининге новых производных ГЛК, было
выявлено
лидерное
соединение
–
солоксолон
метил
–
обладающее
наибольшей
цитотоксичностью в отношении опухолевых клеток KB-3-1, HuTu-80, HepG2 и MH-22a.
Дальнейшие исследования в рамках данной работы были проведены на примере указанного
производного.
3.1.3 Цитотоксичность солоксолон метила в отношении опухолевых клеток
различного гистогенеза
Оценка антипролиферативного действия солоксолон метила была проведена на
нескольких опухолевых клеточных линиях человека различного гистогенеза: клетках
эпидермоидной карциномы шейки матки HeLa, аденокарциномы молочной железы MCF-7,
нейробластомы SK-N-MC, эпидермоидной карциномы КВ-8-5. Клетки инкубировали в
присутствии солоксолон метила в концентрациях 0,1-10 мкМ в течение 24 ч, после чего
определяли жизнеспособность клеток с помощью МТТ-теста. Все полученные данные по
цитотоксичности солоксолон метила приведены в Табл. 5.
Солоксолон метил проявлял высокую цитотоксичность в отношении опухолевых клеток
различного гистогенеза – его значения IC50 в отношении указанных клеток оказались схожими
со значением IC50 в отношении клеток КВ-3-1 (за исключением клеток MCF-7) (Табл. 5).
Необходимо отметить, что солоксолон метил оказался токсичным и для клеток КВ-8-5, в
которых гиперэкспрессирован ген Mdr1, кодирующий Р-гликопротеин – АТФ-зависимый
мембранный насос, выкачивающий из опухолевых клеток различные химиопрепараты и
определяющий тем самым фенотип множественной лекарственной устойчивости опухолевых
клеток [350]. Высокая токсичность исследуемого производного в отношении клеток KB-8-5
свидетельствует о том, что данное соединение не является субстратом для P-гликопротеина.
93
Таблица 5. Цитотоксичность солоксолон метила в отношении опухолевых клеток человека и
мыши различного гистогенеза.
Клеточная линия
IC50, мкМ
KB-3-1
0,3±0,1
HeLa
1,3±0,1
MCF-7
5,0±0,3
SK-N-MC
0,8±0,1
HepG2
2,4±0,4
HuTu-80
0,7±0,2
KB-8-5
1,2±0,1
MH-22a
2,5±0,2
3.2 Механизм гибели опухолевых клеток под действием солоксолон метила
Известно, что существует два основных пути гибели клеток – некроз и апоптоз. Некроз
является патологическим процессом, вызывающим смерть клетки вследствие ее повреждения
(химического, термического и т.д.), в то время как апоптоз – запрограммированная клеточная
гибель, происходящая вследствие работы многих ферментов клетки. Характерными признаками
апоптоза, позволяющими отличить его от некроза, являются: переход фосфатидилсерина из
внутреннего слоя цитоплазматической мембраны в наружный слой, выход цитохрома С из
межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму, активация цистеиновых протеиназ
(каспаз), сморщивание (blebbing) цитоплазматической мембраны, уменьшение объема клетки,
разрывы нитей ядерной ДНК в межнуклеосомных участках, конденсация хроматина по
периферии ядра, последующий распад ядра на части, фрагментация клеток на везикулы с
внутриклеточным содержимым — апоптотические тельца (подробно описано в разделе 1.3).
В настоящее время существует большое количество гипотез, объясняющих механизмы
действия природных тритерпенов и их аналогов на опухолевые клетки. Большая часть данных
свидетельствует в пользу апоптотического механизма гибели клеток при действии данных
веществ (см. раздел 1.4). При этом, как правило, была отмечена активация каспаз, однако в
части случаев предполагают клеточную гибель независимо от них [227].
3.2.1 Влияние солоксолон метила на уровень экстернализации фосфатидилсерина
Живые
клетки
характеризуются
фосфатидилхолин
и
сфингомиелин
фосфотидилсерин
представлен
фосфолипидной
находятся
исключительно
в
во
ассиметрией
наружном
слое,
внутреннем.
в
мембраны
то
Подобная
время
–
как
ассиметрия
поддерживается работой Mg2+-зависимой аминофосфолипидтранслоказы, транспортирующей
фосфатидилсерин во внутренний слой мембраны [351]. При инициации апоптоза происходит
подавление
активности
данного
фермента,
вследствие
увеличения
концентрации
94
внутриклеточного Ca2+, что приводит впоследствии к накоплению фосфатидилсерина в
наружном слое цитоплазматической мембраны.
Антикоагулянт аннексин в присутствии кальция способен специфически связываться с
отрицательно заряженным фосфатидилсерином на наружной мембране апоптотирующих
клеток. Следовательно, конъюгат аннексина-FITC может быть использован для выявления
клеток, находящихся на стадии апоптоза.
На поздних стадиях апоптоза или при некрозе аннексин-FITC способен проникать внутрь
клеток вследствие, соответственно, повышения проницаемости цитоплазматической мембраны
или образования в ней разрывов, и окрашивать их внутренний слой. Для того чтобы отделить
клетки,
находящиеся
на
ранних
стадиях
апоптоза
от
некротических
используется
интеркалирующий в нуклеиновые кислоты краситель йодистый пропидий (PI). Являясь
катионным красителем, PI не проникает через неповрежденную мембрану и, следовательно, не
может окрашивать живые клетки и клетки, находящиеся на ранних стадиях апоптоза.
Клетки КВ-3-1 инкубировали в присутствии солоксолон метила в концентрациях 0,3 и 1
мкМ в течение 4, 18 и 24 часов. В качестве контроля использовались клетки, инкубированные в
присутствии 0,1% ДМСО. После инкубации клетки окрашивали конъюгатом аннексин-FITC и
PI, и анализировали на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter Cytomics FC 500. На
полученных диаграммах оценивали долю клеток в правом нижнем квадранте, соответствующих
апоптотическим клеткам, окрашенным только конъюгатом аннексин-FITC (Рис. 15).
Из рисунка видно, что инкубация клеток в присутствии солоксолон метила в
концентрациях 0,3 и 1 мкМ в течение 4 часов практически не приводит к изменению состава
клеточных популяций по сравнению с контролем (Рис. 15, 4 ч). Увеличение времени инкубации
до 18 (Рис. 15, 18 ч) и далее до 24 ч (Рис. 15, 24 ч) приводит к значительному повышению доли
клеток в состоянии апоптоза. Так, инкубация клеток в присутствии СМ в концентрации 0,3
мкМ (соответствует его IC50) в течение 18 и 24 ч, вызывает апоптоз у 21,8% и 49,7% клеток,
соответственно (Рис. 15). Увеличение концентрации солоксолон метила до 1 мкМ приводит к
значительному повышению доли апоптотических клеток – до 47,3% и 89,2% при инкубации в
течение 18 и 24 ч, соответственно.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют об апоптотическом характере
гибели опухолевых клеток, вызванной действием солоксолон метила. Причем уровень
активации апоптоза оказался напрямую зависимым как от времени инкубации клеток в
присутствии исследуемого производного, так и от его концентрации.
95
4ч
18 ч
24
ч
ДМСО
Флуоресценция, PI
2,2%
6,8%
8,4%
СМ, 0,3 мкМ
5,2%
21,8%
49,7%
СМ, 1 мкМ
7,3%
47,3%
89,2%
Флуоресценция, Аннексин-FITC
Рис. 15. Апоптоз клеток линии КВ-3-1 под действием солоксолон метила. Окрашивание ApopNexinTM
FITC Apoptosis Detection Kit («Chemicon Int.», США). Клетки инкубировали в присутствии солоксолон
метила (СМ) в концентрациях 0,3 мкМ и 1 мкМ в течение 4, 18 и 24 часов. В качестве контроля
использовали клетки, инкубированные в отсутствие соединения, но в присутствии 0,1% ДМСО.
Событий в каждом образце не менее 10000.
3.2.2 Влияние солоксолон метила на мембранный потенциал митохондрий
В настоящее время накоплено множество данных, свидетельствующих о том, что
пентациклические тритерпеноиды запускают апоптоз опухолевых клеток в основном по
внутреннему (митохондриальному) пути, вызывая увеличение проницаемости внешней
мембраны митохондрий, что приводит к быстрой потере мембранного потенциала митохондрий
(МПМ), набуханию митохондрий, разрыву их внешней мембраны и выходу из их
межмембранного пространства в цитоплазму проапоптотических белков.
Для определения способности солоксолон метила индуцировать митохондриальный путь
апоптоза было исследовано его влияние на МПМ. Клетки КВ-3-1 инкубировали в отсутствие
солоксолон метила, но в присутствии 0,1% ДМСО (контроль), либо в присутствии солоксолон
метила в концентрации 1 мкМ (опыт) в течение 6 ч, после чего окрашивали специфичным к
митохондриям катионным красителем JC-1 (йодистый 5,5’,6,6’-тетрахлоро-1,1’,3,3’-тетраэтил
бензимидазол карбоцианин) и определяли изменения в МПМ с помощью проточной
цитометрии и флуоресцентной микроскопии.
96
JC-1 обладает способностью накапливаться в трансмембранном просвете поляризованных
митохондрий и формировать в нем так называемые «J-агрегаты», флуоресцирующие в
оранжевой области (λ = 590 нм), которые могут быть определены с помощью канала FL2
проточного цитофлуориметра или визуализированы с помощью красного фильтра на
флуоресцентном микроскопе. Снижение МПМ вызывает диссоциацию «J-агрегатов» до «Jмономеров», флуоресцирующих в зелено-желтом спектре (λ = 527 нм).
Результаты по исследованию изменения МПМ клеток КВ-3-1 под действием солоксолон
метила представлены на Рис. 16. Большинство контрольных клеток, инкубированных в
присутствии 0,1% ДМСО и в отсутствие солоксолон метила, имело высокий уровень
флуоресценции в канале FL2 проточного цитофлуориметра (Рис. 16А), что свидетельствует о
наличии агрегированных форм JC-1. Инкубация клеток в присутствии солоксолон метила
приводила к значительному снижению уровня флуоресценции в канале FL2 по сравнению с
контролем (Рис. 16А), что указывает на диссоциацию «J-аггрегатов» до «J-мономеров», т.е.
наблюдается снижение МПМ. Результаты цитометрии были подтверждены с помощью
флуоресцентной микроскопии – было показано, что контрольные клетки флуоресцировали в
оранжевом спектре (Рис. 16Б1), т.е. характеризовались высокими значениями МПМ, тогда как в
большинстве клеток, инкубированных с СМ, была отмечена деполяризация митохондрий –
наблюдалась флуоресценция в зеленом спектре (Рис. 16Б2).
Б
1
А
2
Рис. 16. Влияние солоксолон метила на ММП клеток КВ-3-1. А. Проточная цитофлуориметрия.
Цитограмма JC-1 в клетках КВ-3-1, инкубированных в присутствии 0,1% ДМСО (контроль) или 1
мкМ солоксолон метила (опыт) в течение 6 ч. Б. Фотографии в поле флуоресцентного микроскопа
(красный фильтр) при увеличении ×200. 1) Контрольные клетки, инкубированные в присутствии
0,1% ДМСО в течение 6 ч; 2) Опытные клетки, инкубированные в присутствии 1 мкМ солоксолон
метила в течение 6 ч.
97
Таким образом, исходя из полученных экспериментальных данных, можно утверждать,
что солоксолон метил запускает апоптоз опухолевых клеток по митохондриальному пути,
вызывая снижение митохондриального мембранного потенциала.
3.2.3 Влияние солоксолон метила на клеточный цикл
Одним из признаков поздней стадии апоптоза является фрагментация ДНК. Метод
проточной цитофлуориметрии позволяет одновременно регистрировать клетки, содержащие
фрагментированную ДНК, которые оцениваются на получаемых ДНК-гистограммах как
субдиплоидный пик (subG1), и определять соотношение клеток, находящихся в разных фазах
клеточного цикла.
Клетки КВ-3-1 инкубировали в присутствии (0,3 мкМ, опыт) или в отсутствие солоксолон
метила (0,1% ДМСО, контроль) в течение 18 часов, затем фиксировали 70% этанолом,
окрашивали PI и анализировали с помощью проточного цитофлуориметра, как описано в
разделе 2.2.6. На основании полученных данных была построена диаграмма, характеризующая
распределение клеток по фазам клеточного цикла (фаза subG1, соответствующая апоптозу,
фазы G1, S и G2/M) (Рис. 17).
Количество клеток, %
100
24,8%
80
42,1%
G2/M
22,9%
60
12,9%
S
G1
40
25,8%
50,6%
Sub-G1
20
19,2%
1,7%
0
Контроль
СМ
Рис. 17. Распределение клеток КВ-3-1 по фазам клеточного цикла. СМ и Контроль – клетки,
инкубированные в присутствии 0,3 мкМ солоксолон метила и в отсутствие солоксолон метила, но в
присутствии 0,1% ДМСО в течение 18 ч, соответственно. Клетки в Sub-G1 фазе соответствует клеткам
на стадии апоптоза.
Как видно из Рис. 17, количество клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК в контроле
незначительно и составляет всего 1,7%, тогда как в присутствии солоксолон метила
наблюдается 11-кратное увеличение содержания клеток в стадии апоптоза. Помимо этого,
исследуемый тритерпен вызывал остановку клеточного цикла на фазе G2/M – количество
клеток, находящихся в данной фазе, увеличивалось с 24,8% в контроле до 42,1% в опыте.
98
Наблюдаемый эффект, несомненно, вносит весомый вклад в антипролиферативное действие
исследуемого соединения и, по-видимому, характерен для многих тритерпеноидов – ранее было
показано, что остановку клеточного цикла на фазе G2/M вызывают ОК [69], БК [244], CDDOMe [230] и CDODA-Me [140]. Кроме того увеличение популяции клеток в Sub-G1 и G2/M фазах
сопровождается снижением количества клеток в фазах G1 и S в 1,8 и 2 раза, соответственно
(Рис. 17).
Таким образом, полученные данные также свидетельствуют в пользу апоптотического
механизма гибели клеток при действии солоксолон метила. Остановка клеточного цикла,
вызываемая исследуемым соединением, вносит вклад в его антипролиферативное действие.
3.2.4 Изменение морфологии клеточных ядер при действии солоксолон метила
Известно, что морфологическими признаками поздней стадии апоптоза являются
уменьшение размера клеток, конденсация и фрагментация хроматина, фрагментация ядер и
образование апоптотических телец.
Для исследования влияния солоксолон метила на морфологию клеточных ядер клетки КВ3-1 рассаживали на покровные стекла, как описано в разделе 2.2.6, и инкубировали в
присутствии данного производного, взятого в концентрации 1 мкМ, в течение 6, 18 и 24 часов.
По окончании инкубации клетки фиксировали, для визуализации ядер использовали
флуоресцентный краситель Hoechst 33258, который окрашивает нуклеиновые кислоты в синий
цвет (λ=480 нм). Окрашенные ядра анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа
(рис. 18).
А
Б
В
Г
Рис. 18. Деформация и фрагментация клеточных ядер при действии солоксолон метил.
Фотографии ядер клеток КВ-3-1, окрашенных Hoechst 33258, в поле флуоресцентного
микроскопа при увеличении 200х. А. Клетки, культивированные в отсутствие солоксолон
метила, но в присутствии 0,1% ДМСО. Б, В, Г. Клетки, инкубированные в присутствии 1 мкМ
солоксолон метила в течение 6, 18 и 24 ч, соответственно. Ядра неправильной формы и
фрагментированные ядра показаны стрелками.
Из рис. 18А видно, что клетки в контроле характеризуются круглым ядром с четко
обозначенными границами и хорошо выраженными ядрышками. Инкубации клеток в
99
присутствии солоксолон метила в течение 6 часов (рис. 18Б) приводит к появлению единичных
деформированных и фрагментированных ядер, количество которых к 18 часам инкубации
заметно увеличивается (рис. 18В), через 24 ч инкубации клеток с СМ наблюдаются серьезные
повреждения подавляющего количества ядер (рис. 18Г).
Таким образом, было выявлена прямая корреляция между продолжительностью
инкубации клеток КВ-3-1 в присутствии солоксолон метила и количеством клеток на стадии
позднего апоптоза, характеризующихся наличием фрагментированных клеточных ядер.
3.2.5 Влияние солоксолон метила на активацию каспаз
Известно, что центральную роль в процессе апоптоза играют цистеиновые аспартатспецифичные протеазы – каспазы, которые по своим функциональным особенностям можно
разделить на два класса – инициаторные (8-, 9-, 10-) и эффекторные (3-, 6-, 7-) каспазы [352].
Данные ферменты в обычных условиях присутствуют в клетке в форме неактивных
проферментов – прокаспаз. При инициации апоптоза как по внешнему, так и по внутреннему
пути происходит автокаталитическая активация инициаторных каспаз 8 и 10 с помощью
белкового комплекса DISC и каспазы 9 с помощью апоптосомы (подробнее см. раздел 1.3.3.1).
Инициаторные каспазы, в свою очередь, активируют эффекторные каспазы, которые вызывают
протеолитическое расщепление более 280 белков-мишеней, участвующих в поддержании
жизнеспособности клетки [177], что, в конце концов, приводит к ее гибели.
Для оценки способности солоксолон метила вызывать активацию каспаз клетки КВ-3-1
после инкубации в присутствии СМ в течение 18 ч окрашивали с помощью CaspACETM FITCVAD-FMK In Situ Marker по методике, описанной в разделе 2.2.8. Данный маркер представляет
собой флуоресцентный аналог каспазного ингибитора Z-VAD-FMK (карбобензокси-валилаланил-аспартил-[О-метил]-флуорометилкетона), где N-концевая карбобензоксигруппа (Z)
заменена на FITC. Проникая в клетку, данный конъюгат необратимо связывается с активными
формами каспаз и, таким образом, позволяет определять уровень их активности in situ с
помощью измерения сигнала флуоресценции (λ=530 нм). Окрашенные клетки анализировали с
помощью проточного цитофлуориметра (Рис. 19А,Б) и флуоресцентного микроскопа (Рис.
19В). В последнем случае для визуализации ядер использовали флуоресцентный краситель
DAPI, окрашивающий нуклеиновые кислоты в синий цвет (λ=458 нм).
Как видно из Рис. 19, в контрольных клетках наблюдался слабый зеленый сигнал – только
9% клеток в популяции характеризовалось наличием активных каспаз. Инкубация клеток в
присутствии солоксолон метила (0,3 или 1 мкМ) приводит к значительному росту числа клеток
с активными каспазами до 51 и 85%, соответственно (Рис. 19Б). Данные проточной
цитофлуориметрии были подтверждены методом флуоресцентной микроскопии – инкубация
100
клеток в присутствии солоксолон метила приводит к значительному увеличению количества
FITC-VAD-FMK-положительных клеток (Рис.19В).
Таким образом, в результате проведенного эксперимента было установлено, что
солоксолон метил приводит к апоптозу опухолевых клеток по каспазозависимому пути. В
пользу этого также свидетельствует его слабая токсичность в отношении клеток MCF-7,
отмеченная нами выше (см. раздел 3.1.3). В указанных клетках нарушен классический путь
апоптоза: вследствие делеции в третьем экзоне гена Casp3, клетки MCF-7 не способны
экспрессировать каспазу-3 [353], являющуюся одной из центральных молекул в каспазном
каскаде.
Кол-во клеток
А
В
DAPI
FITC-VAD-FMK
ДМСО
FL1 (FITC-VAD-FMK)
Б
СМ
Рис. 19. Активация каспаз в клетках КВ-3-1, вызванная действием солоксолон метила. А.
Цитофлуориметрический анализ. Цитограмма FITC-VAD-FMK в живых клетках КВ-3-1,
инкубированных в присутствии солоксолон метила. 1 – клетки, инкубированные в 0,1 % ДМСО в
отсутствие солоксолон метила (контроль); 2 – клетки, инкубированные в присутствии 0,3 мкМ
солоксолон метила в течение 18 ч; 3 - клетки, инкубированные в присутствии 1 мкМ солоксолон
метила в течение 18 ч. Событий в каждом образце не менее 10000. Б. Соотношение клеток КВ-3-1
с неактивными (темные столбцы) и активными (светлые столбцы) каспазами после инкубации в
присутствии 0,1% ДМСО (контроль), 0,3 мкМ и 1 мкМ солоксолон метила в течение 18 ч. В.
Фотографии в поле флуоресцентного микроскопа при увеличении ×200. Синий цвет – ядра,
окрашенные DAPI, зеленый цвет – клетки с активированными каспазами, окрашенные CaspACEТМ
FITC-VAD-FMK In Situ Marker («Promega Inc.», США). ДМСО - клетки КВ-3-1, инкубированные в
присутствии 0,1% ДМСО и в отсутствие солоксолон метила в течение 18 ч. СМ – клетки КВ-3-1,
инкубированные в присутствии 0,5 мкМ солоксолон метила в течение 18 ч.
101
На основании полученных данных можно заключить, что антипролиферативный эффект
солоксолон метила в отношении опухолевой клеточной линии КВ-3-1 включает в себя
остановку клеточного цикла на фазе G2/M и инициацию апоптоза по внутреннему
(митохондриальному) пути, сопровождающуюся активацией каспазного каскада.
3.3 Полнотранскриптомный анализ экспрессии генов на кДНК-микрочипах в
клетках КВ-3-1, инкубированных в присутствии солоксолон метила
Характерной особенностью пентациклических тритерпеноидов является их способность
воздействовать одновременно на множество внутриклеточных мишеней (см. Главу 1). Мы
предположили, что солоксолон метил, являясь производным природного тритерпеноида
глицирретовой кислоты, действует по такому же принципу, что приводит в конечном итоге к
остановке клеточного цикла и индукции апоптоза опухолевых клеток. Для проверки данной
гипотезы был проведен анализ изменений, вызываемых солоксолон метилом в клетках
эпидермоидной карциномы человека КВ-3-1 на транскриптомном уровне.
Клетки КВ-3-1 инкубировали в присутствии солоксолон метила (1 мкМ) в течение 1, 2, 3,
4, 6 и 10 ч, после чего выделяли суммарную РНК (см. Раздел 2.2.9). В качестве контроля
использовали интактные клетки. Полученные препараты суммарной РНК использовали для
синтеза кДНК, которую затем гибридизовали на ДНК-микроматрицу HumanHT-12 v4 BeadChip
(Illumina, США), позволяющую одновременно оценить уровень экспрессии более 23700
транскриптов (в соответствии с базой данных Ensembl). Работы по синтезу кДНК и кДНКмикрочипированию выполнены в ЗАО «Геноаналитика» (Москва). Статистическая и
биоинформационная обработка полученных данных по экспрессии генов проводилась нами с
использованием платформы GeneXplain (GeneXplain GmbH, Германия).
Полученные данные по уровням экспрессии были нормализованы с использованием
стандартных протоколов. С помощью гипергеометрического анализа были рассчитаны
относительные изменения уровней экспрессии генов в опыте по сравнению с контролем при
p≤0,001 (p –порог достоверности изменений). Для дальнейшего функционального анализа были
отобраны гены, уровень экспрессии которых изменялся под действием солоксолон метила в 2
раза и более по сравнению с контролем. В результате было выявлено 269 дифференциально
экспрессирующихся гена (далее ДЭГ): для 229 генов наблюдалось повышение уровня
экспрессии, а для 40 генов – снижение экспрессии (Рис. 20).
Как видно из Рис. 20, в течение первых двух часов действие солоксолон метила мало
меняет паттерн экспрессии генов в клетках – количество реагирующих генов за данный
промежуток времени составило 4: уровень экспресии гена Hmox1 повысился и произошло
подавление экспрессии трех генов, представленных в Табл. 5. Заметные изменения
102
транскриптома начинают наблюдаться к 3 ч инкубации с СМ, когда происходит значительное
возрастание количества ДЭГ. Необходимо отметить, что под действием солоксолон метила
преимущественно происходит повышение уровней экспрессии генов, а значительное
количество ингибируемых генов (34 гена) было выявлено лишь после 10 ч инкубации клеток с
солоксолон метилом, а в промежутке от 1 до 6 ч инкубации количество ДЭГ, снизивших
уровень экспрессии, составило 6 (Табл. 6).
Рис. 20. Количество дифференциально экспрессирующихся генов в клетках КВ-3-1 в зависимости
от времени инкубации клеток в присутствии 1 мкМ солоксолон метила (p≤0,001). Черные столбцы
– количество генов, увеличивших уровень экспрессии в ≥2 раза по сравнению с контролем. Серые
столбцы – количество генов, уровень экспрессии которых снизился в ≥2 раза по сравнению с
контролем.
3.3.1 Функциональный анализ выявленных ДЭГ
Для выявления внутриклеточных процессов, запускаемых под действием солоксолон
метила, была проведена функциональная аннотация ДЭГ в базе данных Gene Ontology по
словарю «Биологические процессы», и был определен список наиболее перепредставленных
терминов генных онтологий для анализируемых временных точек (Рис. 21, Рис. 22). Вследствие
отсутствия или небольшого количества как генов, активированных в точках 1 и 2 ч, так и
ингибируемых генов в точках 1, 2, 3, 4 и 6 ч, (Рис. 20) обогащение терминами генных онтологий
данных групп ДЭГ давало недостоверные результаты (p>0.05). Поэтому функциональный
анализ данных групп генов проводили вручную по базе данных GeneCards (Институт им.
Вейцмана, Израиль, www.genecards.org) и по литературным данным.
103
Таблица 6. Гены, характеризующиеся значительным снижением уровня экспрессии под
действием солоксолон метила. Данные приведены для 1, 2, 3, 4 ч инкубации клеток КВ-3-1
в присутствии СМ (1 мкМ).
Ген
Название гена
pзначение
Функция*
191
Кратность
подавления
экспрессии
1 час
2,2
6×10-5
Синтез аденозина, метионина
и цистеина
Биосинтез
коллагена,
организация внеклеточного
матрикса
Участник преинициаторного
комплекса РНК полимеразы
II
Entrez
ID
Ahcy
Adenosylhomocysteinase
Crtap
Cartilage associated protein
10491
2,3
4×10-5
Taf15
TAF15 RNA Polymerase
II, TATA Box Binding
Protein (TBP)-Associated
Factor, 68kDa
8148
3,0
2×10-5
Taf15
TAF15 RNA Polymerase
II, TATA Box Binding
Protein (TBP)-Associated
Factor, 68kDa
8148
2 часа
2,6
2×10-5
Участник преинициаторного
комплекса РНК полимеразы
II
Ahcy
Adenosylhomocysteinase
191
3 часа
2,1
2×10-5
Cxcr4
Chemokine (C-X-C motif)
receptor 4
7852
2,0
4×10-5
Синтез аденозина, метионина
и цистеина
Инвазия и миграция клеток
App
Amyloid beta (A4)
precursor protein
351
4 часа
2,0
6×10-5
Golim4
Golgi integral membrane
protein 4
TAF15 RNA Polymerase
II, TATA Box Binding
Protein (TBP)-Associated
Factor, 68kDa
27333
2,0
9×10-5
8148
3,0
2×10-5
Taf15
Предшественник β-амилоида,
провоцирующего
болезнь
Альцгеймера
Транспорт белков из ранних
эндосом в аппарат Гольджи
Участник преинициаторного
комплекса РНК полимеразы
II
Примечание: * Функции белков, кодируемых указанными генами, определены на основе
информации, представленной в базе данных GeneCards, и по литературным данным
3.3.1.1 Функциональный анализ генов, дифференциально ингибированных под
действием солоксолон метила
Результаты анализа генов, чей уровень экспрессии значительно снижался на ранних
этапах воздействия солоксолон метила на клетки КВ-3-1 (1-4 ч), приведены в Табл. 5.
Оказалось, что СМ приводит к значительному подавлению экспрессии гена Taf15, белковый
продукт которого является одной из субъединиц транскрипционного фактора TFIID,
участвующего в формировании преинициаторного комплекса РНК полимеразы II [354], что,
возможно, влияет на регуляцию транскрипции. Кроме того оказалось, что солоксолон метил
ингибирует экспрессию генов, кодирующих белки клеточного метаболизма (Ahcy, Crtap),
внутриклеточного транспорта белков (Golim4) и гена Cxcr4, который кодирует хемокиновый
104
рецептор CXCR4, способствующий усилению пролиферации опухолевых клеток, их инвазии,
миграции и резистентности к цитотоксическим препаратам [355].
На рис. 21 представлены результаты обогащения терминами генных онтологий (GO)
генов,
ингибированных
под
действием
солоксолон
метила
в
точке
10
ч.
Гены,
характеризующиеся сниженной экспрессией, группируются в следующие термины GO:
организация органелл и цитоскелета (Capzb, Dag1, Ltprel4, Nefh, Rhou, Tubg1), клеточный цикл
(E2f2, Leprel4, Rhou, Skp2, Tubg1), процесс катаболизма нуклеотидов (Acly, Dctpp1, Pde8b, Rhou,
Tubg1), процессы биосинтеза ацил-КоА (Acly, Fasn) и липидов (Acly, Fasn, Ptges, Scarb1,
Srebf1).
Процесс биосинтеза ацил-КоА
Процесс катаболизма нуклеотидов
Клеточный цикл
Процесс биосинтеза липидов
Организация цитоскелета
Организация органелл
0
1
2
3
4
5
6
7
Количество генов
Рис. 21. Значимые термины генных онтологий, объединяющие гены, экспрессия которых подавляется
при инкубации клеток КВ-3-1 в присутствии солоксолон метила в течение 10 ч (p<0.05).
Для более детального анализа генов, для которых выявлено ингибирование в точке 10 ч,
был определен список из 10 генов (Топ-10), чья экспрессия была подавлена в наибольшей
степени в результате действия солоксолон метила (Табл. 7). Мы предполагаем, что белковые
продукты именно этих генов определяют пролиферацию опухолевых клеток, а их подавление –
антипролиферативный эффект СМ. Из Табл. 7 видно, что наиболее чувствительным к действию
солоксолон метила оказался ген Clec2d, уровень экспрессии которого снижается в 2,7 раз по
сравнению с контролем. Ген Clec2d кодирует белок LLT1, являющийся лигандом для рецептора
CD161 натуральных киллеров (НК), взаимодействие которых приводит к подавлению
цитотоксической активности НК в отношении опухолевых клеток [356]. Данный факт,
возможно, свидетельствует о способности солоксолон метила снижать иммуносупрессивные
свойства опухолей. Высоким уровнем подавления экспрессии также характеризовались гены
Srebf1, Fasn, Capzb и Pde8b, входящие в Генные онтологии (Рис. 21), связанные с биосинтезом
ацетил-КоА и липидов, организацией цитоскелета и катаболизмом нуклеотидов. Помимо этого
наблюдалось значительное снижение экспрессии генов, кодирующих антиапоптотические
белки (Bri3b, Cxcc5, Card10), регулятор ответа клетки на стресс ЭПР (Dnajb1), факторы
105
сплайсинга
(hnRNPm,
snRNP70),
фактор
инициации
трансляции
(Eif4g1),
главную
каталитическую субъединицу сукцинат-убихинон оксидоредуктазы (комплекса II цепи
переноса электронов) (Sdha) и аминокислотный транспортер (Slc38a5).
Таблица 7. Топ-10 наиболее репрессированных генов в клетках КВ-3-1, инкубированных
в течение 10 ч в присутствии солоксолон метила в концентрации 1 мкМ.
Ген
Название гена
Entrez
ID
Fasn
C-type lectin domain family 2,
member D
Sterol
regulatory
element
binding transcription factor 1
BRI3 binding protein
DnaJ
(Hsp40)
homolog,
member 1, subfamily B
5'-nucleotidase
domain
containing 2
Fatty acid synthase
Tagln2
Cxxc5
Transgelin 2
CXXC finger protein 5
Capzb
Capping
Protein
(Actin
Filament) Muscle Z-Line, Beta
Phosphodiesterase 8B
Clec2d
Srebf1
Bri3bp
Dnajb1
Nt5dc2
Pde8b
pзначение
Функция*
29121
Кратность
подавления
экспрессии
2,7
3×10-8
6720
2,4
1×10-7
140707
3337
2,4
2,4
3×10-7
3×10-7
Иммуносупрессивная
активность
Транскрипционный фактор,
гомеостаз липидов
Негативный регулятор p53
Стресс ЭПР
64943
2,4
3×10-7
Не известна
2194
2,4
3×10-7
8407
51523
2,4
2,4
4×10-7
3×10-7
832
2,3
6×10-7
Синтез жирных кислот из
ацетил-КоА, малонил-КоА
и НАДФ·Н
Не известна
Положительный регулятор
NF-kB сигнального пути
Регуляция цитоскелета
8622
2,3
4×10-7
Гидролиз цАМФ
Примечание: * Функции белков, кодируемых указанными генами, определены на основе
информации, представленной в базе данных GeneCards, и по литературным данным.
