МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА Кокаева Людмила Юрьевна
реклама
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА На правах рукописи Кокаева Людмила Юрьевна МИКОБИОТА ПОРАЖЕННЫХ ЛИСТЬЕВ SOLANUM TUBEROSUM L., S. LYCOPERSICUM L. И S. DULCAMARA L. Специальность 03.02.12 – Микология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук С.Н. Еланский Москва – 2016 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ ............................................................ 4 ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 5 Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................... 10 1. Методические подходы для анализа видового состава грибов ................. 10 1.1. Морфологические методы анализа грибных патогенов ......................... 10 1.2. Молекулярные методы исследования видового состава грибных сообществ ............................................................................................................ 13 1.3. Фитопатогенные грибы - возбудители заболеваний листьев пасленовых культур ................................................................................................................ 28 1.4. Методы молекулярной диагностики фитопатогенных грибов .............. 45 Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .............................. 66 Часть III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ............................................... 85 Глава 3.1. Молекулярная идентификация видового состава грибов и грибоподобных организмов в пораженных растительных тканях................... 85 3.1.1. Рестрикционный анализ клонов........................................................... 86 3.1.2. Исследование видового состава грибов и грибоподобных организмов в пораженных листьях Solanum tuberosum ................................. 90 3.1.3. Видовой состав грибов и грибоподобных организмов в пораженных листьях Solanum lycopersicum ........................................................................... 97 3.1.4. Видовой состав грибов и грибоподобных организмов в пораженных листьях Solanum dulcamara ............................................................................. 102 Глава 3.2. Конструирование тест-систем для идентификации видов рода Alternaria .............................................................................................................. 115 3.2.1. Выделение изолятов Alternaria ............................................................. 116 3.2.2. Вирулентность штаммов Alternaria sp. к сортам картофеля и томата ............................................................................................................................ 116 3.2.3. Изучение активности сериновых протеиназ, секретируемых двумя различающимися по вирулентности штаммами A. alternata ....................... 120 3.2.4. Определение нуклеотидных последовательностей видов Alternaria 122 3.2.4.1. Анализ нуклеотидных последовательностей ядерных рибосомных генов ............................................................................................................... 123 2 3.2.4.2. Анализ последовательности нуклеотидов участка гена mt LSU рДНК .............................................................................................................. 128 3.2.5. Подбор праймеров для идентификации видов Alternaria и проверка их видоспецифичности ......................................................................................... 130 3.2.6. Разработка диагностических систем для идентификации видов Alternaria с использованием ПЦР в реальном времени (РВ ПЦР) ............. 133 4.1. Молекулярная идентификация видов Alternaria alternata и A. solani в пораженных листьях с использованием ПЦР в реальном времени ............... 141 4.2. Молекулярная идентификация видов Alternaria в пораженных листьях методом классической ПЦР ............................................................................... 147 4.3. Идентификация Colletotrichum coccodes с помощью ПЦР. ..................... 153 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................... 157 ВЫВОДЫ ............................................................................................................. 158 НАУЧНО - ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ........................................ 159 БЛАГОДАРНОСТИ ............................................................................................ 160 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ..... 161 Приложение ......................................................................................................... 197 3 СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ ВНИИФ ― Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии. ВНИИКХ ― Всероссийский научно-исследовательский институт картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха. СКНИИГПСХ ― Северо-Кавказский научно-исследовательский институт горного и предгорного сельского хозяйства. КВНС ― Кисловодская Высокогорная Научная Станция ИФА им. А.М.Обухова. нг ― нанограмм. pH ― водородный показатель. TRIS ― 2- амино - 2- гидроксиметил –пропан -1,3- диол (трис (гидроксиметил) амино метана). ЭДТА ― этилендиаминтетрауксусная кислота. TAE ― трис-ацетатный буфер, содержащий трис, ускусную кислоту и ЭДТА (Tris-acetate-EDTA). пн ― пар нуклеотидов. ITS ― внутренние транскрибируемые спейсеры (Internal transcribed spacer). рДНК ― рибосомная ДНК. GenBank ― база данных ГенБанк (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). K ― отрицательный контроль. K+ ― положительный контроль. M ― маркер длин фрагментов. CTAB ― Цетил триметил аммоний бромид (Cetyltrimethyl ammonium bromide). X-Gal ― 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside. IPTG ― изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид. SDS ― Лаурилсульфат натрия (sodium lauryl sulfate). LB ― микробиологическая среда (Luria-Bertani). FAO ― Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН (Food and Agriculture Organization). Euroblight ― European network of scientists and other specialists working on potato late blight. in silica ― компьютерное моделирование (симуляция) эксперимента. in vitro ― «в пробирке» — вне живого организма. 4 ВВЕДЕНИЕ Россия является третьим в мире (после Китая и Индии) производителем картофеля (FAO, 2012). Во всех категориях хозяйств производится около 30 млн. т. Томат в России занимает второе место из возделываемых пасленовых культур. Болезни пасленовых, вызываемые грибами и грибоподобными организмами, наносят значительный ущерб производству и приводят к существенным экономическим потерям (Euroblight, 2014). Изменения климата, активный импорт семян, особенно семенных клубней, интенсивный обмен семенным материалом внутри страны, обработки картофеля и томата узкоспециализированными фунгицидами способствуют появлению новых и расширению ареалов существующих видов грибов - возбудителей заболеваний культурных пасленовых растений. Для эффективной борьбы с болезнями и контроля фитосанитарной обстановки необходим мониторинг видового состава патогенов и их внутривидовых группировок, а также разработка современных методов их быстрой и точной идентификации. Идентификация патогенов по морфолого-культуральным признакам является наиболее используемым методом и часто вызывает затруднения при определении видового состава патогенной микофлоры. Выделяемые изоляты могут быть стерильны, а при их выделении высока вероятность контаминации вторичной микобиотой. Эти методы неэффективны в случае, если заболевание находится в начальной фазе развития или имеет место скрытое заражение семенного материала (латентная инфекция). Многие фитопатогенные виды не способны расти на питательной среде (например, возбудители ржавчины и многие виды головни), в связи с чем их невозможно выделить в чистую культуру. Поэтому выделение и анализ чистых культур не в полной мере отражает видовой состав патогенной микобиоты листьев растений. 5 Обозначенные проблемы стимулируют поиск чувствительных, быстрых и специфичных технологий идентификации фитопатогенов. В настоящее время для этих целей разработано множество основанных на электрофоретическом разделении белков методов, и ДНК, взаимодействии антиген-антитело, ПЦР и ПЦР в реальном времени, изотермической петлевой амплификации (LAMP) и других. На их основе разработаны коммерческие диагностические наборы. В основном, их разработкой занимались иностранные исследователи. При использовании зарубежных тест-систем для диагностики российских штаммов было обнаружено, что импортные наборы специфичны не ко всем штаммам российских видов и могут показывать ложноотрицательные результаты, либо возникают перекрестные реакции, что приводит к ложноположительным результатам (Варицев и др., 2008; Сурина, 2015). В нашей работе проведено изучение видового состава фитопатогенных грибов, ассоциированных с листьями картофеля (Solanum tuberosum L.), томата (S. lycopersicum L.) и дикого многолетнего сорняка паслена сладкогорького (S. dulcamara L.), который часто произрастает вблизи посадок культурных пасленовых и может выступать естественным резерватом инфекций. Изучение разнообразия возбудителей грибных инфекций на листьях пасленовых важно для разработки интегрированных систем защиты картофеля и томата, правильного подбора фунгицидных препаратов, создание коллекции селекционного фитопатогенных материала, изучения грибов для эффективности тестирования используемых и создаваемых фунгицидных препаратов, разработки и верификации систем быстрой диагностики. Методы ПЦР и ПЦР в реальном времени обладают высокой специфичностью, чувствительностью, отличаются высокой скоростью проведения анализа, в связи с чем широко используются при идентификации фитопатогенных организмов, в том числе и грибов. Их применение позволяет существенно дополнить данные, полученные с помощью традиционных 6 подходов. Продукт амплификации может быть подвергнут дальнейшему исследованию, например, секвенированию, что может дать возможность определить с высокой точностью таксономическую принадлежность исследуемого объекта. В нашей работе была поставлена задача изучения разнообразия микобиоты пораженных листьев картофеля, томата и диких пасленовых с помощью молекулярных методов без выделения чистых культур, а также разработки эффективных тест-систем на основе ПЦР для быстрой диагностики исследуемых патогенов пораженных листьев картофеля и томата. Цель и задачи исследований Целью диссертационной работы являлось изучение микобиоты пораженных листьев картофеля (Solanum tuberosum L.), томата (S. lycopersicum L.) и диких пасленовых (на примере S. dulcamara L.), и разработка методов видовой идентификации фитопатогенных грибов с помощью ПЦР. Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач, определяющих структуру исследования: 1. Изучение видового состава грибов и грибоподобных организмов, ассоциированных с пораженными листьями, молекулярно- генетическими методами, без выделения чистых культур. 2. Разработка ПЦР - праймеров и зондов для видовой диагностики фитопатогенных организмов, ассоциированных с пораженными листьями исследуемых растений. 