ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИЧ
реклама
Приложение №2 Министерство здравоохранения Республики Таджикистан Республиканский центр по профилактике и борьбе за СПИД ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИЧ-ИНФЕКЦИИ Методическое пособие Душанбе – 2009 год ВВЕДЕНИЕ В начале XIX века изучение всех патологий ограничивалось простыми визуальными наблюдениями. Установление причин заболеваний, в том числе инфекционных, на клеточном уровне стало возможно только после создания микроскопов. Примерно в то же время патологи стали использовать в своей работе бактериологические и иммунологические методы, а позже получили развитие клиническая биохимия, гематология, вирусология, цитогенетика. Успехи, достигнутые в диагностике инфекционных заболеваний за последние годы, связанны в основном с применение моноклональных антител и генно-инженерных методов. Этому способствовали два крупных научных события, произошедших в 1975 г. открытие моноклональных антител и создание метода гибридизации на фильтрах. В результате первого из них появилась возможность получать в больших количествах антитела, взаимодействующие с определенными эпитопами (частями антигена, распознаваемыми антигенными рецепторами). Второе имело не менее важные последствия разработаны методы Вестерн-Блотинга, методы определения первичной структуры нуклеиновых кислот, и наконец открытие в 1985 году, американским исследователем К. Мюллесом полимеразной цепной реакции. Эти достижения полностью изменили содержание диагностики инфекционных заболеваний, в том числе ВИЧ-инфекции. Диагностика ВИЧ-инфекции и СПИДа – это многоэтапный и многокомпонентный процесс. Важным условием правильной диагностики ВИЧ-инфекции является объективная интерпретация результатов проведённых анализов. В смысле необходимо выделить следующие категории: ВИЧ - положительные – лица с ВИЧ-инфекцией, у которых установлены положительные результаты тестов на ВИЧ. ВИЧ - отрицательные – лица с отсутствием вируса ВИЧ, и у которых не установлено положительных тестов на ВИЧ. Ложно-положительные на ВИЧ – лица с положительными тестами на ВИЧ, но у которых ВИЧ-инфекция, в самом деле отсутствует. Чувствительность метода – число положительных результатов тестирования делённое на общее число ВИЧ-положительных образцов. Специфичность метода – число отрицательных результатов тестирования делённое на общее число образцов, которых отсутствует вирус. Положительная прогностическая ценность – соотношение лиц с положительными результатами тестирования на ВИЧ, которые, в самом деле, являются ВИЧ-инфицированными. Отрицательная прогностическая ценность - соотношение лиц с отрицательными результатами тестирования на ВИЧ, которые, в самом деле, не являются ВИЧ-инфицированными. Скринирование – выявление инфицированных лиц из большого числа людей, подозреваемых на наличие инфекции. Скринирование обычно осуществляется при помощи иммуноферментного анализа (ИФА) на основе определения антител, специфичных к одному или нескольким вирусным белкам. Уточнения диагноза на основе ИФА путём определения антител, специфичных к вирусным антигенам, отличающихся от тех, которые применялись на этапе скринирования. Обычно скринирование и уточнение диагноза осуществляются путём использования разных тест-наборов ИФА, предназначенных для определения антител, специфичных к различным вирусным белкам. 1. Иммуноферментный анализ в диагностике ВИЧ/СПИД В настоящее время наибольшей распространенностью и широкой популярностью в лабораториях диагностики ВИЧ/СПИД пользуется иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA) c использованием меченных ферментом антител или антигенов. Основу ИФА составляет применение иммобилизованных антигенов ВИЧ, к которым присоединяются антитела из образца крови человека, инфицированного ВИЧ. Вирусные антигены иммобилизуют на дне пластиковых планшетов для ИФА анализа. Обычно от качества пластика зависит эффективность иммобилизации антигена, которая влияет на чувствительность ИФА анализа. Другим важным условием является качество применяемого антигена. Часто применяют вирусные лизаты. Однако предпочтительным является использование рекомбинантных вирусных белков, которые позволяют значительно повысить чувствительность и специфичность теста. В ИФА принято определять противовирусные антитела класса IgG, которые присоединяются к иммобилизованному на дне планшета вирусному антигену и тем самым «вылавливаются» из крови ВИЧ-инфицированного. Эти антитела затем обнаруживаются при помощи уже других антител, конъюгированных с ферментом со специальным красителем. Это так называемые проявляющие антитела, поскольку по их содержанию и количеству судят о наличии ВИЧ-инфекции. О присоединении этих проявляющих антител к противовирусным IgG антителам судят по активности конъюгированного фермента на основании цветовой окраски. Положительную реакцию интерпретируют при помощи спектрофотометра (ридера) на основании степени окрашивания в сравнении с отрицательным контролем. Чувствительность ИФА варьирует от 93 до 100 %.