ИЗМЕНЕНИЯ В КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКЕ СТРЕПТОКОККОВ

Аграрный вестник Урала № 12 (118), 2013 г.
Ветеринария
ИЗМЕНЕНИЯ В КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКЕ СТРЕПТОКОККОВ
СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ГРУППЫ С, ИЗОЛИРОВАННЫХ
ОТ ЛОШАДЕЙ КАБАРДИНСКОЙ ПОРОДЫ,
ПОД ДЕЙСТВИЕМ БИОЦИДНОГО ПОЛИМЕРА
УДК 619
Э. М. МЕШЕВ,
кандидат ветеринарных наук, доцент,
Кабардино-Балкарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии
(360024, г. Нальчик, ул. Мечникова, д. 130а; тел.: 8 (8662) 77-33-94; e-mail: [email protected])
Ключевые слова: стрептококки, серологическая группа С, лошадь, кабардинская порода, клеточная стенка, биоцидный полимер.
Стрептококки серологической группы С, выделенные из патологического материала от лошадей кабардинской породы, были подвержены воздействию сополимера диалилдиметиламмонийхлорида с диалилгуанидинацетатом (70 :
30) при совместном инкубировании в МПБ, а также в дистиллированной воде. В опытах с применением атомно-силовой микроскопии было установлено отсутствие роста в МПБ и на кровяном агаре в течение 48 ч у культур, подверженных воздействию сополимера. Через 16 ч после начала контакта с испытуемым сополимером стрептококки теряли
способность к росту на питательных средах, обусловленную нарушением целостности клеточной стенки. Наиболее
характерными изменениями клеточных стенок стрептококков были: сморщивание, грушевидная и овоидная формы,
повышение проницаемости, а также разрыв клеточной стенки. Наиболее вероятной последовательностью событий при
этом является связь с клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной, а затем уже проникновение в цитоплазму
и ядерное вещество клетки, приводящее к увеличению проницаемости клеточной мембраны как для низкомолекулярных, так и высокомолекулярных веществ. Полученные нами данные позволяют считать, что сополимер диалилдиметиламмонийхлорида с диалилгуанидинацетатом обладает биоцидностью для клеток стрептококков. Одним из моментов
такого влияния является нарушение целостности клеточной стенки, обусловленное химическим взаимодействием с
составными элементами клеточной стенки, приводящее к увеличению порозности мембран и их разрыву.
CHANGES IN THE CELL WALL OF STREPTOCOCCI SEROGROUP C,
ISOLATED FROM HORSES OF THE KABARDIAN BREED UNDER
THE INFLUENCE OF BIOCIDAL POLYMER
E. M. MESHEV,
candidate of veterinary science, associate professor,
Kabardino-Balkar scientific research Institute of Agriculture of RACA
(130A Mechnikov Str., 360024, Nalchik; tel: +7 (8662) 77-33-94; e-mail: [email protected])
Keywords: Streptococcus, serogroup C, horse, the Kabardian breed, the cell wall, biocidal polymer.
Streptococci of serological group C, isolated from pathological material from horses of the Kabardian breed were exposed
to copolymer of dialildimethylammoniumchloride with dialilguanidinacetat (70 : 30) co-incubated in BEB and in distilled
water. In experiments using atomic force microscopy, absence of growth was established in BEB and in blood agar within
48 hours in cultures exposed to copolymer. 16 hours after the initial contact with the subject copolymer streptococci lost an
ability to grow on nutrient media caused by violation of the cell wall integrity. The most characteristic changes in the cell walls
of streptococci were wrinkling, pear-shaped and ovoid shapes, increased permeability, and a cell wall burst. The most likely
sequence of events is the connection with a cell wall and cytoplasmatic membrane, and then penetration into the cytoplasm
and nuclear material of cells, leading to an increase in cell membrane permeability for low-molecular and high-molecular
substances. Our data suggest that the copolymer of dialildimethylammoniumchloride with dialilguanidinacetat has biocidal
properties for streptococci cells. One of the highlights of this influence is a violation of the cell wall integrity, due to chemical
interaction with the constituent elements of the cell wall, leading to an increase in the porosity of membranes and their rupture.