3. Выявление фитопатогенных грибов в пораженных листьях картофеля, томата и диких пасленовых из разных регионов с применением систем диагностики на основе ПЦР. 7 Научная новизна исследований В работе впервые проведено исследование комплекса грибов – возбудителей листовых пятнистостей растений из семейства пасленовых молекулярно-генетическими методами без выделения чистых культур. Применение подобных методов анализа позволило выявить в пораженных образцах листьев виды грибов, о нахождении которых на исследуемых растениях ранее в России не сообщалось. Разработаны тест-системы для идентификации трех видов Alternaria sp. Их применение позволило выявить виды A. alternata, A. solani и A. infectoria в пораженных образцах листьев из разных регионов России. В исследованных образцах эти виды встречались как по отдельности, так и совместно. Практическая значимость работы В работе был оптимизирован метод определения видового состава пораженных листьев молекулярно-генетическими методами без выделения чистых культур. Этот метод, основой которого является клонирование амплифицированных фрагментов ДНК с их последующим секвенированием, успешно дополняет существующие методы идентификации видовой структуры грибных сообществ и может быть использован при мониторинге видового состава фитопатогенных грибов и оомицетов. Разработаны высокоспецифичные праймеры для классической ПЦР и ПЦР в реальном времени для идентификации трех видов Alternaria (A. alternata, A. solani и A. infectoria), вызывающих поражения разных органов растений из семейства пасленовых, различающихся по экологическим оптимумам и устойчивости к фунгицидам. Созданные тест-системы могут применяться для экспресс-диагностики этих видов в образцах растительных тканей без выделения грибов в чистую культуру. Личный вклад автора Диссертационная работа является результатом экспериментальных исследований, выполненных лично автором или при его непосредственном участии. Автор осуществлял постановку целей и задач, планирование и 8 проведение сборов, экспериментов, обработку и интерпретацию полученных данных. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Апробация работы Основные результаты работы были представлены на Международной конференции XV Euroblight Workshop (Брашов, Румыния, 13-15 мая 2015), Третьем Международном Микологическом Форуме (Москва, 14-15 апреля 2015 г.); Международной конференции XIV EuroBlight Workshop (Кипр, Лимассол, 11-14 мая 2013 г.); VII международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 19-22 марта 2013 г.); Всероссийской конференции «3 Съезд микологов России» (Москва, 10-12 октября 2013г.); XIX международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2012» (Москва, 9-13 апреля 2012 г.), Международной конференции XIII EuroBlight Workshop (Россия, Санкт-Петербург, 9-12 октября 2011 г.). Связь работы с государственными программами Работа была поддержана грантами РФФИ № 15-29-02512офи_м (20152017 гг.), № 12-04-31992мол_а (2012-2013 гг.); грантом РНФ № 14-50-00029 (2015-2017гг.), а также грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно - технической сфере (2014 - 2015 гг., соглашение № 0007892). Публикации По материалам диссертации опубликована 21 печатная работа, из них 5 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 10 статей – в других периодических изданиях, 6 – тезисы и материалы конференций. Объем и структура работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, перечня публикаций по теме диссертации и списка литературы (348 машинописного источников). текста, Работа содержит 69 изложена на рисунков 197 и 26 страницах таблиц. 9 Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Методические подходы для анализа видового состава грибов 1.1. Морфологические методы анализа грибных патогенов Выявление фитопатогенных микроорганизмов на растениях, в почве, воде и воздухе является одной из важнейших задач фитопатологии. Успешное выполнение этой задачи позволяет: — определить наличие и количество инокулюма и своевременно начать профилактические или лечебные мероприятия; — сертифицировать семена и посадочный материал для карантинной обработки; — количественно оценить популяцию возбудителя для оценки последующей потери урожая; — оценить вариабельность патогенной инфекции для поиска источников устойчивости к болезни; — выявить новые виды и штаммы фитопатогенных микроорганизмов и провести мероприятия с целью ограничения их дальнейшего распространения; — изучить таксономические и эволюционные взаимоотношения патогенов растений; — разделить компоненты сложных заболеваний, вызванных двумя или более фитопатогенами; — изучить особенности взаимодействий между растениями и патогенами, в том числе на генном уровне; — если проведено выделение чистой культуры возбудителя болезни, то можно оценить свойства, его например, культурально-морфологические вирулентность, агрессивность, и биологические устойчивость к фунгицидам. Разработаны многочисленные методы, основанные на биологических, биохимических, иммунологических и молекулярных характеристиках 10 грибных патогенов растений, применяемые для их обнаружения в различных растительных источниках с разной степенью точности. В данной и последующих главах обсуждаются достоинства и недостатки разных методов обнаружения фитопатогенных организмов. Для того чтобы доказать, что микроорганизм является патогенным, он должен соответствовать постулатам Коха: микроорганизм постоянно встречается в организме больных растений и отсутствует у здоровых; микроорганизм может быть изолирован из больного растения в чистую культуру; растение заболевает при заражении чистой культурой микроорганизма (Пугач, 2006; Соколова и др., 2013). Таким образом, получение чистых культур является неотъемлемой частью фитопатологических исследований. Большинство грибов, в том числе и патогенных, можно выделять в чистую культуру и культивировать на искусственных питательных средах, необходимых для их роста и размножения. Традиционные методы идентификации фитопатогенных грибов включают в себя выделение их чистых культур, ведение культур на стандартных агаризованных средах и изучение с использованием светового микроскопа морфолого-культуральных характеристик, таких как морфология колоний, размер, цвет и строение бесполых и половых структур, а именно ― спорангиев, конидий, хламидоспор, склероциев, пикнид и т.д. Многие грибные патогены могут быть идентифицированы таким образом до видового уровня (Armengol et al., 2001; Martin, Cobos, 2007). Этот метод изучения патогенов невозможен в случае, если изучаемый гриб не может быть выделен и расти на питательных средах. Наличие грибных гиф и спорообразующих структур в инфицированных тканях можно визуализировать с помощью различных красителей. Так, например, межклеточный мицелий и гаустории Ustilago scitaminea, вызывающий головню сахарного тростника, можно наблюдать с помощью окрашивания трипановым синим. Этот метод может быть использован для 11 быстрого обнаружения инфекции головни в полевых условиях (Padmanabhan et al. 1995). 1.1.1. Выделение патогенных грибов В большинстве случаев для правильного определения вида по культурально-морфологическим признакам необходимо выделение чистой культуры гриба. Грибные патогены способны заражать различные части растений, такие как корни, стебли, листья, цветы и плоды, вызывая такие характерные симптомы, как пятнистость, антракноз, гнили и т.д. Для выделения чистой культуры необходимо получить конидии или мицелий гриба, не загрязненные субстратом и другими грибами. С этой целью пораженные органы подвергаются поверхностной стерилизации. В течение 30 - 60 сек, их выдерживают в различных растворах (0,1% раствор хлорида ртути, 1% гипохлорит натрия, 50% перекись водорода и 2% раствор перманганата калия). Затем пораженные ткани тщательно промывают в стерильной воде (Narayanasamy, 2011; Дьяков, Еланский, 2016). После стерилизации пораженная часть растения закладывается во влажную камеру (чаще всего этого чашка Петри) и инкубируется несколько суток. Образовавшиеся гифы или спороношение стерильно переносятся на агаризованные среды с добавлением антибиотика (стрептомицин или пенициллин) для того, чтобы предотвратить бактериальное загрязнение. Некоторые виды грибов требуют особых селективных сред. Так, для Phythophthora infestans (Mont.) de Bary используется овсяная агаризованная среда, для видов рода Alternaria картофельно-морковная агаризованная среда (Roberts, 2005). Многие виды фитопатогенов, такие как Botrytis cinerea, Cladosporium fulvum, Colletotrichum acutatum выращиваются на картофельнодекстрозной агаризованной среде (Gonzalez et al., 2006; Mirzaei et al., 2008; Yan et al., 2008). Большинство фитопатогенных грибов способны к росту на среде сусло – агар (Martin, Cobos, 2007). Применяют и дополнительные способы очистки культуры гриба, обычно одним из двух способов: 12 (1) изоляция одной гифы, (2) изоляции одной споры. Затем они переносятся на отдельную чашку Петри с питательной средой. Морфологические характеристики грибных патогенов учитываются и у бесполой, и у половой стадии. Для споруляции (образование спор/конидий) некоторых фитопатогенных грибов требуются конкретные условия. Например, воздействие ультрафиолета является очень эффективным методом для индукции спороношения у Alternaria solani и Septoria lycopersici (Narayanasamy et al., 2010; Орина, 2011). Таким образом, идентификация фитопатогенных грибов по культурально-морфологическим признакам базируется на визуальной и микроскопической оценке морфологии колоний, различных структур гриба и использовании определителей (Билай, 1988; Bensch et al., 2010; Seifert, 2011). 1.2. Молекулярные методы исследования видового состава грибных сообществ В последние годы для анализа микробных сообществ разработано большое количество молекулярных методов, которые предоставляют широкие возможности для исследования в сравнении с традиционными подходами. Например, Торсвик и соавторы (Torsvik et al., 1998) показали, что только 1% почвенных бактерий могут быть выделены и культивированы с использованием традиционных методов. Многие грибы вообще не могут быть культивированы с использованием стандартных подходов (Thorn, 1997; van Elsas et al., 2000), что привело к разработке различных методов, не требующих выделения чистых культур. Несмотря на большое фундаментальное и практическое значение, видовое разнообразие и функциональная роль грибов в различных сообществах сравнительно мало изучались до последнего времени. В основном такие исследования проводились для анализа грибных сообществ почвы. При определении таксонов грибов по морфологическим признакам, грибы, не образующие спороносных структур, требовательные к субстрату, 13 могут не обнаруживаться исследователем. В настоящее время, благодаря современным молекулярным подходам, появилась возможность максимально выявлять и изучать члены сообществ, населяющих разнообразные экосистемы (Казарцев, 2013). 1.2.1. Амплификация ДНК грибов с помощью ПЦР Современные методы молекулярной диагностики основываются на технологии полимеразной-цепной реакции (ПЦР), в которой тотальная ДНК/РНК, выделенная из почвы, используется для предварительной амплификации интересующего таксономически значимого участка геномной ДНК. В случае эукариотических организмов гены рибосомной РНК, (особенно малой субъединицы рибосомной РНК – 18S рРНК), являются основной мишенью при определении членов микробного сообщества (Kowalchuk et al., 2006). Гены большой субъединицы рибосомной РНК, 28S рРНК, также использовались для исследований (Möhlenhoff et al., 2001), но значительно реже, чем 18S рРНК. Эти участки интересны для таксономической идентификации благодаря следующим свойствам: (I) повсеместное присутствие во всех известных организмах; (II) присутствие консервативных и вариабельных областей; (III) экспоненциально расширяется число депонированных в Генбанке последовательностей, используемых для сравнения. В случае анализа сообщества в пробе окружающей среды, консервативные регионы служат сайтами отжига (в ПЦР) для соответствующих универсальных праймеров, тогда как вариабельные области могут быть использованы для филогенетической дифференциации. Кроме того, высокое число копий рДНК в клетках облегчает их обнаружение в пробах окружающей среды. Тем не менее, в связи с малым числом различий в генах 18S рДНК среди родственных видов грибов таксономическая идентификация обычно ограничивается на уровне рода или семейства. Для того чтобы увеличить 14 уровень таксономической идентификации, для исследований обычно используют и внутренние транскрибируемые спейсеры (ITS), которые находятся между 18S рДНК и 28S рДНК (White et al. 1990; Gardes, Bruns, 1993) (рис. 1.1.). Рис.1.1. Строение участка рибосомной ДНК грибов. В связи с быстрой эволюцией некодирующие регионы ITS имеют гораздо большую вариацию последовательностей ДНК среди близкородственных видов, чем регионы, кодирующие гены рРНК. Гены, кодирующие функциональные белки, также были использованы в качестве генетических маркеров некоторых групп, например, ген лакказы аскомицетов (Lyons et al., 2003), или для того, чтобы получить более высокое разрешение у определенных таксонов грибов (Fusarium elongation factors; Yergeau et al., 2005). Эти генетические маркеры были амплифицированы с использованием специфических праймеров с ДНК или РНК почвы. В настоящее время доступны различные наборы праймеров для ПЦР, ориентированные на грибные последовательности ДНК (Anderson, Cairney, 2004). Выбор специфических праймеров для ПЦР является одним из самых важных факторов, влияющих на исходные результаты в анализе грибных сообществ (Jumpponen, 2007; Hoshino, Morimoto, 2010). 