Таким образом, функциональный анализ ДЭГ, уровень экспрессии которых достоверно
снизился при действии солоксолон метила, показал, что исследуемое соединение влияет на
широкий
ряд
внутриклеточных
процессов,
включающих
транскрипцию,
сплайсинг,
трансляцию, внутриклеточный транспорт белков, регуляцию цитоскелета, гомеостаз жирных
кислот, липидов и нуклеотидов, регуляцию клеточного цикла, процессы энергетического
обмена в клетке, что, предположительно, вносит значительный вклад в антипролиферативное
действие СМ в отношении опухолевых клеток.
3.3.1.2 Функциональный анализ генов, дифференциально активированных под
действием солоксолон метила
Значимое повышение экспрессии генов при действии солоксолон метила было отмечено,
начиная с 2 ч инкубации (Рис. 20). Мы показали, что инкубация клеток КВ-3-1 в присутствии
солоксолон метила в течение 2 ч приводит к активации лишь одного гена Hmox1, кодирующего
гемоксигеназу-1 – стресс-индуцируемый фермент, обладающий сильными цитопротекторными,
в том числе и антиапоптотическими, свойствами. Данный белок адаптирует клетки к различным
106
стрессорным воздействиям, включающим окислительный стресс, тепловой шок, гипоксию,
ультрафиолетовое излучение и прочее [357]. Гемоксигеназа-1 часто гиперэкспрессирована в
опухолевых клетках различного гистогенеза и способствует усилению их выживаемости,
пролиферации, метастазированию и ангиогенезу [358]. В большом числе работ было показано,
что воздействие химиопрепаратов на опухолевые клетки способствует дальнейшему усилению
экспрессии данного белка, адаптирующего клетки к новым стрессовым условиям – данный
эффект был отмечен, например, при действии цисплатина
[359], доксорубицина [360],
гемцитабина [361], цитарабина и даунорубицина [362]. Согласно литературным данным,
воздействие на опухолевые клетки тритерпеноидов на примере УК [363], CDDO и CDDO-Im
[364] также вызывало гиперэкспрессию гемоксигеназы-1.
Результаты обогащения терминами генных онтологий дифференциально активированных
генов, выявленных при инкубации клеток КВ-3-1 в присутствии солоксолон метила в течение 3,
4, 6 и 10 ч, представлены на Рис. 22. Как видно из представленных данных, наибольшее
обогащение наблюдалось по генам, ассоциированным с клеточным ответом на стресс (Ddit3,
Dnajb9, Etv5, Herpud1, Hmox1, Hyou1, Igfbp1, Nupr1, Trib3, Vimp и др.) и регуляцией
апоптотического процесса (Anxa1, Adm, Bex2, Cdkn1a, Ddit3, Dnajb9, Ifit2, Ifit3, Igfbp3, Phlda1 и
др.), что свидетельствует о способности исследуемого соединения оказывать стрессорное
воздействие на опухолевые клетки, приводящее впоследствии к запуску их апоптотической
гибели. Данный факт согласуется с наличием у солоксолон метила проапоптотической
Рис. 22. Значимые термины генных онтологий, объединяющие гены, экспрессия которых
повышается при инкубации клеток КВ-3-1 в присутствии солоксолон метила в течение
ч,
- 6 ч,
- 10 ч (p < 0.05)
- 3 ч,
-4
107
активности, установленной нами ранее (см. раздел 3.2). Кроме того, под действием СМ на
высоком уровне экспрессируются гены, связанные с ответом клетки на неправильно свернутые
белки и вызываемый данными белками стресс ЭПР (Asns, Atf4, Ddit3, Dnajb9, Edem1, Herpud 1,
Hyou1, Ppp1r15a, Trib3, Xbp1 и др.). Известно, что в случае накопления в просвете ЭПР
большого количества белков с некорректной третичной и четвертичной структурами может
происходить гибель клеток по пути апоптоза [365]. Таким образом, стресс ЭПР может играть
важную роль в реализации проапоптотической активности солоксолон метила, как это было
отмечено ранее для ряда других тритерпеноидов – УК [366], ГЛЗК [86] и бардоксолон метила
[234].
Одной из причин нарушения правильной укладки белка и последующего запуска стресса
ЭПР, является окислительный стресс [367]. Функциональный анализ ДЭГ выявил высокое
обогащение по генам, связанным с ответом клетки на вышеуказанный процесс (Anxa1, Ddit3,
Fos, Gclc, Gclm, Hmox1, Idh1, Klf2, Lcn2, Slc7a11 и др.) (Рис. 22), что согласуется c
полученными ранее в Лаборатории биохимии нуклеиновых кислот данными по способности
солоксолон метила вызывать в опухолевых клетках синтез АФК [368]. Кроме этого, была
отмечена высокая экспрессия генов, ассоциированных с термином генных онтологий «Ответ на
стимул «Повреждение ДНК» (Bcat1, Cdc14b, Cdkn1a, Ddit3, Eid3, Gadd45a, Hmox1, Ier3, Ifi16,
Ikbkg и др.), что также может косвенно свидетельствовать о способности солоксолон метила
вызывать окислительный стресс, так как известно, что АФК являются одним из важных
источников повреждения клеточных макромолекул, в том числе ДНК [369].
Проведенный функциональный анализ выявил также обогащение по генам, вовлеченным
в процесс регуляции клеточного цикла (Anxa, Asns, Bcat1, Bex2, Cdc14b, Cdkn1a, Ctgf, Gadd45a,
Ier3, Irf1 и др.). В частности, показано, что солоксолон метил приводит к повышению
экспрессии генов Cdc14b, кодирующего регулятор G2/M контрольной точки клеточного цикла
[370], и Cdkn1a, белковый продукт которого способен приводить к остановке клеточного цикла
на фазах G1 и G2 [371], что согласуется со способностью исследуемого соединения вызывать
остановку клеточного цикла в фазе G2/M, отмеченную нами ранее (см. раздел 3.2.3).
На следующем этапе исследования выявленные ДЭГ ранжировали по уровню изменения
экспрессии и выявляли наиболее активированные при действии солоксолон метила гены,
которые, как мы предполагаем, являются определяющими в реализации антипролиферативной
активности СМ в отношении опухолевых клеток (Табл. 8). В точках 3 и 4 ч было выделено по
10 генов, характеризующихся наиболее высокими уровнями экспрессии, а в точках 6 и 10 ч,
ввиду большого количества выявленных ДЭГ и высокого уровня их экспрессии, было
проанализировано по 20 наиболее активированных генов. Как видно из Табл. 8, при
трехчасовой инкубации клеток КВ-3-1 в присутствии солоксолон метила наиболее
108
представленными транскриптами оказались мРНК генов, кодирующих регуляторы цитоскелета
(Shroom4, Tmem17, Sema3e), экзонуклеазу 5, принимающую участие в репарации ДНК (Dem1),
белков, регулирующих активацию MAPK сигнальных путей (Gripap1, Dusp19) и белковых
факторов, приводящих как к ослаблению (Eid2b), так и усилению (Creb1) пролиферации клеток.
С увеличением времени инкубации опухолевых клеток в присутствии солоксолон метила,
в списке наиболее представленных транскриптов (Табл. 8) возрастает доля проапоптотических
генов (Atf3, Cdf15, Ddit3, Errfi1, Osgin1, Phla1, Trib3). Одновременно с этим наблюдается
увеличение количества генов, кодирующих антиапоптотические белки (Asns, Bex2, Ctgf, Dnajb9,
Etv5, F3, Hmox1, Id2, Nupr1, Pck2, Ptgs2, Stc2), что может быть обусловлено запуском в
опухолевых клетках механизмов гомеостаза, адаптирующих данные клетки к цитотоксическому
действию солоксолон метила. Ранее в литературе уже встречались упоминания об индукции в
опухолевых клетках под действием тритерпенов экспрессии антиапоптотических генов –
например, в работе [372] на модели клеток опухоли молочной железы MCF-7 было показано,
что тритерпеновые сапонины корня женьшеня гинсенозиды E2, Rb1 и F1 помимо активации
проапоптотических генов, вызывали усилению экспрессии цитопротективных генов Asns и
Pck2, а в работах [211, 214] на модели клеток опухоли прямой кишки HT-29 и предстательной
железы DU145 было показано, что УК, запуская апоптоз данных клеток, усиливала также
экспрессию белка COX-2, кодируемого геном Ptgs2, который участвовал в формировании
резистентности злокачественных клеток к апоптотической гибели. Однако наблюдаемая
адаптационная реакция опухолевых клеток на действие солоксолон метила впоследствии не
справляется со стрессорной нагрузкой, и в клетках запускается механизм гибели по пути
апоптоза (см. раздел 3.2).
В результате анализа обогащения активированных ДЭГ по терминам генных онтологий
(Рис. 22) и их ранжирования по уровню экспрессии (Табл. 8) было обнаружено, что, начиная с 4
ч инкубации, наблюдается активация генов, ассоциированных с ответом клетки на стресс ЭПР –
в данной временной точке в список наиболее представленных транскриптов (Табл. 7) вошло 3
таких гена (Atf3, Ddit3, Herpud1). Увеличение времени инкубации приводило к увеличению как
количества генов, связанных со стрессом ЭПР (Asns, Dnajb9, Fam129a, Nupr1, Pck2, Phlda1,
Trib3), так и к увеличению уровня их экспрессии (Табл. 8).
Результаты функционального анализа подтверждают предположение о том, что
солоксолон метил вызывает множественные преобразования в регуляторном аппарате клеток.
Действие исследуемого соединения в отношении опухолевых клеток сопровождается
количественными изменениями мРНК генов, задействованных в самых разнообразных
клеточных процессах, среди которых наиболее значимыми являются регуляция апоптоза, стресс
ЭПР, окислительный стресс и защитные механизмы, адаптирующие клетки к стрессовым
109
условиям, вызванным действием солоксолон метила. На основе полученных данных можно
также предположить, что эффект солоксолон метила на опухолевые клетки, возможно,
опосредован действием данного соединения на МАР киназный сигнальный каскад и Akt/NF-kB
сигнальную ось – внутриклеточные сигнальные пути, воздействие на которые было отмечено
ранее в литературе для большого ряда природных тритерпеноидов и их синтетических аналогов
(см. раздел 1.4.1).
Таблица 8. Наиболее активированные гены в клетках КВ-3-1, инкубированных в присутствии
солоксолон метила в течение 3, 4, 6 и 10 ч.
Ген
Название гена
Entrez
ID
р-значение
Функция*
126272
Кратность
увеличения
экспрессии
3 часа
2,7
Eid2b
EP300 interacting inhibitor
of differentiation 2B
2×10-5
154791
2,6
4×10-5
1385
2,5
9×10-5
Shroom4
Gripap1
Chromosome
7
open
reading frame 55
cAMP responsive element
binding protein 1
Shroom family member 4
GRIP1 associated protein 1
Ингибирование EP300 гистон
ацетилтрансферазной
активности, репрессия TGFбета/Smad3 сигнального пути
– подавление пролиферации
клеток
Не известна
C7orf55
57477
56850
2,4
2,4
1×10-4
1×10-4
Tmem17
Transmembrane protein 17
200728
2,4
1×10-4
Sema3e
9723
2,4
3×10-4
Znf549
Sema
Domain,
Immunoglobulin
Domain
(Ig), Short Basic Domain,
Secreted, (Semaphorin) 3E
Zinc finger protein 549
256051
2,3
3×10-4
Dem1
Exonuclease 5
64789
2,3
3×10-4
Dusp19
Dual specificity phosphatase
19
142679
2,3
3×10-4
Hmox1
Heme oxygenase 1
3162
4 часа
6,4
2×10-5
Igfbp1
Insulin-like growth factor
binding protein 1
3484
3,6
9×10-5
Gdf15
Growth
factor 15
Activating
factor 3
differentiation
9518
2,9
1×10-4
transcription
467
2,8
2×10-4
1649
2,7
2×10-4
Creb1
Atf3
Ddit3
DNA-damage-inducible
transcript 3
Транскрипционный фактор,
пролиферация клеток
Регуляция цитоскелета
Активация JNK сигнального
пути
Регуляция
цилиогенеза
(процесса
образования
ресничек и жгутиков)
Регуляция цитоскелета
Регуляция
транскрипции
(возможно)
Репарация
ДНК,
гомологичная рекомбинация
Регуляция
MAPK
сигнального пути
Усиление пролиферации и
выживания клеток
Усиление/подавление
пролиферации
клеток,
вызванной IGF
Апоптоз
Стресс-индуцируемый
транскрипционный фактор,
апоптоз
Ответ на стресс ЭПР, апоптоз
Таблица 8. Продолжение
110
Ген
Название гена
Entrez
ID
р-значение
Функция*
9709
Кратность
увеличения
экспрессии
2,5
Herpud1
Endoplasmic
reticulum
stress-inducible,
homocysteine-inducible,
ubiquitin-like
domain
member 1
2×10-4
Компонент
ЭПРассоциированной
деградационной
системы,
выполняющей
убиквитинзависимую
деградацию
неправильно
свернутых
белков в просвете ЭПР
Osgin1
Oxidative stress induced
growth inhibitor 1
FBJ murine osteosarcoma
viral oncogene homolog
29948
2,3
3×10-4
Апоптоз
2353
2,3
3×10-4
Jun proto-oncogene
3725
2,3
4×10-4
Dusp5
Dual specificity phosphatase
5
1847
2,2
6×10-4
Субъединица
транскрипционного фактора
AP-1, пролиферация клеток,
апоптоз
Субъединица
транскрипционного фактора
AP-1, пролиферация клеток,
апоптоз
Фосфатаза,
ингибирование
протеинкиназ ERK1/2
Hmox1
Heme oxygenase 1
3162
6 часов
7,3
7×10-14
Igfbp1
Insulin-like growth factor
binding protein 1
3484
6,9
5×10-11
Gdf15
Growth
differentiation
factor 15
Ets variant 5
9518
5,1
8×10-10
2119
3,7
2×10-9
DNA-damage-inducible
transcript 3
Tribbles pseudokinase 3
1649
3,7
1×10-10
57761
3,5
1×10-9
Fos
Jun
Etv5
Ddit3
Trib3
Fam129a
Family
with
sequence
similarity 129,member A
116496
3,5
7×10-9
Herpud1
Endoplasmic
reticulum
stress-inducible,
homocysteine-inducible,
ubiquitin-like
domain
member 1
9709
3,2
1×10-9
Osgin1
Oxidative stress induced
growth inhibitor 1
Asparagine
synthetase
(glutamine-hydrolyzing)
29948
3,1
3×10-9
440
3,0
4×10-9
Phosphoenolpyruvate
carboxykinase
2
(mitochondrial)
Nuclear
protein,
transcriptional regulator, 1
5106
3,0
8×10-9
26471
3,0
3×10-8
Asns
Pck2
Nupr1
Усиление пролиферации и
выживания клеток
Усиление/подавление
пролиферации
клеток,
вызванной IGF
Апоптоз
Транскрипционный фактор,
клеточная
пролиферация,
подвижность, инвазия
Ответ на стресс ЭПР, апоптоз
Негативный регулятор NF-kB
и Akt, участвует в Ddit3зависимой клеточной гибели
при стрессе ЭПР
Регуляция фосфорилирования
белков,
участвующих
в
регуляции трансляции, ответ
на стресс ЭПР
Компонент
ЭПРассоциированной
деградационной
системы,
выполняющей
убиквитинзависимую
деградацию
неправильно
свернутых
белков в просвете ЭПР
Апоптоз
Синтез аспарагина, ответ на
стресс ЭПР, выживание и
пролиферация клеток
Глюконеогенез, ответ на
стресс ЭПР, выживание и
пролиферация клеток
Стресс-активируемый белок,
резистентность к апоптозу,
пролиферация клеток
Таблица 8. Продолжение
Ген
Errfi1
ERBB receptor
inhibitor 1
feedback
54206
Кратность
увеличения
экспрессии
2,9
Larp6
La
ribonucleoprotein
domain family, member 6
Connective tissue growth
factor
DnaJ (Hsp40) homolog,
subfamily B, member 9
Coagulation
factor
III
(thromboplastin,tissue
factor)
Stanniocalcin 2
55323
2,9
8×10-8
1490
2,9
6×10-8
4189
2,7
7×10-10
2152
2,6
5×10-10
8614
2,5
5×10-8
Pleckstrin
homology-like
domain, family A, member
1
Prostaglandin-endoperoxide
synthase 2 (prostaglandin
G/H
synthase
and
cyclooxygenase)
22822
2,5
8×10-10
5743
2,5
7×10-9
Биосинтез простагландинов,
усиление адгезии клеток,
резистентность к апоптозу
Igfbp1
Insulin-like growth factor
binding protein 1
3484
10 часов
10,6
1×10-9
Gdf15
Growth
differentiation
factor 15
Heme oxygenase 1
9518
9,8
5×10-9
Усиление/подавление
пролиферации
клеток,
вызванной IGF
Апоптоз
3162
9,3
1×10-8
Family
with
sequence
similarity 129,member A
116496
6,8
6×10-8
Ets variant 5
2119
6,0
1×10-7
La
ribonucleoprotein
domain family, member 6
Nuclear
protein,
transcriptional regulator, 1
55323
5,5
2×10-7
26471
5,4
1×10-7
dominant negative helixloop-helix protein,inhibitor
of DNA binding 2
Glutaredoxin
(thioltransferase)
3398
4,8
3×10-7
2745
4,6
2×10-7
Bex2
Brain expressed X-linked 2
84707
4,6
4×10-7
Asns
Asparagine
synthetase
(glutamine-hydrolyzing)
Cell division cycle 14B
440
4,3
3×10-7
8555
4,2
4×10-7
Trib3
Tribbles pseudokinase 3
57761
4,1
4×10-7
Gfpt1
Glutamine-fructose-6-
2673
4,1
4×10-7
Ctgf
Dnajb9
F3
Stc2
Phlda1
Ptgs2
Hmox1
Fam129a
Etv5
Larp6
Nupr1
Id2
Glrx
Cdc14b
Название гена
111
Entrez
ID
р-значение
Функция*
2×10-7
Ингибитор
каталитической
активность
EGFR,
подавление
пролиферации
клеток
Регуляция синтеза коллагена
I типа
Клеточная адгезия, миграция,
метастазирование
Ответ
на
стресс
ЭПР,
резистентность к апоптозу
Фактор свертывания крови,
пролиферация
эндотелиальных клеток
Пролиферация, миграция и
инвазия клеток
Ответ на стресс ЭПР, апоптоз
Усиление пролиферации и
выживания клеток
Регуляция фосфорилирования
белков,
участвующих
в
регуляции трансляции, ответ
на стресс ЭПР
Транскрипционный фактор,
клеточная
пролиферация,
подвижность, инвазия
Регуляция синтеза коллагена
I типа
Стресс-активируемый белок,
резистентность к апоптозу,
пролиферация клеток
Пролиферация клеток
Антиоксидантная
защита,
контроль
статуса
Sглутатиона
Пролиферация
клеток,
резистентность к апоптозу
Синтез аспарагина, ответ на
стресс ЭПР
Регулятор G2/M контрольной
точки клеточного цикла
Негативный регулятор NF-kB
и Akt, участвует в Ddit3зависимой клеточной гибели
при стрессе ЭПР
Гексозаминовый путь
Таблица 8. Продолжение
Ген
Название гена
Herpud1
Dnajb9
Nampt
Ctgf
Ddit3
Cdkn1a
112
phosphate transaminase 1
Endoplasmic
reticulum
stress-inducible,
homocysteine-inducible,
ubiquitin-like
domain
member 1
DnaJ (Hsp40) homolog,
subfamily B, member 9
Nicotinamide
phosphoribosyltransferase
Connective tissue growth
factor
DNA-damage-inducible
transcript 3
Cyclin-Dependent Kinase
Inhibitor 1A (P21, Cip1)
Entrez
ID
Кратность
увеличения
экспрессии
р-значение
Функция*
9709
4,0
4×10-7
4189
4,0
5×10-7
10135
3,9
5×10-7
Компонент
ЭПРассоциированной
деградационной
системы,
выполняющей
убиквитинзависимую
деградацию
неправильно
свернутых
белков в просвете ЭПР
Ответ
на
стресс
ЭПР,
резистентность к апоптозу
Биосинтез NAD
1490
3,8
6×10-7
1649
3,8
8×10-7
Клеточная адгезия, миграция,
метастазирование
Ответ на стресс ЭПР, апоптоз
1026
3,8
7×10-7
Остановка клеточного цикла
Примечание: * Функции белков, кодируемых указанными генами, определены на основе
информации, представленной в базе данных GeneCards, и по литературным данным.
3.3.2 Создание модели молекулярного механизма действия солоксолон метила в
отношении опухолевых клеток на основе данных полнотранскриптомного анализа
Для определения предположительного молекулярного механизма проапоптотического
действия солоксолон метила был проведен подробный анализ ДЭГ, участвующих в регуляции
апоптоза и ответа клетки на стресс ЭПР, результаты которого сведены в схему, представленную
на Рис. 23.
Ранее в Лаборатории биохимии нуклеиновых кислот было показано, что солоксолон
метил способен вызывать усиление синтеза АФК в опухолевых клетках [368] и, тем самым,
приводить к развитию в них окислительного стресса, и индуцировать тем самым стресс ЭПР
[373]. О способности солоксолон метила вызывать стресс ЭПР свидетельствует достоверное
увеличение экспрессии генов (Hspa5, Atf6, Eif2ak3, Ern1, Atf4, Xbp1, Ddit3, Ppp1r15a),
кодирующих основные белковые маркеры данного процесса. Показано, что с увеличением
времени инкубации клеток КВ-3-1 в присутствии исследуемого производного происходит
усиление экспрессии гена Hspa5, кодирующего молекулярный шаперон ЭПР Grp78 (Табл. 9),
способный связываться с неправильно свернутыми белками и восстанавливать их нативную
третичную и четвертичную структуру [374]. Увеличение уровня экспрессии данного гена с
течением времени, вероятно, является реакцией клетки на все повышающееся количество
неправильно
свернутого
белка,
восстановительном дисбалансе.
уровень
которого
возрастает
при
окислительно-
113
В отсутствие стресса ЭПР, шаперон Grp78 находится в связанном состоянии с тремя
трансмембранными белками ЭПР – ATF6, PERK и IRE1α, ингибируя тем самым их активность
[374]. Накопление неправильно свернутых белков в просвете ЭПР приводит к диссоциации
шаперона, в результате чего ATF6 приобретает способность перемещаться в аппарат Гольджи,
где происходит его протеолитическое расщепление до активной формы ATF6f, а PERK и IRE1α
активируются путем олигодимеризации и автофосфорилирования. Интересно, что инкубация
опухолевых клеток в присутствии солоксолон метила приводила к усилению экспрессии генов,
кодирующих данные белки (Atf6, Eif2ak3, Ern1, соответственно) (Табл. 9), что также может
свидетельствовать о прогрессировании стресса ЭПР при действии исследуемого производного.
Впоследствии активированный PERK увеличивает продукцию транскрипционного
фактора ATF4 [374], который, наряду с белком ATF6f, способен повышать уровень экспрессии
гена Xbp1 (в ходе полногеномного анализа было отмечено, что данный ген значительно
активируется при действии солоксолон метила, Табл. 9). Полученная мРНК Xbp1 далее
подвергается сплайсингу под контролем активированного IRE1α [374]. При этом образуется
зрелая мРНК, кодирующая транскрипционный фактор XBP-1, который участвует в реализации
защитных механизмов, адаптирующих клетки к стрессу ЭПР. Под контролем данного фактора
индуцируется экспрессия:

генов, кодирующих молекулярные шапероны ЭПР (Canx, Clgn, Crt, Dnajb9,
Hsp90b1, Hspa5, Hyou1, Pdi, Serpinh1, Uggt [375,376]), восстанавливающие
нативную третичную и четвертичную структуру неправильно свернутых белков;

генов, кодирующих белки комплекса ERAD (Derl2, Dnajc10, Edem1, Herpud1, Hrd1,
Hspa5, Os9, Vcp, Vimp [377]), осуществляющего деградацию неправильно
свернутых белков.
Отметим, что при инкубации клеток КВ-3-1 в присутствии солоксолон метила более 50%
указанных выше генов являлись дифференциально экспрессируемыми (гены шаперонов – Clgn,
Dnajb9, Hsp90b1, Hspa5, Hyou1, гены белков ERAD - Derl2, Edem1, Herpud1, Hrd1, Hspa5, Vimp)
(Табл. 9), что свидетельствует о запуске в опухолевых клетках адаптационных механизмов в
ответ на вызываемый исследуемым производным стресс ЭПР.
Из литературных источников известно, что транскрипционный фактор ATF4, помимо
активации гена Xbp1, в рамках защиты клеток от стрессового воздействия способен усиливать
экспрессию ряда антиоксидантных генов [373]. В ходе полнотраскриптомного анализа было
показано, что солоксолон метил активирует гены Gclcc, Gclcm, Glrx, Hmox1, Idh1, белковые
продукты которых участвуют в антиоксидантном ответе клетки. Возможно, активация
указанных генов является ATF4-зависимой.
116
Рис. 23. Предположительный механизм противоопухолевого действия солоксолон метила in vitro. Жирным шрифтом выделены названия белков,
кодируемых ДЭГ. Нижнее подчеркивание – активируемые под действием солоксолон метила гены, знак «↓» - ингибируемые гены. Схема создана на
основе полученных данных и данных, приведенных в литературе [373, 375-380, 382, 384, 386-400, 402, 406, 407, 408, 409].
115
Таблица 9. Динамика экспрессии генов, белковые продукты которых участвуют в
предполагаемом механизме противоопухолевого действия солоксолон метила in vitro (p<0.001)
Название
гена
Anxa1
Atf3
Atf4
Atf6
Bax
Bri3bp
Card10
Casp4
Cbx4
Cdc14b
Cdkn1a
Clgn
Cxxc5
Derl2
Ddit3
Dnajb9
Dusp5
Dusp6
Edem1
Eif2ak3
Ern1
Gdf15
Gclc
Gclm
Glrx
Herpud1
Hspa5
Hsp90b1
Hyou1
Idh1
Igfbp3
Klf4
Phlda1
Pmaip1
Ppp1r15a
Syvn1
Tnfrsf10b
Trib3
Vimp
Xbp1
Обозначение
на схеме
ANXA
ATF3
ATF4
ATF6
BAX
BRI3BP
CARD10
Каспаза-4
CBX4
CDC14B
p21
CLGN
CXXC5
DERL2
CHOP
DNAJB9
DUSP5
DUSP6
EDEM1
PERK
IRE1α
NAG-1
GCLC
GCLM
GLRX
HERP
Grp78
HSP90B1
HYOU1
IDH1
IGFBP3
KLF4
PHLDA1
NOXA
GADD34
HRD1
DR5
TRIB3
VIMP
XBP1
Entrez
ID
301
467
468
22926
581
140707
29775
837
8535
8555
1026
1047
51523
51009
1649
4189
1847
1848
9695
9451
2081
9518
2729
2730
2745
9709
3309
7184
10525
3417
3486
9314
22822
5366
23645
84447
8795
57761
55829
7494
1ч
-0,41
0,77
0,17
0,11
0,26
0,21
-0,16
0,23
0,21
-0,76
0,09
0,14
-0,49
-0,14
0,73
0,36
0,22
0,02
0,17
-0,07
0,17
0,21
0,18
0,13
-0,25
0,49
0,11
-0,27
0,32
-0,21
0,17
0,24
0,44
0,17
0,56
0,23
0,1
0,1
-0,29
0,24
Log2(Кратность изменения экспрессии)*
2ч
3ч
4ч
6ч
-0,5
-0,48
-0,26
0,48
-0,05
-0,11
1,49
1,11
0,33
0,13
0,51
0,83
0
-0,03
0,19
0,41
0,51
0,82
0,4
0,07
0,26
0,28
-0,14
-0,54
-0,09
-0,26
-0,31
-0,59
0,18
0,17
0,38
0,52
0,13
0,12
1,07
1,08
0,18
-0,46
0,25
0,76
0,05
-0,08
0,78
1,28
-0,11
-0,06
0,01
0,35
-0,3
-0,48
-0,72
-0,97
0,04
-0,18
0,1
0,41
0,42
0,48
1,44
1,87
0,04
0,07
1,14
1,42
0,00
-0,08
1,14
1,18
0,07
-0,03
0,33
0,56
0,30
0,17
0,52
0,41
-0,01
-0,08
0,03
0,19
0,11
0,28
0,23
0,34
0,15
0,05
1,52
2,36
0,18
0,26
0,53
1,02
0,16
0,8
0,59
1,08
-0,23
-0,12
0,16
1,08
0,24
0,18
1,3
1,66
-0,06
0,17
0,67
1,09
-0,49
-0,38
-0,25
0,52
0,22
0,15
0,64
0,8
-0,18
-0,27
-0,03
0,43
0,21
0,09
0,41
0,79
0,22
0,19
0,56
1,03
-0,06
-0,06
1,06
1,32
0,16
-0,06
0,57
1,13
0,13
0,14
1,27
1,2
0,25
0,26
0,7
0,83
0,2
0,18
0,78
0,88
0,37
0,23
1,28
1,8
-0,15
-0,18
0,16
0,62
0,16
-0,02
0,64
0,81
10 ч
1,04
0,97
1,2
0,58
-0,09
-1,28
-1,1
1,09
1,54
2,06
1,92
0,89
-1,24
0,84
1,92
2,01
1,76
1,12
1,02
0,53
0,94
3,29
1,15
1,41
2,2
2,01
1,7
1
1,5
1,02
1,44
1,27
1,64
1,53
1,58
1,47
1,43
2,05
1,33
1,12
Примечание: * красный цвет – активация гена, синий цвет – репрессия гена.
В случае длительного стрессового воздействия, когда в просвете ЭПР накапливается
критическое количество неправильно свернутого белка, с которым не успевают справляться
шапероны и деградационная система ERAD, включается механизм запуска апоптоза клетки
[373]. Из литературных данных известно, что стресс ЭПР может вызывать апоптоз путем
активации проапоптотической каспазы-4 [381] или вследствие усиления экспрессии белка
PHLDA1 [382], являющегося негативным регулятором анти-апоптотической киназы Aurora A
116
[383]. Нами было показано, что экспрессия генов Casp4 и Phlda1, кодирующих данные белки,
оказалась дифференциально повышенной в результате действия исследуемого производного
(Табл. 9). Указанные пути, однако, не являются центральными – одну из главных ролей в
запуске апоптотической гибели при стрессе ЭПР играет транскрипционный фактор CHOP,
кодируемый геном Ddit3. Показано, что данный белок способен индуцировать апоптоз,
усиливая экспрессию проапоптотических генов (Gdf15 [384], Dr5, Trib3, Bim, Puma [373] и др.),
подавляя экспрессию антиапоптотического Bcl-2 [385] и вызывая выход Ca2+ из ЭПР в
цитоплазму [386]. Нами было показано, что инкубация опухолевых клеток в присутствии
солоксолон метила приводила к значительному увеличению экспрессии, как гена Ddit3, так и
CHOP-зависимых генов Dr5, Gdf15, Trib3 (Табл. 9).