Специфичность ИФА также обычно высокая и составляет, в среднем, около 99%. Причинами ложно-положительных реакций могут явиться такие ситуации, как неправильная лабораторная обработка образцов крови, гемодиализ, а также ряд клинических состояний, к которым относятся аутоиммунные нарушения, множественные миеломы, гемофилия, недавно перенесенная аденовирусная инфекция и алкогольный гепатит. Принцип метода основан на выявлении комплекса антиген- антитело, основными биологическими специфическими компонентами ИФА являются антигены и антитела к ним. Антитела (АТ), называемые также иммуноглобулинами (Ig), - это семейство сывороточных белков, образуемых В-лимфоцитами, обладают способностью к специфическому взаимодействию с гомологичными антигенами. Из 5 классов Ig для ИФА используются практически Ig класса М (антитела этого класса содержатся преимущественно во внутрисосудистом пуле иммуноглобулинов и доминируют в качестве «ранних» антител, чаще всего при иммунном ответе на сложные антигенному составу патогенные микроорганизмы) и G (равномерно распределены между внутри и внесосудистым пулами и составляют большинство антител вторичного иммунного ответа). Моноклинальные антитела (МКА) – это антитела, вырабатываемые одним клоном клеток. Клон - совокупность клеток, происходящих из одной клетки, способной продуцировать данное антитело. АТ, вырабатываемые одним клоном, обладают молекулярной идентичностью и специфичностью, взаимодействуют только с одним антигеном. Такие антитела служат идеальным по специфичности реагентом на ту или иную органическую субстанцию. Возможный ассортимент МКА неограничен. Это могут быть АТ против белков крови и тканей, против специфических антигенов раковых и нормальных клеток, против антигенов вирусов, бактерий, паразитов и т.д. Антигены (АГ) молекулы, которые несут признаки генетической чужеродности и при введении в организм вызывают развитие специфических иммунологических реакций. В основе ИФА лежат два биологических феномена - высокая специфичность антител, т.е. способность реагировать со строго определенными антигенами (эпитопами) и многократное усиление химических реакций ферментами. ИФА состоит из двух этапов: 1. Взаимодействие антител с антигеном 2. Ферментативная индикация комплекса антиген- антитело. В процессе разработки метода были созданы гетерологичные (твердофазные) и гомогенные варианты ИФА, которые принципиально отличаются по способу разделения компонентов иммунохимической реакции. Твердофазные методы основаны на применении антител (антигенов), иммобилизованных (сорбированных) на нерастворимых носителях. Гомогенные методы осуществляются в однофазной системе. Они не требуют стадии механического разделения образовавшихся комплексов, базируясь на эффекте модуляции активности ферментов, используемых для метки ингредиентов реакции. В диагностике инфекционных заболеваний предпочтение отдается твердофазным иммуноферментным реакциям. По сравнению с другими методами выявления антигенов и антител ИФА обладает следующими преимуществами: -высокая чувствительность, позволяющая выявлять искомое вещество в концентрации до 0,05 нг/мл; -возможность использования минимальных объемов исследуемого материала (1-2 мкл); -стабильность при хранении и доступность ингредиентов, необходимых для проведения реакции; -инструментальный или визуальный учет реакции; -экспрессность и возможность автоматизации всех этапов реакции. -иммуносорбент; -исследуемый материал; -конъюгат; -хромоген; Иммуносорбент Получение иммуносорбентов (т.е. антигенов и антител, связанных с носителем) является базисным этапом при разработке твердофазного ИФА. В качестве твердофазных носителей (панели, шарики, палочки), как правило, используют различные пластики, в основном, полистирол. Носители для ИФА должны соответствовать ряду требований, обусловленных спецификой метода. -нерастворимость в условиях проведения анализа; -высокая сорбционная емкость; -прочность связывания белка и стабильность препарата при хранении; -минимальная способность к неспецифическому связыванию; -воспроизводимость результатов (расхождение между однотипными пробами не более 12%). В качестве антигена на твердой фазе используется: -лизат инфицированных клеток; -рекомбинантные антигены; -синтетические пептиды. Лизат инфицированных клеток. В качестве (антиген) АГ на твердую фазу нанесен инактивированный нагреванием лизат культуры инфицированных клеток. Приготовление лизатов - сложный и дорогой процесс, требует очистки от балластных (клеточных) белков. Процедура очистки, в свою очередь небезразлична для специфических белков возбудителя. В итоге суммарное содержание белков в лизатах уменьшается до 2-3% от исходного уровня. Данные тест-системы включают все белки возбудителя, поэтому они выявляют весь спектр специфических антител. Но лизатным тест-системам присуща не только высокая, но и «избыточная» чувствительность; лизатный иммуносорбент «захватывает» из сыворотки неспецифические иммуноглобулины. Рекомбинантные антигены – это генно-инженерные белки, их получают с использованием плазмид (векторов), содержащих фрагменты генома возбудителя. Например, для получения рекомбинантных белков вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в качестве клеток-продуцентов используют чаще всего кишечную палочку, в галактозидазный ген которой встраивают аминокислотные участки генома ВИЧ, кодирующие синтез диагностически важных белков: gp120, gp41, gp160 - для ВИЧ1, gp36 - для ВИЧ 2 (env), p 24, p55 (gag), p31 (роl). «Спаянность» этих белков с галактозидазой E.coli обусловливает существенный недостаток соответствующих тест-систем высокий процент ложноположительных результатов из-за взаимодействия галактозидазного компонента с антителами к нему, имеющимися в крови большинства людей. Поэтому основной задачей приготовления рекомбинантных белков