1.2.2.Методы дифференциации продуктов ПЦР При анализе ДНК пораженного органа растения, ПЦР-продукты, как правило, являются смесью генов-мишеней, таких как рДНК, часто одного размера, полученных из различных видов грибов. Для идентификации видов должна быть проведена дифференциация этих последовательностей, что может быть сделано только на основе анализа нуклеотидного состава. Состав 15 подобных комплексных ПЦР продуктов анализируют с помощью методов, основанных на электрофоретическом разделении фрагментов изучаемых последовательностей, либо на определении последовательностей нуклеотидов (клонирование с последующим секвенированием, технологии секвенирования второго поколения и др.) (Nocker et al., 2007). 1.2.2.1. Методы дифференциации продуктов ПЦР, основанные на электрофоретическом разделении Методы фингерпринтинга ДНК позволяют получать профили тотальной ДНК сообществ на основе прямого анализа ПЦР продуктов из окружающей среды (Muyzer, 1993). Эти методы включают денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ, DGGE - Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, Muyzer, 1993), термальный градиентный гель-электрофорез (ТГГЭ, TGGE — Temperature Gradient Gel Electrophoresis, Felske et al., 1998), анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP — Singlestrand conformation polymorphism, Callon et al., 2006), полиморфизм длин терминальных рестрикционных фрагментов (ТПДРФ, TRFLP -Terminal Restriction Fragment рестрикционный Length анализ Polymorphism, Dickie, амплифицированной FitzJohn, 2007), рибосомной ДНК (ARDRA―Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis Schmidt, Moreth, 1999), автоматизированный анализ рибосомных межгенных спейсеров (АРИСА, ARISA - automated method of ribosomal intergenic spacer analysis, Ranjard et al., 2001), случайно амплифицированная полиморфная ДНК (RAPD- Random Amplified Polymorphic DNA, Welsh, McClelland, 1990), и другие. В основе этих методов лежит дифференциация сообществ микроорганизмов по полиморфизму последовательностей ДНК или полиморфизму длин фрагментов ДНК. Эти подходы были разработаны для того, чтобы выявить какое-либо внешнее воздействие на исследуемые сообщества или показать различия между сообществами, однако они не дают 16 возможность получать непосредственные таксономические данные о компонентах сообщества. Методы, включающие электрофорез фрагментов ДНК, подходят для получения данных об общем генетическом разнообразии микробных сообществ почвы. Продукты ПЦР разделяют электрофорезом на основе нуклеотидного состава. Данные электрофоретических профилей, т.е. положение и относительная интенсивность различных групп или пиков, могут быть переведены в числовые данные, которые применимы для расчета индексов разнообразия и статистического анализа, что дает возможность сравнения различных образцов. В настоящее время, в основном, используются три метода электрофореза: денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ), терминальный рестрикционный анализ полиморфизма (Т-ПДРФ), и автоматизированный анализ рибосомных межгенных спейсеров (АРИСА). Эти подходы основаны на разных принципах (рис. 1.2.). Рис 1.2. Основные принципы методов фингерпринтинга ДНК (Hoshino, 2012). Метод денатурирующего градиентного гель - электрофореза (ДГГЭ) основывается на электрофорезе амплифицированных участков ДНК в полиакриламидном геле c градиентом концентрации денатурирующего агента (мочевины и формальдегида). На основе характеристик плавления двухцепочечных фрагментов ДНК разделяют фрагменты одинакового 17 размера, но различной последовательности. Скорость денатурации (или плавления) зависит от соотношения A-T/G-C пар в исследуемых фрагментах (связь G-С более устойчива). Во время электрофореза двойные цепи ДНК диссоциируют, создавая различные разветвленные молекулы, при этом частичное плавление нитей ДНК снижает их подвижность. В результате частично денатурировавшие фрагменты движутся с различной скоростью, которая напрямую зависит от длины и соотношения оснований в нуклеотидных последовательностях, и каждый фрагмент ДНК будет зарегистрирован как отдельная полоса в геле. С ростом популярности и доступности технологии автоматического капиллярного электрофореза широкое распространение получил метод ТПДРФ (рис. 1.2). ТПДРФ отличается от стандартного метода ПДРФ применением праймеров с флуоресцентной меткой. После рестрикции проводят разделение полученной смеси фрагментов ДНК методом капиллярного или гель- электрофореза. Полосы на электрофореграмме образуют только терминальные (концевые) фрагменты ДНК, так как они содержат флуоресцентно меченый праймер. Фрагменты разделяются в геле в зависимости от их длины. Теоретически, образцу ДНК каждого биологического вида, присутствующего в пробе, будет соответствовать одна из полос (а затем один из пиков на электроферограмме). Полученные результаты интерпретируют при помощи автоматического лазерного секвенатора и получают электрофореграмму, содержащую двумерные пики, отличающиеся по ширине и высоте. Электрофореграммы анализируют с помощью компьютерных программ, используя также базы данных, содержащие информацию об уже известных последовательностях ДНК (Щукина, Горст, 2011). Существуют компьютерные программы (например, Phylogenetic Assignment Tool), позволяющие исследователю получать сведения о предполагаемой таксономической принадлежности членов грибного сообщества, основываясь на данных рестрикции. Метод используется для изучения микоризообразующих грибов (Dickie, FitzJohn, 18 2007). Однако такой подход может привести к ложным результатам. Так, например, разные эктомикоризные виды рода Cortinarius могут иметь одинаковый рестрикционный профиль (Karen et al., 1997), а штаммы одного вида Pisolithus формируют разные RFLP-профили (Hitchcock et al., 2003). Метод АРИСА использует флуоресцентно меченый праймер, при этом амплифицированные фрагменты автоматически регистрируются лазерным детектором (рис. 1.2.). Праймер метят флуоресцентными маркерами ROX или электрофорез FAM; амплифицированной ДНК выполняется в автоматизированной системе, которая обнаруживает флуоресцентно меченые фрагменты ДНК с помощью лазера и электрофоретической камеры. Метод особенно полезен в экологических исследованиях, в которых для получения достоверных результатов необходимо большое количество образцов, полученных при многолетних исследованиях из различных географических зон. В зависимости от использованных праймеров и грибные, и бактериальные сообщества могут быть определены с помощью этого метода. Окубо и Сугияма (Okubo, Sugiyama, 2009) сравнили методы ДГГЭ, T-ПДРФ и АРИСА (рис. 1.2.), анализируя ассоциации грибов почвы. Они обнаружили, что метод ДГГЭ обладает более высокой способностью дифференциировать грибное сообщество почвы, в отличие от Т-ПДРФ и АРИСА, в то время как АРИСА имеет более высокую разрешающую способность. Исходя из этих результатов, авторы делают вывод, что метод ДГГЭ может использоваться для анализа различных сообществ, включая неизвестные, такие как микробные сообщества почвы. Т-ПДРФ метод удобен для анализа сообществ конкретных таксономических групп. АРИСА оказался пригодным для анализа разнообразия сообществ микроорганизмов. 1.2.3. Создание библиотек клонов в комбинации с секвенированием Клонирование и последующее секвенирование фрагментов ДНК является одним из широко используемых методов анализа продуктов ПЦРамплификации в образцах окружающей среды. Полученные 19 последовательности сравнивают с известными последовательностями в базах данных GenBank, проект “Рибосомная База” (RDP, Ribosomal Database Project), Mycobank и др. Как правило, полученные последовательности соответствуют таким таксонам, как тип, класс, отряд, семейство, подсемейство или вид на основании сходства последовательностей с пороговыми значениями 80, 85, 90, 92, 94, 97% процентов сходства соответственно (DeSantis et al., 2007). В работе Линдера и Баника (Lindner, Banik, 2009) метод, основанный на клонировании и секвенировании полученных с помощью ПЦР фрагментов ДНК, был использован для выявления состава грибных сообществ, ассоциированных с корнями ели (Picea glauca). Данный метод применялся при анализе биоразнообразия и распространения грибов в почве в ответ на биогеохимические изменения, а также для изучения микоризных ассоциаций Pinus taeda (Jackson, 2010). Анализ клонов 18S рДНК также применяли для выявления различий в грибных ассоциациях на участках почвы, расположенных непосредственно у ледника и лишенных растительности, и почвы морены без растительного и ледникового покрова (Jumpponen, 2003). Несмотря на ряд ограничений (трудоемкость, временные затраты, стоимость), создание библиотеки клонов до сих пор считается "золотым стандартом" для предварительного исследования микробного разнообразия (DeSantis et al., 2007). С появлением современных методов анализа ДНК и снижением стоимости секвенирования в этом методе анализа микробного разнообразия ожидается большой прогресс. 