Другой центральной молекулой, связывающей стресс ЭПР с запуском апоптоза, является
протеинфосфатаза GADD34, кодируемая геном Ppp1r15a – показано, что данный фермент
вызывает активацию проапоптотического белка p53 и усиливает экспрессию белка p21,
являющегося важным регулятором клеточного цикла [387]. Помимо этого, на уровень
активации p53 также может влиять транскрипционный фактор ATF3, ингибирующий его
убиквитинирование и дальнейшую деградацию [388]. Согласно литературным данным,
указанный транскрипционный фактор регулирует экспрессию генов Ddit3 [384], Gdf15 [389],
Ppp1r15a [390], кодирующих белки CHOP, NAG-1 и GADD34, соответственно, активация
которых под действием солоксолон метила была отмечена нами выше. Индукция экспрессии
генов Ppp1r15a и Atf3, вызываемая исследуемым производным (Табл. 9), возможно,
свидетельствует о его потенциальной способности вызывать активацию проапоптотического
белка p53. В пользу данной гипотезы также говорит повышение в результате действия
солоксолон метила экспрессии гена Cbx4, белковый продукт которого способствует активации
p53 [391], и репрессия гена Bri3bp, кодирующего негативный регулятор данного белка [392], а
также индукция ряда p53-зависимых генов, включающих Anxa1 [393], Bax, Dr5 [394], Cdkn1a
[395], Dusp5, Dusp6 [396], Gdf15 [397], Igfbp3 [398], Klf4 [399] (Табл. 9).
Наблюдаемое увеличение экспрессии генов Anxa1, Noxa и Bax (Табл. 9), вероятно, говорит
о способности СМ активировать митохондриальный путь апоптоза, что согласуется с
описанными выше данными (см. раздел 3.2.2).
В результате проведенного анализа также была обнаружена активация под действием
солоксолон метила генов, белковые продукты которых участвуют в регуляции клеточного
цикла. Показано, что солоксолон метил приводит к усилению экспрессии генов Cdkn1a и
Cdc14b, кодирующих регуляторы G2/M [370] и G1/S, G2/M [371] контрольных точек,
соответственно, что согласуется с отмеченной нами ранее способностью исследуемого
производного вызывать остановку клеточного цикла на фазе G2/M (см. раздел 3.2.3). Кроме
117
того, из литературных источников известно, что KLF4 способен усиливать экспрессию p21 и
подавлять экспрессию циклинов D1, D2, E и B
[400], однако анализ полученных
экспрессионных данных, к сожалению, не выявил репрессии генов, кодирующих указанные
циклины.
Среди проанализированных проапоптотических генов (Табл. 9) одним из наиболее
активированных под действием солоксолон метила оказался ген Gdf15 – уровень его экспрессии
во временных точках 4, 6 и 10 ч возрос по сравнению с контролем в 2,9, 5,1 и 9,8 раз,
соответственно. Согласно литературным данным, белковый продукт данного гена NAG-1
обладает апоптогенными функциями – показано, что гиперэкспрессия данного белка вызывает
апоптоз ряда опухолевых клеток, включающих глиобластому [401], опухоли предстательной
железы [402], желудка [403] и прямой кишки [389, 404]. Повышение экспрессии NAG-1 в
опухолевых клетках под действием тритерпеноидов было отмечено ранее для ГЛК [102] и его
синтетического производного CDODA-Me [142; 143], являющегося структурным аналогом
солоксолон метила. Мы предполагаем, что активация гена Gdf15 под действием исследуемого
производного вносит весомый вклад в его проапоптотическую активность.
Одной из возможных мишеней солоксолон метила является белок IGFBP3, кодируемый
геном Igfbp3, уровень экспрессии которого достоверно повышается под действием
исследуемого соединения в промежутке от 6 до 10 ч (Табл. 9). Известно, что данный белок,
связываясь с рецептором IGFBP3-R, способен индуцировать запуск внутреннего пути апоптоза,
а также образовывать комплексы с инсулин-подобным фактором роста 1 (IGF1), что приводит к
подавлению связывания данного фактора со своим рецептором IGFR1 и последующему
ингибированию активации Akt сигнального пути, вовлеченного в регуляцию клеточной
пролиферации и выживания (см. раздел 1.4.1.1) [405]. В пользу потенциальной способности
солоксолон метила ингибировать Akt сигнальный путь может свидетельствовать также
наблюдаемое усиление экспрессии гена Trib3, белковый продукт которого способен
связываться с киназой Akt [406] и субъединицей p65 NF-kB [407], ингибируя их активацию, и
репрессия генов Card10 и Cxx5, являющихся активаторами NF-kB [408, 409] (Табл. 9).
Наблюдаемое при действии солоксолон метила усиление экспрессии генов Dusp5 и Dusp6
(Табл. 9) может свидетельствовать также о потенциальной возможности исследуемого
производного ингибировать ключевой для выживания и пролиферации клеток ERK1/2
сигнальный путь [258], так как белковые продукты данных генов представляют собой
фосфатазы, обладающие способностью дефосфорилировать протеинкиназы ERK1 и ERK2,
ингибируя тем самым их активность [396].
118
Таким образом, на основе данных полнотранскриптомного анализа экспрессии генов
клеток КВ-3-1, инкубированных в присутствии солоксолон метила, нами была выдвинута
гипотеза о возможном механизме его противоопухолевого действия in vitro, схематично
изображенная на Рис. 23. Предположительно, антипролиферативная и проапоптотическая
активность солоксолон метила основана на его способности:
1) активировать стресс ЭПР;
2) активировать p53 сигнальный путь;
3) индуцировать экспрессию проапоптотических белков NAG-1, IGFBP3, DR5;
4) запускать митохондриальный путь апоптоза в результате усиления экспрессии ANXA
и NOXA;
5) вызывать остановку клеточного цикла в результате индукции экспрессии p21 и
CDC14B;
6) ингибировать Akt и ERK1/2 сигнальные пути, регулирующие клеточное выживание и
пролиферацию.
В настоящее время осуществляется верификация данной гипотезы.
3.4 Увеличение биодоступности солоксолон метила
Известно, что большинство пентациклических тритерпеноидов, представляющих собой
объемные углеводородные молекулы, часто не содержащие в своем составе заряженных или
полярных групп, являются высоко гидрофобными соединениями. Солоксолон метил,
относящийся к указанной группе соединений, не является исключением – показано, что
исследуемое производное обладает низкой степенью растворимости в физиологических средах
и, следовательно, низкой биодоступностью, что делает крайне сложным исследование его
биологической активности на животных моделях. С целью повышения растворимости
солоксолон
метила
липосомальных
нами
были
композиций,
высокодисперсной
аморфной
использованы
содержащих
формы
следующие
исследуемое
солоксолон
подходы
соединение;
метила
с
ПЭГ;
-
(1)
создание
(2)
изготовление
(3)
изготовление
микроэмульсий солоксолон метила с солюбилизаторами.
3.4.1 Создание липосомальных композиций солоксолон метила
В настоящее время одной из актуальных технологий увеличения биодоступности
лекарственных соединений является их инкапсуляция в липосомы – липидные везикулы
сферической формы, состоящие из одного или нескольких фосфолипидных слоев, разделенных
водной фазой. Вследствие того, что основу мембран липосом составляют природные
фосфолипиды, данные везикулы характеризуются отсутствием токсичности и высокой
119
биодеградируемостью и не вызывают иммунный ответ. На сегодняшний момент разработан
целый ряд липосомальных форм лекарственных препаратов, одобренных для применения в
клинической практике или находящихся на стадиях клинических испытаний, большую долю
среди
которых
занимают
липосомы,
нагруженные
противоопухолевыми
препаратами
(доксорубицин, даунорубицин, винкристин, цисплатин и др.) [410].
Липосомальную композицию, содержащую солоксолон метил (СМ), готовили из
исследуемого производного и смеси природных фосфолипидов – фосфатидилхолина из яичного
желтка (яФХ) и фосфатидилинозитола (ФИ) из пекарских дрожжей S. сerevisiae, взятых в
молярном соотношении СМ:яФХ:ФИ = 1:8:1. ФИ был использован с целью стабилизации
получаемых липосом в кровотоке, так как известно, что указанный фосфолипид формирует на
их поверхности высокогидратированную оболочку, препятствующую распознаванию везикул
белками плазмы, их опсонизации и поглощению клетками ретикулоэндотелиальной системы
[411].
Липосомы получали методом выпаривания растворителя из липидной смеси с
образованием липидной пленки, ее последующей лиофилизации и гидратации в ФСБ с
образованием крупных мультиламмелярных (со множеством липидных слоев) липосом.
Полученную липосомальную эмульсию подвергали пяти циклам замораживания (-196°С,
жидкий азот)/оттаивания (40°С), приводящих к формированию крупных моноламмелярных
везикул, размеры которых далее ограничивали и унифицировали путем экструзии через
поликарбонатные мембранные фильтры с диаметром пор 100 нм. Указанный размер пор был
выбран нами на основе литературных данных – известно, что липосомы с диаметром 100-150
нм способны пассивно накапливаться в опухолевых узлах и очагах воспаления вследствие
повышенной проницаемости в них кровеносных капилляров [412]. Степень включения
солоксолон метила в липосомы определяли фотоколориметрически (λmax = 242 нм, ε ~ 21600)
после разрушения приготовленных липосом этанолом.
Было показано, что полученные в результате экструзии липосомы содержали лишь ~50%
от исходной загрузки солоксолон метила, остальная половина исследуемого соединения
адсорбировалась на поверхности поликарбонатной мембраны и не проходила через нее (данные
не приведены). Мы предполагаем, что солоксолон метил, обладая низким сродством к
липидному бислою, формирует в водных растворах крупные конгломераты размером более 100
нм, не способные проходить сквозь используемые фильтры.
На следующем этапе исследования велись попытки увеличения степени включения
солоксолон метила в липосомальные композиции с помощью следующих подходов: (1) путем
снижения
текучести
липидной
мембраны,
вводя
в
состав
липосом
холестерин
(СМ:яФХ:ФИ:Холестерин = 1:7:1:1 (мол.)); (2) путем варьирования длины остатков жирных
120
кислот в липидном бислое, вводя в его состав помимо яФХ и ФИ димиристоил
фосфатидилхолин (ДМФХ), характеризующийся меньшим по сравнению с яФХ размером
жирнокислотной группировки (СМ:яФХ:ФИ:ДМФХ = 1:4:1:4 (мол.)), (3) путем изменения
молярного соотношения солоксолон метила в составе липосом (СМ:яФХ:ФИ = 0,5:8,5:1).
Однако использованные методы не привели к положительным результатам – потери солоксолон
метила на поликарбонатной мембране при экструзии по-прежнему составляли ~50%, что
свидетельствовало о неколичественном включении исследуемого производного в липосомы. В
результате был сделан вывод о целесообразности рассмотрения других подходов увеличения
растворимости солоксолон метила.
3.4.2 Создание высокодисперсной композиции солоксолон метила с ПЭГ
Улучшения растворимости гидрофобных соединений можно добиться путем их
аморфизации – диспергирования и разупорядочения их кристаллических структур, приводящих
к увеличению скорости их растворения. При этом добавление водорастворимого полимерного
носителя может стабилизировать аморфное состояние данных соединений.
С целью увеличения степени растворимости солоксолон метила в воде к.х.н. Огиенко А.
Г. (ИНХ СО РАН, Новосибирск) была разработана высокодисперсная композиция данного
соединения с ПЭГ4000 (далее ПЭГ), получаемая методом сублимационной сушки. В состав
данной композиции был также введен β-глицин (далее Глц), использующийся в качестве
инициатора процесса кристаллизации растворителя. Указанные соединения были отобраны в
весовом
соотношении
СМ:ПЭГ:Глц
=
4:5:1,
растворены
в
трет-бутаноле
и
после
ультразвуковой обработки заморожены при -20°С и лиофилизованы (-20°С, 3 ч, p ниже 17 мм.
рт. ст.). Дифракционные исследования, проведенные Огиенко А. Г., показали, что в полученной
композиции как полимерный носитель (ПЭГ), так и солоксолон метил находились в аморфном
состоянии (неопубликованные данные).
Нами была исследована: (1) цитотоксичность полученной высокодисперсной композиции
солоксолон метила (далее ВКСМ) в отношении опухолевых клеток in vitro и (2) его токсичность
на мышиной модели in vivo.
Цитотоксичность ВКСМ in vitro оценивали по снижению жизнеспособности клеток
эпидермоидной карциномы КВ-3-1 в результате их инкубации в присутствии ВКСМ в
концентрациях 1-10 мкМ (в перерасчете на солоксолон метил) в течение 24 ч с помощью МТТтеста (см. раздел 2.2.3). В качестве композиции-контроля использовали композицию,
содержащую ПЭГ и Глц в весовом соотношении 8,3:1,7, полученную в тех же условиях, что и
ВКСМ. В качестве референсного соединения использовали чистый солоксолон метил,
предварительно растворенный в ДМСО до концентрации 0,01 М. Результаты проведенного
исследования представлены в Табл. 10.
121
Из Табл. 10 видно, что ВКСМ обладает высокой токсичностью в отношении клеток КВ-31, причем ее цитотоксическая активность оказалась сравнимой с активностью соединенияреференса – значение IC50 ВКСМ составило 0,55 мкМ, в то время как значение IC50 солоксолон
метила было несколько выше и составило 0,70 мкМ. При этом композиция, состоящая только из
ПЭГ и Глц оказалась нетоксичной – значение ее IC50 превышало 100 мкМ.
Таблица 10. Цитотоксичность ВКСМ в отношении клеток КВ-3-1
Препарат
IC50, мкМ
ВКСМ
0,55±0,06
СМ
0,70±0,04
ПЭГ+Глц
>100
Примечание: ВКСМ – высокодисперсная композиция солоксолон метила, состоящая из
СМ:ПЭГ:Глц в соотношении 4:5:1 (вес.); СМ – солоксолон метил (референс); ПЭГ+Глц –
композиция-контроль, состоящая из ПЭГ:Глц в соотношении 8,3:1,7 (вес.).
Для
оценки
применимости
разработанной
композиции
солоксолон
метила
в
экспериментах на животных моделях, была исследована острая токсичность ВКСМ in vivo на
мышах линии CBA. ВКСМ растворяли в Opti-MEM в концентрации 0,25 мг/мл и вводили
опытным животным внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно или перорально в дозе 5 мг/кг в
перерасчете на солоксолон метил или 6,25 мг/кг в перерасчете на ПЭГ. Контрольным животным
инъецировали композицию-контроль, содержащую ПЭГ и Глц (8,3:1,7 (вес.)) в дозе 6,25 мг/кг в
перерасчете на ПЭГ. Было показано, что трехкратное введение как композиции-контроля, так и
ВКСМ не вызывало токсического эффекта in vivo – в процессе эксперимента вес животных в
контрольных и опытных группах не снижался. Также было показано отсутствие какого-либо
влияния исследуемой композиции на состав форменных элементов крови (данные не
приведены).
Было обнаружено, что ВКСМ, хорошо растворяется в культуральной среде и Opti-MEM,
но плохо растворима в ФСБ и физиологическом растворе, что вызывает неудобство при работе
на животных моделях. Полученные данные свидетельствуют о необходимости дальнейшей
оптимизации состава ВКСМ.
3.4.3 Создание эмульсий солоксолон метила с солюбилизаторами
Повышения растворимости гидрофобных соединений можно также добиться путем их
включения в состав эмульсий на основе солюбилизаторов. Известно, что солюбилизаторы в
водных растворах могут подвергаться процессу самоорганизации с образованием мицеллярных
форм – частиц размером от 1 до 300 нм, состоящих из гидрофобного ядра и поверхностной
стабилизирующей оболочки. Лекарственные препараты, плохо растворимые в воде, способны
122
проникать в гидрофобное ядро таких частиц, что приводит к значительному увеличению уровня
их водорастворимости.
В качестве солюбилизаторов для приготовлений эмульсий нами были использованы
неионогенные поверхностно-активные вещества Твин-80 (полиоксиэтилен (20) сорбитан
моноолеат) и Кремофор-EL (полиэтоксилированное касторовое масло), нашедшие широкое
применение в фармацевтике, биохимических исследованиях и косметологии.
Микроэмульсию солоксолон метила на основе солюбилизатора Твин-80 готовили методом
выпаривания растворителя. Солоксолон метил растворяли в ДМСО в концентрации 2,5 мг/мл,
после чего к полученному раствору добавляли Твин-80 (10% от конечного объема) с
последующим удалением ДМСО на вакуумном концентраторе Eppendorf Concentrator 5301
(«Eppendorf», Германия). Оставшуюся после выпаривания ДМСО пленку, содержащую
солоксолон метил с Твин-80, растворяли в ФСБ до конечной концентрации 2,5 мг/мл в
перерасчете
на
СМ,
часть
пробирок
обрабатывали
ультразвуком,
часть
оставляли
необработанными.
Микроэмульсию солоксолон метила на основе Кремофор-EL готовили последовательным
смешиванием раствора солоксолон метила (в ДМСО), Кремофор-EL и физиологического
раствора, взятых в объемном соотношении 1:1:8, до конечной концентрации СМ 2,5 мг/мл.
Часть пробирок обрабатывали ультразвуком, часть оставляли необработанными.
В качестве контроля использовались эмульсии, приготовленные аналогичным образом в
отсутствие солоксолон метила.
Полученные эмульсии были проанализированы с помощью просвечивающей электронной
микроскопии (ПЭМ) (работа проведена д.б.н. Рябчиковой Е. И., ИХБФМ СО РАН). На Рис. 24
представлены фотографии ПЭМ, на которых изображены частицы, сформированные Твин-80 в
присутствии или в отсутствие солоксолон метила при ультразвуковом воздействии или без
него.
Как видно из Рис. 24, Твин-80 в комплексе с солоксолон метилом способен формировать
мицеллярные кластеры (Рис. 24А), при ультразвуковой обработке разбивающиеся на отдельные
округлые частицы диаметром 200-300 нм (Рис. 24Б). Солоксолон метил при этом обладает
структурирующими свойствами – контроль, состоящий исключительно из солюбилизатора,
представлял собой бесформенные конгломераты (Рис. 24В), не фрагментирующиеся при
ультразвуковом воздействии (Рис. 24Г).
По данным ПЭМ микроэмульсия солоксолон метила на основе Кремофор-EL
представляла собой крупные скопления вещества, плохо разбиваемые ультразвуком (данные не
приведены).
123
Рис. 24. Фотографии ПЭМ частиц, сформированных солюбилизатором Твин-80. А – частицы
комплекса Твин-80 с солоксолон метилом (без обработки ультразвуком); Б – частицы, полученные
при обработке комплекса Твин-80 с солоксолон метилом ультразвуком; В – бесформенная
частица, образованная Твин-80 в отсутствие солоксолон метила (без обработки ультразвуком); Г –
частицы, образованные Твин-80 в отсутствие солоксолон метила, полученные при обработке
ультразвуком. Негативное контрастирование уранилацетатом. Просвечивающая электронная
микроскопия выполнена д.б.н. Рябчиковой Е. И.
Таким образом, в результате проведенных экспериментов мы показали, что наиболее
оптимальным
способом
увеличения
растворимости
солоксолон
метила
среди
проанализированных подходов является создание его эмульсионной формы на основе Твин-80.
Данная микроэмульсия содержит исследуемое производное в относительно высокой
концентрации, составляющей 2,5 мг/мл, что позволяет вводить солоксолон метил мышам в дозе
до 125 мг/кг (из расчета максимально допустимых объемов введения инъекций лабораторным
животным, согласно [413]). Указанный подход использовался нами впоследствии для
приготовления инъекционных форм солоксолон метила в экспериментах на мышинных моделях
in vivo. Эмульсионная форма исследуемого производного на основе Кремофор-EL, несмотря на
отрицательные характеристики, обнаруженные с помощью ПЭМ, также была использована
нами в экспериментах in vivo, так как ранее в литературе уже встречались упоминания о
применении эмульсий на основе Кремофора EL для внутрибрюшинного и перорального
введения мышам бардоксолон метила [414] и его модифицированной формы CDDO-Im [415],
соответственно.
124
3.5. Спектр биологических активностей солоксолон метила
К настоящему время накоплено большое количество экспериментальных данных,
свидетельствующих о тесной взаимосвязи многих патологических процессов, как на клеточном,
так и на организменном уровне, так как в их регуляции зачастую задействованы общие
сигнальные пути. Ярким примером этому может служить тесная связь между злокачественной
трансформацией клеток и воспалением – показано, что активация воспалительного ответа
может вызывать повреждение ДНК, усиление клеточной пролиферации, ингибирование
апоптоза, стимулирование ангиогенеза, миграции и адгезии клеток, что может приводить к
возникновению опухоли и ее прогрессии [416]. При этом было показано, что важную роль во
взаимосвязи данных процессов играют сигнальные пути MAP киназ [417] и NF-kB [418],
являющиеся внутриклеточными мишенями тритерпеноидов (см. раздел 1.4.1). Кроме этого,
согласно литературным данным, NF-kB и ERK сигнальные пути задействованы в регуляции
размножения вируса гриппа А – показано, что ингибирование данных сигнальных каскадов
приводило к значительному подавлению репродукции вируса гриппа как на клеточных, так и на
мышиных моделях [419]. Ранее в литературе отмечалась способность структурных аналогов
солоксолон метила влиять на активацию MAP киназ и ингибировать Akt/NF-kB сигнальную ось
(см. Табл. 1, раздел 1.4.1), поэтому интересным представлялось изучить спектр биологических
активностей солоксолон метила, включающий противоопухолевую, противовоспалительную и
противовирусную активности.
3.5.1 Противоопухолевая активность солоксолон метила на мышиных моделях
3.5.1.1 Противоопухолевая активность солоксолон метила ex vivo
Исследование противоопухолевой активности солоксолон метила на животных моделях
начали с экспериментов ex vivo, позволяющих оценить чувствительность первичной культуры
опухолевых клеток, пассируемых на мышах, к действию изучаемого соединения и, таким
образом, определить целесообразность его дальнейшего исследования на модели опухолевой
прогрессии in vivo.
В качестве опухолевой модели для эксперимента ex vivo нами была использована
карцинома Кребс-2, перевиваемый штамм которой поддерживался на мышах линии A/Sn.
Клетки карциномы Кребс-2 выделяли из асцитной жидкости мышей-опухоленосителей по
методике, описанной в разделе 2.2.14, после чего инкубировали их в физиологическом растворе
в присутствии солоксолон метила в концентрации 0,5 мг/кг (~ 1 мМ) (опыт) либо в отсутствие
солоксолон метила (контроль) при 37°С в течение 1 ч. Далее проводили трансплантацию
клеточных суспензий в бедренную мышцу правой лапы мышей линии A/Sn для формирования
125
опухолевого узла. Через каждые 2-3 дня измеряли объемы опухолей у мышей из контрольной и
опытной групп.
На Рис. 25 приведена динамика роста карциномы Кребс-2. Из приведенных данных видно,
что указанная опухолевая линия оказалась чувствительной к действию СМ. На 15 сутки после
трансплантации опухоли средний объем опухолевого узла в опытной группе оказался в 9 раз
меньше данного показателя в контрольной группе (p<0,001) (Рис. 25). На 15 сутки мыши
выводились из эксперимента, опухолевые узлы, сформировавшиеся в мышцах, извлекались, и
измерялась их масса. Оказалось, что инкубация клеток карциномы Кребс-2 в присутствии
солоксолон метила в условиях ex vivo приводит к торможению роста опухоли на 88% по
сравнению с контролем.
Таким образом, показано, что карцинома Кребс-2 является чувствительной к действию
солоксолон метила.
***
Рис. 25. Влияние солоксолон метила на карциному Кребс-2 в эксперименте ex vivo
А. Динамика роста опухоли Кребс-2.
– контрольные животные с опухолью, развившейся из
клеток, инкубированных в присутствии физиологического раствора, содержащего 0,1% ДМСО, в
течение 1 ч при 37°С;
- опытные животные с опухолью, развившейся из клеток,
инкубированных в присутствии солоксолон метила в концентрации 0,5 мг/мл, в течение 1 ч при
37°С. Б. Вес опухолевого узла.
- контрольные мыши,
- опытные мыши. *** p<0.001
3.5.1.2 Исследование токсичности солоксолон метила in vivo
Оценку токсичности солоксолон метила проводили на 2-3 месячных мышах линии DD.
Солоксолон метил вводили внутрибрюшинно в суспензии с 10% Твин-80 в дозе 50 мг/кг
ежедневно в течение 9 дней. Контрольные животные получали внутрибрюшинные инъекции
физиологического раствора, содержащего 10% Твин-80. Наблюдение за животными проводили
в течение 10 суток. Токсическое воздействие исследуемого препарата на организм
экспериментальных животных оценивали по снижению веса мышей и их выживаемости. Было
показано, что вес животных в опытной группе в течение всего эксперимента не отличался от
126
веса контрольных животных (данные не приведены). Через 10 суток после первого введения
никто из опытных мышей не погиб.
Таким образом, солоксолон метил в дозе 50 мг/кг в составе суспензии с 10% Твин-80
является нетоксичным для мышей.
3.5.1.3 Исследование противоопухолевой активности солоксолон метила на моделях
опухолевой прогрессии in vivo
3.5.1.3.1 Противоопухолевая активность солоксолон метила на модели карциномы
Кребс-2
Противоопухолевый потенциал солоксолон метила исследовали на модели карцинома
Кребс-2/мыши A/Sn. Солоксолон метил вводился мышам в составе суспензий, содержащих 10%
Твин-80 или 10% Кремофор-EL. Ранее с помощью ПЭМ мы показали, что эмульсия солоксолон
метила в Кремофор-EL плохо разбивается ультразвуком, что свидетельствует о невозможности
ее использования для внутривенного введения, однако это не препятствует введению такой
эмульсии внутрибрюшинно.
Суспензию клеток карциномы Кребс-2 внутрибрюшинно трансплантировали мышам
линии DD для формирования асцитной формы опухоли. Через 24 часа после трансплантации
опухоли мышей-опухоленосителей делили на 5 групп и вводили внутрибрюшинно (1)
физиологический раствор (контроль), (2) 10% раствор Твин-80, (3) 10% раствор Кремофор-EL,
(4) солоксолон метил в 10% растворе Твин-80 в дозе 50 мг/кг или (5) солоксолон метил в 10%
растворе Кремофор-EL в дозе 50 мг/кг.
Препараты вводили ежедневно за исключением выходных в течение 2-х недель (всего 9
инъекций). На 14 сутки мышей выводили из эксперимента и определяли массу асцита и
содержание клеток в асцитной жидкости (Рис. 26). Солоксолон метил значительно подавляет
рост карциномы Кребс-2, причем выбор солюбилизатора практически не влиял на его
активность. В группах мышей, которым вводили солоксолон метил в суспензии с 10% Твин-80
и 10% Кремофор-EL средняя масса асцита составила 2,1±0,9 и 3,7±1,2 г, соответственно, что в
4,1 и 2,4 раза ниже по сравнению с контрольной группой. При этом показано, что сами
солюбилизаторы не влияли на рост опухоли.
3.5.1.3.2
Противоопухолевая
активность
солоксолон
метила
на
модели
гепатоцеллюлярной карциномы HA-1
Перевивку опухоли HA-1 проводили путем внутривенного введения суспензии
опухолевых клеток 22 мышам линии A/Sn. Через 24 часа после перевивки мышейопухоленосителей делили на 2 группы – (1) первая группа была контрольной и получала
внутривенные инъекции 10% Твин-80 в физиологическом растворе, (2) вторая группа получала
127
Рис. 26. Влияние солоксолон метила в растворе с солюбилизаторами на развитие асцитной формы
карциномы Кребс-2. А. Анализ массы асцита. Б. Количество клеток в асцитной жидкости.
Контроль – контрольные мыши, получавшие физиологический раствор; Твин – мыши,
получавшие 10% раствор Твин-80; СМ+Твин – мыши, получавшие солоксолон метил в 10%
растворе Твин-80 в дозе 50 мг/кг; Cremophor - мыши, получавшие 10% раствор Кремофор-EL;
СМ+Cremophor-EL – мыши, получавшие солоксолон метил в 10% растворе Кремофор-EL в дозе
50 мг/кг. * - p<0,05, ** - p<0,01,*** p<0,001
Выживаемость, %
100
80
60
40
20
0
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
Время после трансплантации, сут.
Рис. 27. Влияние солоксолон метила на продолжительность жизни мышей с опухолью HA-1.
- контрольные животные, получавшие инъекции 10% Твин-80,
- опытные животные,
получавшие инъекции солоксолон метила в 10% растворе Твин-80 в дозе 50 мг/кг.
128
внутривенные инъекции солоксолон метила в 10% растворе Твин-80 в дозе 50 мг/кг. Инъекции
проводились ежедневно, всего было сделано 3 инъекции.
На Рис. 27 представлен график выживаемости животных. Из графика видно, что
применение солоксолон метила в начальный период развития опухоли увеличивает
продолжительность жизни мышей с опухолью HA-1. Средняя продолжительность жизни
мышей в контрольной и опытной группах составила 18,9±0,4 и 22,8±1,6 суток, соответственно.
Отметим, что основное количество животных в обеих группах (80% в контроле и 75% в опыте)
погибло на 21 сутки, однако продолжительность жизни оставшихся мышей отличалась – мыши,
получавшие инъекции солоксолон метила, прожили на 9 дней дольше, чем контрольные
животные.
В результате проведенного эксперимента нами было показано, что солоксолон метил на
модели
гепатоцеллюлярной
карциномы
HA-1
характеризуется
значительно
меньшей
эффективностью по сравнению с его действием на карциному Кребс-2. Однако, основываясь на
том, что HA-1 характеризуется высокой злокачественностью и метастазированием во многие
органы, можно говорить о перспективе дальнейшего исследования солоксолон метила в
качестве противоопухолевого агента.
3.5.2 Противовоспалительная активность солоксолон метила
Известно, что злокачественная трансформация тканей зачастую связана с наличием в ней
хронических воспалительных процессов [420], поэтому в настоящее время развиваются новые
стратегии борьбы с онкологическими заболеваниями, заключающиеся в комплексном
воздействии химиопрепаратов не только напрямую на опухолевые клетки, но также и на
опухолевое микроокружение – в частности, на подавление воспалительных процессов,
сопровождающих
опухоль.
Поэтому тритерпеноиды,
обладающие
широким
спектром
биологических активностей, представляют большой интерес в данной области.
В
настоящее
время
накоплено
множество
экспериментальных
данных,
свидетельствующих о наличии у природных тритерпеноидов и их синтетических аналогов
противовоспалительной активности (см. раздел 1.1.2).
3.5.2.1 Исследование противовоспалительного потенциала солоксолон метила in vitro
Противовоспалительную активность солоксолон метила в экспериментах in vitro
оценивали по его способности подавлять синтез провоспалительного медиатора оксида азота
(II) (NO) макрофагальными клетками J-774, активированными липополисахаридом (ЛПС) E.
coli.
129
3.5.2.1.1 Исследование цитотоксичности солоксолон метила в отношении клеток J774
В первую очередь был определен уровень цитотоксичности солоксолон метила в
отношении клеток J-774. Клетки инкубировали в присутствии исследуемого производного в
концентрации от 0,01 до 15 мкМ, в течение 24 ч при 37°С. По окончании инкубации с помощью
МТТ-теста определяли жизнеспособность клеток J-774 и определяли значение IC50 для
солоксолон метила. Нами было показано, что исследуемое производное характеризуется
умеренным уровнем цитотоксичности в отношении клеток J-774 (IC50 = 3,79±0,04 мкМ).
3.5.2.1.2 Влияние солоксолон метила на синтез NO макрофагальными клетками J774, активированными ЛПС
Клетки J-774 одновременно инкубировали в присутствии ЛПС в концентрации 10 мкг/мл
и солоксолон метила в диапазоне концентраций от 0,01 до 1 мкМ в течение 24 часов. После
инкубации надклеточную среду анализировали на наличие NO с помощью набора реагентов
Griess Reagent System («Promega», США) (см. раздел 2.2.15). В качестве препаратов сравнения
использовали высокоактивный структурный аналог солоксолон метила бардоксолон метил,
описаный выше (см. раздел 1.2), и широко используемый в клинической практике
нестероидный
противовоспалительный
препарат
индометацин.
Результаты
данного
эксперимента представлены на рис. 28.