ВИЧ на основе кишечной палочки является их максимальная очистка от галактозидазного балласта. Синтетические пептиды. Современная технология получения таких пептидов основана на отборе посредством компьютерного анализа высококонсервативных доминантных участков (эпитопов) диагностически важных белков, представленных сравнительно небольшим (10-20) числом аминокислотных последовательностей. На втором этапе осуществляется биохимический синтез таких участков. Недостаток пептидных тест-систем является сравнительно низкая чувствительность и, следовательно, риск получения ложноотрицательных результатов. Этот недостаток компенсируется исследованием сывороток в низких разведениях (1:2-1:10), тогда как в лизатных и рекомбинантных ИФА сыворотки обычно разводят 1:100. Риск получения ложноотрицательных результатов в пептидных ИФА может быть связан и с тем, что в сыворотках будут отсутствовать антитела именно к тем антигенным детерминантом, которые моделируются пептидами данной тест-системы. Современные тест-системы имеют комбинацию иммуносорбентов, включающих рекомбинантные, синтетические, высоко очищенные лизатновирионные антигены, а также моноклональные антитела против белка p24 ВИЧ-1. Эти тесты позволяют обнаружить не только антитела к ВИЧ, но и ВИЧ- антиген. Конъюгат Третьим (после иммуносорбента и испытуемого материала) компонентом в твердофазном ИФА является конъюгат - комплекс, состоящий из иммунной части и ферментной (химической). Отсюда происходит и название метода иммуноферментный анализ. Иммунная часть может быть представлена: -моноклональными антителами – Ig A, M, G животных (коз, баранов, реже кроликов), иммунизированных Ig A, M и G человека, -антигенами (лизат инфицированных клеток, рекомбинантные, синтетические белки), -смесь рекомбинантных, синтетических и высоко очищенных лизатновирионных антигенов и моноклональных антител к р24 ВИЧ-1 (тестсистемы для одновременного выявления в сыворотке крови АТ и АГ). Ферментная или химическая часть конъюгата (метка) представлена ферментами (пероксидаза, бета-галактозидаза, щелочная фосфатаза, глюкозидаза), авидин-биотиновыми системами. Конъюгацию проводят таким образом, чтобы имелась возможность соединения иммунной части с АТ или АГ, если таковые имелись в испытуемом материале и были «захвачены» иммуносорбентом с одной стороны, и для взаимодействия ферментной части с хромоген-субстратом с другой. Хромоген На заключительном этапе постановки ИФА в лунки вносят приготовленную ех tempore смесь хромогена (краситель) и субстрата (окислитель- мочевина, перекись водорода – в присутствии которого проходит химическая реакция взаимодействия ферментной метки конъюгата и хромогена). Результат этой химической реакции – цветное окрашивание раствора, в случае положительного ответа. Наиболее распространенные хромогены - орто-фенилендиамин (ОФД) и 3,3, 5,5-тетрааминобензидин (ТАБ), тетраметилбензидин (ТМБ). Проведение иммуноферментного анализа. Существует два основных вида твердофазного иммуноферментного анализа конкурентный и неконкурентный. В обоих случаях можно выявлять антитела и антигены в сыворотке крови. Конкурентный метод используется в двух вариантах. В одном из них (рис.2.1.) антитела к определяемому антигену иммобилизуют на твердой фазе. Исследуемый антиген вносят в лунки в присутствии антигена, меченого ферментом. Чем больше антигена содержится в исследуемой пробе, тем меньше фермента (конъюгированного с антигеном) свяжется с твердой фазой. При этом тестируемый антиген вносят вместе с меченым антигеном (метод одномоментной конкуренции) или с опережением (метод последовательного насыщения). Во втором варианте (рис 2.2.) на твердой фазе иммобилизуют антиген. Антитела в анализируемой пробе конкурируют за связывание с мечеными ферментом антителами. Чем больше в исследуемом образце антител, тем меньше меченых антител свяжется с твердой фазой. Интенсивность окраски будет снижена. П Х П Х П Х П Х П Х П Х П Х П Х П Х П Х П Х П Х Рис 2.1 Рис. 2.1 Конкурентный метод ИФА определения антигенов (вариант с иммобилизованным антителами). А – негативная проба; Б -позитивная (антигенсодержащая) проба. Антиген исследуемого материала связывается с иммуносорбентом (антитела, сорбированные на носителе). Это блокирует связывание стандартного меченого антигена, что выражается снижением интенсивности иммуноферментной реакции соответственно , окраски . П Х П Х Рис. 2.2 Рис. 2.2 Конкурентный метод ИФА определения антител (варианте иммобилизованным антигеном) А - негативная проба; Б – позитивная проба (содержит искомые антитела). Антитела исследуемого материала связываются с иммуносорбентом (антиген, сервированный на носителе). Это блокирует связывание стандартных меченых антител , что ведет к снижению интенсивности иммуноферментной реакции. Неконкурентный метод можно подразделить на два типа – выявления антител и выявления антигенов. В зависимости от этого на твердой фазе сорбируются а/г или а/т. Для выявления антигенов часто применяется метод «прямого сэндвича» (рис.2.3). К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на твердой фазе образуется комплекс антиген –антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют антитела, меченые ферментом. После повторной инкубации и удаления избытка антител, конъюгированных с ферментом, определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. Достоинством этого метода является высокая чувствительность. Сэндвич – метод можно методически