Положительная рецензия представлена А. М. Биттировым, доктором биологических наук, заведующим кафедрой
ветеринарной медицины Кабардино-Балкарского государственного аграрного университета имени В. М. Кокова.
32
www.m-avu.narod.ru
www.avu.usaca.ru
Аграрный вестник Урала № 12 (118), 2013 г.
Ветеринария
Спектр хозяев стрептококков включает все виды
сельскохозяйственных, промысловых, диких и лабораторных животных, а также всех домашних и
диких птиц, пчел, рыб и пресмыкающихся [2]. Вызываемые стрептококками патологические состояния можно отнести к так называемым факторным
инфекциям, для которых характерно длительное
пребывание возбудителя, как в организме, так и в
популяции хозяев. Длительное пребывание возбудителя в популяции обусловливает отбор антибиотикоустойчивых рас микроорганизмов, формирующийся на протяжении жизни многих поколений
хозяев. С другой стороны, длительный контакт с
иммунной системой одного и того же вида приводит к формированию у этих микроорганизмов различных факторов, позволяющих им «ускользать»
от ее механизмов и факторов. Таким образом, проблема терапии факторных инфекций, обусловленных стрептококками, весьма актуальна и требует
изыскания новых подходов в разработке средств и
методов ее проведения.
Для решения этих задач перспективным представляется использование полимеров, которые
в силу своей химической природы, открывают
перспективу создания биоцидных препаратов,
оказывающих комбинированное воздействие на
бактериальную клетку. Нерастворимость в воде
ограничивает возможность использования некоторых веществ в качестве биоцидных средств. При
использовании же в качестве носителей водорастворимых полимеров этот недостаток в значительной степени устраняется. При этом утрачивается
вредное воздействие на клетки и ткани биоцидного вещества, при полном сохранении его антимикробной активности [4]. Нами было изучено действие сополимера диалилдиметиламмонийхлорида
с диалилгуанидинацетатом (70 : 30) на клеточную
стенку стрептококков серологической группы С,
выделенных от лошадей кабардинской породы. Сополимеры добавляли в среду с культурами стрептококка через 16 часов инкубирования при 37 °С.
Через 24 ч клетки стрептококков отмывали трехкратно стерильным физиологическим раствором
методом центрифугирования при 3000 об./мин.
Полученные таким образом взвеси микробов
фиксировали на подложке из слюды и изучались
методом сканирующей зондовой микроскопии.
Во втором случае суточные бульонные культуры
стрептококков отмывали трехкратно и добавляли полимер. Через 12 ч фиксировали микробы на
подложку из слюды и проводили микроскопию.
Визуализацию поверхности бактериальных клеток осуществляли в полуконтактном и контактном
режимах на атомно-силовом микроскопе Solver
Pro-47 в лаборатории нанозондовых исследований
Кабардино-Балкарского государственного университета. В качестве зонда был использован кантилевер NGS-10 с острием из нитрида кремния,
механическая жесткость кантилеверов составляла
0,06 и 0,12 н/м. Величина силы взаимодействия
между острием и исследуемой поверхностью составляла 10-9 Н.
www.m-avu.narod.ru
www.avu.usaca.ru
Результаты исследований.
Через 16 ч инкубирования в среде с полимером
был проведен пересев стрептококков в стерильный бульон и на МПА с 5 % эритроцитов барана
для выяснения влияния изучаемого полимера на
жизнедеятельность стрептококковых клеток и их
морфологию. Нами было установлено отсутствие
роста в МПБ и на кровяном агаре в течение 48 ч у
культур, подверженных воздействию сополимера
диалилдиметиламмонийхлорида с диалилгуанидинацетатом.
Визуализация клеточной стенки методом атомно-силовой микроскопии позволила установить
наличие различного рода дефектов, сводящихся
в основном к нарушению их целостности. При
этом довольно часто отмечалось отсутствие длинных или коротких цепочек. Микробные клетки,
как правило, располагались парами или одиночно. Конфигурация кокков была изменена и имела
чаще грушевидную форму или форму овоидов.