Проведенные исследования показали, что солоксолон метил эффективно подавляет синтез
NO в концентрациях, не являющихся токсичными для используемых клеток J-774 (EC50NO*=
0,4±0,1 мкМ, что на порядок ниже значения IC50 солоксолон метила на клетках J-774). В
концентрации
1
мкМ
исследуемое
производное
снижает
продукцию
данного
провоспалительного медиатора до исходного уровня, характерного для интактных клеток. При
этом активность солоксолон метила оказалась практически в пять раз выше активности
бардоксолон метила (EC50NO = 2,1±0,3 мкМ) и в 64 раза выше активности препарата сравнения
индометацина (EC50NO = 27,0±1,4 мкМ).
3.5.2.2 Исследование антиэкссудативной активности солоксолон метила на модели
острого воспаления in vivo
Для оценки противовоспалительной активности солоксолон метила in vivo была
использована модель острого экссудативного воспаления, вызванного введением под
планарный апоневроз правой задней лапы беспородных мышей 0,1% раствора гистамина
*
EC50NO – эффективная концентрация препарата, приводящая к снижению синтеза NO на 50% по сравнению с
контролем.
130
Концентрация нитрита, мкМ
20
16
12
8
4
0
Солоксолон метил
Бардоксолон метил
Индометацин
Рис. 28. Подавление синтеза NO макрофагальными клетками J-774, активированными ЛПС, под
действием тритерпеновых соединений. Клетки J-774 инкубировали в присутствии 10 мкг/мл ЛПС
и исследуемых препаратов в течение 24 часов. После завершения инкубации концентрацию
нитрита в надклеточной среде определяли с помощью набора реагентов Griess Reagent System
(«Promega», США). ЛПС (+) – положительный контроль, клетки инкубировали в присутствии
ЛПС и в отсутствие соединений. ЛПС (-) – отрицательный контроль, клетки инкубировали в
отсутствие как ЛПС, так и соединений. Представленные данные получены в трех независимых
экспериментах.
(данная работа проведена совместно с сотрудниками ЛФИ НИОХ СО РАН). Солоксолон метил
использовался в данном эксперименте в виде эмульсии с 10% Твин-80 и вводился
внутрижелудочно через зонд в дозе 50 мг/кг за 1 ч до введения гистамина. В качестве
референсного
соединения
был
использован
индометацин
в
дозе
20
мг/кг.
О
противовоспалительной активности судили по уменьшению отека в сравнении с интактной
левой лапой по формуле:
% отека = (1-((Мпр-Мл)контроль – (Мпр-Мл)опыт) / (Мпр-Мл)контроль)×100%,
где Мпр – средний вес правой лапы с отеком, Мл – средний вес левой интактной лапы.
Полученные результаты представлены на Рис. 29.
Показано,
что
солоксолон
метил
обладает
антиэкссудативной
активностью
–
внутрижелудочное введение данного соединения в дозе 50 мг/кг приводило к достоверному
снижению средней величины отека на 74,3% по сравнению с контролем (p<0,05).
Эффективность действия исследуемого тритерпена оказалась сравнимой с эффективностью
индометацина, подавляющего отек в среднем на 55,3% (p<0,05).
131
Таким
активностью
образом,
солоксолон
в отношении
метил,
опухолевых
характеризующийся
клеток,
антипролиферативной
проявляет и противовоспалительную
активность.
Рис. 29. Противовоспалительное действие солоксолон метила in vivo. Модель острого воспаления,
вызванного гистамином. Контроль – контрольные мыши, получавшие внутрижелудочно
физиологический раствор. Индометацин - мыши, получавшие внутрижелудочно индометацин в
дозе 20 мг/кг. СМ – опытные мыши, получавшие внутрижелудочно солоксолон метил в 10%
растворе Твин-80 в дозе 50 мг/кг (Работа выполнена совместно с ЛФИ НИОХ СО РАН). * p<0.05
3.5.3 Противовирусная активность солоксолон метила
Ранее было показано, что ГЛЗК обладает противовирусной активностью в отношении
вируса гриппа А [17, 421]. Солоксолон метил представляет собой производное агликона ГЛЗК –
ГЛК, поэтому интересным представлялось оценить его противовирусный потенциал в
отношении вируса гриппа А. В качестве модельного вируса в экспериментах использовали
вирус гриппа А/WSN/33 (H1N1). Для оценки противогриппозной активности препаратов in vitro
использовали клетки MDCK, MDCK-L9 и A-549, поэтому на первом этапе исследований была
оценена цитотоксичность солоксолон метила в отношении этих линий клеток.
3.5.3.1 Исследование цитотоксичности солоксолон метила в отношении клеток
MDCK, MDCK-L9 и A-549
Клетки MDCK, MDCK-L9 и A-549 инкубировали в присутствии исследуемого
производного, в концентрациях от 0,01 до 10 мкМ, в течение 24 ч при 37°С. По окончании
инкубации с помощью МТТ-теста определяли жизнеспособность данных клеток и определяли
значение IC50 для солоксолон метила (Табл. 11).
132
Таблица 11. Цитотоксичность солоксолон метила в отношении различных клеточных
линий.
Клеточная линия
MDCK
MDCK-L9
A-549
IC50, μM
4,63±0,07
2,75±0,10
2,24±0,12
Примечание: Указанные данные представляют собой среднее значение ± стандартное
отклонение трех независимых экспериментов.
Значения IC50 солоксолон метила для этих линий клеток лежат в пределах 2,2 – 4,6 мкМ. С
помощью оптической микроскопии проводили оценку токсического действия солоксолон
метила в отношении используемых клеток по изменению их морфорлогии, в результате чего
были определены оптимальные рабочие концентрации исследуемого соединения. Оптимальные
концентрации солоксолон метила для клеток MDCK ограничивались промежутком 0,5 – 1,5
мкМ, для клеток MDCK-L9 и A549 – 0,5 – 1 мкМ.
3.5.3.2 Исследование влияния солоксолон метила на цитопатический эффект вируса
гриппа А
Для оценки противовирусной активности солоксолон метила в отношении вируса гриппа
A было исследовано его влияние на цитопатический эффект, вызванный данным вирусом в
культуре клеток MDCK-L9. Данное исследование проводили на приборе RTCA DP Instrument
(xCelligence, ACEA Biosciences Inc., США) по методике, описанной ранее [339]. Указанный
прибор позволяет оценивать жизнеспособность клеток путем измерения электрического
импеданса на микро-электродах, встроенных в дно культурального планшета. Живые клетки
монослойной культуры, прикрепляясь ко дну планшета, выступают в качестве диэлектриков.
Прибор, измеряя значения импеданса, способен оценивать количество прикрепленных ко дну
планшета клеток и фиксировать какие-либо патологические изменения в клеточном монослое.
Клетки MDCK-L9 заражали вирусом гриппа А/WSN/33 (H1N1) при множественности
заражения 0,1 фокусобразующих единиц на клетку (MOI = 0,1 ФОЕ/кл) (см. раздел 2.2.18) и
инкубировали в присутствии солоксолон метила в концентрациях 0,5 и 1 мкМ в течение 47
часов при 37°С в 5% атмосфере CO2. В качестве контроля использовали а) инфицированные
клетки, инкубировавшиеся в отсутствие солоксолон метила, б) незараженные клетки,
инкубировавшиеся в присутствии СМ в тех же концентрациях (Mock), в) интактные клетки.
Измерения импеданса проводили через каждые 10 минут. В результате эксперимента показано,
что солоксолон метил в концентрациях 0,5 и 1 мкМ не проявляет цитотоксичности в отношении
клеток MDCK-L9 (Рис. 30), что сходится с данными, полученными при помощи МТТ-теста.
Цитопатический эффект вируса гриппа А наблюдался, начиная с 30 часов после инфекции
(далее ч.п.и.), и достигал своего максимума к 47 ч.п.и. (в данной точке клеточный индекс
133
снижался в 7,5 раз по сравнению с отрицательным контролем и достигал уровня 1,9 о.е.).
Солоксолон метил эффективно и дозозависимо подавлял цитопатический эффект, вызванный
вирусом гриппа А – к 47 ч.п.и. значения клеточного индекса для зараженных клеток,
инкубированных в присутствии 0,5 мкМ и 1 мкМ солоксолон метила, составляли 7,4 и 10,2 о.е.,
соответственно. Интересно, что кривая клеточного роста у данных опытных групп лежала
достоверно ниже кривых клеточного контроля и Mock (Рис. 30). Возможно, солоксолон метил
оказывает избирательное цитостатическое действие на зараженные клетки, либо способен
снижать эффективность их адгезии ко дну планшета.
Рис. 30. Влияние солоксолон метила на адгезию и пролиферацию клеток MDCK-L9,
инфицированных вирусом гриппа А. В – клетки, инфицированные вирусом гриппа А. В+СМ –
зараженные клетки, инкубированные в присутствии солоксолон метила (0,5 или 1 мкМ). СМ –
клетки Mock, инкубированные в присутствии солоксолон метила (0,5 или 1 мкМ). Интактные
клетки – клетки, инкубированные в отсутствие вируса и солоксолон метила. Клеточный индекс
измеряли с помощью прибора xCelligence RTCA DP instrument.
3.5.3.3 Исследование влияния солоксолон метила на репродукцию вируса гриппа А
Полученные выше данные по противовирусному действию солоксолон метила были
подтверждены в экспериментах по влиянию данного соединения на репродукцию вируса
гриппа А. Солоксолон метил в концентрациях 0,5, 1 и 1,5 мкМ был добавлен к клеткам MDCK
как во время заражения (MOI = 0,01 ФОЕ/кл), так и после удаления вирусного инокулята. В
качестве референсных препаратов были использованы противовирусный препарат широкого
спектра действия рибавирин и глицирризиновая кислота, противогриппозная активность
которой была описана ранее (см. раздел 1.1.1).
Через 24 часа после заражения определяли титр вируса методом подсчета фокусобразующих единиц (ФОЕ) (раздел 2.2.19) (далее методом ФОЕ). Полученные данные
134
приведены на Рис. 31. Видно, что солоксолон метил дозозависимо подавляет размножение
вируса гриппа А – инкубация зараженных клеток в присутствии солоксолон метила приводит к
достоверному снижению титр вируса по сравнению с контролем на 0,5, 1,1 и 2,8 lg для 0,5, 1 и
1,5 мкМ СМ, соответственносоответственно. Рибавирин в концентрации 1 мкМ приводил к
снижению титра вируса лишь на 0,7 lg, а глицирризиновая кислота (1 мМ) не оказывала
влияния на репродукцию вируса гриппа А.
Анализ противовирусного действия солоксолон метила на клетках почки собаки MDCKL9 и карциномы легких человека A549 показал, что эффективность солоксолон метила в
концентрации 1 мкМ не меняется при смене линии клеток – как и в эксперименте с клетками
MDCK, добавление солоксолон метила (1 мкМ) приводило к снижению титра вируса
приблизительно в 10 раз по сравнению с контролем (первичные данные не приведены).
Рис. 31. Влияние солоксолон метила на репродукцию вируса гриппа А in vitro. Клетки MDCK
инфицировали вирусом гриппа А при MOI = 0,01 ФОЕ/кл. Спустя 1 ч после адсорбции вируса при
37°C клетки дважды промывали ФСБ и инкубировали при 37°C в течение 24 ч в свежей среде,
содержащей указанные вещества. Далее в надклеточной среде определяли титр вируса по методу
ФОЕ. Контроль – инфицированные клетки, инкубировавшиеся в отсутствие соединений, ГЛЗК глицирризиновая кислота. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение
трех независимых экспериментов. * p < 0.05, ** p <0.01, *** p < 0.001.
3.5.3.4 Исследование механизма противовирусного действия солоксолон метила
3.5.3.4.1 Исследование вирулицидного действия солоксолон метила в отношении
вируса гриппа А
На первом этапе исследования механизма противовирусного действия солоксолон метила
мы оценили его вирулицидную активность – способность инактивировать вирусные частицы
при прямом воздействия на них. К вирусной суспензии (106 ФОЕ/мл) добавляли равный объем
135
раствора солоксолон метила в концентрации 1 мкМ и инкубировали в течение 1, 2 и 4 часов при
37ºC. Затем определяли титр вируса методом ФОЕ. Оказалось, что солоксолон метил не
проявляет вирулицидной активности – титр вируса не изменялся после инкубации в
присутствии СМ (данные не приведены). Таким образом, способность солоксолон метила
подавлять репродукцию вируса гриппа А не связана с его прямым действием на вирусные
частицы.
На следующем этапе исследования мы определяли, влияет ли солоксолон метил на
активность поверхностных гликопротеинов вируса гриппа А гемагглютинина и нейраминидазы,
отвечающих, соответственно, за прикрепление вирусной частицы к клеточной мембране и
облегчении высвобождения вирусных частиц из инфицированной клетки.
3.5.3.4.2 Исследование влияния солоксолон метила на активность гемагглютинина
вируса гриппа А
Влияние солоксолон метила на активность гемагглютинина вируса гриппа определяли
методом гемагглютинации, основанном на способности вируса связываться с помощью
гемагглютинина с мембраной эритроцитов и вызывать их склеивание (агглютинацию). Для
этого серию двукратных разведений солоксолон метила (0,098 – 100 мкМ) смешивали в
иммунологическом планшете с U-образным дном с равным объемом вирусной суспензии,
содержащей 4 гемагглютинирующие единицы (ГАЕ) вируса гриппа (см. раздел 2.2.22), и
инкубировали в течение 1 ч при 4°С. После чего добавляли в лунки 0,5% раствор эритроцитов
петуха и после инкубации в течение 40 мин при 4°С определяли разведение солоксолон метила,
при котором наблюдалось отсутствие гемагглютинации, вызываемой вирусом гриппа. В
результате проведенного эксперимента мы показали, что солоксолон метил не способен
ингибировать прикрепление вирусных частиц к клеточной поверхности куриных эритроцитов,
так как во всех лунках наблюдались агглютинированные клетки, и, следовательно, не способен
влиять на активность гемагглютинина вируса гриппа А (данные не приведены).
3.5.3.4.3 Исследование влияния солоксолон метила на активность нейраминидазы
вируса гриппа А
Для исследования влияния солоксолон метила на активность нейраминидазы солоксолон
метил в концентрациях от 0,01 нМ до 10 мкМ смешивали с вирусом гриппа (5×105 ФОЕ) и
инкубировали 30 мин при 37°С. Активность нейраминидазы оценивали с помощью
коммерческого набора NA-Fluor™ Influenza Neuraminidase Assay Kit («Applied Biosystems»,
США) по методике, описанной в гл. 2.2.25. Солоксолон метил в использованных концентрациях
не подавлял активность нейраминидазы (данные не приведены).
136
Таким образом, гемагглютинин и нейраминидаза вируса гриппа А (H1N1) не являются
мишенями для солоксолон метила.
3.5.3.4.4 Исследование влияния времени добавления солоксолон метила на титр
вируса
Для более детального изучения противогриппозной активности солоксолон метила, мы
исследовали его противовирусный эффект в зависимости от времени добавления к зараженным
клеткам (эксперимент time-of-addition).
Первый этап исследования проводили по схеме, представленной на Рис. 32А. Клетки
MDCK заражали вирусом гриппа А (MOI = 0,01 ФОЕ/кл), инкубировали в течение 1 ч при 37°С,
промывали ФСБ и добавляли свежую среду. Солоксолон метил добавляли к клеткам в
концентрации 1 мкМ за 5 часов до заражения, во время заражения (вместе с вирусом), сразу
после отмывки от вируса или через 8 часов после инфицирования (Рис. 32А). Через 24 часа
после заражения клеток определяли титры вируса по методу ФОЕ.
Результаты данного эксперимента представлены на Рис. 32В. Видно, что добавление
солоксолон метила к клеткам до и во время инфекции не приводило к снижению титра вируса, в
то время как введение препарата после отмывки от вируса вызывало подавление вирусной
репликации – титр в опыте снизился в 11 раз по сравнению с контролем (Рис. 32В). Отсутствие
активности в случае добавления солоксолон метила через 8 ч после заражения свидетельствует
о том, что данное соединение оказывает свое действие лишь на ранней стадии развития
вирусной инфекции. Солоксолон метил, добавленный на позднем сроке, возможно, не
справляется с увеличившейся вирусной нагрузкой.
Для выявления конкретных этапов репликативного цикла вируса гриппа, чувствительных
к действию солоксолон метила, нами был исследован временной промежуток, ограничивающий
только один цикл репродукции вируса (от 0 до 8 ч п.и.) (Рис. 32Б). Инфицирование вирусом
(MOI = 0.001 ФОЕ/кл) было синхронизовано путем заражения клеток MDCK при 4°С – в
данных условиях возможно лишь связывание вирусных частиц с клеточной мембраной, внутрь
клеток вирусные частицы при данной температуре проникнуть не могут. После инфицирования
клетки отмывали от неприкрепившихся вирусных частиц и помещали в CO2-инкубатор на 37°C,
активируя процесс эндоцитоза вируса в клетки. Зараженные клетки инкубировали в
присутствии солоксолон метила в концентрации 1 мкМ в течение следующих временных
промежутков: 0-2, 2-4, 4-6, 6-8 и 0-8 ч. Через 8 часов после инфекции определяли титр вируса
по методу ФОЕ. Результаты данного эксперимента приведены на Рис. 32Г.
137
Рис. 32. Влияние времени добавления солоксолон метила на его противовирусный эффект. А. Клетки
MDCK инфицировали вирусом гриппа при MOI = 0,01 ФОЕ/кл в течение 1 ч при 37°С. Вирусную
адсорбцию проводили в промежутке -1 – 0 ч. Солоксолон метил в концентрации 1 мкМ добавляли к
клеткам в отмеченных стрелками временных промежутках. Через 24 ч.п.и. определяли титры вируса в
надклеточной жидкости по методу ФОЕ. Б. Клетки MDCK инфицировали вирусом гриппа при MOI =
0,001 ФОЕ/кл в течение 1 ч (-1-0 ч.п.и.) при 4°С. Солоксолон метил в концентрации 1 мкМ добавляли к
клеткам в отмеченных стрелками временных промежутках. После каждого инкубационного периода,
среду, содержащую солоксолон метил, удаляли и клетки инкубировали в свежей среде до временной
точки 8 ч.п.и, после которой определяли титры вируса в надклеточной жидкости методом ФОЕ. В,
Г.Черные столбцы – контроль – клетки MDCK, зараженные вирусом гриппа и инкубировавшиеся в
отсутствие солоксолон метила. Белые столбцы – опыт – клетки MDCK, зараженные вирусом гриппа и
инкубировавшиеся в присутствии солоксолон метила. На графиках представлены средние значения
титра вируса ± стандартное отклонение по результатам 3 независимых экспериментов. *p<0.05, **
p<0.01.
Как видно из рис. 32Г, достоверное ингибирование вирусной репродукции было отмечено
в двух случаях – когда инфицированные клетки инкубировали в присутствии солоксолон
метила в течение всего вирусного цикла (от 0 до 8 ч после инфицирования) и в промежутке от 0
до 2 часов после инфицирования. Временные рамки (0-2 ч.п.и.) соответствуют ранним этапам
жизненного цикла вируса гриппа, включающим проникновение вируса внутрь клеток,
снижение pH внутри эндосом и слияние вирусной оболочки с эндосомальной мембраной [422].
138
В обоих случаях титр в опытной группе снижался приблизительно на один порядок по
сравнению с контролем. Во всех остальных временных промежутках солоксолон метил не
проявлял своей противовирусной активности.
Полученные данные согласуются с результатами первой части экспериментов time-ofaddition (Рис. 32В), где снижение титра вируса было отмечено при введении солоксолон метила
непосредственно после заражения.
Таким образом, показано, что противовирусная активность солоксолон метила основана на
его способности ингибировать ранние стадии жизненного цикла вируса гриппа А.
3.5.3.4.5 Исследование влияния солоксолон метила на связывание вируса гриппа А с
клеточной мембраной
Для исследования эффекта солоксолон метила на самый ранний этап репликативного
цикла вируса гриппа – его связывание с клеточной мембраной - клетки MDCK заражали
вирусом (MOI = 0.01 ФОЕ/кл) в присутствии солоксолон метила в концентрациях 0,75, 1 и 1,5
мкМ на льду в течение 3 ч, позволяя вирусным частицам прикрепиться к клеточной
поверхности без дальнейшего их проникновения внутрь клеток. Неприкрепившиеся вирусные
частицы отмывали ФСБ и зараженные таким образом клетки инкубировали в течение 24 ч при
37°C в атмосфере 5% CO2, после чего определяли титр вируса (Рис. 33).
Рис. 33. Влияние солоксолон метила на связывание вируса гриппа А с клеточной мембраной. Клетки
MDCK предохлаждали при 4°С в течение часа, после чего инфицировали вирусом (MOI = 0,01
ФОЕ/кл), добавляли к ним солоксолон метил в концентрациях 0,75, 1 и 1,5 мкМ и инкубировали при
4°С в течение 3 ч. Далее клетки отмывали ФСБ от вируса и солоксолон метила, добавляли свежую
среду и инкубировали далее при 37°С. Через 24 ч п.и. определяли титры вируса методом ФОЕ.
Контроль – инфицированные клетки MDCK, инкубированные в отсутствие солоксолон метила. Планки
погрешностей представляют собой стандартное отклонение двух независимых экспериментов,
выполненных в трех повторах. * p<0,05
139
Как видно из рис. 33, солоксолон метил в концентрации 0,75 и 1 мкМ не подавлял
связывание вирусных частиц с клеточной поверхностью, что согласуется с описанным выше
отсутствием противовирусного эффекта у солоксолон метила в эксперименте time-of-addition во
временном промежутке (-1)-0 часов. Однако в концентрации 1,5 мкМ данное соединение
оказывает выраженное ингибирующее действие – наблюдается резкое снижение титра вируса в
опыте в 70 раз по сравнению с контролем. Полученные данные свидетельствуют о способности
солоксолон метила в указанной концентрации препятствовать прикреплению вирусных частиц
к клеточной мембране. Следует отметить, что солоксолон метил, как было описано выше, не
способен ингибировать активность гемагглютинина, поэтому наблюдаемый эффект, возможно,
объясняется взаимодействием исследуемого препарата с сиаловыми кислотами, вызывающим
блокировку их связывания с активным центром гемагглютинина.
Полученные данные указывают на то, что солоксолон метил в определенной
концентрации способен подавлять связывание вируса гриппа А с клеточной мембраной, однако
данное свойство СМ не является основным в механизме его противовирусного действия.
3.5.3.4.6 Исследование влияния солоксолон метила на проникновение вируса гриппа
внутрь клеток
На основе полученных данных, мы предположили, что солоксолон метил способен
ингибировать проникновение вируса гриппа А внутрь клеток хозяина. Для проверки данной
гипотезы клетки MDCK заражали вирусом (MOI 0.1) и помещали на лед на 1 ч, позволяя
вирусным частицам прикрепиться к клеточной мембране без дальнейшего их проникновения
внутрь клеток. Неприкрепившиеся вирусные частицы отмывали ФСБ. Солоксолон метил
добавляли в концентрациях 1 и 1,5 мкМ непосредственно перед помещением клеток в CO 2инкубатор на 37°C, запускающим процесс эндоцитоза вируса в клетки. Зараженные таким
образом клетки инкубировали в присутствии СМ в течение 3 часов, после чего не проникшие
внутрь клеток вирусные частицы инактивировали кислым ФСБ. Через 24 часа определяли титр
вируса методом ФОЕ (Рис. 34).
Солоксолон метил в обеих использованных концентрациях значительно подавляет
вирусную инфекцию – происходит падение титра вируса в опыте по сравнению с вирусным
контролем на 83% и 82%, соответственно. Полученные данные доказывают, что солоксолон
метил способен подавлять проникновение вируса внутрь клеток, причем 1,5-кратное
увеличение концентрации СМ не приводило к усилению уровня ингибирования. Механизм
наблюдаемого эффекта, возможно, связан с влиянием исследуемого препарата на текучесть
клеточной мембраны – из литературных данных известно, что глицирризиновая кислота,
являющаяся
исходным
соединением
при
синтезе
солоксолон
метила,
ингибирует
проникновение вируса гриппа А в клетки именно с помощью данного механизма [421].
140
Рис. 34. Влияние солоксолон метила на проникновение вируса гриппа А внутрь клеток. Клетки
MDCK предохлаждали при 4°С в течение 1 ч и заражали вирусом гриппа (MOI = 0,1 ФОЕ/кл) при
4°С в течение 3 ч. Далее к клетками добавляли солоксолон метил в концентрациях 1 и 1,5 мкМ и
инкубировали в течение 1 ч при 37°C, после чего инактивировали непроникшие внутрь клеток
вирусные частицы кислым фосфатно-солевым буфером. К клеткам добавляли свежую среду. Через
24 ч.п.и. определяли титры вируса методом ФОЕ. Контроль – инфицированные клетки MDCK,
инкубированные в отсутствие солоксолон метила. Количество ФОЕ представлено в виде процента
от контроля. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение двух
независимых экспериментов, выполненных в трех повторах.
Таким образом, исследование механизма противовирусного действия солоксолон метила в
отношении вируса гриппа А (H1N1) свидетельствует о том, что солоксолон метил подавляет
ранние этапы вирусного репликационного цикла. Доказано, что СМ способен эффективно
ингибировать: а) проникновение вируса внутрь клеток и б) ранние этапы вирусного
репликативного цикла во временном промежутке 0-2 ч после инфекции. Увеличение
концентрации солоксолон метила до 1,5 мкМ приводит к значительному усилению
противовирусной активности препарата и появлению у него активности, ингибирующей
связывание вируса с клеткой.
3.5.3.5 Исследование противовирусной активности солоксолон метила на модели
гриппозной пневмонии мышей in vivo
Оценку эффективности солоксолон метила в отношении вируса гриппа проводили in vivo
на мышах линии BALB/c, которых интраназально заражали 0,5 ЛД† вируса гриппа. Солоксолон
метил в суспензии с 10% Твин-80 вводился мышам интраназально в дозе 5 мг/кг за 6 часов до
заражения, одновременно с заражением и далее один раз в сутки в течение 4 суток (Рис. 35А).
На 5 сутки мышей выводили из эксперимента, извлекали легкие, определяли в них титры
вируса методом ФОЕ, описанным выше, и проводили гистологические исследования.
†
ЛД50 –доза вируса, приводящая к гибели 50% животных. Значение ЛД 50 для вируса гриппа А/WSN/33 (H1N1)
было определено ранее к.б.н. Гончаровой Е. П. (ИХБФМ СО РАН).
141
Как видно из рис. 35, солоксолон метил оказался эффективным в отношении мышиной
модели гриппозной инфекции – средний титр вируса в гомогенатах легких мышей из
контрольной группы, получавших лишь 10% Твин-80, составлял 44,2 ФОЕ/(мл×г), в то время
как в опытной группе, получавшей солоксолон метил, у четырех мышей из пяти титр в легких
оказался равен нулю.
В
Г
Рис. 35. Влияние введения солоксолон метила на развитие гриппозной пневмонии мышей in
vivo. А. Схема введения препаратов. Стрелками обозначены дни, в которых вводился солоксолон
метил. Б. Титры вируса гриппа А в гомогенатах легких мышей. Горизонтальной планкой отмечен
средний титр вируса в группе. Отличие между контрольной (Твин-80) и опытной (СМ (5 мг/кг))
группами статистически достоверно (*p<0.05). В, Г. Патоморфологические изменения в ткани
легких мышей, инфицированных вирусом гриппа А после шестикратного интраназального
введения Твин-80 (В) или солоксолон метила в суспензии с 10% Твин-80 в дозе 5 мг/кг (Работа
выполнена к.м.н. Сеньковой А. В., ИХБФМ СО РАН).
Гистологический анализ показал, что у животных, зараженных вирусом гриппа А и не
получавших лечение (Рис. 35В), морфологические изменения легочной ткани на 5 сутки после
заражения характеризовались поражениями в виде скопления экссудата и клеточного детрита в
просвете бронхов. Кроме того, наблюдались очаги геморрагического отека и инфильтрации
нейтрофилов. При использовании солоксолон метила поражение ткани легких в результате
гриппозной пневмонии было резко ограничено. В просветах бронхов не отмечалось экссудата и
клеточного детрита. Солоксолон метил приводил к нормализации структуры легочной ткани, в
том числе повышению степени воздушности респираторных отделов.
142
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют об эффективности солоксолон
метила на модели гриппозной пневмонии мышей.
3.5.3.6 Исследование влияния солоксолон метила на синтез ИЛ-6 в клетках,
зараженных вирусом гриппа
Известно, что вирусная инфекция приводит к активации в организме быстрого и
неспецифического механизма защиты – воспалительного процесса. В случае длительной или
избыточной воспалительной реакции возможно развитие серьезных повреждений тканей. В
частности, известно, что воспаление, вызываемое вирусом гриппа А/H5N1 (птичьего гриппа) и
вирусом ТОРС (атипичной пневмонии), характеризующееся нерегулируемым и чрезмерным
выделением провоспалительных цитокинов (цитокиновым штормом), влечет за собой развитие
острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), серьезно угрожающего жизни пациента
[423]. Интерлейкин-6 играет одну из центральных ролей в острой фазе воспаления [424] и
подавление синтеза данного цитокина значительно облегчает ОРДС [423]. Таким образом,
ингибирование синтеза цитокинов при вирусной инфекции является важным аспектом для
противогриппозной терапии.
Выше мы показали способность солоксолон метила снижать воспалительный отек,
вызываемый гистамином (см. раздел 3.5.2.2). Интересным представлялось оценить влияние
солоксолон метила на воспаление, вызванное вирусом гриппа. Для этого клетки A549,
зараженные вирусом (MOI = 0.1 ФОЕ/кл), инкубировали в присутствии соединения в
концентрациях 0,1-1 мкМ. Через 24 ч.п.и. уровень ИЛ-6 в надклеточной среде определяли с
помощью ELISA (см. раздел 2.2.30). Полученные данные представлены на Рис. 36.
Рис. 36. Влияние солоксолон метила на синтез ИЛ-6 клетками A549, зараженными вирусом гриппа
А. Клетки А549 заражали вирусом гриппа А (MOI 0.1) и инкубировали в присутствии солоксолон
метила в концентрациях 0,1, 0,5, 0,75 и 1 мкМ. Через 24 ч.п.и. уровень ИЛ-6 в надклеточной среде
определяли с помощью ELISA. Mock – интактные клетки. Вирус – клетки A549, инфицированные
вирусом гриппа А, инкубированные в отсутствие солоксолон метила. На графиках представлены
средние концентрации ИЛ-6 ± стандартное отклонение по результатам 3 независимых экспериментов.
### p<0.002, *** p<0.001.
143
Уровень ИЛ-6 у mock-инфицированных клеток оказался равным 28,3±0,6 пг/мл, в то время
как вирусная инфекция привела к значительному увеличению синтеза данного цитокина в 9,1
раз (256,5±25,5 пг/мл). Добавление солоксолон метила дозозависимо снижало продукцию ИЛ-6
(EC50 = 1,1±0,1 мкМ), не меняя при этом базальный уровень синтеза данного цитокина
незараженными клетками (данные не приведены).
Таким образом, было показано, что солоксолон метил не только ингибирует репродукцию
вируса гриппа А, но также способен подавлять воспаление, вызванное данным патогеном.
144
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе проведено исследование антипролиферативной активности новых
производных ГЛК. Из 40 исследованных при первичном скрининге соединений 10 проявили
умеренную токсичность (IC50 = 10-50 мкМ) и 8 оказались высокотоксичными (IC50 = 0,1-10
мкМ). На основе результатов, полученных при скрининге, был проведен анализ взаимосвязи
«структура-активность». Показано, что наибольшую токсичность проявляют производные,
содержащие 2-циано-1-ен-3-оновую структуру, среди которых для дальнейших экспериментов
было отобрано соединение метил 2-циано-3,12-диоксо-18βH-олеан-1(2),11(9)-диен-30-оат
(солоксолон метил), уровень цитотоксичности которого был наибольшим (IC 50 = 0,3±0,1 мкМ).
Оказалось, что солоксолон метил (СМ) характеризуется высоким антипролиферативным
эффектом в отношении целого ряда опухолевых клеток различного гистогенеза (IC 50 = 0,3-5,0
мкМ). Полученные в результате скрининга данные представляют собой новый и ценный
материал для дальнейших исследований в области создания высокоактивных производных
природных тритерпеноидов.