упростить, если анализируемый антиген и меченые антитела внести одновременно (рис.2.4). Эта схема называется одностадийным сэндвич – методом. Как и в предыдущем случае, на носители образуется тройной комплекс с участием меченых антител, концентрация которых (а, следовательно, и интенсивность окраски после проявления реакции) пропорциональна начальной концентрации определяемого антигена. Однако чувствительность одностадийного варианта несколько ниже, чем при двух стадийной схеме. Кроме того, контакт фермента с анализируемым антигеном может неблагоприятно сказаться на результатах анализа. Рис. 2.3 Неконкурентный метод ИФА; прямой «сэндвич» - двустадийный вариант. Рис 2.3 Рис. 2.4. Неконкурентный «сэндвич» вариант. метод ИФА: одностадийный прямой Рис 2.4 Использование иммобилизованного и меченого антигена (рис.2.5). Пробу, анализируемую на присутствие антител, инкубируют с иммобилизованным антигеном, и после отмывки от несвязавшихся компонентов для выявления образовавшихся иммунных комплексов проводят инкубацию с меченым антигеном, который вступает во взаимодействие со свободными центрами антител, входящих в состав иммунных комплексов. ПХ ПХ ПХ ПХ Примеры: выявление IgG и IgM анти - HCV, IgM анти - HAV, IgG анти - HEV ПХ Рис.2.5 Неконкурентный метод ИФА: определение антител с использованием иммобилизованного и меченого антигена. Этот метод в последние годы широко используются в зарубежных тестсистемах, так как обладает высокой чувствительностью и позволяет одномоментно определять антитела всех классов. Тест-системы, выявляюшие антитела и антиген используют иммобилизованные моноклональные антитела против р24 ВИЧ1 и иммобилизованные антигены одновременно. А в качестве конюгата: 1-поликлональные меченые антитела против р24 антигена, 2 – антиген с меткой. Рис. 2.6 Определение антител и антигена одновременно. Результат ИФА учитывают по интенсивности окрашивания раствора в лунках после остановки реакции обычно серной кислотой. С помощью спектрофотометра (ридера) с вертикально направленными пучками света замеряют показатели экстинции (оптическую плотность) в лунках с испытуемыми образцами, а также контролями положительных и отрицательных сывороток и коньюгата при длине волны предлагаемой конкретной инструкцией фирмы – производителя (чаще всего 492, 450, 492/620, 450/620). По этим данным рассчитывают пограничный уровень оптической плотности, с которым сравнивают оптическую плотность жидкости в лунках с испытуемыми образцами. Формула расчета, критерии позитивности предлагаются фирмами производителями. 2. Иммунный блоттинг Подтверждение диагноза на основе определения вирусных белков при помощи метода Western Blot, который иначе называется иммуноблотом. Как правило, на данном этапе диагноз считают окончательным. В настоящее время для подтверждения специфичности первичного положительного результата в ИФА, либо выявления возможных неспецифических реакций чаще всего используются метод иммунного блоттинга. Принцип теста заключается в выявления антител к определенным белкам вируса, иммобилизованным на нитроцеллюлозную мембрану методом непрямого иммуноферментного анализа. То есть в качестве твердой фазы используется не полистирол, как в обычном ИФА, а нитроцеллюлоза, на которую нанесены рекомбинантные белки ВИЧ-1 или ВИЧ-2. Нитроцеллюлоза отличается очень высокими сорбционными свойствами, обеспечивает хорошие условия для отмывания несвязавшихся компонентов, что повышает специфичность реакции. В приведенной ниже таблице представлены основные белки ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Подготовка нитроцеллюлозной мембраны для коммерческих тестсистем происходит следующим образом. На первом этапе производят разделение белков ВИЧ по молекулярному весу с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Белки мигрируют в слоях геля при наложении электрического потенциала: белки с малым молекулярным весом проходят через поры в полиакриламидном геле легче, чем тяжелые белки, и быстрее достигают конца геля. Затем осуществляют электрофоретический перенос (блоттинг) пептидов на поверхность листа нитроцеллюлозы. После этого мембрана обрабатывается блокирующим раствором во избежание неспецифического связывания иммуноглобулинов тестируемой сыворотки, затем отмывается, высушивается и разрезается на отдельные полоски (стрипы), которые вкладываются в коммерческий набор. Таблица Группа белков Белки оболочки вируса (env) Белки сердцевины (gag) Ферменты вируса (pol) Основные белки ВИЧ ВИЧ-1 ВИЧ-2 gp160 кд, gp120 кд, gp41кд, gp105кд, gp41кд gp36кд p55кд, p24 кд, p17кд p56кд, p26кд, p18кд p66кд, p31кд, p51кд p68кд Примечание: *- геном ВИЧ содержит 11 генов, 3 из них – структурные, которые кодируют формирование основных структурных и функционально важных компонентов вирусной частицы: env (от англ. envelope - оболочка), qaq (от анлг. qroup antiqen – групповой антиген) и pol (от анлг. polymerase - полимераза). кд – молекулярный вес белков, выражается в килодальтонах. Методика включает следующие этапы: 1.Замачивание стрипов. 2.Инкубирование подтверждаемых образцов и контрольных сывороток в емкостях со скрипами. При наличии антител они свяжутся с представленными на трипе белками вируса. 3.После промывки добавляют антитела против Lq G человека, меченные, например, щелочной фосфатазой и инкубируют. Конъюгат связывается с анти–ВИЧ антителами на твердой подложке – нитроцеллюлозной мембране. 4.