1.2.4. Пиросеквенирование На протяжении последнего десятилетия технологии секвенирования второго поколения, такие как пиросеквенирование, были разработаны и введены в исследования микробной экологии (Petrosino et al., 2009; Roesch et 20 al., 2007), в том числе для анализа грибных сообществ (Buee et al., 2009; Lim et al., 2010; Lumini et al., 2010; Liu et al., 2015). Метод пиросеквенирования ДНК, или секвенирования путем синтеза, был разработан Секвенирование в середине путем 1990-х синтеза годов происходит (Ronaghi при et al., 1996). последовательном добавлении к ДНК-полимеразному комплексу дезоксинуклеозидтрифосфатов (Ronaghi et al., 1996). При включении дезоксинуклеотида в цепочку происходит выделение пирофосфата. Этот пирофосфат в присутствии сульфурилазы и аденозинфосфосульфата преобразуется в АТФ и запускает окисление люциферина люциферазой, при этом высвобождается видимый свет, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшегося АТФ (рис. 1.3). Люминесценция регистрируется фотоумножителем или цифровой камерой (Ronaghi et al., 1996). Рис. 1.3. Система реакций пиросеквенирования (http://molbiol.ru/bio/001/001). Пиросеквенирование позволяет сократить время и трудозатраты, присущие клонированию, и имеет некоторое ценовое преимущество за пару оснований перед секвенированием по Сэнгеру. Буйе с авторами исследовали разнообразие грибов в шести различных лесных почвах с использованием 454 пиросеквенирования (Buee et al., 2009). В результате было изучено 166350 нуклеотидных последовательностей ITS1 и выявлено до 1000 ОТЕ (оперативные таксономические единицы). При этом количество ОТЕ, представленных всего лишь одной последовательностью, достигало 60% от 21 всего определенного таксономического многообразия. Таким образом, использование 454 пиросеквенирования позволило прочитать более сотни тысяч ПЦР-ампликонов в течение 1 прогона (раунда амплификации). Одним из основных ограничений метода пиросеквенирования является его неспособность к прочтению относительно длинных последовательностей ДНК. Длина прочтения последовательности редко превышает 400-500 оснований. Из-за этого ограничения секвенирование по Сэнгеру продолжают широко использовать для получения и расшифровки более длинных последовательностей. Исследования, посвященные изучению патогенной и непатогенной микробиоты, проводились для растений томата, однако исследовались только бактерии. В 2013 году в США с помощью технологий NGS секвенирования было проведен сравнительный анализ микробиоты различных органов S. lycopersicum: листьев, стеблей, корней и плодов (Ottesen et al., 2013). Также, в США с помощью 454 пиросеквенирования были изучены бактерии поверхности плодов томата (Telias et. al., 2011). В 2011 г. в Австрии с помощью NGS секвенирования было проведено изучение эндофитных бактерий корней и стеблей картофеля (Nikolic et. al., 2011). Сведений об изучении структуры микобиоты органов картофеля или томата нам найти не удалось. Однако в области фитопатогенной микологии данные методы не имели широкого применения. Нунес с соавторами (Nunes et al., 2011) использовал 454 технологию секвенирования для характеристики РНК транскриптома мицелия и апрессорий Magnaporthe oryzae. В работе сделано предположение, что полученные данные способствуют лучшему пониманию патогенных процессов и в перспективе позволят сконструировать растительный геном, способный к модификации транскриптома М. oryzae и эффективному подавлению его развития. В другой работе с помощью пиросеквенирования были количественно определены замены в генах сукцинатдегидрогеназы, связанные с устойчивостью к фунгицидам в популяциях Botrytis sp. (Gobeil22 Richard, et al., 2015). Пиросеквенирование ITS1 региона ДНК использовали для идентификации видов Phytophthora (Vettraino, et al., 2012). Другую технологию секвенирования второго поколения, Ion Torrent, использовали для секвенирования Pyrenophora teres и Sphaerulina musiva (Leboldus et al., 2015). 1.2.5. Использование различных ITS праймеров для исследования видового разнообразия грибных сообществ и их количественной оценки в образцах окружающей среды Для изучения сообществ грибов как методом пиросеквенирования, так и другими методами, часто используют ITS регион рДНК. Выбор и дизайн праймеров играет важную роль в применении методов, связанных с анализом ДНК. Олигонуклеотидные праймеры, выбранные для анализа сообществ, должны быть специфичными и универсальными для целевой группы. Для анализа бактериальных сообществ используют праймеры на основе 16S рРНК гена, в связи с тем, что он является универсальным для бактерий и содержит как высоко консервативные, так и вариабельные последовательности (Hill et al., 2000). На этом же основании 18S, 5.8S и 28S гены рРНК, которые соединены гипервариабельными ITS1 и ITS2 регионами (рис. 1.4), являются удобными для анализа при исследовании грибных ассоциаций (Hill et al., 2000). Рис. 1.4. Схема строения участка рибосомных генов со специфичными праймерами к ITS районам. В настоящее время, согласно литературным данным, существуют различные ПЦР праймеры для оценки разнообразия в образцах ДНК, специфичные к участку 18S рДНК (таблица 1.1.). 23 Таблица 1.1. Некоторые ПЦР-праймеры, специфичные к участкам рДНК грибов. Участок амплифиации 18S rDNA ITS ПЦР праймер Последовательность праймера (5'-3') Авторы NS1 EF3 EF4 Fung5 nu-SSU-1196 nu-SSU-1536 FR1 FF390 Fung ITS1 ITS2 ITS4 ITS1F ITS4B GTAGTCATATGCTTGTCTC TCCTCTAAATGACCAAGTTTG GGAAGGGRTGTATTTATTAG GTAAAAGTCCTGGTTCCCC TCTGGACCTGGTGAGTTTCC ATTGCAATGCYCTATCCCCA AICCATTCAATCGGTAIT CGATAACGAACGAGACCT ATTCCCCGTTACCCGTTG TCCGTAGGTGAACCTGCGG GCTGCGTTCTTCATCGATGC TCCTCCGCTTATTGATATGC CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG White et al., 1990 Smit et al., 1999 Vainio, Hantula, 2000 May et al., 2001 White et al., 1990 Gardes, Bruns, 1993 Для точного анализа грибных сообществ подходящие ПЦР-праймеры должны полностью амплифицировать из пулов ДНК только последовательности грибов и исключить амплификацию не грибных последовательностей. Тем не менее, праймеры, избирательные к 18S рДНК грибов или ITS регионов, амплифицируют также гены негрибных организмов из-за высокого уровня сходства последовательностей между 18S рДНК грибов и некоторых близких групп эукариот. При увеличении специфичности праймеров с их помощью можно амплифицировать только определенную группу грибов (Anderson, Cairney, 2004). Первыми ПЦР праймерами, получившими широкое распространение в работах с грибами, были "ITS1" и "ITS4", которые способствовали амплификации высоко вариабельных ITS1 и ITS2 последовательностей, окружающие 5.8S ген и расположенные между последовательностями, кодирующими малую субъединицу (SSU) и большую субъединицу (LSU) рибосомного оперона (White et al, 1990). Эти праймеры участвовали в амплифицикации последовательностей у широкого круга грибов и применялись для анализа ДНК, выделенной из отдельных организмов или 24 чистых культур. Однако они не эффективны в исследованиях микобиоты, связанной с растениями, в тех случаях, когда нужно исключить последовательности ДНК растения-хозяина в смешанных образцах ДНК фитосферы (Sun et al., 2013). Впоследствии широкое распространение получили праймеры ITS1-F и ITS4-B, исключающие геном растения из анализа ITS последовательностей грибов, однако эти праймеры являются специфичными только для настоящих грибов (Gardes, Bruns, 1993). В работе (Manter, Vivanco, 2007) проводился анализ специфичности и эффективности праймеров ITS1F и ITS4 в одиночных или смешанных образцах ДНК. Эти праймеры были высокоспецифичны к широкому кругу грибных организмов (аскомицеты, базидиомицеты и зигомицеты), и не были эффективны в отношении ДНК оомицетов. Амплифицированные с помощью праймеров фрагменты ДНК показали значительную изменчивость (от 420 до 825 пн), но выявленное фактическое видовое разнообразие из-за одинаковых размеров ампликонов у некоторых видов грибов может быть существенно уменьшено (примерно в 2 раза). Для специфичной амплификации сообществ грибов почвы были использованы пары праймеров ITS86F и ITS4, ITS1-F и ITS86R (Vancov, Keen, 2009). Пара ITS86F и ITS4 избирательно специфична для аскомицетов, базидиомицетов и зигомицетов. Пара праймеров ITS1F и ITS86R также специфична к последовательностям аскомицетов и базидиомицетов, но не к зигомицетам. Обе пары считаются подходящими для фингерпринтинга ДНК грибных сообществ окружающей среды. В работе (Martin, Rygiewicz, 2005) был проведен анализ различных ПЦР праймеров для отбора из их числа высокоспецифичных к грибной ДНК с отсутствием амплификации растительной ДНК (рис. 1.5.). Было обнаружено, что обратный праймер ITS4-B не амплифицирует участки ДНК аскомицетов и имеет низкий коэффициент совпадений с последовательностями базидиомицетов. Авторами были разработаны и 25 предложены к использованию несколько пар nested (nested) ПЦР-праймеров (ПЦР со вложенной парой праймеров), специфичных для дикариомицетов: 1. Первая пара в nested ПЦР (NSA3/NLC2), инициируют амплификацию наиболее длинного фрагмента, около 1200 пн. 2. Праймеры NSI1/NLB4 – участвуют в амплификации обоих ITS регионов. 3. Праймеры 58A1F, 58A2F – специфичны только к 5.8S гену (анологичны праймерам ITS3/ITS2 (White et al, 1990). 4. Пара праймеров NSIP/NLBP – специфичная для ДНК растений, создана для проверки ПЦР продуктов на наличие контаминации растительной ДНК. Полный набор праймеров был разработан с целью дифференцировки последовательностей растений и грибов при их исследовании в образцах, содержащих высокие уровни фоновой ДНК растений, например, эктомикориз или сообществ филосферы. Однако, предлагаемые авторами праймеры не подходят для изучения оомицетов и зигомицетов. Рис. 1.5. Схема локализации праймеров в регионе рДНК, включая SSU, ITS1, 5.8S, ITS2 и LSU. 26 Для анализа библиотек клонов из образцов почвы (Hoshino, Morimoto, 2010) с целью оценки частоты встречаемости последовательностей ДНК, отличных от грибных, сравнили различные праймеры для стандартной и nested PCR. В работе использовали 4 пары праймеров: для стандартной ПЦР NS1/GCFung, FF390/FR1(N)-GC, и NS1/FR1(N)-GC, и для nested ПЦР NS1/EF3 для первого раунда ПЦР, и NS1/FR1(N)-GC для второго раунда ПЦР. Полученные результаты показали, что во всех случаях применения праймеров для стандартной ПЦР обнаружено присутствие не грибной эукариотической 18S рДНК, в то время как при nested ПЦР амплифицировались только последовательности ДНК грибов. Однако их разнообразие было значительно ниже, чем при стандартной ПЦР. Эти результаты свидетельствуют о том, что система nested ПЦР с использованием набора праймеров NS1/EF3 и NS1/FR1(N)-GC не подходит для анализа разнообразия широкого диапазона таксономических групп (например, всех грибов). Специфичность ПЦР-праймеров зависит от состава эукариотической ДНК, содержащейся в извлеченном ДНК-пуле. Например, несмотря на то, что праймеры EF4/EF3 и EF4/fung5 участвуют исключительно грибных последовательностей ДНК, в амплификации выделенной из ризосферы пшеницы (Smit et al., 1999), они также амплифицируют некоторые не грибные последовательности, выделенные из почвы под авокадо (Borneman, Hartin, 2000). В зависимости от наборов используемых праймеров выявлялись различные группы эукариотических организмов не грибного происхождения. Специфичность праймеров также зависела от состава последовательностей ДНК в образцах, не относящихся к грибам. Таким образом, авторы делают вывод о важности проверки специфичности праймеров на образцах проб из окружающей среды. Из работы Андерсона и др. (Anderson et al., 2003) следует, что в ПЦР с праймерами nu-SSU-817/nu-SSU-1196, nu-SSU-817/nu-SSU-1536, EF4/EF3 и ITS1F/ITS4 относительные доли последовательностей четырех основных 27 филогенетических групп грибов, выделенных из пастбищных почв, были одинаковыми в библиотеках клонов. В другой работе (Jumpponen, 2007) было показано, что пара праймеров EF4/EF3 была специфична к последовательностям базидиомицетов, как было показано ранее (Smit et al., 1999). Другая пара праймеров (nu-SSU-817/nu-SSU-1536), в основном, инициирует амплификацию представителей аскомицетов из почвенных образцов под ивовыми насаждениями. Частота обнаружения Chytridiomycota, различается в зависимости от наборов праймеров. Использование праймеров NS1/GCFung не привело к амплификации Chytridiomycota, в то время как FF390/FR1(N)-GC при амплификации были более эффективны. Таким образом, выбор праймеров имеет решающее значение для исследования структуры сообществ, однако специфичность праймера может быть не настолько значительна, как считали авторы (Anderson et al., 2003). Эти результаты показывают, что соответствующие праймеры должны быть выбраны согласно цели и происхождению образцов, и/или следует использовать более двух наборов праймеров с различными свойствами, чтобы получить более полное представление о сообществе грибов. Таким образом, современные методы анализа ДНК и полученные на их основе данные позволяют получить более широкое представление о богатстве окружающего мира и, следовательно, по-иному взглянуть на функционирование природных экосистем. 1.3. Фитопатогенные грибы - возбудители заболеваний листьев пасленовых культур 1.3.1. Фитофтороз Фитофтороз картофеля и томата – опасное заболевание, распространяющееся с высокой скоростью и вызывающее значительные потери урожая (Kamoun, 2003; Дьяков, Еланский, 2007; Кокаева и др., 2011). 