Анализ механизма антипролиферативного действия СМ в отношении опухолевых клеток
показал, что СМ индуцирует митохондриальный каспазозависимый апоптоз. Для более
детального анализа внутриклеточных событий, активируемых действием СМ, был проведен
полнотранскриптомный анализ экспрессии генов опухолевых клеток КВ-3-1, инкубированных в
присутствии СМ. В результате было установлено, что СМ вызывает множественные
преобразования в регуляторном аппарате клетки – наблюдается значительное изменение уровня
экспрессии генов, вовлеченных в целый ряд клеточных процессов, среди которых наиболее
значимыми являются регуляция апоптоза, стресс ЭПР и окислительный стресс. Кроме этого
показано, что клетки в ответ на действие СМ запускают адаптационные механизмы,
приспосабливающие их к стрессовым условиям, вызываемым исследуемым производным. На
основе полученных экспрессионных данных и данных, представленных в литературе, была
предложен механизм противоопухолевого действия солкосолон метила in vitro.
Известно,
биологической
что
тритерпеноиды
активности
характеризуются
вследствие
способности
широким
спектром
одновременно
нативной
действовать
на
многочисленные внутриклеточные мишени. В настоящей работе была исследована активность
СМ в отношении опухолевой прогрессии, воспаления и вирусной инфекции – процессов, тесно
взаимосвязанных между собой общими сигнальными путями внутри клеток.
На моделях перевиваемых опухолей in vivo показано, что СМ эффективно подавляет рост
асцитной формы карциномы Кребс-2 и приводит к увеличению средней продолжительности
жизни мышей с высокоагрессивной гепатоцеллюлярной карциномой HA-1. Кроме этого
доказана способность СМ подавлять синтез провоспалительных медиаторов NO и ИЛ-6 in vitro
145
и развитие воспалительного отека in vivo, что свидетельствует о высокой перспективности
исследуемого соединения в качестве противоопухолевого агента, способного воздействовать не
только напрямую на злокачественные клетки, но также подавлять воспалительные процессы,
сопровождающие развитие опухоли.
Впервые для синтетических аналогов природных тритерпеноидов, несущих 2-циано-1-ен3-оновую структуру, на примере СМ была показана противовирусная активность в отношении
вируса гриппа А. In vitro СМ достоверно подавляет развитие вирусной инфекции в культуре
клеток MDCK, причем уровень противовирусной активности СМ оказался более чем на 3
порядка выше активности ГЛЗК – исходного соединения, используемого для синтеза СМ.
Анализ механизма противовирусного действия СМ in vitro показал, что СМ ингибирует
проникновение вируса гриппа в клетки и ранние этапы его жизненного цикла. In vivo СМ
снижает титр вируса гриппа в легких и препятствует развитию гриппозной пневмонии у
инфицированных животных.
К нерешенным пока вопросам относится получение растворимой формы СМ.
Исследования в этом направлении будут продолжены.
Полученные в настоящей работе данные позволяют предложить СМ в качестве
соединения-лидера для проведения доклинических испытаний как противоопухолевого,
противовоспалительного и противогриппозного средства.
146
ВЫВОДЫ
1. Показано, что новые производные ГЛК обладают цитотоксичностью в отношении
опухолевых клеток in vitro. Выявлено соединение-лидер метил 2-циано-3,12-диоксо18βH-олеан-1(2),11(9)-диен-30-оат (солоксолон метил, СМ), обладающий наибольшим
уровнем цитотоксичности в отношении опухолевых клеток различного гистогенеза
(IC50 = 0,3-5 мкМ).
2. Анализ механизма действия СМ на клетки показал, что СМ вызывает остановку
клеточного цикла на фазе G2/M и гибель опухолевых клеток в результате активации
митохондриального каспазозависимого пути апоптоза. Показано, что действие СМ на
опухолевые клетки сопровождается значительной активацией экспрессии генов,
задействованных
в
регуляции
апоптоза,
стресса
ЭПР,
клеточного
цикла,
окислительного стресса и клеточного гомеостаза.
3. Исследование спектра биологической активности СМ показало, что СМ обладает
противоопухолевым, противовоспалительным и противогриппозным действиями.

На модели опухолевой прогрессии in vivo показано, что инъекции СМ в составе
эмульсий на основе Твин-80 и Кремофор EL приводят к подавлению роста
асцитной формы карциномы Кребс-2 на 76% и 57% по сравнению с контролем,
соответственно, и вызывают достоверное снижение количества опухолевых
клеток в асцитной жидкости. Введение эмульсионной формы СМ на основе
Твин-80 приводит к увеличению средней продолжительности жизни мышей с
гепатоцеллюлярной карциномой HA-1 на 21%

На клеточных моделях in vitro показано, что СМ эффективно подавляет синтез
медиаторов воспаления NO (EC50 = 0,4±0,1 мкМ) и ИЛ-6 (EC50 = 1,1±0,1 мкМ).

На модели острого воспаления in vivo показано, что СМ эффективно снижает
отек, вызванный гистамином у мышей, на 74% по сравнению с контролем.

Показано, что СМ обладает противовирусной активностью in vitro в отношении
вируса гриппа А/WSN/33 (H1N1), подавляя его проникновение в клетки и
ранние этапы репликативного цикла вируса.

Показано, что СМ эффективно подавляет развитие постинфекционной
пневмонии, вызванной вирусом гриппа, ингибируя репродукцию вируса и
подавляя вызванное им воспаление.
147
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Newman, D.J., Cragg, G.M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from
1981 to 2010. // J. Nat. Prod. – 2012. – V. 75 – P. 311–35.
2.
Shanmugam, M.K., Dai, X., Kumar, A.P., Tan, B.K., Sethi, G., Bishayee, A. Oleanolic acid and
its synthetic derivatives for the prevention and therapy of cancer: preclinical and clinical
evidence. // Cancer Lett. – 2014. – V. 346 – P. 206-16.
3.
https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00967187
4.
Толстиков, Г.А., Балтина, Л.А., Гранкина, В.П., Кондратенко, Р.М., Толстикова, Т.Г.
Солодка: Биоразнообразие, химия, применение в медицине. Новосибирск: Гео, 2007,
Часть 2-4.
5.
Newman, D.J. Natural Products as Leads to Potential Drugs: An Old Progress or the New Hope
for Drug Discovery. // J. Med. Chem. – 2008. – V. 51. – P. 2589-2599.
6.
Dzubak, P., Hajduch, M., Vydra, D., Hustova, A., Kvasnica, M., Biedermann, D., Markova, L.,
Urban, M., Sarek, J. Pharmacological activities of natural triterpenoids and their therapeutic
implications. // Nat. Prod. Rep. – 2006. – V. 23 – P. 394-411.
7.
Племенков, В.В. Введение в химию природных соединений. Казань, 2001, C. 376.
8.
Hill, R.A., Connolly, J.D. Triterpenoids. // Nat. Prod. Rep. – 2015. – V. 32 – P. 273-327.
9.
Ikeda, T., Yokomizo, K., Okawa, M., Tsuchihashi, R., Kinjo, J., Nohara, T., Uyeda, M. Antiherpes virus type 1 activity of oleanane-type triterpenoids. // Biol. Pharm. Bull. – 2005. – V. 28 –
P. 1779-81.
10.
Pavlova, N.I., Savinova, O.V., Nikolaeva, S.N., Boreko, E.I., Flekhter, O.B. Antiviral activity of
betulin, betulinic and betulonic acids against some enveloped and non-enveloped viruses. //
Fitoterapia. – 2003. – V. 74 – P. 489-92.
11.
Baba, M., Shigeta, S. Antiviral activity of glycyrrhizin against varicella-zoster virus in vitro. //
Antiviral Res. – 1987. – V. 7- P. 99-107.
12.
Lin, J.C. Mechanism of action of glycyrrhizic acid in inhibition of Epstein-Barr virus replication
in vitro. // Antiviral Res. – 2003. – V. 59 – P. 41-47.
13.
Zhao, J., Chen, J., Liu, T., Fang, J., Wan, J., Zhao, J., Li, W., Liu, J., Zhao, X., Chen, S. Antiviral effects of urosolic acid on guinea pig cytomegalovirus in vitro. // J. Huazhong. Univ. Sci.
Technolog. Med. Sci. – 2012 – V. 32 – P. 883-7.
14.
Crance, J.M., Scaramozzino, N., Jouan, A., Garin, D. Interferon, ribavirin, 6-azauridine and
glycyrrhizin: antiviral compounds active against pathogenic flaviviruses. // Antiviral Res. –
2003. – V. 58 – P. 73-9.
15.
Zhao, C.H., Xu, J., Zhang, Y.Q., Zhao, L.X., Feng, B. Inhibition of human enterovirus 71
replication by pentacyclic triterpenes and their novel synthetic derivatives. // Chem. Pharm. Bull.
(Tokyo). – 2014. – V. 62 – P. 764-71.
16.
Cinatl, J., Morgenstern, B., Bauer, G., Chandra, P., Rabenau, H., Doerr, H.W. Glycyrrhizin, an
active component of liquorice roots, and replication of SARS-associated coronavirus. // Lancet. –
2003. – V. 361 – P. 2045-6.
148
17.
Michaelis, M, Geiler, J., Naczk, P., Sithisarn, P., Leutz, A., Doerr, H.W., Cinatl, J. Glycyrrhizin
exerts antioxidative effects in H5N1 influenza A virus-infected cells and inhibits virus
replication and pro-inflammatory gene expression. // PLoS One. – 2011. – V. 6 – P. e19705.
18.
Wang, L. J., Geng, C.A., Ma, Y.B., Huang, X.Y., Luo, J., Chen, H., Zhang, X.M., Chen, J.J.
Synthesis, biological evaluation and structure-activity relationships of glycyrrhetinic acid
derivatives as novel anti-hepatitis B virus agents. // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2012. – V. 22 –
P. 3473-9.
19.
Kong, L., Li, S., Liao, Q., Zhang, Y., Sun, R., Zhu, X., Zhang, Q., Wang, J., Wu, X., Fang, X.,
Zhu, Y. Oleanolic acid and ursolic acid: novel hepatitis C virus antivirals that inhibit NS5B
activity. // Antiviral Res. – 2013. – V. 98 – P. 44-53.
20.
Crance, J.M., Biziagos, E., Passagot, J., van Cuyck-Gandré, H., Deloince, R. Inhibition of
hepatitis A virus replication in vitro by antiviral compounds. // J. Med. Virol. – 1990. – V. 31 –
P. 155-60.
21.
Li, J.Y., Cao, H.Y., Liu, P., Cheng, G.H., Sun, M.Y. Glycyrrhizic acid in the treatment of liver
diseases: literature review. // Biomed. Res. Int. – 2014. – V. 2014 – P. 872139.
22.
Takahara, T., Watanabe, A., Shiraki, K. Effects of glycyrrhizin on hepatitis B surface antigen: a
biochemical and morphological study. // J. Hepatol. – 1994. – V. 21 – P. 601-9.
23.
Arase, Y., Ikeda, K., Murashima, N., Chayama, K., Tsubota, A., Koida, I., Suzuki, Y., Saitoh, S.,
Kobayashi, M., Kumada, H. The long term efficacy of glycyrrhizin in chronic hepatitis C
patients. // Cancer. – 1997. – V. 79 – P. 1494-500.
24.
Ashfaq, U.A., Masoud, M.S., Nawaz, Z., Riazuddin, S. Glycyrrhizin as antiviral agent against
Hepatitis C Virus. // J. Transl. Med. – 2011. – V. 9 – P. 112.
25.
Mori, K., Sakai, H., Suzuki, S., Akutsu, Y., Ishikawa, M., Imaizumi, M., Tada, K., Aihara, M.,
Sawada, Y., Yokoyama, M. Effects of glycyrrhizin (SNMC: Stronger Neo-Minophagen C) in
hemophilia patients with HIV-1 infection. // Tohoku J. Exp. Med. – 1990. – V. 162 – P. 183-93.
26.
Mengoni, F., Lichtner, M., Battinelli, L., Marzi, M., Mastroianni, C.M., Vullo, V., Mazzanti, G.
In vitro anti-HIV activity of oleanolic acid on infected human mononuclear cells. // Planta Med.
– 2002. – V. 68 – P. 111-4.
27.
Baglin, I., Mitaine-Offer, A.C., Nour, M., Tan, K., Cavé, C., Lacaille-Dubois, M.A. A review of
natural and modified betulinic, ursolic and echinocystic acid derivatives as potential antitumor
and anti-HIV agents. // Mini Rev. Med. Chem. – 2003. – V. 3 – P. 525-39.
28.
Cichewicz, R.H., Kouzi, S.A. Chemistry, biological activity, and chemotherapeutic potential of
betulinic acid for the prevention and treatment of cancer and HIV infection. // Med. Res. Rev. –
2004. – P. 24 – V. 90-114
29.
Huang, L., Ho, P., Lee, K.H., Chen, C.H. Synthesis and anti-HIV activity of bi-functional
betulinic acid derivatives. // Bioorg. Med. Chem. – 2006. – V. 14 – P. 2279-89.
30.
Wang, C.Y., Kao, T.C., Lo, W.H., Yen, G.C. Glycyrrhizic acid and 18β-glycyrrhetinic acid
modulate lipopolysaccharide-induced inflammatory response by suppression of NF-κB through
PI3K p110δ and p110γ inhibitions. // J. Agric. Food. Chem. – 2011. – V. 59 – P. 7726-33.
149
31.
Kawahara, K., Hashiguchi, T., Masuda, K., Saniabadi, A.R., Kikuchi, K., Tancharoen, S., Ito, T.,
Miura, N., Morimoto, Y., Biswas, K.K., Nawa, Y., Meng, X., Oyama, Y., Takenouchi, K.,
Shrestha, B., Sameshima, H., Shimizu, T., Adachi, T., Adachi, M., Maruyama, I. Mechanism of
HMGB1 release inhibition from RAW264.7 cells by oleanolic acid in Prunus mume Sieb. et
Zucc. // Int. J. Mol. Med. – 2009. – V. 23 – P. 615-20.
32.
Yang, Z.G., Li, H.R., Wang, L.Y., Li, Y.H., Lu, S.G., Wen, X.F., Wang, J., Daikonya, A.,
Kitanaka, S. Triterpenoids from Hippophae rhamnoides L. and their nitric oxide productioninhibitory and DPPH radical-scavenging activities. // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). – 2007. – V.
55 – P. 15− 18.
33.
Tsai, S.J., Yin, M.C. Antioxidative and anti-inflammatory protection of oleanolic acid and
ursolic acid in PC12 cells. // J. Food. Sci. – 2008. – V. 73 – P. H174-8.
34.
Kang, O.H., Kim, J.A., Choi, Y.A., Park, H.J., Kim, D.K., An, Y.H., Choi, S.C., Yun, K.J., Nah,
Y.H., Cai, X.F., Kim, Y.H., Bae, K.H., Lee, Y.M. Inhibition of interleukin-8 production in the
human colonic epithelial cell line HT-29 by 18 beta-glycyrrhetinic acid. // Int. J. Mol. Med. –
2005. – V. 15 – P. 981-985.
35.
Marquez-Martin, A., De La Puerta, R., Fernandez-Arche, A., Ruiz-Gutierrez, V., Yaqoob, P.
Modulation of cytokine secretion by pentacyclic triterpenes from olive pomace oil in human
mononuclear cells. // Cytokine. – 2006. – V. 36 – P. 211-7.
36.
Yang, E.J., Lee, W., Ku, S.K., Song, K.S., Bae, J.S. Anti-inflammatory activities of oleanolic
acid on HMGB1 activated HUVECs. // Food Chem. Toxicol. – 2012. – V. 50 – P. 1288−1294.
37.
Tsuruga, T., Chun, Y.T., Ebizuka, Y., Sankawa, U. Biologically active constituents of Melaleuca
leucadendron: inhibitors of induced histamine release from rat mast cells. // Chem. Pharm. Bull.
(Tokyo). – 1991. – V. 39 – P. 3276-8.
38.
Salminen, A., Lehtonen, M., Suuronen, T., Kaarniranta, K., Huuskonen, J. Terpenoids: natural
inhibitors of NF-kappaB signaling with anti-inflammatory and anticancer potential. // Cell. Mol.
Life. Sci. – 2008. – V. 65 – P. 2979-99.
39.
Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. // Cell. – 2002. – V. 109 – P. S8196.
40.
Suh, N., Honda, T., Finlay, H.J., Barchowsky, A., Williams, C., Benoit, N.E., Xie, Q.W.,
Nathan, C., Gribble, G.W., Sporn, M.B. Novel triterpenoids suppress inducible nitric oxide
synthase (iNOS) and inducible cyclooxygenase (COX-2) in mouse macrophages. // Cancer Res.
– 1998. – V. 58 – P. 717-23.
41.
Ryu, S.Y., Oak, M.H., Yoon, S.K., Cho, D.I., Yoo, G.S., Kim, T.S., Kim, K.M. Anti-allergic and
anti-inflammatory triterpenes from the herb of Prunella vulgaris. // Planta Med. – 2000. – V. 66 –
P. 358-60.
42.
Diaz, A.M., Abad, M.J., Fernandez, L., Recuero, C., Villaescusa, L., Silvan, A. M., Bermejo, P.
In vitro anti-inflammatory activity of iridoids and triterpenoid compounds isolated from
Phillyrea latifolia L. // Biol. Pharm. Bull. – 2000. – V. 23 – P. 1307−1313.
43.
Ringbom, T., Segura, L., Noreen, Y., Perera, P., Bohlin, L. Ursolic acid from Plantago major, a
selective inhibitor of cyclooxygenase-2 catalyzed prostaglandin biosynthesis. // J. Nat. Prod. –
1998. – V. 61 – P. 1212-5.
150
44.
Singh, G.B., Singh, S., Bani, S., Gupta, B.D., Banerjee, S.K. Antiinflammatory activity of
oleanolic acid in rats and mice. // J. Pharm. Pharmacol. – 1992. – V. 44 – P. 456-8.
45.
Sultana, N., Saify, Z.S. Naturally occurring and synthetic agents as potential anti-inflammatory
and immunomodulants. // Antiinflamm. Antiallergy Agents Med. Chem. – 2012. – V. 11 – P. 319.
46.
Rui, H. Research and development of cancer chemopreventive agents in China. // J. Cell.
Biochem. Suppl. – 1997. – V. 27 – P. 7-11.
47.
Baricevic, D., Sosa, S., Della Loggia, R., Tubaro, A., Simonovska, B., Krasna, A., Zupancic, A.
Topical anti-inflammatory activity of Salvia officinalis L. leaves: the relevance of ursolic acid. //
J. Ethnopharmacol. – 2001. – V. 75 – P. 125-32
48.
Recio, M.C., Giner, R.M., Máñez, S., Ríos, J.L. Structural requirements for the antiinflammatory activity of natural triterpenoids. // Planta Med. – 1995. – V. 61 – P. 182-5.
49.
Banno, N., Akihisa, T., Tokuda, H., Yasukawa, K., Higashihara, H., Ukiya, M., Watanabe, K.,
Kimura, Y., Hasegawa, J., Nishino, H. Triterpene acids from the leaves of Perilla frutescens and
their anti-inflammatory and antitumor-promoting effects. // Biosci. Biotechnol. Biochem. – 2004.
– V. 68 – P. 85-90.
50.
Recio, M.C., Giner, R.M., Manez, S., Gueho, J., Julien, H.R. Hostettmann, K., Rios, J.L.
Investigations on the steroidal antiinflammatory activity of triterpenoids from Diospyros
leucomelas. // Planta Med. – 1995. – V. 61 – P. 9-12.
51.
Tapondjou, L.A., Lontsi, D., Sondengam, B.L., Choi, J., Lee, K.T., Jung, H.J., Park, H.J. In vivo
anti-nociceptive and antiinflammatory effect of the two triterpenes, ursolic acid and 23hydroxyursolic acid, from Cussonia bancoensis. // Arch. Pharm. Res. – 2003. – V. 26 – P. 143-6.
52.
Hocaoglu, A.B., Karaman, O., Erge, D.O., Erbil, G., Yilmaz, O., Bagriyanik, A., Uzuner, N.
Glycyrrhizin and long-term histopathologic changes in a murine model of asthma. // Curr. Ther.
Res. Clin. Exp. – 2011.– V. 72 – P. 250-61.
53.
Ni, Y.F., Kuai, J.K., Lu, Z.F., Yang, G.D., Fu, H.Y., Wang, J., Tian, F., Yan, X.L., Zhao, Y.C.,
Wang, Y.J., Jiang, T. Glycyrrhizin treatment is associated with attenuation of
lipopolysaccharide-induced acute lung injury by inhibiting cyclooxygenase-2 and inducible nitric
oxide synthase expression. // J. Surg. Res. – 2011. – V. 165 – P. 29-35.
54.
Krogh, R., Kroth, R., Berti, C., Madeira, A.O., Sourza, M.M., Cechinel-Felho, V., DelleMonache, F., Yunes, R.A. Isolation and identification of compounds with antinociceptive action
from Ipomoea pes-caprae (L.) R. Br. // Pharmazie. – 1999. – V. 54 – P. 464-6.
55.
Hata, K., Hori, K., Takahashi, S. Differentiation- and apoptosis-inducing activities by
pentacyclic triterpenes on a mouse melanoma cell line. // J. Nat. Prod. – 2002. – V. 65 – P. 645–
648.
56.
Kim, Y.K., Yoon, S.K., Ryu, S.Y. Cytotoxic triterpenes from stem bark of Physocarpus
intermedius. // Planta Med. – 2000. – V. 66 – P. 485-6.
57.
Gheorgheosu, D., Duicu, O., Dehelean, C., Soica, C., Muntean, D. Betulinic acid as a potent and
complex antitumor phytochemical: a minireview. // Anticancer Agents Med. Chem. – 2014. – V.
14 – P. 936-45.
151
58.
Sharma, G., Kar, S., Palit, S., Das, P.K. 18β-glycyrrhetinic acid induces apoptosis through
modulation of Akt/FOXO3a/Bim pathway in human breast cancer MCF-7 cells. // J. Cell.
Physiol. – 2012. – V. 227 – P. 1923-31.
59.
Yadav, D.K., Kalani, K., Singh, A.K., Khan, F., Srivastava, S.K., Pant, A.B. Design, synthesis
and in vitro evaluation of 18β-glycyrrhetinic acid derivatives for anticancer activity against
human breast cancer cell line MCF-7. // Curr. Med. Chem. – 2014. – V. 9 – P. 1160-70.
60.
Hsu, H.F., Houng, J.Y., Chang, C.L., Wu, C.C., Chang, F.R., Wu, Y.C. Antioxidant activity,
cytotoxicity, and DNA information of Glossogyne tenuifolia. // J. Agric. Food Chem. – 2005. –
V. 53 – P. 6117–6125.
61.
Es-Saady, D., Simon, A., Jayat-Vignoles, C., Chulia, A.J., Delage, C. MCF-7 cell cycle arrested
at G1 through ursolic acid, and increased reduction of tetrazolium salts. // Anticancer Res. –
1996. – V. 16 – P. 481-6.
62.
Amico, V., Barresi, V., Condorelli, D., Spatafora, C., Tringali, C. Antiproliferative terpenoids
from almond hulls (Prunus dulcis): Identification and structure-activity relationships. // J. Agric.
Food Chem. – 2006. – V. 54 – P. 810-4.
63.
Wei, J., Liu, M., Liu, H., Wang, H., Wang, F., Zhang, Y., Han, L., Lin, X. Oleanolic acid arrests
cell cycle and induces apoptosis via ROS-mediated mitochondrial depolarization and lysosomal
membrane permeabilization in human pancreatic cancer cells. // J. Appl. Toxicol. – 2013. – V.
33 – P. 756–765.
64.
Hawthorne, S., Gallagher, S. Effects of glycyrrhetinic acid and liquorice extract on cell
proliferation and prostate-specific antigen secretion in LNCaP prostate cancer cells. // J. Pharm.
Pharmacol. – 2008. – V. 60 – P. 661-6.
65.
Thirugnanam, S., Xu, L., Ramaswamy, K., Gnanasekar, M. Glycyrrhizin induces apoptosis in
prostate cancer cell lines DU-145 and LNCaP. // Oncol. Rep. – 2008. – V. 20 – P. 1387-92.
66.
Taniguchi, S., Imayoshi, Y., Kobayashi, E., Takamatsu, Y., Ito, H., Hatano, T., Sakagami, H.,
Tokuda, H., Nishino, H., Sugita, D., Shimura, S., Yoshida, T. Production of bioactive triterpenes
by Eriobotrya japonica calli. // Phytochemistry. – 2002. – V. 59 – P. 315-23.
67.
Hibasami, H., Iwase, H., Yoshioka, K., Takahashi, H. Glycyrrhetic acid (a metabolic substance
and aglycon of glycyrrhizin) induces apoptosis in human hepatoma, promyelotic leukemia and
stomach cancer cells. // Int. J. Mol. Med. – 2006. – V. 17 – P. 215-9.
68.
Kuang, P., Zhao, W., Su, W., Zhang, Z., Zhang, L., Liu, J., Ren, G., Yin, Z., Wang, X. 18βglycyrrhetinic acid inhibits hepatocellular carcinoma development by reversing hepatic stellate
cell-mediated immunosuppression in mice. // Int. J. Cancer. – 2013. – V. 132 – P. 1831-41.
69.
Wang, X., Bai, H., Zhang, X., Liu, J., Cao, P., Liao, N., Zhang, W., Wang, Z., Hai, C. Inhibitory
effect of oleanolic acid on hepatocellular carcinoma via ERK-p53-mediated cell cycle arrest and
mitochondrial-dependent apoptosis. // Carcinogenesis. – 2013. – V. 34 – P. 1323–1330.
70.
Shyu, M.H., Kao, T.C., Yen, G.C. Oleanolic acid and ursolic acid induce apoptosis in HuH7
human hepatocellular carcinoma cells through a mitochondrial-dependent pathway and
downregulation of XIAP. // J. Agric. Food Chem. – 2010.-V. 58 – P. 6110–6118.
152
71.
Ahn, K.S., Hahm, M.S., Park, E.J., Lee, H.K., Kim, I.H. Corosolic acid isolated from the fruit of
Crataegus pinnatifida var. psilosa is a protein kinase C inhibitor as well as a cytotoxic agent. //
Planta Med. – 1998. – V. 64 – P. 468-70.
72.
Zhu, J., Chen, M., Chen, N., Ma, A., Zhu, C., Zhao, R., Jiang, M., Zhou, J., Ye, L., Fu, H.,
Zhang, X. Glycyrrhetinic acid induces G1‑phase cell cycle arrest in human non‑small cell lung
cancer cells through endoplasmic reticulum stress pathway. // Int. J. Oncol. – 2015. – V. 46 – P.
981-8.
73.
Yadav, D.K., Kalani, K., Khan, F., Srivastava, S.K.. QSAR and docking based semi-synthesis
and in vitro evaluation of 18 β-glycyrrhetinic acid derivatives against human lung cancer cell
line A-549. // Med. Chem. – 2013. – V. 8 – P. 1073-84.
74.
Lucio, K.A., da Rocha, G.G., Moncao-Ribeiro, L.C., Fernandes, J., Takiya, C.M., Gattass, C.R.
Oleanolic acid initiates apoptosis in non-small cell lung cancer cell lines and reduces metastasis
of a B16F10 melanoma model in vivo. // PLoS One. – 2011. – V. 6 – P. e28596.
75.
Haghshenas, V., Fakhari, S., Mirzaie, S., Rahmani, M., Farhadifar, F., Pirzadeh, S., Jalili, A.
Glycyrrhetinic Acid inhibits cell growth and induces apoptosis in ovarian cancer a2780 cells. //
Adv. Pharm. Bull. – 2014. – V. 4 – P. 437-41.
76.
Yang, J.C., Myung, S.C., Kim, W., Lee, C.S. 18β-glycyrrhetinic acid potentiates Hsp90
inhibition-induced apoptosis in human epithelial ovarian carcinoma cells via activation of death
receptor and mitochondrial pathway. // Mol. Cell. Biochem. – 2012. – V. 370 – P. 209-19.
77.
Rios, M.Y., González-Morales, A., Villarreal, M.L. Sterols, triterpenes and biflavonoids of
Viburnum jucundum and cytotoxic activity of ursolic acid. // Planta Med. – 2001. – V. 67 – P.
683-4.
78.
Lee, C.S., Kim, Y.J., Lee, M.S., Han, E.S., Lee. S.J. 18beta-Glycyrrhetinic acid induces
apoptotic cell death in SiHa cells and exhibits a synergistic effect against antibiotic anti-cancer
drug toxicity. // Life Sci. – 2008. – V. 83 – P. 481-9.
79.
Lin, K.W., Huang, A.M., Hour, T.C., Yang, S.C., Pu, Y.S., Lin, C.N. 18β-Glycyrrhetinic acid
derivatives induced mitochondrial-mediated apoptosis through reactive oxygen species-mediated
p53 activation in NTUB1 cells. // Bioorg. Med. Chem. – 2011. – V. 19 – P. 4274-85.
80.
Lin, D., Zhong, W., Li, J., Zhang, B., Song, G., Hu, T. Involvement of BID translocation in
glycyrrhetinic acid and 11-deoxy glycyrrhetinic acid-induced attenuation of gastric cancer
growth. // Nutr. Cancer. – 2014. – V. 66 – P. 463-73.
81.
Hibasami, H., Iwase, H., Yoshioka, K., Takahashi, H. Glycyrrhizin induces apoptosis in human
stomach cancer KATO III and human promyelotic leukemia HL-60 cells. // Int. J. Mol. Med. –
2005. – V. 16 – P. 233-6.
82.
Hua, Y., Zhang, Z., Li, J., Li, Q., Hu, S., Sun, M., Cai, Z. Oleanolic acid derivative Dex-OA has
potent anti-tumor and anti-metastatic activity on osteosarcoma cells in vitro and in vivo. //
Invest. New Drugs. – 2011. – V. 29 – P. 258–265.
83.
Li, S., Zhu, J.H., Cao, L.P., Sun, Q., Liu, H.D., Li, W.D., Li, J.S., Hang, C.H. Growth inhibitory
in vitro effects of glycyrrhizic acid in U251 glioblastoma cell line. // Neurol. Sci. – 2014. – V. 35
– P. 1115-20.
153
84.
Fujiwara, Y., Komohara, Y., Kudo, R., Tsurushima, K., Ohnishi, K., Ikeda, T., Takeya, M.
Oleanolic acid inhibits macrophage differentiation into the M2 phenotype and glioblastoma cell
proliferation by suppressing the activation of STAT3. // Oncol. Rep. – 2011. – V. 26 – P. 1533–
1537.
85.
Zuco. V., Supino, R., Righetti, S.C., Cleris, L., Marchesi, E., Gambacorti-Passerini, C., Formelli,
F. Selective cytotoxicity of betulinic acid on tumor cell lines, but not on normal cells. // Cancer
Lett. – 2002. – V. 175 – P. 17-25
86.
Chueh, F.S., Hsiao, Y.T., Chang, S.J., Wu, P.P., Yang, J.S., Lin, J.J., Chung, J.G., Lai, T.Y.
Glycyrrhizic acid induces apoptosis in WEHI-3 mouse leukemia cells through the caspase- and
mitochondria-dependent pathways. // Oncol. Rep. – 2012. – V. 28 – P. 2069-76.
87.
Zhang, P., Li, H., Chen, D., Ni, J., Kang, Y., Wang S. Oleanolic acid induces apoptosis in human
leukemia cells through caspase activation and poly(ADP-ribose) polymerase cleavage. // Acta
Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai). – 2007. – V. 39 – P. 803–809.
88.
Chiang, L.C., Chiang, W., Chang, M.Y., Ng, L.T., Lin, C.C. Antileukemic activity of selected
natural products in Taiwan. // Am. J. Chin. Med. – 2003. – V. 31 – P. 37-46.
89.
Kitagawa, K., Nishino, H., Iwashima, A. Inhibition of the specific binding of 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate to mouse epidermal membrane fractions by glycyrrhetic acid. //
Oncology. – 1986 – V. 43 – P. 127-30.
90.