Типичным было также сморщивание стрептококковых клеток. Некоторые кокки были несколько
увеличены в сравнении с исходными культурами.
Такие же результаты были получены в опытах с
отмытыми культурами стрептококков, где контакт
полимера с бактериальной клеткой осуществлялся
в стерильном растворе дистиллированной воды.
Через 6 ч после начала контакта при комнатной
температуре и трехкратной отмывки стерильным
физиологическим раствором, стрептококки теряли способность к росту на МПБ и МПА с 5 % эритроцитов барана. Изменения конфигурации кокков
при этом были менее выражены или не выражены вообще. Однако также отмечались нарушения
целостности клеточных стенок и небольшое увеличение их объема. Мы предполагаем, что изменения формы клеток больше выражено у растущих
культур в условиях питательных сред. Как отмечалось нами раннее, после контакта с сополимером
диалилдиметиламмонийхлорида с диалилгуанидинацетатом, клетки стрептококков практически
не окрашивались по Грамму.
Полученные нами данные позволяют считать,
что сополимер диалилдиметиламмонийхлорида с
диалилгуанидинацетатом обладает биоцидностью
для клеток стрептококков. Одним из моментов такого влияния является нарушение целостности клеточной стенки, обусловленное химическим взаимодействием с составными элементами клеточной
стенки, приводящее к увеличению порозности мембран и их разрыву. Проведенные ранее [4] исследования взаимодействия полимеров с эритроцитами и
бактериальными клетками показали, что некоторые
полимеры быстро связываются с клеточной стенкой
и цитоплазматической мембраной, а затем уже проникают в цитоплазму и ядерное вещество клетки.
При этом увеличивается проницаемость клеточной
мембраны как для низкомолекулярных, так и высокомолекулярных веществ [5]. Повышение концентрации полиэлектролитов до 50–100 мкг/мл и более
приводит к интенсивному повреждению клеточной
мембраны [1, 4, 6].
33
Аграрный вестник Урала № 12 (118), 2013 г.
Ветеринария
Выводы.
На основании проведенных исследований и полученных в них результатах нами были сделаны
следующие выводы:
1. сополимер диалилдиметиламмонийхлорида
с диалилгуанидинацетатом обладают бактерицидным действием для стрептококков серологической
группы С, изолированных из патологического материала от лошадей кабардинской породы;
2. действие полимера приводит к нарушению
целостности клеточной стенки стрептококков, изменению ее структуры, а также нарушению проницаемости и разрыву.
Литература
1. Афиногенов Г. Е., Панарин Е. Антимикробные полимеры. СПб. : Гиппократ, 1993.
2. Есепенок В. А., Горбатова Х. С. Этиология, патогенез, лечение и профилактика стрептококкозов (современный
взгляд) // Ветеринарный консультант. 2006. № 10. С. 3–5.
3. Платэ Н. А., Васильев А. Е. Высокомолекулярные соединения. 1982. Т. 24. № 4. С. 675.
4. Хаширова С. Ю. Новые биоцидные гуанидинсодержащие полимеры : дисс. … канд. хим. наук. М., 2002.
5. Panarin E. F. 26 Microsymposium on Macromolecules Polymers in medicine and Biology. Prague, 1984. P. 87.
6. Ryser H. J. Science. 1965. V. 150. P. 501.
References
1. Afinogenov G. E., Panarin E. Antimicrobial polymers. St. Petersburg : Hippocrates, 1993.
2. Esepenok V. A., Gorbatova H. S. Etiology, pathogenesis, treatment and prevention of streptococcosis (modern view) //
Veterinary Consultant. 2006. № 10. P. 3–5.
3. Plate N. A., Vasiliev A. E. Polymers. 1982. T. 24. № 4. P. 675.
4. Khashirova S. Y. New guanidinsoderzhaschie biocidal polymers : diss. ... candidate. chem. science. M., 2002.
5. Panarin E. F. 26 Microsymposium on Macromolecules Polymers in medicine and Biology. Prague, 1984. P. 87.
6. Ryser H. J. Science. 1965. V. 150. P. 501.
34
www.m-avu.narod.ru
www.avu.usaca.ru