28 Оомицет Phytophthora infestans (Mont.) de Bary является основным возбудителем фитофтороза картофеля и томата на территории России (рис. 1.6., 1.8.-1.9.) P. infestans является биотрофным паразитом, вызывает тяжелые поражения всех органов картофеля и томата, а также он способен поражать баклажаны и некоторые дикие пасленовые, развивающиеся на полях в качестве сорняков. Рис. 1.6. Сиптомы фитофторозного поражения листьев томата (фото Long Island Horticultural Research & Extension Center). В зимнее время и в период жаркого сухого лета P. infestans может сохраняться в виде мицелия в инфицированных клубнях, стеблях картофеля, плодах и семенах томата. Другой инфекционной структурой, способной к выживанию при неблагоприятных условиях, являются ооспоры, образующиеся в результате полового размножения (Анисимов и др., 2009). В живых органах растений при встрече штаммов разных типов спаривания, P.infestans формирует ооспоры (рис. 1.7), которые зимуют в растительных остатках и весной образуют бесполое спороношение, способное к заражению растений (Дьяков, Еланский, 2007). Рис. 1.7. Ооспора и конидии P.infestans (фото Е.Д. Мыца). 29 Рис.1.8. Распространение и зоны вредоносности Phytophthora infestans на картофеле (http://www.agroatlas.ru/). Рис. 1.9. Распространение и зоны вредоносности Phytophthora infestans на томате. Из литературных источников известно и о других видах рода Phytophthora, встречающихся как на листьях, так и на плодах томата. Бланкард (Blancard, 2009) выделяет как патогены томата следующие виды фитофторы, вызывающие: 30 А). Увядания и корневые гнили: Phytophthora nicotianae (Phytophthora parasitica nicotianae) как наиболее широко распространенный во всем мире патоген; P. cryptogea, обнаруживается в некоторых странах на корнях томата, особенно на ранних стадиях; P. capsici распространена по всему миру, в том числе была найдена на территории бывшего СССР на растениях томата (Erwin, Ribeiro, 1996); P areacae (= P. palmivora), найдена в Нидерландах в 1960-е годы; P. citricola, ответственная за увядание проростков растений и гнили корневой шейки у молодых растений (Италия, 1960 г.); P. mexicana, в основном приводит к поражению плодов, но также является причиной корневой гнили и увядания; P. erythroseptica, есть данные об обнаружении в сгнивших растениях или в почве (Австралия, Болгария); P. cactorum и P. dreschleri ― распространены в США и Европе. Б). Поражения листьев и плодов: Phytophthora infestans и Phytophthora nicotianae. P. erythroseptica часто встречается на картофеле и вызывает заболевание, известное как розовая гниль. Распространена повсеместно, обнаруживается в почве (Erwin, Ribeiro, 1996, Турко и др., 2010, Nanayakkara et al., 2010). Багировой и др. (1995) в образцах листьев, стеблей, корневой шейки, корней и плодов томата из защищенного грунта (Московская обл.) были определены виды P. cactorum, P. сryptogea (впервые обнаружен на томате в Московской обл.), P. parasitica и P. сapsici. Виды P. cryptogea Peth. et Laff. и P. nicotianae B. de Haan var. parasitica (Dast.) Waterhouse вызывают заболевание, называемое «южный фитофтороз томата». Данное заболевание встречается в основном в грунтовых теплицах и развивается на плодах (Багирова и др., 1995). 31 1.3.2. Альтернариоз Alternaria spp. Виды рода Alternaria Nees являются патогенами листьев и вызывают альтернариоз, опасное заболевание картофеля и томата (рис. 1.10). Патогены принадлежат к семейству Pleosporaceae, порядок Pleosporales, подкласс Pleosporomycetidae, класс Dothideomycetes, подотдел Pezizomycotina, отдел Ascomycota, царство Fungi. Некоторые виды Alternaria являются анаморфами рода Lewia E.G.Simmons, другие рода Pleospora и некоторые виды считаются анаморфами Leptosphaeria. Рис.1.10. Симптомы альтернариоза листьев (фото автора). Большинство видов Alternaria являются сапрофитами, которые обычно встречаются в почве или на разлагающихся растительных тканях. Некоторые виды вызывают целый ряд заболеваний у большого числа разнообразных агрономически (экономически) важных растений-хозяев, включая зерновые, картофель и томат, капусту, брокколи, морковь, декоративные растения, цитрусовые и яблони. Виды Alternaria spp. также известны как опасные послеуборочные патогены. У видов Alternaria не обнаружена половая стадия или зимующие споры, но гриб может сохраняться в виде мицелия или спор на разлагающихся растительных остатках в течение значительного времени, или же в качестве латентной инфекции в семенах (Rotem, 1994). В семенах гриб может 32 инфицировать рассаду во время прорастания. В основном споры распространяются ветром, попадают на поверхность растений, где может происходить инфицирование. Как правило, ткани, подверженные старению или повреждению, более восприимчивы к инфекции, чем здоровые. Многие мелкоспоровые виды Alternaria могут поражать несколько растений-хозяев и встречаются в большинстве регионов европейской части России (Ганнибал, 2007; Орина, 2011; Побединская и др, 2012). Крупноспоровые виды (A. solani) в большинстве своём приурочены к одному или нескольким видам растений одного рода, и встречаются значительно реже (рис. 1.11.). Рис. 1.11. Распространение и зона вредоносности альтернариоза или сухой пятнистости томата (Alternaria solani Sorauer.). Внутри рода Alternaria виды определяются на основании морфологических характеристик конидий (рис. 1.12). Так, во всем мире было описано более 100 видов (Simmons, 1992). Однако, изменчивость морфологических признаков, которые зависят не только от внутренних факторов, но и от условий окружающей среды, приводит к неточностям в систематике видов Alternaria. 33 Рис. 1.12. Цепочки конидий А. alternata (фото G. Barron) и одиночная конидия A. solani (фото B. Watt). В настоящее время получила наибольшее признание классификация Симмонса, суть которой в том, что внутри рода были образованы группы видов, где в каждой есть типичный представитель (Simmons, 1992). Так, например, группа alternata включает в себя виды с маленькими конидиями, ветвящимися в цепочках (рис. 1.12.), группа porri включает в себя виды с большими одиночными конидиями (A. porri). Также штаммы некоторых видов, морфологически сходные, но имеющие различных хозяев (особенно А. alternata) были определены как formae speciales или «патотипы» (Nishimura, Kohmoto, 1983). В настоящее время выделяется 14 видов рода Alternaria, консервативно приуроченных к картофелю и томату (Simmons, 1999, 2000, 2007; Орина, 2011). Эти виды обычно разделяют на три клады. В первую относят крупноспоровый вид A. solani, и недавно выделенный из него A. tomatophila (Simmons, 2007; Еланский, 2012; Ганнибал, 2013). Во второй находятся мелкоспоровые виды, которые, хотя и имеют видимые морфологические отличия (Simmons 2007; Орина, 2011; Побединская и др., 2012; Ганнибал, 2013), но неразличимы по структуре ITS региона генома (Еланский, 2012). Часто их объединяют в вид A. alternata sensu lato (Иванюк и др., 2003). В данной работе мы используем эту классификацию. 34 В третьей кладе находится комплекс видов A. infectoria, которые на основании молекулярных данных предлагается выделить в самостоятельный род Pseudoalternaria (Pryor, Michailides, 2002; de Hoog, Horre, 2002; Еланский, 2012; Ганнибал, 2013; Lawrence et al., 2013). Дифференциация групп видов имеет высокую практическую значимость, так как виды из этих групп имеют разную устойчивость к фунгицидам (Побединская и др., 2012; Kapsa, 2008), вирулентность к сортам растений, разные температурные оптимумы роста (Еланский, 2012). 1.3.3. Colletotrichum coccodes Colletotrichum coccodes (Wallr.) S. Hughes принадлежит к грибам порядка Glomerellaceae, Incertae sedis, подкласс Hypocreomycetidae, класс Sordariomycetes, подотдел Pezizomycotina, отдел Ascomycota, царство Fungi и является одним из вредоносных фитопатогенов. Он вызывает заболевания картофеля и томата, известные под названиями «антракноз» и «черная пятнистость» клубней картофеля. Телеоморфой рода Colletotrichum является Glomerella Spauld. & H. Schrenk. Гриб способен паразитировать на широком круге хозяев из различных семейств высших растений (Chesters, Hornby, 1965), включая Solanaceae, из которых наиболее часто поражает томат и картофель. Патоген инфицирует ослабленные растения и на картофеле проявляется обычно на нижней части стебля, корнях и клубнях, где образует мелкие черные склероции. Вид C. coccodes в России рассматривается, в основном, как патоген клубней, хотя анализ литературных данных показал, что он может встречаться и на других частях растений (рис 1.12). 35 Рис.1.12. Симптомы антракноза листьев томата. Патоген способен зимовать на клубнях в виде склероциев, или в тканях других хозяев, таких, как дикие пасленовые или сорняки (Raid, Pennypacker 1987). Склероции C. coccodes (рис. 1.13.) также могут перезимовывать и в почве, но только в присутствии растительных остатков. Выживать и сохранять вирулентность в почве склероции могут до 8 лет (Dillard, Cobb 1998). Рис. 1.13. Склероций C. coccodes (фото Kelly Clark). Исследования, проведенные в Великобритании в 1989-1990 гг показали, что C. coccodes присутствовал в 75% исследованных растений картофеля и томата (Read, Hide, 1995; Lees et al., 2003). Tsror и др. установили, что в 1998 году из всех ввозимых в Израиль из Голландии 36 партий клубней картофеля до 34% были заражены черной пятнистостью (Tsror et al., 1999). Довольно часто симптомы инфекции трудно распознать и отличить от других заболеваний. Поэтому частота и тяжесть заболевания, вызываемого C. coccodes, бывает нередко недооценена. Например, некрозы на листьях могут быть идентичны признакам фузариозного или вертициллезного увядания. Зачастую тяжело отличить поражения стеблей от ризоктониоза. «Черная пятнистость» на клубнях картофеля может ошибочно приниматься за налет серебристой парши, вызываемой Helminthosporium solani (Lees, 2003). Значительный вред урожаю приносит истощение растений, вызванное инфекционным некрозом листьев и следующее за тем преждевременное старение и увядание, а также снижение качества и количества урожая из-за потери веса при хранении. Hunger, McIntyre (1979) отмечают, что клубни, пораженные более чем на 60%, после 18 недель хранения потеряли в среднем 10% сырой массы, в то время как клубни с 0-1% поражения потеряли только 5%. Эти данные коррелируют с повреждением перидермы зараженных клубней (Lees, 2003). 1.3.4. Septoria lycopersici По данным Паластровой, в Курганской области наибольший вред листьям и плодам томата наносил вид Septoria lycopersici Speg (Паластрова, 2006). Вид относится к сем. Mycosphaerellaceae, пор. Capnodiales, п/классу Dothideomycetidae, классу Dothideomycetes, п/отделу Pezizomycotina, отделу Ascomycota, царство Fungi. Septoria lycopersici является биотрофным паразитом. Патоген вызывает заболевание, называемое септориоз. Септориоз характеризуется небольшими круглыми темными пятнами (рис. 1.14), до нескольких миллиметров в диаметре, напоминающие бактериальное поражение или развивающийся альтернариоз. 37 Рис. 1.14. Симптомы септориоза (фото S. Bost.). Поражается рассада в парниках и растения в открытом грунте. Пикниды могут сохраняться в пораженных растительных остатках, плодах и почве и служить источником инфекции (по материалам www.agroatlas.ru). В настоящее время заболевание можно встретить по всему ареалу возделывания томата, но наибольший вред патоген наносит в районах с повышенной влажностью. Сильное поражение томата отмечено в Западной и Восточной Сибири, на Дальнем Востоке, Прибалтике, Белоруссии, Украине, Волгоградской области, Закавказье, в Мордовии, Республике Марий Эл, Башкирии, на Северном Кавказе (пораженность растений 36-100%) (по материалам www.agroatlas.ru, рис 1.15). Мероприятия, направленные на защиту растений от альтернариоза также эффективны в отношении Septoria. В настоящее время не существует устойчивых к септориозу сортов томата, однако севооборот с любой из культур позволяет существенно снизить количество инокулюма. 