Agarwal, R., Wang, Z.Y., Mukhtar, H. Inhibition of mouse skin tumor-initiating activity of
DMBA by chronic oral feeding of glycyrrhizin in drinking water. // Nutr. Cancer. – 1991. – V.
15 – P. 187–193.
91.
Oguro, T., Liu, J., Klaassen, C.D., Yoshida, T. Inhibitory effect of oleanolic acid on 12Otetradecanoylphorbol-13-acetate-induced gene expression in mouse skin. // Toxicol. Sci. –
1998. – V. 45 – P. 88–93.
92.
Tsuda, H., Okamoto, H. Elimination of metabolic cooperation by glycyrrhetinic acid, an antitumor promoter, in cultured Chinese hamster cells. // Carcinogenesis. – 1986. – V. 7 – P. 1805-7.
93.
Nishino, H. Antitumor-promoting activity of glycyrrhetinic acid and its related compounds. In
Cancer Chemoprevention. - Boca Raton, FL: CRC. – 1992. – P. 457–467.
94.
Furtado, R.A., Rodrigues, E.P., Araujo, F.R., Oliveira, W.L., Furtado, M.A., Castro, M.B.,
Cunha, W.R., Tavares, D.C. Ursolic acid and oleanolic acid suppress preneoplastic lesions
induced by 1,2- dimethylhydrazine in rat colon. // Toxicol. Pathol. – 2008. – V. 36 – P. 576–580.
95.
Logemann, W., Lauria, F., Cudkowicz, G., Franceschini, J. Antileukaemic activity of
glycyrrhetinic acid. // Nature. – 1960. – V. 187 – P. 607-8.
96.
Lee, I., Lee, J., Lee, Y.H., Leonard, J. Ursolic acid-induced changes in tumor growth, O2
consumption, and tumor interstitial fluid pressure. // Anticancer Res. – 2001. – V. 21 – P. 2827–
2833.
97.
Kwon, H.J., Shim, J.S., Kim, J.H., Cho, H.Y., Yum, Y.N., Kim, S.H., Yu, J. Betulinic acid
inhibits growth factor-induced in vitro angiogenesis via the modulation of mitochondrial
function in endothelial cells // Jpn. J. Cancer Res. – 2002. – V. 93 – P. 417-25.
98.
Hanahan, D., Weinberg, R.A. The hallmarks of cancer. // Cell. – 2000 – V. 100 – P. 57–70.
154
99.
Bhagwat, S.V., Lahdenranta, J., Giordano, R., Arap, W., Pasqualini, R., Shapiro, L.H.
CD13/APN is activated by angiogenic signals and is essential for capillary tube formation. //
Blood. – 2001. – V. 97 – P. 652–659.
100. Cárdenas, C., Quesada, A.R., Medina, M.A. Effects of ursolic acid on different steps of the
angiogenic process. // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2004. – V. 320 – P. 402–408.
101. Jayasooriya, R.G., Dilshara, M.G., Park, S.R., Choi, Y.H., Hyun, J.W., Chang, W.Y., Kim, G.Y.
18β-Glycyrrhetinic acid suppresses TNF-α induced matrix metalloproteinase-9 and vascular
endothelial growth factor by suppressing the Akt-dependent NF-κB pathway. // Toxicol. In
Vitro. – 2014. – V. 28 – P. 751-8.
102. Shetty, A.V., Thirugnanam, S., Dakshinamoorthy, G., Samykutty, A., Zheng, G., Chen, A.,
Bosland, M.C., Kajdacsy-Balla, A., Gnanasekar, M. 18α-glycyrrhetinic acid targets prostate
cancer cells by down-regulating inflammation-related genes. // Int. J. Oncol. – 2011. – V. 39 – P.
635-40.
103. Kim, K.J., Choi, J.S., Kim, K.W., Jeong, J.W. The anti-angiogenic activities of glycyrrhizic acid
in tumor progression. // Phytother. Res. – 2013. – V. 27 – P. 841-6.
104. Lin, J., Chen, Y., Wei, L., Hong, Z., Sferra, T.J., Peng, J. Ursolic acid inhibits colorectal cancer
angiogenesis through suppression of multiple signaling pathways. // Int. J. Oncol. – 2013. – V.
43 – P. 1666-74.
105. Lin, C.C., Huang, C.Y., Mong, M.C., Chan, C.Y., Yin, M.C. Antiangiogenic potential of three
triterpenic acids in human liver cancer cells. // J. Agric. Food Chem. – 2011. – V. 59 – P. 755762.
106. Chintharlapalli, S., Papineni, S., Ramaiah, S.K., Safe, S. Betulinic acid inhibits prostate cancer
growth through inhibition of specificity protein transcription factors. // Cancer Res. – 2007. – V.
67 – P. 2816–2823.
107. Wang, X.F., Zhou, Q.M., Lu, Y.Y., Zhang, H., Huang, S., Su, S.B. Glycyrrhetinic acid potently
suppresses breast cancer invasion and metastasis by impairing the p38 MAPK-AP1 signaling
axis. // Expert Opin. Ther. Targets. – 2015. – V. 19 – P. 577-87.
108. Cha, D.S., Shin, T.Y., Eun, J.S., Kim, D.K., Jeon, H. Anti-metastatic properties of the leaves of
Eriobotrya japonica. // Arch. Pharm. Res. – 2011. – V. 34 – P. 425-436.
109. Sohn, K.H., Lee, H.Y., Chung, H.Y., Young, H.S., Yi, S.Y., Kim, K.W. Anti-angiogenic activity
of triterpene acids. // Cancer Lett. – 1995. – V. 94 – P. 213-8.
110. Zhu, W.J., Yu, D.H., Zhao, M., Lin, M.G., Lu, Q., Wang, Q.W., Guan, Y.Y., Li, G.X., Luan, X.,
Yang, Y.F., Qin, X.M., Fang, C., Yang, G.H., Chen, H.Z. Antiangiogenic triterpenes isolated
from Chinese herbal medicine Actinidia chinensis Planch. // Anticancer Agents Med. Chem. –
2013. – V. 13 – P. 195-8.
111. Chang, Y.L., Chen, C.L., Kuo, C.L., Chen, B.C., You, J.S. Glycyrrhetinic acid inhibits ICAM-1
expression via blocking JNK and NF-kappaB pathways in TNF-alpha-activated endothelial cells.
// Acta Pharmacol. Sin. – 2010. – V. 31 – P. 546-53.
112. Yoon, J.J., Lee, Y.J., Kim, J.S., Kang, D.G., Lee, H.S. Protective role of betulinic acid on TNFalpha-induced cell adhesion molecules in vascular endothelial cells. // Biochem. Biophys. Res.
Commun. – 2010. – V. 391 – P. 96-101.
155
113. Melzig, M.F., Bormann, H. Betulinic acid inhibits aminopeptidase N activity. // Planta Med. –
1998. – V. 64 – P. 655–657.
114. Kanjoormana, M., Kuttan, G. Anti-angiogenic activity of ursolic acid. // Integr. Cancer Ther. –
2010. – V. 9 – P. 224-235.
115. Soerjomataram, I., Lortet-Tieulent, J., Parkin, D.M., Ferlay, J., Mathers, C., Forman, D., Bray, F.
Global burden of cancer in 2008: a systematic analysis of disability-adjusted life-years in 12
world regions. // Lancet. – 2012. – V. 380 – P. 1840–1850.
116. Alonso, D.F., Ripoll, G.V., Garona, J., Iannucci, N.B., Gomez, D.E. Metastasis: recent
discoveries and novel perioperative treatment strategies with particular interest in the hemostatic
compound desmopressin. // Curr. Pharm. Biotechnol. – 2011. – V. 12 – P. 1974-80.
117. Guo, G., Yao, W., Zhang, Q., Bo, Y. Oleanolic acid suppresses migration and invasion of
malignant glioma cells by inactivating MAPK/ERK signaling pathway. // PLoS One. – 2013. –
V. 8 –P. e72079.
118. Yeh, C.T., Wu, C.H., Yen, G.C. Ursolic acid, a naturally occurring triterpenoid, suppresses
migration and invasion of human breast cancer cells by modulating c-Jun N-terminal kinase, Akt
and mammalian target of rapamycin signaling. // Mol. Nutr. Food Res. – 2010. – V. 54 – P.
1285-1295.
119. Zhang, Y., Kong, C., Zeng, Y., Wang, L., Li, Z., Wang, H., Xu, C., Sun, Y. Ursolic acid induces
PC-3 cell apoptosis via activation of JNK and inhibition of Akt pathways in vitro. // Mol.
Carcinog. – 2010. – V. 49 – P. 374-385.
120. Huang, H.C., Huang, C.Y., Lin-Shiau, S.Y., Lin, J.K. Ursolic acid inhibits IL-1beta or TNFalpha-induced C6 glioma invasion through suppressing the association ZIP/p62 with PKC-zeta
and downregulating the MMP-9 expression. // Mol. Carcinog. – 2009. – V. 48 – P. 517-531.
121. Kondo, M., MacKinnon, S.L., Craft, C.C., Matchett, M.D., Hurta, R.A., Neto, C.C. Ursolic acid
and its esters: Occurrence in cranberries and other Vaccinium fruit and effects on matrix
metalloproteinase activity in DU145 prostate tumor cells. // J. Sci. Food. Agric. – 2011. – V. 91
– P. 789-96.
122. Huang, C.Y., Lin, C.Y., Tsai, C.W., Yin, M.C. Inhibition of cell proliferation, invasion and
migration by ursolic acid in human lung cancer cell lines. // Toxicol. In Vitro. – 2011. – V. 25 –
P. 1274-1280.
123. Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic.
// Nat. Med. – 2013. – V. 19 – P. 1450–1464.
124. Yu, W., Huang, C., Wang, Q., Huang, T., Ding, Y., Ma, C., Ma, H., Chen, W. MEF2
transcription factors promotes EMT and invasiveness of hepatocellular carcinoma through TGFβ1 autoregulation circuitry. // Tumour Biol. – 2014. – V. 35 – P. 10943-51.
125. Gheorgheosu, D., Jung, M., Ören, B., Schmid, T., Dehelean, C., Muntean, D., Brüne, B.
Betulinic acid suppresses NGAL-induced epithelial-to-mesenchymal transition in melanoma. //
Biol. Chem. – 2013. – V. 394 – P. 773-81.
126. Kalluri, R., Weinberg, R.A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. // J. Clin. Invest. –
2009. – V. 119 – P. 1420–1428.
156
127. Shanmugam, M.K., Manu, K.A., Ong, T.H., Ramachandran, L., Surana, R., Bist, P., Lim, L.H.,
Kumar, A.P., Hui, K.M., Sethi, G. Inhibition of CXCR4/CXCL12 signaling axis by ursolic acid
leads to suppression of metastasis in transgenic adenocarcinoma of mouse prostate model. // Int.
J. Cancer. – 2011. – V. 129 – P. 1552-1563.
128. Kobayashi, M., Fujita, K., Katakura, T., Utsunomiya, T., Pollard, R.B., Suzuki, F. Inhibitory
effect of glycyrrhizin on experimental pulmonary metastasis in mice inoculated with B16
melanoma // Anticancer Res. – 2002. – V. 22 – P. 4053-8.
129. Jedinak, A., Muckova, M., Kostʼalova, D., Maliar, T., Masterova, I. Antiprotease and
antimetastatic activity of ursolic acid isolated from Salvia officinalis. // Z. Naturforsch. C. –
2006. – V. 61 – P. 777–782.
130. Sawada, N., Kataoka, K., Kondo, K., Arimochi, H., Fujino, H., Takahashi, Y., Miyoshi, T.,
Kuwahara, T., Monden, Y., Ohnishi, Y. Betulinic acid augments the inhibitory effects of
vincristine on growth and lung metastasis of B16F10 melanoma cells in mice. // Br. J. Cancer. –
2004. – V. 90 – P. 1672–1678.
131. Hidaka, I., Hino, K., Korenaga, M., Gondo, T., Nishina, S., Ando, M., Okuda, M., Sakaida, I.
Stronger Neo-Minophagen C, a glycyrrhizin-containing preparation, protects liver against carbon
tetrachloride-induced oxidative stress in transgenic mice expressing the hepatitis C virus
polyprotein. // Liver Int. – 2007. – V. 27 – P. 845-53.
132. Толстиков, Г.А., Балтина, Л.А., Шульц, Э.Э., Покровский, А.Г. Глицирризиновая кислота.
// Биоорганическая химия. – 1997. – № 23 – С. 691-709.
133. Zhu, Z., Qian, Z., Yan, Z., Zhao, C., Wang, H., Ying, G. A phase I pharmacokinetic study of
ursolic acid nanoliposomes in healthy volunteers and patients with advanced solid tumors. // Int.
J. Nanomedicine. – 2013. – V. 8 – P. 129-36.
134. Sporn, M.B., Liby, K.T., Yore, M.M., Fu, L., Lopchuk, J.M., Gribble, G.W. New synthetic
triterpenoids: potent agents for prevention and treatment of tissue injury caused by inflammatory
and oxidative stress. // J. Nat. Prod. – 2011. – V, 74 – P. 537-45.
135. Deeb, D., Gao, X., Dulchavsky, S.A., Gautam, S.C. CDDO-me induces apoptosis and inhibits
Akt, mTOR and NF-kappaB signaling proteins in prostate cancer cells // Anticancer Res. – 2007.
– V. 27 – P. 3035-44.
136. Sogno, I., Vannini, N., Lorusso, G., Cammarota, R., Noonan, D.M., Generoso, L., Sporn, M.B,
Albini, A. Anti-angiogenic activity of a novel class of chemopreventive compounds: oleanic acid
terpenoids. // Recent Results Cancer Res. – 2009. – V. 181 – P. 209-12.
137. To, C., Kulkarni, S., Pawson, T., Honda, T., Gribble, G.W., Sporn, M.B., Wrana, J.L., Di
Guglielmo, G.M. The synthetic triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acidimidazolide alters transforming growth factor beta-dependent signaling and cell migration by
affecting the cytoskeleton and the polarity complex. // J. Biol. Chem. – 2008. –V. 283 – P.
11700-13.
138. Hong, D.S., Kurzrock, R., Supko, J.G., He, X., Naing, A., Wheler, J., Lawrence, D., Eder, J.P.,
Meyer, C.J., Ferguson, D.A., Mier, J., Konopleva, M., Konoplev, S., Andreeff, M., Kufe, D.,
Lazarus, H., Shapiro, G.I., Dezube, B.J. A phase I first-in-human trial of bardoxolone methyl in
157
patients with advanced solid tumors and lymphomas. // Clin. Cancer Res. – 2012. – V. 18 – P.
3396-406.
139. Chintharlapalli, S., Papineni, S., Jutooru, I., McAlees, A., Safe, S. Structure-dependent activity
of glycyrrhetinic acid derivatives as peroxisome proliferator-activated receptor {gamma}
agonists in colon cancer cells. // Mol. Cancer Ther. – 2007. – V. 6 – P. 1588-98.
140. Chintharlapalli, S., Papineni, S., Abdelrahim, M., Abudayyeh, A., Jutooru, I., Chadalapaka, G.,
Wu, F., Mertens-Talcott, S., Vanderlaag, K., Cho, S.D., Smith, R. 3rd., Safe, S. Oncogenic
microRNA-27a is a target for anticancer agent methyl 2-cyano-3,11-dioxo-18beta-olean-1,12dien-30-oate in colon cancer cells. // Int. J. Cancer. – 2009. – V. 125 – P. 1965-74.
141. Chadalapaka, G., Jutooru, I., McAlees, A., Stefanac, T., Safe, S. Structure-dependent inhibition
of bladder and pancreatic cancer cell growth by 2-substituted glycyrrhetinic and ursolic acid
derivatives. // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2008. – V. 18 – P. 2633-9.
142. Papineni, S., Chintharlapalli, S., Safe, S. Methyl 2-cyano-3,11-dioxo-18 beta-olean-1,12-dien30-oate is a peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonist that induces receptorindependent apoptosis in LNCaP prostate cancer cells. // Mol. Pharmacol. – 2008. – V. 73 – P.
553-65.
143. Jutooru, I., Chadalapaka, G., Chintharlapalli, S., Papineni, S., Safe, S. Induction of apoptosis and
nonsteroidal anti-inflammatory drug-activated gene 1 in pancreatic cancer cells by a
glycyrrhetinic acid derivative. // Mol. Carcinog. – 2009. – V. 48 – P. 692-702.
144. Song, D., Gao, Y., Wang, R., Liu, D., Zhao, L., Jing, Y. Downregulation of c-FLIP, XIAP and
Mcl-1 protein as well as depletion of reduced glutathione contribute to the apoptosis induction of
glycyrrhetinic acid derivatives in leukemia cells. // Cancer Biol. Ther. – 2010. – V. 9 – P. 96108.
145. Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. The mitochondrial death/life regulator in
apoptosis and necrosis. // Annu. Rev. Physiol. – 1998. – V. 60 – P. 619-42.
146. Galluzzi, L., Kroemer, G. Necroptosis: a specialized pathway of programmed necrosis. // Cell. –
2008. – V. 135 – P. 1161-3.
147. Vandenabeele, P., Galluzzi, L., Vanden Berghe, T., Kroemer, G. Molecular mechanisms of
necroptosis: an ordered cellular explosion. // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. – 2010. – V. 11 – P. 70014.
148. . Eskelinen, E.L., Saftig, P. Autophagy: a lysosomal degradation pathway with a central role in
health and disease. // Biochim. Biophys. Acta. – 2009. – V. 1793 – P. 664–73.
149. Maycotte, P., Thorburn, A. Autophagy and cancer therapy. // Cancer Biol. Ther. – 2011, -V. 11 –
P. 127—137.
150. Mizushima, N., Klionsky, D. J. Protein turnover via autophagy: implications for metabolism. //
Annu. Rev. Nutr. – 2007. – V. 27 – P. 19—40.
151. Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. // Mol. Cell.
– 2010. – V. 40 – P. 280—293
152. Clarke P. G. Developmental cell death: morphological diversity and multiple mechanisms. //
Anat. Embryol. – 1990 – V. 181 – P. 195—213.
158
153. Fazi, B., Bursch, W., Fimia, G. M., Nardacci, R., Piacentini, M., Di Sano, F., Piredda, L.
Fenretinide induces autophagic cell death in caspase-defective breast cancer cells. // Autophagy.
– 2008. – V. 4. – P. 435–441.
154. Laane, E., Tamm, K. P., Buentke, E., Ito, K., Kharaziha, P., Oscarsson, J. Corcoran, M.,
Björklund, A.C., Hultenby, K., Lundin, J., Heyman, M., Söderhäll, S., Mazur, J., Porwit, A.,
Pandolfi, P.P., Zhivotovsky, B., Panaretakis, T., Grandér, D. Cell death induced by
dexamethasone in lymphoid leukemia is mediated through initiation of autophagy. // Cell Death
Differ. – 2009. – V. 16 – P. 1018–1029.
155. Notte, A, Leclere, L, Michiels, C. Autophagy as a mediator of chemotherapy-induced cell death
in cancer. // Biochem. Pharmacol. – 2011 – V. 82 – P. 427-34.
156. Пупышев, А.Б. Репаративная аутофагия и аутофаговая гибель клетки. Функциональные и
регуляторные аспекты. //Цитология. – 2014. - № 56. – С. 179-196.
157. Noda, N.N., Inagaki, F. Mechanisms of Autophagy. // Annu. Rev. Biophys. – 2015. – V. 44 – P.
101-22.
158. Zhang, W., Men, X., Lei, P. Review on anti-tumor effect of triterpene acid compounds. // J.
Cancer Res. Ther. – 2014. – V. 10 – P. 14-9.
159. Бажанова, Е.Д. Роль TNF в механизмах апоптоза. // Естественные науки. – 2010. - №4. – С.
100-109.
160. Green, D.R. Apoptotic pathways: the roads to ruin. // Cell. – 1998. – V. 94 – P. 695-8.
161. Nagata S. Apoptosis by death factor. // Cell. – 1997. – V. 88 – P. 355-65.
162. Kischkel, F.C., Lawrence, D.A., Chuntharapai, A., Schow, P., Kim, K.J., Ashkenazi, A.
Apo2L/TRAIL-dependent recruitment of endogenous FADD and caspase-8 to death receptors 4
and 5. // Immunity. – 2000. – V. 12 – P. 611-20.
163. Kischkel, F.C., Lawrence, D.A., Tinel, A., LeBlanc, H., Virmani, A., Schow, P., Gazdar, A.,
Blenis, J., Arnott, D., Ashkenazi, A. Death receptor recruitment of endogenous caspase-10 and
apoptosis initiation in the absence of caspase-8. // J. Biol. Chem. – 2001. – V. 276 – P. 46639-46.
164. Norbury, C.J., Zhivotovsky, B. DNA damage-induced apoptosis. // Oncogene. – 2004. – V. 23 –
P. 2797-808.
165. Sinha, K,. Das, J., Pal, P.B., Sil, P.C. Oxidative stress: the mitochondria-dependent and
mitochondria-independent pathways of apoptosis. // Arch. Toxicol. – 2013. – V. 87 – P. 1157-80.
166. Orrenius, S., Zhivotovsky, B., Nicotera, P. Regulation of cell death: the calcium-apoptosis link.
// Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. – 2003. – V. 4 – P. 552-65.
167. Deniaud, A., Sharaf el dein, O., Maillier, E., Poncet, D., Kroemer, G., Lemaire, C., Brenner C.
Endoplasmic reticulum stress induces calcium-dependent permeability transition, mitochondrial
outer membrane permeabilization and apoptosis. // Oncogene. – 2008. – V. 27 – P. 285-99.
168. Zamzami, N., Marchetti, P., Castedo, M., Zanin, C., Vayssiere, J.L., Petit, P.X., Kroemer, G.
Reduction in mitochondrial potential constitutes an early irreversible step of programmed
lymphocyte death in vivo. // J. Exp. Med. – 1995. – V. 181 – P. 1661-1672.
159
169. Antonsson, B., Conti, F., Ciavatta, A., Montessuit, S., Lewis, S., Martinou, I., Bernasconi, L.,
Bernard, A., Mermod, J.J., Mazzei, G., Maundrell, K., Gambale, F., Sadoul, R., Martinou, J.C.
Inhibition of Bax channel-forming activity by Bcl-2. // Science. – 1997. – V. 277 – P. 370-2.
170. Cory, S.; Adams, J.M. The Bcl2 family: Regulators of the cellular life-or-death switch. // Nat.
Rev. Cancer. – 2002. V. 2 – P. 647–656.
171. Haldar, S., Jena, N., Croce. C.M. Inactivation of Bcl-2 by phosphorylation. // Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A. – 1995. – V. 92 – P. 4507-11.
172. Willis, S.N., Adams. J.M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. // Curr.
Opin. Cell Biol. – 2005. – V. 17 – P. 617-25.
173. Salvesen, G.S., Duckett, C.S. IAP proteins: blocking the road to death's door. // Nat. Rev. Mol.
Cell Biol. – 2002. – V. 3 – P. 401-10.
174. Mita, A.C., Mita, M.M., Nawrocki, S.T., Giles, F.J. Survivin: key regulator of mitosis and
apoptosis and novel target for cancer therapeutics. // Clin. Cancer Res. – 2008. – V. 14 – P.
5000-5.
175. Candé, C., Cohen, I., Daugas, E., Ravagnan, L., Larochette, N., Zamzami, N., Kroemer, G.
Apoptosis-inducing factor (AIF): a novel caspase-independent death effector released from
mitochondria. // Biochimie. – 2002. – V. 84 – P. 215-22.
176. Kaufmann, S.H., Earnshaw, W.C. Induction of apoptosis by cancer chemotherapy. // Exp. Cell
Res. – 2000. – V. 256 – P. 42—49
177. Fischer, U., Jänicke, R.U., Schulze-Osthoff, K. Many cuts to ruin: a comprehensive update of
caspase substrates. // Cell Death Differ. – 2003. – V. 10 – P. 76-100.
178. Александрушкина, И.И., Ванюшин, Б.Ф. Эндонуклеазы и апоптоз у животных. // Успехи
биологической химии. – 2012. - № 52 – С. 63-96.
179. Javle, M., Curtin, N.J. The role of PARP in DNA repair and its therapeutic exploitation. // Br. J.
Cancer. – 2011. – V. 105 – P. 1114-22.
180. Korsmeyer, S.J., Wei, M.C., Saito, M., Weiler, S., Oh, K.J., Schlesinger, P.H. Pro-apoptotic
cascade activates BID, which oligomerizes BAK or BAX into pores that result in the release of
cytochrome c. // Cell Death Differ. – 2000. – V. 7 – P. 1166-73.
181. Fadok, V.A., Bratton, D.L., Frasch, S.C., Warner, M.L., Henson, P.M. The role of
phosphatidylserine in recognition of apoptotic cells by phagocytes. // Cell Death Differ. – 1998 –
V. 5 – P. 551-62.
182. Mullauer, F.B., Kessler, J.H., Medema, J.P. Betulinic acid induces cytochrome c release and
apoptosis in a Bax/Bak-independent, permeability transition pore dependent fashion. //
Apoptosis. – 2009. – V. 14 – P. 191-202.
183. Liu, Y., Luo, W. Betulinic acid induces Bax/Bak-independent cytochrome c release in human
nasopharyngeal carcinoma cells. // Mol. Cells. – 2012. – V. 33 – P. 517-24.
184. Tang, Q., Ji, Q., Tang, Y., Chen, T., Pan, G., Hu, S., Bao, Y., Peng, W., Yin, P. Mitochondrial
translocation of cofilin-1 promotes apoptosis of gastric cancer BGC-823 cells induced by ursolic
acid. // Tumour Biol. – 2014. – V. 35 – P. 2451-9.
160
185. Battaglia, V., Brunati, A.M., Fiore, C., Rossi, C.A., Salvi, M., Tibaldi, E., Palermo, M.,
Armanini, D., Toninello, A. Glycyrrhetinic acid as inhibitor or amplifier of permeability
transition in rat heart mitochondria. // Biochim. Biophys. Acta. – 2008. – V. 1778 – P. 313-23.
186. Azarashvili, T., Baburina, Y., Grachev, D., Krestinina, O., Papadopoulos, V., Lemasters, J.J.,
Odinokova, I., Reiser, G. Carbenoxolone induces permeability transition pore opening in rat
mitochondria via the translocator protein TSPO and connexin43. // Arch. Biochem. Biophys. –
2014. – V. 558 – P. 87-94.
187. Halestrap A.P., McStay G.P., Clarke S.J. The permeability transition pore complex: another
view. // Biochimie. – 2002 – V. 84 – P. 153-166.
188. Zorov, D.B., Juhaszova, M., Sollott, S.J. Mitochondrial ROS-induced ROS release: an update
and review. // Biochim. Biophys. Acta. – 2006. – V. 1757 – P. 509-17.
189. Fulda, S., Scaffidi, C., Susin, S.A., Krammer, P.H., Kroemer, G., Peter, M.E., Debatin, K.M.
Activation of mitochondria and release of mitochondrial apoptogenic factors by betulinic acid. //
J. Biol. Chem. – 1998. – V. 273 – P. 33942-8.
190. Li, G.B., Cheng, Q., Liu, L., Zhou, T., Shan, C.Y., Hu, X.Y., Zhou, J., Liu, E.H., Li, P., Gao, N.
Mitochondrial translocation of cofilin is required for allyl isothiocyanate-mediated cell death via
ROCK1/PTEN/PI3K signaling pathway. // Cell Commun. Signal. – 2013. – V. 11 – P. 50.
191. Brookes, P.S., Morse, K., Ray, D., Tompkins, A., Young, S.M., Hilchey, S., Salim, S.,
Konopleva, M., Andreeff, M., Phipps, R., Bernstein, S.H. The triterpenoid 2-cyano-3,12dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid and its derivatives elicit human lymphoid cell apoptosis
through a novel pathway involving the unregulated mitochondrial permeability transition pore. //
Cancer Res. – 2007. – V. 67 – P. 1793-802.
192. Bernstein, S.H., Venkatesh, S., Li, M., Lee, J., Lu, B., Hilchey, S.P., Morse, K.M., Metcalfe,
H.M., Skalska, J., Andreeff, M., Brookes, P.S., Suzuki, C.K. The mitochondrial ATP-dependent
Lon protease: a novel target in lymphoma death mediated by the synthetic triterpenoid CDDO
and its derivatives. // Blood. – 2012. – V. 119 – P. 3321-9.
193. Safa AR. c-FLIP, a master anti-apoptotic regulator. // Exp. Oncol. – 2012. – V. 34 – P. 176-84.
194. Yamaguchi, H., Kidachi, Y., Kamiie, K., Noshita, T., Umetsu, H., Ryoyama, K. Glycyrrhetinic
acid induces anoikis-like death and cytoskeletal disruption in the central nervous system
tumorigenic cells. // Biol. Pharm. Bull. – 2010. – V.33 – P. 321-4.
195. Yamaguchi, H., Noshita, T., Yu, T., Kidachi, Y., Kamiie, K., Umetsu, H., Ryoyama, K. Novel
effects of glycyrrhetinic acid on the central nervous system tumorigenic progenitor cells:
induction of actin disruption and tumor cell-selective toxicity. // Eur. J. Med. Chem. – 2010. – V.
45 – P. 2943-8.
196. Yamaguchi, H., Yu, T., Kidachi, Y., Akitaya, T., Yoshida, K., Kamiie, K., Noshita, T., Umetsu,
H., Ryoyama, K. Selective toxicity of glycyrrhetinic acid against tumorigenic r/m HM-SFME-1
cells is potentially attributed to downregulation of glutathione. // Biochimie. – 2011. – V. 93 – P.
1172-8.
197. Song, J., Ko, H.S., Sohn, E.J., Kim, B., Kim, J.H., Kim, H.J., Kim, C., Kim, J.E., Kim, S.H.
Inhibition of protein kinase C α/βII and activation of c-Jun NH2-terminal kinase mediate
161
glycyrrhetinic acid induced apoptosis in non-small cell lung cancer NCI-H460 cells. // Bioorg.
Med. Chem. Lett. – 2014. – V. 24 – P. 1188-91.
198. Gao, Z., Kang, X., Hu, J., Ju, Y., Xu, C. Induction of apoptosis with mitochondrial membrane
depolarization by a glycyrrhetinic acid derivative in human leukemia K562 cells. //
Cytotechnology. – 2012. – V. 64 – P. 421-8.
199. Pirzadeh, S., Fakhari, S., Jalili, A., Mirzai, S., Ghaderi, B., Haghshenas, V. Glycyrrhetinic Acid
Induces Apoptosis in Leukemic HL60 Cells Through Upregulating of CD95/ CD178. // Int. J.
Mol. Cell. Med. – 2014. – V. 3 – P. 272-8.
200. Tang, Z.H., Li, T., Chang, L.L., Zhu, H., Tong, Y.G., Chen, X.P., Wang, Y.T., Lu, J.J.
Glycyrrhetinic Acid triggers a protective autophagy by activation of extracellular regulated
protein kinases in hepatocellular carcinoma cells. // J. Agric. Food Chem. – 2014. – V. 62 – P.
11910-6.
201. Wang, D., Wong, H.K., Feng, Y.B., Zhang, Z.J. 18beta-glycyrrhetinic acid induces apoptosis in
pituitary adenoma cells via ROS/MAPKs-mediated pathway. // J. Neurooncol. – 2014. – V. 116
– P. 221-30.
202. Feng, L., Au-Yeung, W., Xu, Y.H., Wang, S.S., Zhu, Q., Xiang, P. Oleanolic acid from Prunella
Vulgaris L. induces SPC-A-1 cell line apoptosis via regulation of Bax, Bad and Bcl-2
expression. // Asian. Pac. J. Cancer Prev. – 2011. – V. 12 – P. 403-8.
203. Zhou, R., Zhang, Z., Zhao, L., Jia, C., Xu, S., Mai, Q., Lu, M., Huang, M., Wang, L., Wang, X.,
Jin, D., Bai, X. Inhibition of mTOR signaling by oleanolic acid contributes to its anti-tumor
activity in osteosarcoma cells. // J. Orthop. Res. – 2011. – V. 29 – P. 846-52.
204. Li, H., He, N., Li, X., Zhou, L., Zhao, M., Jiang, H., Zhang, X. Oleanolic acid inhibits
proliferation and induces apoptosis in NB4 cells by targeting PML/RARα. // Oncol. Lett. – 2013.