После промывания и удаления избытка конъюгата, вносится хромоген, выявляющий комплекс, связанный с нитроцеллюлозной мембраной. 5.Появления специфически окрашенных полос подтверждает наличие анти – ВИЧ антител в сыворотке крови. Интерпретация результатов. Согласно Центру по Контролю заболеваний США и Американской ассоциации директоров лабораторий штатов и территорий США, результат иммуноблота считается положительным при наличии положительных линий, соответствующих вирусным белкам р24\25, gp41, gp120\160 (СДС, 1989 г.). В случае отсутствия указанных линий, результат иммуноблота считается отрицательным. Кроме того, могут наблюдаться неопределённые результаты при наличии лишь одной или двух положительных линий. В таких случаях рекомендуется повторить иммуноблот через 1 месяц. Пример. Результат иммунного блоттинга положительный если имеется наличие одной –двух полос белков env*+=gag+= pol Результат неопределенный – qaq + pol qaq pol Результат отрицательный-нет специфических полос -полосы отсутствуют вообще Примечание: -в зависимости от фирмы – производителя. 3. Алгоритм лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. Если результат отрицательный, то повторить через 4-6 месяцев, если есть клинические показания или был риск заражения. Если результаты оказываются положительными или неопределёнными, показано повторное тестирование. Если при двух повторных тестах результаты окажутся отрицательными, делают заключение о том, что первоначальный результат был ложноположительным, и диагноз ВИЧ-инфекцию исключают. Если же повторные результаты оказываются положительными, необходимо проводить углубленное исследование при помощи иммуноблота. Если иммуноблот окажется положительным, то ставится диагноз ВИЧ-инфекции. При отрицательном результате иммуноблота дается заключение о том, что данные иммуноферментного анализа были ложно-положительными, и наличие ВИЧ-инфекции исключается. В случае неопределённого результата иммуноблота, рекомендуется его повторить через один месяц. Иногда целесообразным является проведение других высокочувствительных тестов таких, как определение антигена р24, или ПЦР. При отрицательном повторном иммуноблоте, и других тестах, диагноз ВИЧ-инфекции исключается. В случае же положительного результата одного из тестов, ставится временный диагноз ВИЧ-инфекции, который в последующем требует подтверждения при помощи иммуноблота. 4. Иммунологический мониторинг ВИЧ инфицированных. 4.1. Расстройства иммунных функций при ВИЧ инфекции. Спектр этих расстройства весьма широк и включают нарушения активации клеток иммунной системы в результате прямого действия ВИЧ, а также истощение и дисфункцию субпопуляции Т-клеток CD4+ (хелперыпомошники), развивающиеся со временем и составляющие основную причину возникновение иммунодефицита. Инфицированные клетки могут соединяться с неинфицированными в результате взаимодействия gp120CD4+, при этом образуются гигантские многоядерные нежизнеспособные клетки (синцитий). Связываясь с поверхностью неинфицированных Тклеток CD4+, gp120 делает их также чувствительными к антителозависимой клеточной цитотоксической активности (АЗКЦ); инфицированные клетки могут уничтожаться gp120-специфическими цитотоксическими Тлимфоцитами. Белки ВИЧ способны действовать как суперантигены, вызывая выраженную экспансию пула иммунокомпетентных клеток с его последующим истощением. Кроме того, ВИЧ может индуцировать апоптоз (гибель) Т-клеток и вызывать повреждение клеточной мембраны и лизис при отпочковывании вирусных частиц с поверхности клетки. Нарушения иммунных функций под влиянием ВИЧ состоят в истощении субпопуляции Т-клеток CD4+ и угнетений их реакций на антигены, митогены, аллоантигены и антитела анти- CD3 с параллельным снижением продукции интерлейкина-2 (IL-2) и другими изменениями продукции цитокинов. В результате этих нарушений утрачиваются способность цитотоксических Т-клеток к ВИЧ-специфичному ответу и некоторые антигенпрезентирующие клеточные функции. При этом возрастает число активированных и ареактивных Т-клеток CD8+ (киллеры/цитотоксические), повышается содержание бета2-микроглобулина и неоплелина в сыворотке, происходит поликлональная В-клеточная активация с появлением В-лимфоцитов, невосприимчивых к действию Тнезависимых В-клеточных активаторов, возрастает образование аутоантител и иммунных комплексов. Субпопуляции Т-лимфоцитов-CD4+ и CD8+ являются хорошими лабораторными маркерами, позволяющими определить стадию ВИЧинфекции, поэтому для пациентов, инфицированных ВИЧ, рекомендуется подсчет числа CD4+ и CD8+ клеток. 4.2. Количественное определение субпопуляции Т-лимфоцитов CD4+ и CD8+. (Проточная цитофлуорометрия) Проточная цитофлуорометрия – подсчет Т-клеток CD4+ и Т-клеток CD8+ основанный на определении CD-маркеров клеточной поверхности это метод, позволяющий измерять подвижность клеток в жидкой среде и устанавливать их свойства. Флюоресценция – это способность молекул поглощать монохромный свет определённой длины волны (например, луч лазера) и испускать свет более широкой длины волны. Измерение длины волны обусловлено потерей энергии в процессе поглощения и испускания света, который характеризуется, как «возбуждение». Свет, испускаемый такой «возбуждённой» молекулой, носит название флуоресцентного свечения. В проточном цитофлуориметре, клетки будут испускать флуоресценцию зелёного цвета, когда лимфоциты проходят в потоке жидкости через луч лазера, который «возбуждает» только лишь те клетки, которые