38 Рис. 1.15. Распространение и зона вредоносности Septoria lycopersici. 1.3.5. Cladosporium fulvum Cladosporium fulvum Cooke относится к семейству Cladosporiaceae, пор. Capnodiales, п/кл. Dothideomycetidae, кл. Dothideomycetes, п/отделу Pezizomycotina, отд. Ascomycota, царство Fungi. Вид не связан с родом Cladosporium sensu strictu и недавно был переименован в Passalora fulva (Cooke) U. Braun & Crous (Thomma et al, 2005). С. fulvum - биотрофный патоген томата, который служил в качестве модельной системы для изучения растительно-микробных взаимодействий (de Wit et al., 2012). Кладоспориоз, или бурая пятнистость (рис. 1.16), чаще всего поражает тепличные растения, но также встречается на растениях в открытом грунте. 39 Рис. 1.16. Симптомы кладоспориоза (фото S. Bost). В первой экономическую половине значимость, 20-го но века его заболевание значение имело большую уменьшилось после интрогрессии сортов томата генами устойчивости Cf (для С. fulvum) (de Wit, 1992; Thomma et al., 2005). Тем не менее, вспышки заболевания до сих пор встречаются (рис. 1.17) в тех странах, где сорта томатов не содержат Cf гены устойчивости, а также в районах, где выращивание устойчивых растений томата привело к появлению штаммов грибов, преодолевающих устойчивость растений с Cf генами (Enya et al, 2009). Следует отметить, что патоген характеризуется наличием большого числа физиологических рас. Распространение инфекции происходит с помощью конидий, которые переносятся потоками воздуха и брызгами воды. Конидии могут сохраняться на растительных остатках в течение нескольких месяцев. 40 Рис. 1.17. Зоны вредоносности Cladosporium fulvum (www.agroatlas.ru). 1.3.6. Phoma sp. Согласно литературным данным заболевание, известное как фомоз, вызывается двумя видами: Phoma destructiva Plowr и Phoma lycopersici Cooke (в настоящее время переименован в Boeremia lycopersici (Cooke) Aveskamp, Gruyter & Verkley). Morgan-Jones, Burch (1988) сообщают о P. destructiva как о патогене томата. В Индии патогенное воздействие отмечают у Phoma parasitica (Aulakh, Grover, 1969) и Phoma betae (Mathur, 1979), а в Колумбии указывается Phoma audina (Leorakkar et al., 1986). Рис. 1.18. Пятнистость листьев томата, вызванная фомозом (фото N. Goldberg). 41 Фомоз может поражать листья (рис. 1.18), стебли и плоды картофеля и томата. Споры (рис. 1.19) распространяются с помощью капель дождя, воды для полива и с помощью человека. Споры способны сохраняться в почве, на растительных остатках, а также переносятся с других растений семейства пасленовых (перец и дикие сорные виды). Патоген проникает в растение через ранки, вызванные механическими повреждениями. Рис. 1.19. Пикнида и споры Phoma destructiva ( фото N. Goldberg, NMSU-PDC). Выявлено широкое распространение патогена по всему миру (Индия, Италия, Острова Тихого Океана, Россия, Великобритания и США) и по всему ареалу возделывания томата в России (Wani, 2011). 1.3.7. Мучнистая роса томатов В ряде работ возбудителями заболевания мучнистой росы томатов считаются следующие виды: Erysiphe communis (Wallr.) f. solani-lycopersici Jacz. (Braun, 1995); Leveillula taurica (Lev.)G. Arnaud. (Guzmán-Plazola et al, 2011) и его анаморфа Oidiopsis taurica; Oidium neolycopersici L. Kiss (Kiss et al, 2005) и Oidium lycopersici Cooke & Massee (Ciccarese, et al, 1998). Систематическое положение всех этих видов одинаково: семейство Erysiphaceae, порядок Erysiphales, подкласс Leotiomycetidae, класс Leotiomycetes, п/отдел Pezizomycotina, отдел Ascomycota, царство Fungi. Основным хозяином О. neolycopersici является томат, однако этот возбудитель способен поражать множество растений, особенно пасленовые культуры (перец, баклажан, картофель, табак) и дикие пасленовые (сорняки) 42 (Cerkauskas, 2005). Гриб производит большое количество конидий, образующихся на простых, коротких конидиеносцах, которые легко разносятся ветром и дождем (рис. 1.20). Рис. 1.20. Конидиеносец и конидия О. neolycopersici (фото J. Liberato). В меньшей степени патоген распространяется с помощью насекомыхвредителей (трипс, тлей и белокрылки) и работников полей. Прорастание спор и заражение возможны при широком интервале температур (18-28⁰С) и влажности воздуха. Совершенные стадии образуют клейстотеции, в которых формируются округлые сумки со спорами. Мицелий гриба и клейстотеции могут сохраняться на остатках пораженных растений и в почве. Однако возбудитель L. taurica в России обнаружен только в конидиальной стадии Oidiopsis taurica (Осницкая, 1968). Симптомы могут появиться в течение 7 дней с того момента, как конидии оказались на поверхности листьев. Развитию болезни способствуют такие факторы, как близкое расстояние между растениями и их пышный рост, возникающий при высоких уровнях азота. Заболевание обнаруживается в закрытом и в открытом грунте, и, согласно материалам портала АгроАтлас, не имеет широкого распространения в России. 1.3.8. Botrytis cinerea Pers. (серая пятнистость листьев) Систематическое положение патогена - Sclerotiniaceae, Helotiales, Leotiomycetidae, Leotiomycetes, Pezizomycotina, Ascomycota, Fungi. 43 Серая пятнистость листьев (рис. 1.21.) является широко распространенным заболеванием картофельных полей, а также растений томата в закрытом грунте (Mouekouba et al., 2013). Заболевание часто наблюдается на стеблях и листьях, но когда накапливается большое количество инокулюма, заболевание может также обнаруживаться на клубнях. Гриб способен зимовать в почве в виде склероциев. Поражения листьев и стеблей приводят к ранней гибели растений, снижению урожайности и качества клубней. Высокая влажность способствует развитию серой гнили. Возбудитель имеет широкий круг хозяев, некоторые из которых используются в ротации с картофелем (Elad et al., 2007). Рис. 1.21. Сиптомы поражения Botrytis cinerea на листьях картофеля (фото W. Kirk). Условиями развития заболевания является относительная влажность воздуха выше 90% и температура ниже 25°C. Распространение заболевания происходит спорами, которые легко переносятся в воздухе. Для контроля заболевания успешно применяются фунгициды, но в теплицах они эффективны только в сочетании с изменением влажности. Botrytis cinerea распространен повсеместно, также часто встречается на территории России и СНГ (Кашйап, 1977; Поликсенова, 2008). 44 1.3.9. Распространенные за пределами России заболевания и их возбудители. В соответствии с многочисленными литературными источниками (Hooker,1981; O’Callaghan et al., 2004; Кузнецова, 2007; Mareli, 2008; Amuji et al., 2013; Тимина, 2014) в качестве возбудителей заболевания листьев картофеля и томата рассматриваются также следующие виды грибов: Mycovellosiella concors (= Cercospora concors), Cercospora solani, Pseudocercospora fuligena (синоним: Cercospora fuligena) - возбудители церкоспороза; Puccinia pittieriana ―бурая ржавчина картофеля; Aecidium cantensis ― бурая пятнистость картофеля; Corynespora cassicola ― мишенеобразная пятнистость томата; Stemphylium solani, S. lycopersici (синоним: S. floridanum) S. botryosum f. sp. lycopersici ― серая пятнистость листьев томата. Однако нами не было найдено свидетельств об их широком распространении на растениях семейства пасленовые в России. 1.4. Методы молекулярной диагностики фитопатогенных грибов Обнаружение и точная идентификация патогенов растений является одной из наиболее важных стратегий для борьбы с их болезнями. Особый интерес вызывает выявление возбудителей на раннем этапе в семенах, маточных растениях и в рассаде, что помогает избежать проникновения и дальнейшего распространения патогенов в другие регионы. По этой причине необходимо наличие быстрых, чувствительных и точных методов идентификации фитопатогенных грибов. Традиционно, самые распространенные методы, используемые для идентификации патогенов растений основаны на культурально - морфологических подходах. Эти методы, однако, не всегда позволяют определить таксономическую принадлежность, вследствие внутривидовой изменчивости, наличия видов-двойников. К другим ограничениям относятся 45 трудности или невозможность выращивания некоторых видов в культуре и проведения точной количественной оценки возбудителя (Goud, Termorshuizen, 2003). Развитие молекулярной биологии и создание обширных баз данных о структуре геномов фитопатогенов (Geiser, 2004) позволили разработать диагностические системы на основе молекулярного анализа возбудителей болезней картофеля. значительной Методы молекулярной специфичностью диагностические системы на и их диагностики чувствительностью, основе обладают что делает высокоэффективными для идентификации возбудителей заболеваний сельскохозяйственных культур. Молекулярные методы также позволяют изучать генетическую изменчивость популяций патогена, обнаруживать и идентифицировать некультивируемые виды, и, ввиду их высокой степени специфичности, различать близкородственные организмы на разных таксономических уровнях. Практическая значимость идентификации фитопатогенных грибов также обусловлена необходимостью выявления латентной инфекции в тканях растения, что имеет большое значение для своевременного применения химических средств защиты (Kolombet et al., 2006). Методы молекулярной идентификации не противопоставляются анализу культурально - морфологических признаков, они дополняют друг друга, а совместное использование этих подходов позволяет преодолеть недостатки обоих методов. 1.4.1. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ПЦР-ПДРФ – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов продуктов полимеразной цепной реакции (PCR – RFLP – polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism) является широко известной технологией генотипирования. В основе метода лежит амплификация целевого участка ДНК на основе ПЦР со специфическими праймерами, с последующим расщеплением 46 полученных фрагментов определенной эндонуклеазой рестрикции (Schumm et al., 1988). В случае, если исследуемый участок ДНК содержит точечную мутацию, то при электрофоретическом разделении продуктов рестрикции выявляются фрагменты различных размеров. В настоящее время метод ПЦР-ПДРФ продолжает использоваться для идентификации и дифференциации геномов различных животных, микроорганизмов и др. Данный метод был использован для анализа 27 различных видов Phytophthora (Drenth et al., 2006). ПЦР-ПДРФ-анализ ITS региона показал наличие различных анастомозных групп (АG) у штаммов Rhizoctonia solani (Pannecoucque, Hofte, 2009). Используя данную методику (Gomez-Alpizar et al., 2011) проводили дифференциацию патогенных и непатогенных штаммов Pythium myriotolum (Gomez-Alpizar et al., 2011). В то же время (Grunwald et al., 2011) не удалось с помощью этого метода провести анализ ITS региона и дифференцировать близкие виды P. infestans и P. mirabilis. 1.4.2. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA, или произвольно амплифицированная полиморфная ДНК, Williams et al., 1990) являлся одним из самых применяемых при изучении генетического разнообразия геномов в конце 1990-х и начале 2000 гг (Кокаева и др., 2011). Метод основан на использовании полимеразной цепной реакции с одиночными 10-членными соединяются с представляющие короткими праймерами, которые последовательностями инвертированные повторы, комплиментарно ДНК патогена, расположенные на противоположных цепях ДНК и достаточно близком расстоянии (до 5000 пн). Полученные ПЦР-фрагменты затем разделяют с помощью электрофореза. В результате образуются в среднем от 3 до 15 RAPDфрагментов, специфичных для определенных видов или штаммов грибов. 