– V. 6(4) – P. 885-890.
205. Chen, J.Y., Zhang, L., Zhang, H., Su, L., Qin, L.P. Triggering of p38 MAPK and JNK signaling
is important for oleanolic acid-induced apoptosis via the mitochondrial death pathway in
hypertrophic scar fibroblasts. // Phytother. Res. – 2014. – V. 28 – P. 1468-78.
206. Liu, J., Wu, N., Ma, L.N., Zhong, J.T., Liu, G., Zheng, L.H., Lin, X.K. p38 MAPK signaling
mediates mitochondrial apoptosis in cancer cells induced by oleanolic acid. // Asian Pac. J.
Cancer Prev. – 2014. –V. 15 – P. 4519-25.
207. Liu, J., Zheng, L., Wu, N., Ma, L., Zhong, J., Liu, G., Lin, X. Oleanolic acid induces metabolic
adaptation in cancer cells by activating the AMP-activated protein kinase pathway. // J. Agric.
Food. Chem. – 2014. – V. 62 – P. 5528-37.
208. Zhang, Z., Zhang, C., Ding, Y., Zhao, Q., Yang, L., Ling, J., Liu, L., Ji, H., Zhang, Y. The
activation of p38 and JNK by ROS, contribute to OLO-2-mediated intrinsic apoptosis in human
hepatocellular carcinoma cells. // Food Chem. Toxicol. – 2014 – V. 63 – P. 38-47.
209. Zhao, X., Liu, M., Li, D. Oleanolic acid suppresses the proliferation of lung carcinoma cells by
miR-122/Cyclin G1/MEF2D axis. // Mol. Cell. Biochem. – 2015. – V. 400 – P. 1-7.
210. Lu, Y., Zhu, M., Chen, W., Yin, L., Zhu, J., Chen, N., Chen, W. Oleanolic acid induces
apoptosis of MKN28 cells via AKT and JNK signaling pathways. // Pharm. Biol. – 2014. – V. 52
– P. 789-95.
162
211. Limami, Y., Pinon, A., Leger, D.Y., Mousseau, Y., Cook-Moreau, J., Beneytout, J.L., Delage,
C., Liagre, B., Simon, A. HT-29 colorectal cancer cells undergoing apoptosis overexpress COX2 to delay ursolic acid-induced cell death. // Biochimie. – 2011. – V. 93 – P. 749-57.
212. Prasad, S., Yadav, V.R., Kannappan, R., Aggarwal, B.B. Ursolic acid, a pentacyclin triterpene,
potentiates TRAIL-induced apoptosis through p53-independent up-regulation of death receptors:
evidence for the role of reactive oxygen species and JNK. // J. Biol. Chem. – 2011. – V. 286 – P.
5546-57.
213. Zhang, T., He, Y.M., Wang, J.S., Shen, J., Xing, Y.Y., Xi, T. Ursolic acid induces HL60
monocytic differentiation and upregulates C/EBPβ expression by ERK pathway activation. //
Anticancer Drugs. – 2011. – V. 22 – P. 158-65.
214. Limami, Y., Pinon, A., Leger, D.Y., Pinault, E., Delage, C., Beneytout, J.L., Simon, A., Liagre,
B. The P2Y2/Src/p38/COX-2 pathway is involved in the resistance to ursolic acid-induced
apoptosis in colorectal and prostate cancer cells. // Biochimie. – 2012. – V. 94 – P. 1754-63.
215. Shin, S.W., Kim, S.Y., Park, J.W. Autophagy inhibition enhances ursolic acid-induced apoptosis
in PC3 cells. // Biochim. Biophys. Acta. – 2012, - V. 1823 – P. 451-7.
216. Wang, J.S., Ren, T.N., Xi, T. Ursolic acid induces apoptosis by suppressing the expression of
FoxM1 in MCF-7 human breast cancer cells. // Med. Oncol. – 2012. – V. 29 – P. 10-5.
217. Wu, B., Wang, X., Chi, Z.F., Hu, R., Zhang, R., Yang, W., Liu, Z.G. Ursolic acid-induced
apoptosis in K562 cells involving upregulation of PTEN gene expression and inactivation of the
PI3K/Akt pathway. // Arch. Pharm. Res. – 2012. – V. 35 – P. 543-8.
218. Zhao, C., Yin, S., Dong, Y., Guo, X., Fan, L., Ye, M., Hu, H. Autophagy-dependent EIF2AK3
activation compromises ursolic acid-induced apoptosis through upregulation of MCL1 in MCF-7
human breast cancer cells. // Autophagy. – 2013. – V. 9 – P. 196-207.
219. Deng, L., Zhang, R., Tang, F., Li, C., Xing, Y.Y., Xi, T. Ursolic acid induces U937 cells
differentiation by PI3K/Akt pathway activation. // Chin. J. Nat. Med. – 2014. – V. 12 – P. 15-9.
220. Li, Y., Lu, X., Qi, H., Li, X., Xiao, X., Gao, J. Ursolic acid induces apoptosis through
mitochondrial intrinsic pathway and suppression of ERK1/2 MAPK in HeLa cells. // J.
Pharmacol. Sci. – 2014. – V. 125 – P. 202-10.
221. Shen, S., Zhang, Y., Zhang, R., Tu, X., Gong, X. Ursolic acid induces autophagy in U87MG
cells via ROS-dependent endoplasmic reticulum stress. // Chem. Biol. Interact. – 2014. – V. 218
– P. 28-41.
222. Mullauer, F.B., Kessler, J.H., Medema, J.P. Betulin is a potent anti-tumor agent that is enhanced
by cholesterol. // PLoS One. – 2009. – V. 4 – P. e1.
223. Chintharlapalli, S., Papineni, S., Lei, P., Pathi, S., Safe S. Betulinic acid inhibits colon cancer
cell and tumor growth and induces proteasome-dependent and -independent downregulation of
specificity proteins (Sp) transcription factors. // BMC Cancer. – 2011. – V. 11 – P. 371.
224. Yang, L.J., Chen, Y., He, J., Yi, S., Wen, L., Zhao, J., Zhang, B.P., Cui, G.H. Betulinic acid
inhibits autophagic flux and induces apoptosis in human multiple myeloma cells in vitro. // Acta
Pharmacol. Sin. – 2012. – V. 33 – P. 1542-8.
163
225. Ye, B., Ji, Z.N. 23-hydroxybetulinic acid-induced HL-60 cell autophagic apoptosis and its
molecular mechanism. // Nat. Prod. Res. – 2012. – V. 26 – P. 1063-8.
226. Li, X.D., Zhang, Y.J., Han, J.C. Betulin inhibits lung carcinoma proliferation through activation
of AMPK signaling. // Tumour Biol. – 2014. – V. 35 – P. 11153-8.
227. Konopleva, M., Tsao, T., Estrov, Z., Lee, R.M., Wang, R.Y., Jackson, C.E., McQueen, T.,
Monaco, G., Munsell, M., Belmont, J., Kantarjian, H., Sporn, M.B., Andreeff, M. The synthetic
triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid induces caspase-dependent and independent apoptosis in acute myelogenous leukemia. // Cancer Res. – 2004. – V. 64 – P. 792735.
228. Ahmad, R., Raina, D., Meyer, C., Kharbanda, S., Kufe, D. Triterpenoid CDDO-Me blocks the
NF-kappaB pathway by direct inhibition of IKKbeta on Cys-179. // J. Biol. Chem. – 2006. –V.
281 – P. 35764-9.
229. Ji, Y., Lee, H.J., Goodman, C., Uskokovic, M., Liby, K., Sporn, M., Suh, N. The synthetic
triterpenoid CDDO-imidazolide induces monocytic differentiation by activating the Smad and
ERK signaling pathways in HL60 leukemia cells. // Mol. Cancer Ther. – 2006. – V. 5 – P. 14528.
230. Ling, X., Konopleva, M., Zeng, Z., Ruvolo, V., Stephens, L.C., Schober, W., McQueen, T.,
Dietrich, M., Madden, T.L., Andreeff, M. The novel triterpenoid C-28 methyl ester of 2-cyano-3,
12-dioxoolen-1, 9-dien-28-oic acid inhibits metastatic murine breast tumor growth through
inactivation of STAT3 signaling. // Cancer Res. - 2007. – V. 67 – P. 4210-8.
231. Zou, W., Chen, S., Liu, X., Yue, P., Sporn, M.B., Khuri, F.R., Sun, S.Y. c-FLIP downregulation
contributes to apoptosis induction by the novel synthetic triterpenoid methyl-2-cyano-3, 12dioxooleana-1, 9-dien-28-oate (CDDO-Me) in human lung cancer cells. // Cancer Biol. Ther. –
2007. – V. 6 – P. 1614-20.
232. Hughes, D.T., Martel, P.M., Kinlaw, W.B., Eisenberg, B.L. The synthetic triterpenoid CDDO-Im
inhibits fatty acid synthase expression and has antiproliferative and proapoptotic effects in
human liposarcoma cells. // Cancer Invest. – 2008. – V. 26 – P. 118-27.
233. Hyer, M.L., Shi, R., Krajewska, M., Meyer, C., Lebedeva, I.V., Fisher, P.B., Reed, J.C.
Apoptotic activity and mechanism of 2-cyano-3,12-dioxoolean-1,9-dien-28-oic-acid and related
synthetic triterpenoids in prostate cancer. // Cancer Res. – 2008. – V. 68 – P. 2927-33.
234. Zou, W., Yue, P., Khuri, F.R., Sun, S.Y. Coupling of endoplasmic reticulum stress to CDDOMe-induced up-regulation of death receptor 5 via a CHOP-dependent mechanism involving JNK
activation. // Cancer Res. – 2008. – V. 68 – P. 7484-92.
235. Deeb, D., Gao, X., Jiang, H., Dulchavsky, S.A., Gautam, S.C. Oleanane triterpenoid CDDO-Me
inhibits growth and induces apoptosis in prostate cancer cells by independently targeting prosurvival Akt and mTOR. // Prostate. – 2009. – V. 69 – P. 851-60.
236. Ryu, K., Susa, M., Choy, E., Yang, C., Hornicek, F.J., Mankin, H.J., Duan, Z. Oleanane
triterpenoid CDDO-Me induces apoptosis in multidrug resistant osteosarcoma cells through
inhibition of Stat3 pathway. // BMC Cancer. – 2010. – V. 10 – P. 187.
164
237. Deeb, D., Gao, X., Jiang, H., Janic, B., Arbab, A.S., Rojanasakul, Y., Dulchavsky, S.A., Gautam,
S.C. Oleanane triterpenoid CDDO-Me inhibits growth and induces apoptosis in prostate cancer
cells through a ROS-dependent mechanism. // Biochem. Pharmacol. – 2010. – V. 79 – P. 350-60.
238. Gao, X., Liu, Y., Deeb, D., Arbab, A.S., Guo, A.M., Dulchavsky, S.A., Gautam, S.C. Synthetic
oleanane triterpenoid, CDDO-Me, induces apoptosis in ovarian cancer cells by inhibiting
prosurvival AKT/NF-κB/mTOR signaling. // Anticancer Res. – 2011. – V. 31 – P. 3673-81.
239. Gao, X., Deeb, D., Liu, P., Liu, Y., Arbab-Ali, S., Dulchavsky, S.A., Gautam, S,C. Role of
reactive oxygen species (ROS) in CDDO-Me-mediated growth inhibition and apoptosis in
colorectal cancer cells. // J. Exp. Ther. Oncol. – 2011. – V. 9 – P. 119-27.
240. Deeb, D., Gao, X., Liu, Y.B., Gautam, S.C. Inhibition of cell proliferation and induction of
apoptosis by CDDO-Me in pancreatic cancer cells is ROS-dependent // J. Exp. Ther. Oncol. –
2012. – V. 10 – P. 51-64.
241. Deeb, D., Gao, X., Liu, Y., Kim, S.H., Pindolia, K.R., Arbab, A.S., Gautam, S.C. Inhibition of
cell proliferation and induction of apoptosis by oleanane triterpenoid (CDDO-Me) in pancreatic
cancer cells is associated with the suppression of hTERT gene expression and its telomerase
activity. // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2012. – V. 422 – P. 561-7.
242. Liu, Y., Gao, X., Deeb, D., Gautam, S.C. Oleanane triterpenoid CDDO-Me inhibits Akt activity
without affecting PDK1 kinase or PP2A phosphatase activity in cancer cells. // Biochem.
Biophys. Res. Commun. – 2012. – V. 417 – P. 570-5.
243. Pang, X., Zhang, L., Wu, Y., Lin, L., Li, J., Qu, W., Safe, S., Liu, M. Methyl 2-cyano-3,11dioxo-18-olean-1,12-dien-30-oate (CDODA-Me), a derivative of glycyrrhetinic acid, functions
as a potent angiogenesis inhibitor. // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 2010. – V. 335 – P. 172-9.
244. Chintharlapalli, S., Papineni, S., Lee, S.O., Lei, P., Jin, U.H., Sherman, S.I., Santarpia, L., Safe,
S. Inhibition of pituitary tumor-transforming gene-1 in thyroid cancer cells by drugs that
decrease specificity proteins. // Mol. Carcinog. – 2011. – V. 50 – P. 655-67.
245. Kim, K., Chadalapaka, G., Pathi, S.S., Jin, U.H., Lee, J.S., Park, Y.Y., Cho, S.G.,
Chintharlapalli, S., Safe, S. Induction of the transcriptional repressor ZBTB4 in prostate cancer
cells by drug-induced targeting of microRNA-17-92/106b-25 clusters. // Mol. Cancer Ther. –
2012. – V. 11 – P. 1852-62.
246. Porta, C., Paglino, C., Mosca, A. Targeting PI3K/Akt/mTOR signaling in cancer. // Front. Oncol.
– 2014. – V. 4 – P. 64.
247. Park, S., Chapuis, N., Tamburini, J., Bardet, V., Cornillet-Lefebvre, P., Willems, L., Green, A.,
Mayeux, P., Lacombe, C., Bouscary, D. Role of the PI3K/AKT and mTOR signaling pathways
in acute myeloid leukemia. // Haematologica. – 2010. – V. 95 – P. 819-28.
248. Scheper, G.C., Proud, C.G. Does phosphorylation of the cap-binding protein eIF4E play a role in
translation initiation? // Eur. J. Biochem. – 2002. – V. 269 – P. 5350-9.
249. Kis, A., Yellon, D.M., Baxter, G.F. Second window of protection following myocardial
preconditioning: an essential role for PI3 kinase and p70S6 kinase. // J. Mol. Cell. Cardiol. –
2003. – V. 35 – P. 1063-71.
250. Crino, P.B., Nathanson, K.L., Henske, E.P. The tuberous sclerosis complex. // N. Engl. J. Med. –
2006. – V. 355 – P. 1345–1356.
165
251. Oeckinghaus, A., Hayden, M.S., Ghosh, S. Crosstalk in NF-κB signaling pathways. // Nat.
Immunol. – 2011. – V. 12 – P. 695-708.
252. Bentires-Alj, M., Barbu, V., Fillet, M., Chariot, A., Relic, B., Jacobs, N., Gielen, J., Merville,
M.P., Bours, V. NF-kappaB transcription factor induces drug resistance through MDR1
expression in cancer cells. // Oncogene. – 2003. – V. 22 – P. 90-7.
253. Cao, Y., Karin, M. NF-kappaB in mammary gland development and breast cancer. // J.
Mammary Gland Biol. Neoplasia. – 2003. – V. 8 – P. 215-23.
254. Karin, M., Lin, A. NF-kappaB at the crossroads of life and death. // Nat. Immunol. – 2002. – V.
3 – P. 221-7.
255. Yoshimura, A. Signal transduction of inflammatory cytokines and tumor development. // Cancer
Sci. – 2006. – V. 97 – P. 439-47.
256. Zhao, F., Lam, E.W. Role of the forkhead transcription factor FOXO-FOXM1 axis in cancer and
drug resistance. // Front. Med. – 2012. – V. 6 – P. 376-380.
257. Hommes, D.W., Peppelenbosch, M.P., van Deventer, S.J. Mitogen activated protein (MAP)
kinase signal transduction pathways and novel anti-inflammatory targets. // Gut. – 2003. – V. 52
– P. 144-51.
258. Sebolt-Leopold, J.S., Herrera, R. Targeting the mitogen-activated protein kinase cascade to treat
cancer. // Nat. Rev. Cancer. – 2004. – V. 4 – P. 937-47.
259. Cuadrado, A., Nebreda, A.R. Mechanisms and functions of p38 MAPK signaling. // Biochem. J.
– 2010. – V. 429 – P. 403-17.
260. Sabapathy, K. Role of the JNK pathway in human diseases. // Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. –
2012. – V. 106 – P. 145-69.
261. Bobilev, I., Novik, V., Levi, I., Shpilberg, O., Levy, J., Sharoni, Y., Studzinski, G.P., Danilenko,
M. The Nrf2 transcription factor is a positive regulator of myeloid differentiation of acute
myeloid leukemia cells. // Cancer. Biol. Ther. – 2011. –V. 11 – P. 317-29.
262. Yamada, T., Egashira, N., Bando, A., Nishime, Y., Tonogai, Y., Imuta, M., Yano, T., Oishi, R.
Activation of p38 MAPK by oxidative stress underlying epirubicin-induced vascular endothelial
cell injury. // Free Radic. Biol. Med. – 2012. – V. 52 – P. 1285-93.
263. Chun, K.S., Surh. Y.J. Signal transduction pathways regulating cyclooxygenase-2 expression:
potential molecular targets for chemoprevention. // Biochem. Pharmacol. – 2004. – V. 68 – P.
1089-100.
264. Son, Y., Cheong, Y.K., Kim, N.H., Chung, H.T., Kang, D.G., Pae, H.O. Mitogen-Activated
Protein Kinases and Reactive Oxygen Species: How Can ROS Activate MAPK Pathways? // J.
Signal Transduct. – 2011. - V. 2011 – P. 792639.
265. Di, L., Kerns, E.H., Carter, G.T. Drug-like property concepts in pharmaceutical design. // Curr.
Pharm. Des. – 2009. – V. 15 – P. 2184-94.
266. Rautio, J., Kumpulainen, H., Heimbach, T., Oliyai, R., Oh, D., Järvinen, T., Savolainen, J.
Prodrugs: design and clinical applications. // Nat. Rev. Drug Discov. – 2008. – V. 7 – P. 255-70.
166
267. Huttunen, K.M., Raunio, H., Rautio, J. Prodrugs – from serendipity to rational design. //
Pharmacol. Rev. – 2011. – V. 63 – P. 750-71.
268. Ettmayer, P., Amidon, G.L., Clement, B., Testa, B. Lessons learned from marketed and
investigational prodrugs. // J. Med. Chem. – 2004. – V. 47 – P. 2393-404.
269. Beaumont, K., Webster, R., Gardner, I., Dack, K. Design of ester prodrugs to enhance oral
absorption of poorly permeable compounds: challenges to the discovery scientist. // Curr. Drug.
Metab. – 2003. – V. 4 – P. 461-85.
270. Yang, C.Y., Dantzig, A.H., Pidgeon, C. Intestinal peptide transport systems and oral drug
availability. // Pharm. Res. – 1999. – V. 16 – P. 1331-43.
271. Jousserandot, A., Boucher, J.L., Henry, Y., Niklaus, B., Clement, B., Mansuy, D. Microsomal
cytochrome P450 dependent oxidation of N-hydroxyguanidines, amidoximes, and ketoximes:
mechanism of the oxidative cleavage of their C=N(OH) bond with formation of nitrogen oxides.
// Biochemistry. – 1998. – V. 37 – P. 17179-91.
272. Greenfield, R.S., Kaneko, T., Daues, A., Edson, M.A., Fitzgerald, K.A., Olech, L.J., Grattan,
J.A., Spitalny, G.L., Braslawsky, G.R. Evaluation in vitro of adriamycin immunoconjugates
synthesized using an acid-sensitive hydrazone linker. // Cancer Res. – 1990. – V. 50 – P. 6600-7.
273. Hudecz, F., Ross, H., Price, M.R., Baldwin, R.W. Immunoconjugate design: a predictive
approach for coupling of daunomycin to monoclonal antibodies. // Bioconjug. Chem. – 1990. –
V. 1 – P. 197-204.
274. Stubbs, M., McSheehy, P.M., Griffiths, J.R., Bashford, C.L. Causes and consequences of tumour
acidity and implications for treatment. // Mol. Med. Today. – 2000. – V. 6 – P. 15-9.
275. Li, F., Maag, H., Alfredson, T. Prodrugs of nucleoside analogues for improved oral absorption
and tissue targeting. // J. Pharm. Sci. – 2008. – V. 97 – P. 1109-34.
276. Stella, V.J., Nti-Addae, K.W. Prodrug strategies to overcome poor water solubility. // Adv. Drug
Deliv. Rev. – 2007. – V. 59 – P. 677-94.
277. Hirata, K., Helal, F., Hadgraft, J., Lane, M.E. Formulation of carbenoxolone for delivery to the
skin. // Int. J. Pharm. – 2013. – V. 448 – P. 360-5.
278. Shearman, D.J., Hetzel, D. The medical management of peptic ulcer. // Annu. Rev. Med. – 1979.
– V. 30 – P. 61–79.
279. Zacchigna, M., Cateni, F., Drioli, S., Procida, G., Altieri, T. PEG–Ursolic Acid Conjugate:
Synthesis and In Vitro Release Studies. // Sci. Pharm. – 2014. – V. 82 – P. 411–421.
280. Dai, L., Li, D., Cheng, J., Liu, J., Deng, L.H., Wang, L.Y., Lei, J.D., He, J. Water soluble
multiarm-polyethylene glycol–betulinic acid prodrugs: design, synthesis, and in vivo
effectiveness. // Polym. Chem. – 2014. – V. 5 – P. 5775-5783.
281. Jeong, H.J., Chai, H.B., Park, S.Y., Kim, D.S. Preparation of amino acid conjugates of betulinic
acid with activity against human melanoma. // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 1999. – V. 9 – P.
1201-4.
282. Lu, X.M., Yi, H.W., Xu, J.L., Sun, Y., Li, J.X., Cao, S.X., Xu, Q. A novel synthetic oleanolic
acid derivative with amino acid conjugate suppresses tumour growth by inducing cell cycle
arrest. // J. Pharm. Pharmacol. – 2007. – V. 59 – P. 1087-93.
167
283. Onyango, E.O., Fu, L., Cao, M., Liby, K.T., Sporn, M.B., Gribble, G.W. Synthesis and
biological evaluation of amino acid methyl ester conjugates of 2-cyano-3,12-dioxooleana1,9(11)-dien-28-oic acid against the production of nitric oxide (NO). // Bioorg. Med. Chem. Lett.
– 2014. – V. 24 – P. 532-4.
284. Koga, K., Kawamura, M., Iwase, H., Yoshikawa, N. Intestinal absorption and biliary elimination
of glycyrrhizic acid diethyl ester in rats. // Drug. Des. Devel. Ther. – 2013. – V. 7 – P. 1235-43.
285. Zhang, B., Zhu, X.M., Hu, J.N., Ye, H., Luo, T., Liu, X.R., Li, H.Y., Li, W., Zheng, Y.N., Deng,
Z.Y. Absorption Mechanism of Ginsenoside Compound K and Its Butyl and Octyl Ester
Prodrugs in Caco-2 Cells. // J. Agric. Food Chem. – 2012. – V. 60 – P. 10278−10284.
286. Fromm, M.F. Importance of P-glycoprotein for drug disposition in humans. // Eur. J. Clin.
Invest. – 2003. – V. 33 – P. 6-9.
287. Chen, H., Gao, Y., Wang, A., Zhou, X., Zheng, Y., Zhou, J. Evolution in medicinal chemistry of
ursolic acid derivatives as anticancer agents. // Eur. J. Med. Chem. – 2015. – V. 92 – P. 648-55.
288. Tu, H.Y., Huang, A.M., Wei, B.L., Gan, K.H., Hour, T.C., Yang, S.C., Pu, Y.S., Lin, C.N.
Ursolic acid derivatives induce cell cycle arrest and apoptosis in NTUB1 cells associated with
reactive oxygen species. // Bioorg. Med. Chem. – 2009. – V. 17 – P. 7265-74.
289. Akhtar, M.J., Ahamed, M., Alhadlaq, H.A., Alrokayan, S.A., Kumar, S. Targeted anticancer
therapy: Overexpressed receptors and nanotechnology. // Clin. Chim. Acta. – 2014. – V. 436 – P.
78-92.
290. Zhou, L., Xu, N., Sun, Y., Liu, X.M. Targeted biopharmaceuticals for cancer treatment. // Cancer
Lett. – 2014. – V. 352 – P. 145-51.
291. Stockert, R. J., Morell, A. G. Hepatic binding protein: The galactose-specific receptor of
mammalian hepatocytes. // Hepatology. – 1983. – V. 3 – P. 750−757.
292. O’Brien, M. L., Tew, K. D. Glutathione and related enzymes in multidrug resistance. // Eur. J.
Cancer. – 1996. – V. 32A – P. 967−978.
293. Fukumura, D., Kashiwagi, S., Jain, R. K. The role of nitric oxide in tumour progression. // Nat.
Rev. Cancer. – 2006. – V. 6 – P. 521−534.
294. Fu, J., Liu, L., Huang, Z., Lai, Y., Ji, H., Peng, S., Tian, J., Zhang, Y. Hybrid molecule from O2(2,4-dinitrophenyl)diazeniumdiolate and oleanolic acid: a glutathione S-transferase π-activated
nitric oxide prodrug with selective anti-human hepatocellular carcinoma activity and improved
stability. // J. Med. Chem. – 2013. – V. 56 – P. 4641-55.
295. Cao, F., Jia, J., Yin, Z., Gao, Y., Sha, L., Lai, Y., Ping, Q., Zhang, Y. Ethylene glycol-linked
amino acid diester prodrugs of oleanolic acid for PepT1-mediated transport: synthesis, intestinal
permeability and pharmacokinetics. // Mol. Pharm. – 2012. – V. 9 – P. 2127−2135.
296. Cao, F., Gao, Y., Wang, M., Fang, L., Ping, Q. Propylene glycol-linked amino acid/dipeptide
diester prodrugs of oleanolic acid for PepT1-mediated transport: synthesis, intestinal
permeability, and pharmacokinetics. // Mol. Pharm. – 2013. – V. 10 – P. 1378-87.
297. Mizuno, N., Niwa, T., Yotsumoto, Y., Sugiyama, Y. Impact of drug transporter studies on drug
discovery and development. // Pharmacol. Rev. – 2003. – V. 55 – P. 425-61.
168
298. Landowski, C.P., Vig, B.S., Song, X., Amidon, G.L. Targeted delivery to PEPT1-overexpressing
cells: acidic, basic, and secondary floxuridine amino acid ester prodrugs. // Mol. Cancer Ther. –
2005. – V. 4 – P. 659-67.
299. Tai, W., Chen, Z., Cheng, K. Expression profile and functional activity of peptide transporters in
prostate cancer cells. // Mol. Pharm. – 2013. – V. 10 – P. 477−487.
300. Fang, L., Wang, M., Gou, S., Liu, X., Zhang, H., Cao, F. Combination of amino acid/dipeptide
with nitric oxide donating oleanolic acid derivatives as PepT1 targeting antitumor prodrugs. // J.
Med. Chem. – 2014. – V. 57 – P. 1116-20.
301. Low, P.S., Antony, A.C. Folate receptor-targeted drugs for cancer and inflammatory diseases. //
Adv. Drug Deliv. Rev. – 2004. – V. 56 – P. 1055-8.
302. Gao, Y., Li, Z., Xie, X., Wang, C., You, J., Mo, F., Jin, B., Chen, J., Shao, J., Chen, H., Jia, L.
Dendrimeric anticancer prodrugs for targeted delivery of ursolic acid to folate receptorexpressing cancer cells: Synthesis and biological evaluation. // Eur. J. Pharm. Sci. – 2015. – V.70
– P. 55-63.
303. Gauthier, C., Legault, J., Rondeau, S., Pichette, A. Synthesis of betulinic acid acyl glucuronide
for application in anticancer prodrug monotherapy. // Tetrahedron Letters. – 2009. – V. 50 – P.
988–991.
304. Kratz, F., Müller, I.A., Ryppa, C., Wamecke, A. Prodrug strategies in anticancer chemotherapy.
// Chem. Med. Chem. – 2008. – V. 3 – P. 20–53.
305. Sperker, B., Backman, J.T., Kroemer, H.K. The role of beta-glucuronidase in drug disposition
and drug targeting in humans. // Clin. Pharmacokinet. – 1997. – V. 33 – P. 18–31.
306. Peng, W.B., Sun, W.Z., Jiang, T., Li, G.Q., Dai, S.J. In vitro and in vivo pharmacokinetics of
two novel 1,3-cyclic propanyl phosphate ester prodrugs of 18β-glycyrrhetic acid in rats. // J.
Asian Nat. Prod. Res. – 2010. – V. 12 – P. 879-93.
307. Huttunen, K.M., Mähönen, N., Leppänen, J., Vepsäläinen, J., Juvonen, R.O., Raunio, H.,
Kumpulainen, H., Järvinen, T., Rautio, J. Novel cyclic phosphate prodrug approach for
cytochrome P450-activated drugs containing an alcohol functionality. // Pharm. Res. – 2007. –
V. 24 – P. 679-87.
308. Sultana, N., Ata, A. Oleanolic acid and related derivatives as medicinally important compounds.
// J. Enzyme Inhib. Med. Chem. – 2008. – V. 23 – P. 739-56.
309. Zhang, D.M., Xu, H.G., Wang, L., Li, Y.J., Sun, P.H., Wu, X.M., Wang, G.J., Chen, W.M., Ye,
W.C. Betulinic Acid and its Derivatives as Potential Antitumor Agents. // Med. Res. Rev. –
2015. – doi: 10.1002/med.21353.
310. Lallemand, B., Gelbcke, M., Dubois, J., Prévost, M., Jabin, I., Kiss, R. Structure-activity
relationship analyses of glycyrrhetinic acid derivatives as anticancer agents. // Mini Rev. Med.
Chem. – 2011. – V. 11 – P. 881-7.
311. Stanetty, C., Wolkerstorfer, A., Amer, H., Hofinger, A., Jordis, U., Claßen-Houben, D., Kosma,
P. Synthesis and antiviral activities of spacer-linked 1-thioglucuronide analogues of glycyrrhizin.
// Beilstein J. Org. Chem. – 2012. – V. 8 – P. 705-11.
169
312. Harada, S., Maekawa, T., Haneda, E., Morikawa, Y., Nagata, N., Ohtsuki, K. Biochemical
characterization of recombinant HIV-1 reverse transcriptase (rRT) as a glycyrrhizin-binding
protein and the CK-II-mediated stimulation of rRT activity potently inhibited by glycyrrhetinic
acid derivative. // Biol. Pharm. Bull. – 1998. – V. 21 – P. 1282-5.
313. Zhou, X., Zhao, L., Liu, X., Li, X., Jia, F., Zhang, Y., Wang, Y. Antimycobacterial and
synergistic effects of 18β-glycyrrhetinic acid or glycyrrhetinic acid-30-piperazine in combination
with isoniazid, rifampicin or streptomycin against Mycobacterium bovis. // Phytother. Res. –
2012. – V. 26 – P. 253-8.
314. Ma, C.M., Cai, S.Q., Cui, J.R., Wang, R.Q., Tu, P.F., Hattori, M., Daneshtalab, M. The cytotoxic
activity of ursolic acid derivatives. // Eur. J. Med. Chem. – 2005. – V. 40 – P. 582-9.
315. Csuk, R., Schwarz, S., Siewert, B., Kluge, R., Ströhl, D. Synthesis and antitumor activity of ring
A modified glycyrrhetinic acid derivatives. // Eur. J. Med. Chem. – 2011. – V. 46 – P. 5356-69.
316. Liu, D., Song, D., Guo, G., Wang, R., Lv, J., Jing, Y., Zhao, L. The synthesis of 18betaglycyrrhetinic acid derivatives which have increased antiproliferative and apoptotic effects in
leukemia cells. // Bioorg. Med. Chem. – 2007. – V. 15 – P. 5432-9.