имеют на поверхности СД4-рецепторы с прикреплёнными к ним моноклональными антителами, окрашенными флуоресцентным красителем FITC. Именно таким образом определяют стадию развития ВИЧ-инфекции на основе концентрации СД4-клеток в крови – если она составляет менее 200 клеток в одном микролитре крови. Метод проточной цитофлюориметрии требует дорогостоящего оборудования и реагентов, поэтому не может быть широко использован в практических лабораториях. В последние годы в качестве альтернативы предложен тест "BD FACSCount TM Reagents CD4/CH8" (фирмы Becton Dickinson, Германия). Этот метод позволяет проводить точный, быстрый прямой подсчет клеток из образца крови ВИЧ положительного лица объемом в 50 мкл. У здоровых взрослых средние значения составляют: TCD4+ - 830±288 клеток/мкл крови и TCD8+ -530±231 клеток/мкл крови. Помимо антител, реагенты в пробирках содержат также известное количество флуоресцентных референсных частиц. Эти частицы в пробе являются флуоресцентным стандартом для определения лимфоцитов и количественным стандартом для подсчета клеток. Подсчет абсолютного количества СD4, СD8 и СD3 Т-лимфоцитов используется для оценки иммунного статуса у пациентов с установленным или подозреваемым иммунодефицитом, таким как, Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). Антиген СD4+ является рецептором вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Абсолютное количество СD4+ Т-лимфоцитов является клеточным параметром, наиболее тесно связанным с прогрессией ВИЧинфекции и прогнозом развития заболевания. Соотношение СD4+/СD8+ известно также как соотношение хелперов/супрессоров. Относительная доля СD4+ Т-лимфоцитов падает, а СD8+ Т-лимфоцитов-растет в ходе развития ВИЧ-инфекции, что приводит к снижению соотношения хелперов/супрессоров. 5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Наличие антител к ВИЧ в крови человека, определяемых методом ИФА и ИБ, является лишь косвенным маркером ВИЧ-инфекции, т.к. в развитии болезни существуют периоды, когда антитела отсутствуют или их концентрация недостаточна для улавливания: - период "серонегативного окна" в первые недели после заражения (описаны отдельные случаи, когда этот период затягивался до нескольких месяцев и даже лет); - терминальный период, когда при глубоком угнетении иммунитета концентрация антител к ВИЧ значительно снижается, что может привести к ложно-отрицательным результатам ИФА и ИБ. Методы обнаружения антител также не достаточно информативны при обследовании детей первых трех лет жизни, рожденных от ВИЧ инфицированных матерей. Еще одним фактором, снижающим ценность информации, полученной методами ИФА, ИБ является то, что в некоторых случаях эти методы дают ложно-положительные и неопределенные результаты, обусловленные перекрестными серологическими реакциями. Перечисленные выше недостатки серологической диагностики ВИЧинфекции заставили думать о дополнении, а в ряде случаях и о замене ее методами прямой детекции вируса. Вирусологические методы диагностики ВИЧ-инфекции, направленные на выделение и идентификацию вируса для широкой лабораторной практики неприемлемы из-за длительности, трудоемкости, небезопасности. Наиболее эффективным методом диагностики вирусных инфекций, независимо от их стадии, является обнаружение генома возбудителя либо доказательство его отсутствия. С 1975 г. для этих целей используется метод гибридизации нуклеиновых кислот. Нуклеиновая кислота вирусного генома, как носитель наследственной информации, содержит полную характеристику возбудителя в виде специфической последовательности нуклеотидов дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или рибонуклеиновой кислоты (РНК). В гибридизационном методе фрагмент одноцепочечной ДНК, меченный ферментом и связывающийся со специфической областью генома возбудителя (зондом), используется для выявления генетического маркера инфекции. Выявление нуклеиновой кислоты возбудителя является прямым указанием на наличие первоисточника инфекции у пациента. При гибридизации чувствительности метода не хватает для выявления вирусоспецифической ДНК (РНК) из-за ее низкой способности копироваться в клетках. Для осуществления ДНК-гибридизации необходимо выделить ДНК из не менее чем 10000 клеток, а в случае ВИЧ-инфекции концентрация возбудителя в крови и в биологических средах недостаточны для обнаружения его данным методом. Кроме того, этот метод предполагает использование радиоактивных меток. Поэтому понадобилось предварительное многократное увеличение количества копий ДНК (амплификация). В 1985 г. американским исследователем К. Мюллесом, удостоившимся за это открытие в последствии Нобелевской премии, был разработан принцип избирательного умножения нуклеотидных последовательностей посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). В настоящее время наиболее распространена диагностика ПЦР в «режиме реального времени». Амплификация нуклеиновых кислот и их детекция-одни из наиболее ценных современных методов, используемых в биологических исследованиях. Детекция продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени стала возможной благодаря введению в реакцию флуоресцирующих реактивов сообщающих об увеличении количества дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) пропорциональным увеличением флуоресцентного сигнала. К флуоресцирующим веществам, используемым для этой цели относятся красители, связывающие ДНК, и флуоресцентно меченные праймеры или зонды. Детекция ПЦР продуктов в режиме реального времени обеспечивает точное и высокочувствительное определение исходного числа копий нуклеиновой кислоты в пределах всего динамического диапазона. Для измерения уровня флуоресцентного сигналов время амплификации используется специальные термоциклеры, снабженные модулями для детекции флуоресценции. Система IQТМ5 для мультиканальной детекции ПЦР продуктов в режиме реального времени основана на достоинствах термоциклера, который обеспечивает оптимальную амплификацию. ПЦР состоит из следующих процедур: 1. подготовки исследуемой пробы (выделение ДНК или РНК), 2. собственно ПЦР (амплификация) 3. детекция (обнаружение) продуктов амплификации. . Стадии Полимеразной Цепной Реакции: 1. денатурация ДНК (950С). 