47 В дальнейшем некоторые из полиморфных RAPD-фрагментов могут быть вырезаны из геля, клонированы и секвенированы для создания специфичных SCAR-маркеров (SCAR – Sequence Characterized Amplified Region) – амплифицированных участков ДНК, полученных на основе секвенированной нуклеотидной последовательности (Kesseli et al., 1993). К концевым участкам секвенированных фрагментов подбираются праймеры длиной 20-25 оснований, воспроизводимостью которые амплифицируют с высокой одну специфичностью полосу, и соответствующую одному локусу. SCAR-маркеры были использованы для специфической идентификации Phytophthora cactorum (Causin et al., 2005), Fusarium subglutinans (Zaccaro et al., 2007) и Guignardia citricarpa (Stringari et al., 2009), для дифференциации разновидностей (formae speciales) Fusarium oxysporum (Lievens et al., 2008), штамма Sclerotinia minor (Pan et al., 2010) с тем, чтобы установить 2 различные группы в Gaeumannomyces graminis var. tritici (Daval et al., 2010). Результаты RAPD-анализа могут быть полезны в филогенетических исследованиях грибов для анализа генетического разнообразия и построения дендрограмм. Для этого полученные фрагменты ДНК оценивают по наличию (1) или отсутствию (0) полос различного размера и в дальнейшем представляют в виде матриц состояния бинарных признаков. Полученные данные анализируют для расчета генетических расстояний и построения кластерных дендрограмм. RAPD-фрагменты были использованы для анализа генетического разнообразия среди разных видов и рас Fusarium spp. (Lievens et al., 2007; Arici, Koc, 2010) различных патотипов Elsinoe spp. (Hyun et al., 2009). RAPD-анализ применялся для дифференциации изолятов грибов в связи с их приуроченностью к растениям-хозяевам (Midorikawa et al., 2008). 48 1.4.3. AFLP AFLP – метод или анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов ДНК (Amplified Restriction Fragment Length Polymorphism). Это технология генотипирования, основанная на амплификации множества фрагментов геномной ДНК с использованием ограниченного набора общих праймеров (Vos et al., 1995). В основе эндонуклеазами метода лежит рестрикции обработка (MseI и EcoRI, геномной ДНК узнающих 6-и двумя и 4-х нуклеотидные последовательности соответственно). В результате образуются фрагменты ДНК с липкими концами. На следующем этапе осуществляется лигирование этих фрагментов с адапторами, после чего проводят преамплификацию с помощью праймеров, комплиментарных к адаптерам и сайтам рестрикции. Для того чтобы уменьшить число получаемых фрагментов, во второй амплификации к праймерам с 3’ конца присоединяют дополнительные, от одного до четырех, некомплементарные адапторам нуклеотиды (рис. 1.22). В начале использования технологии AFLP применяли радиоактивно меченые праймеры с дальнейшим электрофорезом продуктов амплификации в акриламидном денатурирующем геле, впоследствии - флуоресцентно меченые праймеры с последующим использованием капиллярного электрофореза (Meudt, Clarke, 2007). Метод AFLP был использован для дифференциации изолятов грибов на несколько таксономических уровней, например, чтобы отличить Cladosporium fulvum от видов Pyrenopeziuz brassicae (Majer et al., 1996), Aspergillus carbonarius от A. ochraceus (Schmidt et al., 2004), Colletotrichum gossypii от C. gossypii var. cephalosporioides (Silva et al., 2005). AFLP применялся в работе (Stewart et al., 2006), чтобы отделить непатогенные штаммы Fusarium oxysporum от F. commune. 49 Рис. 1.22. Схема метода AFLP. Специфические AFLP-фрагменты используются для получения SCARмаркеров с целью разработки тест-систем для диагностики патогенов. В работе (Cipriani et al., 2009) SCAR маркеры были применены для дифференцировки изолятов Fusarium oxysporum и патогена сорняка Orobanche ramose. Метод AFLP также получил широкое распространение для филогенетического анализа комплекса видов Fusarium oxysporum (Baayen et al., 2000; Fourie et al., 2011; Groenewald et al., 2006). 1.4.4. Анализ микросателлитов Микросателлиты или простые повторяющиеся последовательности (SSRs - Simple Sequence Repeats), или STRs (Short Tandem Repeats), представляют собой короткие тандемные повторы групп (от 1 до 6) нуклеотидов, которые повторяются несколько раз во всех геномах эукариот (обычно в некодирующих областях). Так как число повторов отличается в исследуемых группах, а их распределение в геноме происходит случайным образом, это приводит к тому, что микросателлиты являются высокополиморфными, кодоминантными, многоаллельными маркерами. Метод SSR позволяет проводить анализ образцов с высокой 50 воспроизводимостью, с незначительным количеством геномной ДНК, а также использовать ДНК низкого качества. Для создания SSR-маркеров используются последовательности ДНК, окружающие микросателлитный повтор, к которым подбираются праймеры. Поэтому необходимо предварительное знание нуклеотидной последовательности этих фланкирующих участков ДНК. Последующее определение размеров повторов проводят с помощью электрофореза после их разделения в полиакриламидном или агарозном гелях. Микросателлиты были использованы для изучения генетического разнообразия внутри видов патогенных грибов таких растений, как Ascochyta rabiei (Bayraktar et al., 2007), Ceratocystis fimbriata (Rizatto et al., 2010), Sclerotinia subarctica и S. sclerotiorum (патоген клубней и стеблей картофеля) (Winton et al., 2007). В другом эксперименте микросателлитные маркеры, специфичные для Phytophthora ramorum, применялись для дифференциации 2-х изолятов A1 и A2 типов спаривания этого патогена из 2 разных географических зон распространения (Prospero et al., 2004). 1.4.5. ПЦР с видоспецифичными праймерами Для практических целей более удобны методы идентификации на основе ПЦР с видоспецифичными праймерами, т. е. амплификация тех участков ДНК, которые коррелируют с видовым статусом гриба. В литературе описаны многочисленные примеры клонирования видоспецифичных ДНК для практических целей, например, для диагностики возбудителей фитофтороза и альтернариоза. 1.4.5.1. ПЦР-системы для идентификации Phytophthora infestans Для диагностики P. infestans на картофеле и томате было разработано несколько тест-систем. По результатам исследования, проведенного Tooley et al. (1997), использование праймеров к участку ITS 2 позволило эффективно различать три вида патогенов картофеля из рода Phytophthora (P. infestans, P. erythroseptica и P. nicotianae), однако они приводили к амплификации ДНК 51 у близкородственных видов P. mirabilis и P. phaseoli (Lees, 2012). Метод показал низкий предел чувствительности – 1-10 пг. В дальнейшем с новым семейством праймеров к ITS2 был повышен предел чувствительности (Tooley et al., 2002), в то же время нивелировать эффект перекрестной амплификации с близкими видами по-прежнему не удавалось. Создание тест-систем, способных однозначно идентифицировать виды Phytophthora, велось недостаточно успешно, поэтому были предприняты попытки создания родоспецифичных праймеров. К настоящему времени получены экспериментальные данные, подтверждающие создание родоспецифичных праймеров, однако не во всех работах проведены контрольные эксперименты, однозначно подтверждающие их специфичность и отсутствие амплификации с близким родом Pythium. Одним из успешных экспериментов по созданию тест-систем у Phytophthora была работа австралийских исследователей Drenth и др. (2006). Ими была создана пара праймеров A2/I2 (ACT TTC CAC GTG AAC CGT TTC AA / GAT ATC AGG TCC AAT TGA GAT GC) на основе участка ITS-региона длиной от 752 до 832 п.н., проверенных на специфичность к роду Phytophthora путем гибридизации с 9 видами рода Pythium, при которой был получен отрицательный результат. При этом авторы утверждают, что праймеры могут быть использованы и для видовой диагностики. Аналогичную попытку создания специфичных праймеров к роду Phytophthora предприняли ученые из Италии (Schena et al., 2008). Они использовали ген Ypt1, кодирующий Ras-белок, имеющий несколько консервативных экзонов, в частности, 3 и 6, для разработки пары праймеров Yph1F и Yph2R, (5’-CGA CCA TKG GTG TGG ACT TT, 5’-ACG TTC TCM CAG GCG TAT CT) к участку длиной 419-478 п.н. На основании изменчивости в интронных последовательностях 3, 4, и 5 были созданы видоспецифичные праймеры, однако их эффективность в работе не проверялась. 52 Для создания тест-систем использовались различные участки генома. Например, ранее исследователи из США (Martin, et al., 2004) сконструировали Phy-8b и Phy-10b (5’-AAA AGA GAA GGT GTT TTT TAT GGA и 5'-GCA AAA GCA CTA AAA ATT AAA TAT AA) праймеры, специфичные к изолятам Phytophthora, выделенные из листьев, которые амплифицировали спейсерную область между митохондриальными генами cox1 и cox2 и не давали реакции с генетическим материалом растений или грибов рода Pythium. Эти же праймеры применялись для видовой идентификации Phytophthora ramorum в растительной ткани. Для идентификации оомицета P. infestans в пораженных органах исследователи использовали множество подходов. Сложность изучения этого патогена заключается в полиморфизме его генома и, вследствие этого, слабой воспроизводимости результатов (Кокаева и др., 2011). Полиморфизм ДНК может быть связан с такими факторами, как крупные делеции и вставки, трансверсии, транслокации, транспозиции мобильных генетических элементов и т.п. (Saiki, 1990, Сулимова и др., 2006, Кокаева и др., 2011). 1.4.5.2. ПЦР-системы для идентификации возбудителей альтернариоза Проблема диагностики видов Alternaria в чистой культуре и растительном материале поднималась в ряде работ, в которых авторы предлагают различные пары праймеров. Для идентификации группы близких видов, включающей A. solani и некоторые другие крупноспоровые виды, McKay с соавторами (1999) была предложена пара праймеров ALP/ITS4, амплифицирующих ITS регион длиной 535 п.н. ALP (5'-GGC ACC TCC CGG GGT GGC), ITS4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC). Для совершенствования метода молекулярной диагностики крупноспоровых видов непосредственно в растительной ткани Ориной (2011) были сконструированы праймеры AslR/AslF, специфичные к группе 53 крупноспоровых видов “A. solani” и не амплифицирующие ДНК мелкоспоровых видов. Konstantinova et al. (2002) разработали праймеры AAF2/AAR3, AAF2 (5'-TGC AAT CAG CGT CAG TAA CAA AT), AAR3 (5'-ATG GAT GCT AGA CCT TTG CTG AT) специфичные к группе видов “A. alternata”, которые идентифицируют A. alternata, A. tenuissima, A. arborescens и, вероятно, некоторые другие мелкоспоровые виды. Продукт амплификации составляет 340 п. н. Другие системы для идентификации Alternaria: Ain3F/Ain4R, специфичные к комплексу видов «A. infectoria» (Gannibal, Yli-Mattila, 2007); LinF1/LinR, специфичные к A. mali (Johnson et al, 2000); Pa2071/Pa2072 (Pryor et al., 2001) и ARF2/ARR3 (Konstantinova et al., 2002), специфичные к A. radicina; ABCsens/ABCrev, специфичные к A. brassicae (Guillemette et al., 2004); Dir1ITSAlt/Inv1ITSAlt специфичные к роду Alternaria sp. были разработаны для детекции в пищевых продуктах (Pavon et al., 2012); Asol 129(Edin 2012)/143 (обратный праймер) Rosenzweig et al. (2008) подобраны к гену цитохрома b A. solani, детектирующие мутацию F129L устойчивости к стробилуринам. 