317. Csuk, R., Schwarz, S., Kluge, R., Ströhl, D. Does one keto group matter? Structure-activity
relationships of glycyrrhetinic acid derivatives modified at position C-11. // Arch. Pharm.
(Weinheim). – 2012. – V.345 – P. 28-32.
318. Nakagawa-Goto, K., Nakamura, S., Bastow, K.F., Nyarko, A., Peng, C.Y., Lee, F.Y., Lee, F.C.,
Lee, K.H. Antitumor agents. 256. Conjugation of paclitaxel with other antitumor agents:
evaluation of novel conjugates as cytotoxic agents. // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2007. – V. 17
– P. 2894-8.
319. Schwarz, S., Csuk, R. Synthesis and antitumour activity of glycyrrhetinic acid derivatives. //
Bioorg. Med. Chem. – 2010. – V. 18 – P. 7458-74.
320. Lallemand, B., Chaix, F., Bury, M., Bruyère, C., Ghostin, J., Becker, J.P., Delporte, C., Gelbcke,
M., Mathieu, V., Dubois, J., Prévost, M., Jabin, I., Kiss, R. N-(2-{3-[3,5bis(trifluoromethyl)phenyl]ureido}ethyl)-glycyrrhetinamide
(6b):
a
novel
anticancer
glycyrrhetinic acid derivative that targets the proteasome and displays anti-kinase activity. // J.
Med. Chem. – 2011. – V. 54 – P. 6501-13.
321. Tatsuzaki, J., Taniguchi, M., Bastow, K.F., Nakagawa-Goto, K., Morris-Natschke, S.L., Itokawa,
H., Baba, K., Lee, K.H. Anti-tumor agents 255: novel glycyrrhetinic acid-dehydrozingerone
conjugates as cytotoxic agents. // Bioorg. Med. Chem. – 2007. – V. 15 – P. 6193-9.
322. Shi, J., Xiao, J., Wei, D. Synthesis of biotinylated 18β-glycyrrhetinic acid and its effect on tumor
cells activity. // Med. Chem. Res. – 2009. – V. 18 – P. 538–544.
323. Tan, J., Lai, Z., Liu, L., Long, W., Chen, T., Zha, J., Wang, L., Chen, M., Ji, H., Lai, Y. ONTD
induces apoptosis of human hepatoma Bel-7402 cells via a MAPK-dependent mitochondrial
pathway and the depletion of intracellular glutathione. // Int. J. Biochem. Cell Biol. – 2013. – V.
45 – P. 2632-42.
324. Gao, C., Dai, F.J., Cui, H.W., Peng, S.H., He, Y., Wang, X., Yi, Z.F., Qiu, W.W. Synthesis of
novel heterocyclic ring-fused 18β-glycyrrhetinic acid derivatives with antitumor and
antimetastatic activity. // Chem. Biol. Drug Des. – 2014. – V. 84 – P. 223-33.
170
325. Parida, P.K., Sau, A., Ghosh, T., Jana, K., Biswas, K., Raha, S., Misra, A.K. Synthesis and
evaluation of triazole linked glycosylated 18β-glycyrrhetinic acid derivatives as anticancer
agents. // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2014. – V. 24 – P. 3865-8.
326. Csuk, R., Schwarz, S., Siewert, B., Kluge, R., Ströhl, D. Conversions at C-30 of glycyrrhetinic
acid and their impact on antitumor activity. // Arch. Pharm. (Weinheim). – 2012. – V. 345 – P.
223-30. (b)
327. Csuk, R., Schwarz, S., Kluge, R., Ströhl, D. Improvement of the cytotoxicity and tumor
selectivity of glycyrrhetinic acid by derivatization with bifunctional amino acids. // Arch. Pharm.
(Weinheim). – 2011. – V. 344 – P. 505-13. (b)
328. Ablise, M., Leininger-Muller, B., Wong, C.D., Siest, G., Loppinet, V., Visvikis, S. Synthesis and
in vitro antioxidant activity of glycyrrhetinic acid derivatives tested with the cytochrome
P450/NADPH system. // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). – 2004. – V. 52 – P. 1436-9.
329. Maitraie, D., Hung, C.F., Tu, H.Y., Liou, Y.T., Wei, B.L., Yang, S.C., Wang, J.P., Lin, C.N.
Synthesis, anti-inflammatory, and antioxidant activities of 18beta-glycyrrhetinic acid derivatives
as chemical mediators and xanthine oxidase inhibitors. // Bioorg. Med. Chem. – 2009. – V. 17 –
P. 2785-92.
330. Chen, T., Mou, Y., Tan, J., Wei, L., Qiao, Y., Wei, T., Xiang, P., Peng, S., Zhang, Y., Huang, Z.,
Ji, H. The protective effect of CDDO-Me on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in
mice. // Int. Immunopharmacol. – 2015. – V. 25 – P. 55-64.
331. Kulkarni, A.A., Thatcher, T.H., Hsiao, H.M., Olsen, K.C., Kottmann, R.M., Morrissette, J.,
Wright, T.W., Phipps, R.P., Sime, P.J. The triterpenoid CDDO-Me inhibits bleomycin-induced
lung inflammation and fibrosis. // PLoS One. – 2013. – V. 8 – P. e63798.
332. Liu, M., Reddy, N.M., Higbee, E.M., Potteti, H.R., Noel, S., Racusen, L., Kensler, T.W., Sporn,
M.B., Reddy, S.P., Rabb, H. The Nrf2 triterpenoid activator, CDDO-imidazolide, protects
kidneys from ischemia-reperfusion injury in mice. // Kidney Int. – 2014. – V. 85 – P. 134-41.
333. Neymotin, A., Calingasan, N.Y., Wille, E., Naseri, N., Petri, S., Damiano, M., Liby, K.T.,
Risingsong, R., Sporn, M., Beal, M.F., Kiaei, M. Neuroprotective effect of Nrf2/ARE activators,
CDDO ethylamide and CDDO trifluoroethylamide, in a mouse model of amyotrophic lateral
sclerosis. // Free Radic. Biol. Med. – 2011. – V. 51 – P. 88-96.
334. Johansson, M.H. Reversible Michael additions: covalent inhibitors and prodrugs. // Mini Rev.
Med. Chem. – 2012. – V. 12 – P. 1330-44.
335. Couch, R.D., Browning, R.G., Honda, T., Gribble, G.W., Wright, D.L., Sporn, M.B., Anderson,
A.C. Studies on the reactivity of CDDO, a promising new chemopreventive and
chemotherapeutic agent: implications for a molecular mechanism of action. // Bioorg. Med.
Chem. Lett. – 2005. – V. 15 – P. 2215-9.
336. Dinkova-Kostova, A.T., Liby, K.T., Stephenson, K.K., Holtzclaw, W.D., Gao, X., Suh, N.,
Williams, C., Risingsong, R., Honda, T., Gribble, G.W., Sporn, M.B., Talalay, P. Extremely
potent triterpenoid inducers of the phase 2 response: correlations of protection against oxidant
and inflammatory stress. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 2005. – V. 102 – P. 4584-9.
171
337. Fiore, C., Salvi, M., Palermo, M., Sinigaglia, G., Armanini, D., Toninello, A. On the mechanism
of mitochondrial permeability transition induction by glycyrrhetinic acid. // Biochim. Biophys.
Acta. – 2004. – V. 1658 – P. 195-201.
338. Yogosawa, S., Yamada, Y., Yasuda, S., Sun, Q., Takizawa, K., Sakai, T. Dehydrozingerone, a
structural analogue of curcumin, induces cell-cycle arrest at the G2/M phase and accumulates
intracellular ROS in HT-29 human colon cancer cells. // J. Nat. Prod. – 2012. – V. 75 – P. 208893.
339. Tian, D., Zhang, W., He, J., Liu, Y., Song, Z., Zhou, Z., Zheng, M., Hu, Y. Novel, real-time cell
analysis for measuring viral cytopathogenesis and the efficacy of neutralizing antibodies to the
2009 influenza A (H1N1) virus. // PLoS One. – 2012. – V. 7 –P. e31965.
340. Chen, D.Y., Chiou S.S., Hsu W.L., Shien J.H., Chang T.J., Lee Y.J., Chan K.W., Tiley L., Wang
S.Y. Curcumin inhibits influenza virus infection and haemagglutination activity. // Food
Chemistry. – 2010. – V. 119 – P. 1346-1351.
341. Rajasekaran, D., Palombo, E.A., Chia Yeo, T., Lim Siok Ley, D., Lee Tu, C., Malherbe, F.,
Grollo, L. Identification of traditional medicinal plant extracts with novel anti-influenza activity.
// PLoS One. – 2013. – V. 8 – P. e79293.
342. Albin, R., Chase, R., Risano, C., Lieberman, M., Ferrari, E., Skelton, A., Buontempo, P., Cox,
S., DeMartino, J., Wright-Minogue, J., Jirau-Lucca, G., Kelly, J., Afonso, A., Kwong, A.D.,
Rozhon, E.J., O'Connell, J.F. SCH 43478 and analogs: in vitro activity and in vivo efficacy of
novel agents for herpesvirus type 2. // Antiviral Res. – 1997. – V. 35 – P. 139-46.
343. Dempsey, M.E. Regulation of steroid biosynthesis. // Annu. Rev. Biochem. – 1974. – V. 43 – P.
967-90.
344. Chien, J.M., Chou, C.T., Liang, W.Z., Cheng, J.S., Chang, H.T., Tseng, H.W., Kuo, S.Y., Kuo.
C.C., Chen. F.A., Shieh, P., Ho, C.M., Lin, J.R., Kuo, D.H., Jan, C.R. Effect of deoxycholic acid
on Ca2+ movement, cell viability and apoptosis in human gastric cancer cells. // Toxicol. Mech.
Methods. – 2015. –V. 25 – P. 113-9.
345. Song, W., Yang, H.B., Chen, P., Wang, S.M., Zhao, L.P., Xu, W.H., Fan, H.F., Gu, X., Chen,
L.Y. Apoptosis of human gastric carcinoma SGC-7901 induced by deoxycholic acid via the
mitochondrial-dependent pathway. // Appl. Biochem. Biotechnol. – 2013. – V. 171 – P. 1061-71.
346. Ignacio Barrasa, J., Olmo, N., Pérez-Ramos, P., Santiago-Gómez, A., Lecona, E., Turnay, J.,
Antonia Lizarbe, M. Deoxycholic and chenodeoxycholic bile acids induce apoptosis via
oxidative stress in human colon adenocarcinoma cells. // Apoptosis. – 2011. – V. 16 – P. 105467.
347. Yui, S., Kanamoto, R., Saeki, T. Deoxycholic acid can induce apoptosis in the human colon
cancer cell line HCT116 in the absence of Bax. // Nutr. Cancer. – 2008. – V. 60 – P. 91-6.
348. Katona, B.W., Rath, N.P., Anant, S., Stenson, W.F., Covey, D.F. Enantiomeric deoxycholic acid:
total synthesis, characterization, and preliminary toxicity toward colon cancer cell lines. // J. Org.
Chem. – 2007. – V. 72 – P. 9298-307.
349. Chiang, J.Y. Bile acid metabolism and signaling. // Compr. Physiol. – 2013. – V. 3 – P. 1191212.
172
350. Noonan, K.E., Beck, C., Holzmayer, T.A., Chin, J.E., Wunder, J.S., Andrulis, I.L., Gazdar, A.F.,
Willman, C.L., Griffith, B., Von Hoff, D.D., Roninson, I.B. Quantitative analysis of MDR1
(multidrug resistance) gene expression in human tumors by polymerase chain reaction. // Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 1990. – V. 87 – P. 7160-4.
351. Devaux, P.F. Protein involvement in transmembrane lipid asymmetry. // Annu. Rev. Biophys.
Biomol. Struct. – 1992. – V. 21 – P. 417-39.
352. Zhang, A., Wu, Y. Apoptosis – a brief review. // Neuroembryology. – 2004. – V. 3 – P. 47-59.
353. Jänicke, R.U., Sprengart, M.L., Wati, M.R., Porter, A.G. Caspase-3 is required for DNA
fragmentation and morphological changes associated with apoptosis. // J. Biol. Chem. – 1998. –
V. 273 – P. 9357-60.
354. Bertolotti, A., Lutz, Y., Heard, D.J., Chambon, P., Tora, L. hTAF(II)68, a novel RNA/ssDNAbinding protein with homology to the pro-oncoproteins TLS/FUS and EWS is associated with
both TFIID and RNA polymerase II. // EMBO J. – 1996. – V. 15 – P. 5022-31.
355. Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. //
Adv. Cancer Res. – 2014. – V. 124 – P. 31-82
356. Aldemir, H., Prod'homme, V., Dumaurier, M.J., Retiere, C., Poupon, G., Cazareth, J., Bihl, F.,
Braud, V.M. Cutting edge: lectin-like transcript 1 is a ligand for the CD161 receptor. // J.
Immunol. – 2005. – V. 175 – P. 7791-5.
357. Hjortsø, M.D., Andersen, M.H. The expression, function and targeting of haem oxygenase-1 in
cancer. // Curr. Cancer Drug Targets. – 2014. –V. 14 – P. 337-47.
358. Was, H., Dulak, J., Jozkowicz, A. Heme oxygenase-1 in tumor biology and therapy. // Curr.
Drug Targets. – 2010. – V. 11 – P. 1551-70.
359. Yin, Y., Liu, Q., Wang, B., Chen, G., Xu, L., Zhou, H. Expression and function of heme
oxygenase-1 in human gastric cancer. // Exp. Biol. Med. (Maywood) – 2012. – V. 237 – P. 362–
371.
360. Miyake, M., Fujimoto, K., Anai, S., Ohnishi, S., Nakai, Y., Inoue, T., Matsumura, Y., Tomioka,
A., Ikeda, T., Tanaka, N., Hirao, Y. Clinical significance of heme oxygenase-1 expression in
non-muscle-invasive bladder cancer. // Urol. Int. – 2010. – V. 85 – P. 355–363.
361. Miyake, M., Fujimoto, K., Anai, S., Ohnishi, S., Nakai, Y., Inoue, T., Matsumura, Y., Tomioka,
A., Ikeda, T., Okajima, E., Tanaka, N., Hirao, Y. Inhibition of heme oxygenase-1 enhances the
cytotoxic effect of gemcitabine in urothelial cancer cells. // Anticancer Res. – 2010 – V. 30 – P.
2145–2152.
362. Heasman, S.A., Zaitseva, L., Bowles, K.M., Rushworth, S.A., Macewan, D.J. Protection of acute
myeloid leukaemia cells from apoptosis induced by frontline chemotherapeutics is mediated by
haem oxygenase-1. // Oncotarget. – 2011. – V. 2 – P. 658–668.
363. Ma, D., Fang, Q., Li, Y., Wang, J., Sun, J., Zhang, Y., Hu, X., Wang, P., Zhou, S. Crucial role of
heme oxygenase-1 in the sensitivity of acute myeloid leukemia cell line Kasumi-1 to ursolic
acid. // Anticancer Drugs. – 2014. – V. 25 – P. 406-14.
364. Liby, K., Hock, T., Yore, M.M., Suh, N., Place, A.E., Risingsong, R., Williams, C.R., Royce,
D.B., Honda, T., Honda, Y., Gribble, G.W., Hill-Kapturczak, N., Agarwal, A., Sporn, M.B. The
173
synthetic triterpenoids, CDDO and CDDO-imidazolide, are potent inducers of heme oxygenase1 and Nrf2/ARE signaling. // Cancer Res. – 2005. –V. 65 – P. 4789-98.
365. Szegezdi, E., Logue, S.E., Gorman, A.M., Samali, A. Mediators of endoplasmic reticulum stressinduced apoptosis // EMBO Rep. – 2006. – V. 7 – P. 880-5.
366. Zheng, Q.Y., Li, P.P., Jin, F.S., Yao, C., Zhang, G.H., Zang, T., Ai, X. Ursolic acid induces ER
stress response to activate ASK1-JNK signaling and induce apoptosis in human bladder cancer
T24 cells. // Cell Signal. – 2013. – V. 25 – P. 206-13.
367. Chaudhari, N., Talwar, P., Parimisetty, A., Lefebvre d'Hellencourt, C., Ravanan, P. A molecular
web: endoplasmic reticulum stress, inflammation, and oxidative stress. // Front. Cell. Neurosci. –
2014. – V. 8- P. 213.
368. Logashenko, E.B., Salomatina, O.V., Markov, A.V., Korchagina, D.V., Salakhutdinov, N.F.,
Tolstikov, G.A., Vlassov, V.V., Zenkova, M.A. Synthesis and pro-apoptotic activity of novel
glycyrrhetinic acid derivatives. // Chembiochem. – 2011. – V. 12 – P. 784-94.
369. Cui, H., Kong, Y., Zhang, H. Oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging. // J. Signal
Transduct. – 2012. – V. 2012 – P. 646354.
370. Bassermann, F., Frescas, D., Guardavaccaro, D., Busino, L., Peschiaroli, A., Pagano, M. The
Cdc14B-Cdh1-Plk1 axis controls the G2 DNA-damage-response checkpoint. // Cell. – 2008. –
V. 134 – P. 256-67.
371. Niculescu, A.B. 3rd., Chen, X., Smeets, M., Hengst, L., Prives, C., Reed. S.I.. Effects of
p21(Cip1/Waf1) at both the G1/S and the G2/M cell cycle transitions: pRb is a critical
determinant in blocking DNA replication and in preventing endoreduplication. // Mol. Cell. Biol.
– 1998. – V. 18 – P. 629-43.
372. Dong, S., Kiyama, R. Characterisation of oestrogenic activity of ginsenosides in MCF-7 cells
using a customised DNA microarray. // Food Chemistry. – 2009. – V. 113 – P. 672-678.
373. Kadowaki, H., Nishitoh, H. Signaling pathways from the endoplasmic reticulum and their roles
in disease. // Genes (Basel). – 2013. – V. 4 – P. 306-33.
374. Pfaffenbach, K.T., Lee, A.S. The critical role of GRP78 in physiologic and pathologic stress. //
Curr. Opin. Cell Biol. – 2011. – V. 23 – P. 150-6.
375. Ma, Y., Hendershot, L.M. ER chaperone functions during normal and stress conditions. // J.
Chem. Neuroanat. – 2004. – V. 28 – P. 51-65.
376. Lee, A.H., Iwakoshi, N.N., Glimcher, L.H. XBP-1 regulates a subset of endoplasmic reticulum
resident chaperone genes in the unfolded protein response. // Mol. Cell. Biol. – 2003. – V. 23 –
P. 7448-59.
377. Hoseki, J., Ushioda, R., Nagata, K. Mechanism and components of endoplasmic reticulumassociated degradation. // J. Biochem. – 2010. – V. 147 – P. 19-25.
378. Ueki, K., Kadowaki, T. The other sweet face of XBP-1. // Nat. Med. – 2011. – V. 17 – P. 246-8.
379. Todd, D.J., Lee, A.H., Glimcher, L.H. The endoplasmic reticulum stress response in immunity
and autoimmunity. // Nat. Rev. Immunol. – 2008. – V. 8 – P. 663-74.
174
380. Wick, G., Berger, P., Jansen-Dürr, P., Grubeck-Loebenstein, B. A Darwinian-evolutionary
concept of age-related diseases. // Exp. Gerontol. – 2003 – V. 38 – P. 13-25.
381. Hitomi, J., Katayama, T., Eguchi, Y., Kudo, T., Taniguchi, M., Koyama, Y., Manabe, T.,
Yamagishi, S., Bando. Y., Imaizumi, K., Tsujimoto, Y., Tohyama, M. Involvement of caspase-4
in endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis and Abeta-induced cell death. // J. Cell Biol. –
2004. – V. 165 – P. 347-56.
382. Hossain, G.S., van Thienen, J.V., Werstuck, G.H., Zhou, J., Sood, S.K., Dickhout, J.G., de
Koning, A.B., Tang, D., Wu, D., Falk, E., Poddar, R., Jacobsen, D.W., Zhang, K., Kaufman,
R.J., Austin, R.C. TDAG51 is induced by homocysteine, promotes detachment-mediated
programmed cell death, and contributes to the cevelopment of atherosclerosis in
hyperhomocysteinemia. // J. Biol. Chem. – 2003 – V. 278 – P. 30317-27.
383. Johnson, E.O., Chang, K.H., de Pablo, Y., Ghosh, S., Mehta, R., Badve, S., Shah, K. PHLDA1 is
a crucial negative regulator and effector of Aurora A kinase in breast cancer. // J. Cell Sci. –
2011. – V. 124 – P. 2711-22.
384. Yang, H., Park, S.H., Choi, H.J., Moon, Y. The integrated stress response-associated signals
modulates intestinal tumor cell growth by NSAID-activated gene 1 (NAG-1/MIC-1/PTGF-beta).
// Carcinogenesis. – 2010. -V. 31 – P. 703-11.
385. McCullough, K.D., Martindale, J.L., Klotz, L.O., Aw, T.Y., Holbrook, N.J. Gadd153 sensitizes
cells to endoplasmic reticulum stress by down-regulating Bcl2 and perturbing the cellular redox
state. // Mol. Cell. Biol. – 2001. – V. 21 – P. 1249-59.
386. Scull, C.M., Tabas, I. Mechanisms of ER stress-induced apoptosis in atherosclerosis. //
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2011. – V. 31 – P. 2792-7.
387. Yagi, A., Hasegawa, Y., Xiao, H., Haneda, M., Kojima, E., Nishikimi, A., Hasegawa, T.,
Shimokata, K., Isobe, K. GADD34 induces p53 phosphorylation and p21/WAF1 transcription, //
J. Cell. Biochem. – 2003. – V. 90 – P. 1242-9.
388. Yan, C., Lu, D., Hai, T., Boyd DD. Activating transcription factor 3, a stress sensor, activates
p53 by blocking its ubiquitination. // EMBO J. – 2005. – V, 24 – P. 2425-35.
389. Baek, S.J., Kim, J.S., Jackson, F.R., Eling, T.E., McEntee, M.F., Lee, S.H. Epicatechin gallateinduced expression of NAG-1 is associated with growth inhibition and apoptosis in colon cancer
cells. // Carcinogenesis. – 2004. – V. 25 – P. 2425-32.
390. Jiang, H.Y., Wek, S.A., McGrath, B.C., Lu, D., Hai, T., Harding, H.P., Wang, X., Ron, D.,
Cavener, D.R., Wek, R.C. Activating transcription factor 3 is integral to the eukaryotic initiation
factor 2 kinase stress response. // Mol. ell. Biol. – 2004. – V. 24 – P.(3):1365-77.
391. Pelisch, F., Pozzi, B., Risso, G., Muñoz, M.J., Srebrow A. DNA damage-induced heterogeneous
nuclear ribonucleoprotein K sumoylation regulates p53 transcriptional activation. // J. Biol.
Chem. – 2012. – V. 287 – P. 30789-99.
392. Ha, S.A., Shin, S.M., Lee, Y.J., Kim, S., Kim, H.K., Namkoong, H., Lee, H., Lee, Y.S., Cho,
Y.S., Park, Y.G., Jeon, H.M., Oh, C., Kim, J.W. HCCRBP-1 directly interacting with HCCR-1
induces tumorigenesis through P53 stabilization. // Int. J. Cancer. – 2008. – V. 122 – P. 501-8.
175
393. Lecona, E., Barrasa, J.I., Olmo, N., Llorente, B., Turnay, J., Lizarbe, M.A. Upregulation of
annexin A1 expression by butyrate in human colon adenocarcinoma cells: role of p53, NF-Y,
and p38 mitogen-activated protein kinase. // Mol. Cell. Biol. – 2008. – V. 28 – P. 4665-74.
394. Bieging, K.T., Mello, S.S., Attardi, L.D. Unravelling mechanisms of p53-mediated tumour
suppression. // Nat. Rev. Cancer. – 2014. – V. 14 – P. 359-70.
395. Zheltukhin, A.O., Chumakov, P.M. Constitutive and induced functions of the p53 gene. //
Biochemistry (Mosc). – 2010. – V. 75 – P. 1692-721.
396. Piya, S., Kim, J.Y., Bae, J., Seol, D.W., Moon, A.R., Kim, T.H. DUSP6 is a novel transcriptional
target of p53 and regulates p53-mediated apoptosis by modulating expression levels of Bcl-2
family proteins. // FEBS Lett. – 2012. – V. 586 – P. 4233-40.
397. Yang, H., Filipovic, Z., Brown, D., Breit, S.N., Vassilev, L.T. Macrophage inhibitory cytokine1: a novel biomarker for p53 pathway activation. // Mol. Cancer Ther. – 2003. – V. 2 – P. 10239.
398. Grimberg, A. P53 and IGFBP-3: apoptosis and cancer protection. // Mol. Genet. Metab. – 2000.
– V. 70 – P. 85-98.
399. Rowland, B.D., Peeper, D.S. KLF4, p21 and context-dependent opposing forces in cancer. // Nat.
Rev. Cancer. – 2006. – V. 6 – P. 11-23.
400. Evans, P.M., Liu, C. Roles of Krüpel-like factor 4 in normal homeostasis, cancer and stem cells.
// Acta Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai). – 2008. – V. 40 – P. 554-64.
401. Zhang, Z., Wu, L., Wang, J., Li, G., Feng, D., Zhang, B., Li, L., Yang, J., Ma, L., Qin, H.
Opposing effects of PI3K/Akt and Smad-dependent signaling pathways in NAG-1-induced
glioblastoma cell apoptosis. // PLoS One. – 2014. – V. 9 – P. e96283.
402. Liu, T., Bauskin, A.R., Zaunders, J., Brown, D.A., Pankhurst, S., Russell, P.J., Breit, S.N.
Macrophage inhibitory cytokine 1 reduces cell adhesion and induces apoptosis in prostate cancer
cells. // Cancer Res. – 2003. – V. 63 – P. 5034-40.
403. Yu, C.Y., Su, K.Y., Lee, P.L., Jhan, J.Y., Tsao, P.H., Chan, D.C., Chen, Y.L. Potential
Therapeutic Role of Hispidulin in Gastric Cancer through Induction of Apoptosis via NAG-1
Signaling. // Evid. Based Complement. Alternat. Med. – 2013. – V. 2013 – P. 518301.
404. Woo, S.M., Min, K.J., Kim, S., Park, J.W., Kim, D.E., Chun, K.S., Kim, Y.H., Lee, T.J., Kim,
S.H., Choi, Y.H., Chang, J.S., Kwon, T.K. Silibinin induces apoptosis of HT29 colon carcinoma
cells through early growth response-1 (EGR-1)-mediated non-steroidal anti-inflammatory drugactivated gene-1 (NAG-1) up-regulation. // Chem. Biol. Interact. – 2014. – V. 211 – P. 36-43.
405. Lee, K.W., Ma, L., Yan, X., Liu, B., Zhang, X.K., Cohen, P. Rapid apoptosis induction by
IGFBP-3 involves an insulin-like growth factor-independent nucleomitochondrial translocation
of RXRalpha/Nur77. // J. Biol. Chem. – 2005. – V. 280 – P. 16942-8.
406. Du, K., Herzig, S., Kulkarni, R.N., Montminy, M. TRB3: a tribbles homolog that inhibits
Akt/PKB activation by insulin in liver. // Science. – 2003 – V. 300 – P. 1574-7.
407. Wu, M., Xu, L.G., Zhai, Z., Shu, H.B. SINK is a p65-interacting negative regulator of NFkappaB-dependent transcription. // J. Biol. Chem. – 2003. – V. 278 – P. 27072-9.
176
408. Wang, L., Guo, Y., Huang, W.J., Ke, X., Poyet, J.L., Manji, G.A., Merriam, S., Glucksmann,
M.A., DiStefano, P.S., Alnemri, E.S., Bertin, J. Card10 is a novel caspase recruitment
domain/membrane-associated guanylate kinase family member that interacts with BCL10 and
activates NF-kappa B. // J. Biol. Chem. – 2001. – V. 276 – P. 21405-9.
409. Matsuda, A., Suzuki, Y., Honda, G., Muramatsu, S., Matsuzaki, O., Nagano, Y., Doi, T.,
Shimotohno, K., Harada, T., Nishida, E., Hayashi, H., Sugano, S. Large-scale identification and
characterization of human genes that activate NF-kappaB and MAPK signaling pathways. //
Oncogene. – 2003. – V. 22 – P. 3307-18.
410. Allen, T.M., Cullis, P.R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications.
// Adv. Drug Deliv. Rev. – 2013. – V. 65 – V. 36-48.
411. Muller, M., Zschornig, O., Ohki, S., Arnold, K. Fusion, leakage and surface hydrophobicity of
vesicles containing phosphoinositides: infl uence of steric and electrostatic effects. // J.
Membrane Biol. - 2003. – V. 192. – P. 33-43.
412. Бовин, Н.В., Водовозова, Е.Л., Моисеева, Е.В., Гаенко, Г.П., Молотковский, Ю.Г.
Применение липидных производных химиотерапевтических средств в липосомальных
формах – метод усиления противоопухолевого эффекта лекарств. // Российский
биотерапевтический журнал. – 2008. – №. 2. – С. 24-33.
413. Руководство
по
эксперименетальному
(доклиническому)
изучению
новых
фармакологических веществ /Под общей редакцией член-корр. РАМН, проф. Р.У.
Хабриева. – 2-е изд., перераб. и доп. – М. – ОАО «Издательство «Медицина». – 2005. –
С.832.
414. Ames, E., Harouna, S., Meyer, C., Welniak, L.A., Murphy, W.J. The triterpenoid CDDO-Me
promotes hematopoietic progenitor expansion and myelopoiesis in mice. // Biol. Blood Marrow
Transplant. – 2012. – V. 18 – P. 396-405.
415. Shin, S., Wakabayashi, J., Yates, M.S., Wakabayashi, N., Dolan, P.M., Aja, S., Liby, K.T.,
Sporn, M.B., Yamamoto, M., Kensler, T.W. Role of Nrf2 in prevention of high-fat diet-induced
obesity by synthetic triterpenoid CDDO-imidazolide. // Eur. J. Pharmacol. – 2009. – V. 620 – P.
138-44.
416. Grivennikov, S.I., Greten, F.R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. // Cell. – 2010. –
V. 140 – P. 883-99.
417. Huang, P., Han, J., Hui, L. MAPK signaling in inflammation-associated cancer development. //
Protein Cell. – 2010. – V. 1 – P. 218-26.
418. Nguyen, D.P., Li, J., Yadav, S.S., Tewari, A.K.. Recent insights into NF-κB signalling pathways
and the link between inflammation and prostate cance.r // BJU Int. – 2014. – V. 114 – P. 168-76.
419. Ludwig, S. Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in
anti-influenza therapy. // J. Antimicrob. Chemother. – 2009. – V. 64 – P. 1-4.
420. Coussens, L.M., Werb, Z. Inflammation and cancer. // Nature. – 2002. – V. 420 – P. 860-7.
421. Wolkerstorfer, A., Kurz, H., Bachhofner, N., Szolar, O.H. Glycyrrhizin inhibits influenza A
virus uptake into the cell. // Antiviral Res. – 2009. – V. 83 – P. 171-8.
177
422. Banerjee, I., Yamauchi, Y., Helenius, A., Horvath, P. High-content analysis of sequential events
during the early phase of influenza A virus infection. // PLoS One. – 2013. – V. 8 – P. e68450.
423. Imai, Y., Kuba, K., Neely, G.G., Yaghubian-Malhami, R., Perkmann, T., van Loo, G.,
Ermolaeva, M., Veldhuizen, R., Leung, Y.H., Wang, H., Liu, H., Sun, Y., Pasparakis, M., Kopf,
M., Mech, C., Bavari, S., Peiris, J.S., Slutsky AS, Akira S, Hultqvist M, Holmdahl R, Nicholls J,
Jiang C, Binder CJ, Penninger JM. Identification of oxidative stress and Toll-like receptor 4
signaling as a key pathway of acute lung injury. // Cell. – 2008. – V. 133 – P. 235-49.
424. Gabay, C., Kushner, I. Acute-phase proteins and other systemic responses to inflammation. // N.
Engl. J. Med. – 1999. – V. 340 – P. 448-54.