2. отжиг праймеров (55-650С)+отжиг зонда с флуоресцентной меткой (или связывание метки). 3. полимеризация цепей ДНК (720С или 60-650С) ПЦР на ДНК провируса ВИЧ используется как диагностическая методика для предварительной диагностики ВИЧ-инфекции, а ПЦР на РНК ВИЧ - как методика для количественного измерения концентрации вируса в крови с целью прогноза и мониторинга уже установленной ВИЧ-инфекции. В настоящее время ПЦР является самым чувствительным и специфичным методом прямого обнаружения ВИЧ. Однако при такой высокой чувствительности ПЦР, позволяющей определять единичные молекулы ДНК, существует опасность получения ложноположительного результата. В связи с этим, разработаны специальные требования к планировке и режиму ПЦРлаборатории. Причинами ложноположительных результатов являются следующие три вида контаминации: 1. перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов, 2. контаминация рекомбинатными плазмидами, содержащими клонированные последовательности детектируемого гена; 3. контаминация продуктами амплификации (амплификонами) является наиболее частой причиной ложноположительных результатов, поскольку в процессе ПЦР амплификоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся с аэрозолями и через приборы. Преодолев проблему получения ложноположительных результатов, возникает еще одна не менее важная - ложноотрицательные результаты. Две основные причины получения ложноотрицательных результатов: 1. очень низкое содержание провирусной ДНК ВИЧ в клетках крови 2. высокая вариабельность ВИЧ. Факторы, влияющие на появление ложноотрицательных результатов ПЦРанализа: 1. условия забора, хранения, транспортировки и предобработки клинического материала. 2. качество работы оборудования (в первую очередь амплификаторов). Было бы ошибкой считать ПЦР идеальным и абсолютно точным методом тестирования на ВИЧ. Даже для системы Ампликор, предоставляющей собой «золотой стандарт» ПЦР-диагностики, чувствительность составляет около 95% и специфичность – Около 98% Резюме по ПЦР. Этот трехступенчатый цикл (денатурация, отжиг, удлинение цепи), занимает 2-3 минуты, может быть повторен многократно. Этот процесс ПЦР называется амплификацией, потому что происходит копирование изначальной последовательности и затем каждая копия, в свою очередь, копируется снова и снова, пока их число не достигнет миллионов. Каждая новая нить ДНК служит матрицей для ферментативного синтеза цепей в следующем цикле. Теоретически, каждый новый цикл удваивает количество копий ДНК; в первом цикле их образуется 2, затем 4, затем 8, а затем 16, и т.д. в точности происходит экспоненциальное нарастание количества копий. Это и есть Цепная реакция в методе ПЦР. Теоретически, в результате 20 циклов образуется миллион копий, в результате 30-миллиард. ПЦР позволяет получить количество материала, достаточное для детекции ДНК. Основные характеристики ПЦР. Высокая чувствительность, основанная на экспоненциальном принципе накопления продукта. Высокая специфичность, основанная на выявлении уникальных для микро-(макро)-организма участков генетического материала. Метод прямого выявления возбудителя, основанный на универсальности способа хранения и передачи генетической информации живой материи. 6. Диагностика ВИЧ инфекции у детей. Имеются объективные причины ненадежной диагностики ВИЧ- инфекции у детей раннего возраста. Эти причины определяются малым числом или отсутствием клинических симптомов ВИЧ-инфекции, неоднородностью лабораторных показателей, а также тем, что в крови новорожденных и детей до 18 месяцев могут циркулировать материнские анти - ВИЧ IgG. Кроме того, у детей первого месяца жизни отсутствует репликация ВИЧ, поэтому ни вирус, ни его геном не выявляются. В это время может обнаруживаться только р24, входящий в состав циркулирующих иммунных комплексов. Принцип проведения диагностики ВИЧ-инфекции у детей до 18 месяцев и старше, матери которых инфицированы ВИЧ и являются серопозитивными: В возрасте до 18 месяцев, выявляется ВИЧ с помощью ПЦР (качественный), если положительный или отрицательный анализ, то повторяем через каждые 2 или 4 месяца, по истечении 18 месяцев берем образцы крови ребенка и исследуем методом иммуноблотинга (ИБ) и если белки обнаруживаются, то ставится окончательный диагноз ВИЧ-инфекция, если нет, то ребенка снимаем с учета и диспансерного наблюдения. ПРИМЕЧАНИЕ. Изредка материнские антитела могут обнаруживаться после 18 месяцев. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, современная лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции основывается на использовании множества методов, направленных на выявление антител, выделение вируса, детекцию его антигенов и геномного материала. Отдельную группу составляют методы оценки иммунного статуса. Однако, на "переднем плане" идентификации и последующей характеристики ВИЧ-инфекции остаются иммунохимические методы, предусматривающие выявление антител, антигена в сыворотке крови. Серодиагностика ВИЧ-инфекции имеет первостепенное значение для практического звена по доступности, объему и значимости получаемой информации. Дальнейшее развитие этих методов будет связано с решением вопросов, касающихся раннего и экспрессного выявления антител/антигенов, обеспечения безопасности взятия и обследования материалов от серопозитивных лиц, а также приобретающего все большее значение вопроса о соответствии тест-систем возможностям достоверной детекции антител/антигенов в связи с уникальными темпами естественной изменчивости ВИЧ, не имеющими аналогов среди других вирусных возбудителей. Все специализированные лабораторные исследования по ВИЧ-инфекции, проводимые в лабораторных условиях согласно действующему законодательству и нормативно-правовым документам проводятся исключительно в государственных медицинских учреждениях. СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ Антиген - любая молекула, распознаваемая антителом или Т-клеточными рецепторами. Антитела - сывороточные или секреторные иммуноглобулины, обладающие способностью к специфическому взаимодействию с гомологичными антигенами. Основными продуцентами являются плазматические клетки, которые образуются в результате гуморального иммунного ответа на гомологичный антиген. Антнген-антитело взаимодействие - соединение молекул антигена и антитела с образованием иммунного комплекса. На первом этапе взаимодействия основные связующие силы - кулоновские, а после сближения поверхностей детерминант и антидетерминант на расстоянии в доли нанометра решающую роль в формировании комплекса играют ван-дерВаальсовые силы. ВИЧ - вирус иммунодефицита человека. ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота. Содержит генетическую информацию. Иммуноглобулины - белки животного происхождения строгой иммунохимической специфичности, большинство из которых обладает активностью антител. Известно 5 классов иммуноглобулинов: G, М, А, Е, D. Иммунитет - совокупность защитно-адаптационных реакций, направленных на сохранение постоянства антигенного состава внутренней среды организма путем расщепления, нейтрализации, блокирования или удаления паразитов, чужеродных клеток (тканей) и веществ антигенной природы. Иммунитет гуморальный - иммунитет, основным эффектором которого являются антитела. Иммунитет клеточный - иммунитет, основным эффектором которого являются сенсибилизированные лимфоциты и продуцируемые ими лимфокины. Иммунный статус-совокупность иммунобиологических свойств организма, характеризующих конституциональный или приобретенный иммунитет, иммунофизиологическую реактивность в конкретный момент. Иммунодефицитные состояния - врожденные (генетически обусловленные) дефекты в структуре или (и) функции одного или нескольких звеньев иммунной системы организма, снижающие эффективность иммунного ответа. Интерлейкины низкомолекулярные белки, продуцируемые иммунокомпетентньми клетками, участвуют во взаимодействии, пролиферации и дифференцировке клеток крови. Клеточный рецептор - образование белковой природы на поверхности клетки, осуществляющее взаимосвязь с микроокружением клетки и регуляцию функциональной активности этой клетки. Лимфоциты-мононуклеарные клетки «белой» крови, лимфатических узлов и ткани, которые вместе с макрофагами обусловливают иммунный ответ организма. Лимфоциты способны специфически распознавать собственные и чужеродные антигены. Макрофаги - крупные долгоживущие клетки с хорошо развитым лизосомальным и мембранным аппаратом, главный тип клеток системы мононуклеарных фагоцитов. Моноклональные антитела - гомогенные антитела - продукт единственного В-клеточного клона одного изотопа с идентичными антигенсвязывающими центрами (моноспецифичность). Моноцит - мононуклеарный фагоцит крови, предшественник тканевых макрофагов. Нуклеотиды - мономеры, из которых состоят нуклеиновые кислоты Перекрестные серологические реакции - свойство некоторых микроорганизмов и их антигенов вступать в реакцию иммунного взаимодействия не только с гомологичными, но и с гетерологичными антителами. Плазматическая клетка - В-лимфоцит конечной стадии дифференцировки, секретирующий большое количество антител. РНК – рибонуклеиновая кислота, участвует в синтезе белка СПИД-синдром приобретенного иммунодефицита. CD - Маркеры - поверхностные молекулы клеточной мембраны лейкоцитов и тромбоцитов, определяемые при помощи моноклинальных антител. Моноклональные антитела совпадающей специфичности связывания объединяют в одну группу, присваивая ей номер в системе CD. CD - маркеры могут служить маркерами различных клеточных популяций. Т-хелпер-лимфоцит - субкласс СД4+ Т-клеток, обеспечивающий эффекторные функции других клеток иммунной системы. Т-лимфоцит СД8+ - среди субпопуляции клеток СД8+ есть клетки, выполняющие киллерную и цитотоксическую функцию. Цитокины - класс регуляторных высокоактивных молекул белковой природы, участвующих наряду с другими гуморальными веществами (гормонами, нейромедиаторами) в поддержании гомеостаза. Цитокины синтезируются и выделяются как клетками лимфоидной ткани, так и клетками других тканей: клетками иммунной системы. Эпитоп - часть антигена, распознаваемая антигенным рецептором.