1.4.6. Гнездовая ПЦР (ПЦР с вложенной парой праймеров, Nested - PCR) Метод Nested ПЦР используется когда необходимо увеличение чувствительности и/или специфичности обнаружения. Этот метод состоит из двух последовательных раундов амплификации, где в первом с помощью двух внешних праймеров амплифицируется больший ампликон. Если образуется неспецифический продукт (шмер, множественные полосы) или его не видно на агарозном геле, то, продукт используется в качестве мишени для второго цикла амплификации с использованием двух внутренних праймеров (Porter-Jordan et al., 1990). Две реакции, как правило, 54 осуществляются в раздельных пробирках. Это приводит к дополнительным временным затратам и увеличению риска ложноположительных результатов из-за перекрестной контаминации. Тем не менее данный метод широко используется для обнаружения и/или дальнейшей характеристики значительного числа грибов (Aroca, Raposo, 2007; Hong et al., 2010; Langrell et al., 2008; Meng, Wang, 2010; Badiee et al., 2015). Одна из первых тест систем для идентификации C. coccodes в клубнях картофеля и в почве была разработана группой исследователей из Англии на основе nested ПЦР (Cullen et al., 2002). Были созданы два набора праймеров – внешние праймеры Cc1F1 (5’-ACC TAA CTG TTG CTT CGG CG) и Cc2R1 (5’-AAA TTT GGG GGT TTT ACG GC), для амплификации ITS1/ITS2 региона и вложенные праймеры Cc1NF1 (5’-TGC CGC CTG CGG ACC CCC CT) и Cc2NR1 (5’-GGC TCC GAG AGG GTC CGC CA), обеспечивающие повышенную чувствительность на втором этапе амплификации. Вышеуказанные праймеры были протестированы авторами на восьми видах Colletotrichum (C. acutatum, C. capsici, C. dematium, C. fragariae, С. gloeosporioides, C. graminicola, C. linicola и С. trifolii) представляющих шесть филогенетических групп рода, и других грибных и бактериальных патогенах, в результате чего была показана специфичность праймеров к С. сoccodes. Чувствительность этой тест-системы составила 0 - 12 склероциев на 1 г почвы (Lees, 2003). Данный метод использовали для детекции Sclerotinia sclerotiorum на лепестках рапса (Brassica napus) (Qin, Fu et al., 2011), другие исследователи для детекции Ceratocystis fagacearum в древесине и почве (Wu, Chen et al., 2011). 1.4.7. Мультиплексная ПЦР Мультиплексная ПЦР основана на использовании нескольких ПЦРпраймеров в одной реакции, что позволяет одновременно с высокой чувствительностью обнаружить различные целевые ДНК и оптимизировать 55 время и расходы. Этот метод полезен в фитопатологии, поскольку растения обычно заражены более чем одним патогеном. В результате могут одновременно амплифицироваться различные специфичные фрагменты разных грибов, и затем они могут быть идентифицированы при электрофорезе в агарозном геле на основании их молекулярных размеров. Метод мультиплексной ПЦР был использован для одновременного обнаружения и дифференциации Podosphaera xanthii и Golovinomyces cichoracearum в подсолнечнике (Chen et al., 2008); для обнаружения Phytophthora lateralis на кедрах и в пробах воды (Winton, Hansen, 2001); для определения типа спаривания патогенов Tapesia yallundae и T. acuformis (Dyer et al., 2001); для дифференциации двух патотипов Verticilliun alboatrum, заражающих хмель (Radisěk, Jakše et al., 2004) и для дифференциации одиннадцати таксонов грибов, поражающих лиственные деревья (Guglielmo et al., 2007). В то же время из-за сложности дизайна праймеров этот метод недавно был заменен другими подходами, включая мультиплексную ПЦР в реальном времени (раздел 1.4.11). 1.4.8. ПЦР - Ифа Иммуно-ферментный литературе) – анализ серологический (ИФА, метод, ELISA – в использующий англоязычной антитела для специфической детекции целевого объекта. В настоящее время эта технология является самым распространенным методом бактериальной и вирусной диагностики заболеваний картофеля (Блинцов и др, 2009). В диагностике грибных заболеваний картофеля иммунологические методы не так популярны, как ПЦР или технология с использованием микрочипов ДНК, тем не менее разработки специфических тестов для идентификации патогенных грибов на основе иммуно-ферментного анализа ведутся в Великобритании, Италии, США (Иванюк и др, 2005). В настоящее время получены антитела к ряду фитопатогенных грибов - возбудителей болезней 56 картофеля, однако масштабы использования метода в данном направлении еще не велики. Для обнаружения нескольких видов Phytophtora и Pythium (Bailey et al., 2002) применялся метод, представляющий собой синтез ПЦР и ИФА. Метод основан на использовании прямого и обратного праймеров, несущих на их 5'конце биотин и антигенную группу (например, флуоресцеин) (Landgraf et al., 1991). ПЦР-амплификация ДНК проводится на микротитрационных планшетах и биотиновый фрагмент прямого праймера определяется количественно с помощью ИФА. Метод ПЦР - ИФА так же чувствителен, как и nested ПЦР. Этот метод был использован для выявления и дифференциации Didymella bryoniae из родственных видов Phoma у тыквенных (Somai et al., 2002). 1.4.9. ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR) Важным ограничением молекулярных методов является неспособность различать живые или мертвые организмы, а также структуры грибов. Вследствие этого у выявленных патогенных грибов необходимо проверить способность к заражению. Известно, что мРНК быстро деградирует в мертвых клетках, поэтому обнаружение мРНК считается точным индикатором жизнеспособности клеток (Sheridan et al., 1998). В этом методе РНК подвергается обратной транскрипции с помощью фермента обратной транскриптазы. Полученную кДНК затем используют для амплификации с применением стандартного или любого другого ПЦР метода. ОТ-ПЦР была применена для определения жизнеспособности популяций Mycosphaerella graminicola в пшенице (Guo et al., 2005). Метод ОТ-ПЦР в комбинации с nested был применен для обнаружения Oidium neolycopersici – патогена томата (Matsuda et al., 2005). Наиболее часто этот метод в фитопатологии применяется во время развития заболевания для анализа экспрессии генов растений и грибов (Soyer et al., 2014). 57 1.4.10. In situ ПЦР Данный метод позволяет амплифицировать специфические последовательности генов внутри интактных клеток или тканей, и сочетает в себе две технологии: ПЦР и in situ гибридизация (ISH) (Long, 1993; Nuovo, 1992). Повышенная чувствительность данного метода позволяет обнаружить даже одну копию целевой ДНК на клетку (Haase et al., 1990; Nuovo et al., 1991). Bindsley et al. (2002) использовали технику in situ ПЦР, чтобы определить споры и мицелий Blumeria graminis на листьях ячменя. 1.4.11. ПЦР в реальном времени В настоящее время ПЦР в реальном времени считается «золотым стандартом» среди методов обнаружения патогенов растений. Эта методика позволяет осуществлять мониторинг реакции в процессе амплификации с использованием флуоресцентного сигнала, который возрастает пропорционально количеству образующихся ампликонов и количеству мишеней, присутствующих в образце (Wittwer et al., 1997). Метод позволяет провести точную количественную оценку целевого патогена путем интерполяции измеряемой величины со стандартной кривой с известным количеством копий ДНК мишени. Количественная характеристика очень важна в фитопатологии для того, чтобы соотнести количество гриба в биологическом образце с состоянием болезни или для мониторинга прогресса заболевания в зараженном растении (Leiminger et al., 2015). Для образования флуоресцентного сигнала в реакцию добавляют специальные флуоресцентные красители. 1.4.11.1 Неспецифические флуоресцентные красители SYBR Green I – флуоресцентный интеркалирующий краситель, обладает высоким флуоресцентный сродством сигнал к реакции двухцепочечной ДНК. пропорционален Общий количеству двухцепочечной ДНК (дцДНК), присутствующей в образце, и увеличивается 58 в соответствии с амплификацией мишени. Преимущества использования интеркалирующего красителя заключаются в том, что стандартная ПЦР при добавлении красителя в реакцию может быть легко преобразована в ПЦР в реальном времени. ПЦР в реальном времени с неспецифическим флуоресцентным красителем SYBR Green, был использован для детекции Phytophthora capsici (Silvar et al., 2005) в перце и Phytophthora cryptogea в гербере (Minerdi et al., 2008), а также для идентификации некоторых других фитопатогенных грибов, в том числе и для мультиплексного анализа (табл. 1.2). Табл. 1.2. Использование ПЦР с SYBR Green для идентификации патогенов растений Патоген Botrytis cinerea Cladosporium fulvum Colletotrichum acutatum Fusarium graminearum Краситель SYBR Green SYBR Green SYBR Green SYBR Green multiplex Автор Diguta el al., 2010 Yan et al., 2008 Samuelian et al., 2011 Растение-хозяин виноград томат виноград Brandfass, Karlovsky, 2006 злаки горох почва люцерна пшеница злаки рапс картофель Fusarium oxysporum SYBR Green Jiménez-Fernández et al., 2010 Phoma sclerotioides SYBR Green Larsen et al., 2007 Rhizoctonia solani Sclerotinia sclerotiorum Verticillium dahliae SYBR Green SYBR Green SYBR Green Okubara et al., 2009 Yin et al., 2009 Attallah et al., 2007 1.4.11.2. Специфические флуоресцентные меченые зонды Принцип TaqMan (Heid et al., 1996) основан на использовании олигонуклеотидного зонда, расположенного между двумя ПЦР-праймерами. Зонд мечен флуорофором, с 5' конца ковалентно связан с репортером и гасителем на 3'- конце. С помощью 5'-3' экзонуклеазной активности Taq ДНК полимеразы происходит разделение флуорофора и гасителя, что позволяет репортерному красителю излучать флуоресценцию. Флуоресценция прямо пропорциональна высвобождению флуорофора и количеству матричной ДНК, присутствующей в ПЦР. 59 Зонды TaqMan были разработаны с целью усиления специфичности реакции, поскольку обнаружение и точная количественная оценка требует высокой комплементарности с целевой последовательностью. Зонды могут быть помечены различными репортерными красителями (FAM, VIC, TET, TAMRA, HEX, JOE, ROX, Cy5, Texas Red, и т.д.), что позволяет проводить мультиплексное обнаружение двух или более разных патогенов в одной реакции, увеличивая пропускную способность (Aroca et al., 2008; Bilodeau et al., 2009). В работе Kox et al. (2007) были созданы праймеры FITS_15Ph/ RITS_279Ph (5’-TGC GGA AAG GAT CAT TAC CAC ACC / GCG AGC CTA GAC ATC CAC TG и зонд All-PHY (5’- FAM-TTG CTA TCT AGT TAA AAG CA -MGBNFQ). Эта тест-система была применена для амплификации ДНК из 73 изолятов, 38 видов Phytophthora spp., но при тестировании ее на 13 видах Pythium давала 5 положительных результатов. Одна из удачных тест-систем для идентификации P. infestans на листьях картофеля была предложена Lees et al. (2012). Исследователи применили пару праймеров PinfTQF (5'-AAC CCA ATA GTT GGG GGT CTT AC-3'), PinfTQR (5'-TCG TCC CCA CAG TAT AAT CAG TAT TAA -3') и флуоресцентный TaqMan-зонд PinfTQPR (5' –AAG CTA CTA GCT CAG ACC GAA GTC CAA ACG CT - 3'). Данная система была проверена и продемонстрировала высокую специфичность, однако еще не была опробована российскими исследователями на отечественных штаммах. В начале 2000 гг. были разработаны тест-системы для ПЦР в реальном времени для диагностики С. coccodes в почве и тканях клубней картофеля (Cullen et al., 2002). Система представляет собой праймеры CcTqF1/CCTqR1 (5’-TCT ATA ACC CTT TGT GAA CAT ACC TAA CTG) и (5’-CAC TCA GAA GAA ACG TCG TTA AAA TAG AG) вместе с молекулярным маячком CcTqP1 (5’- CGC AGG CGG CAC CCC CT). Эффективность диагностической системы была неоднократно подтверждена при обнаружении патогена в почве (Lees et al, 2002; Lees, Hilton, 2003). На российских штаммах 60 С. coccodes специфичность разработанных за рубежом праймеров и тестсистем до сих пор не проверялась. К настоящему моменту накоплено значительное количество экспериментальных данных, полученных с помощью этого метода для анализа фитопатогенных грибов, и их число в последние годы растет (табл. 1.3.) Таблица 1.3. TaqMan системы для выявления патогенных грибов растений, разработанные втечение последних 10 лет. Патоген Принцип Авторы Botrytis squamosa TaqMan Carisse et al., 2009 Растение хозяин Лук Colletotrichum spp. Colletotrichum acutatum, Colletotrichum gloesporioides TaqMan Garrido et al., 2009 Земляника TaqMan Inami et al., 2010 Томат TaqMan TaqMan multiplex Demontis et al., 2008 Цитрусовые Bilodeau et al., 2009 Дуб Phytophthora citricola TaqMan Schena et al., 2006 Древесные культуры Phytophthora erythroseptica TaqMan Nanayakkara et al., 2009 Картофель Phytophthora kernoviae P. quercina TaqMan Schena et al., 2006 Phytophthora ramorum TaqMan, TaqMan multiplex Bilodeau et al., 2009 Puccinia graminis Pythium vexans Thielaviopsis basicola TaqMan TaqMan TaqMan Barnes, Szabo, 2007 Tewoldemedhin et al., 2011 Huang, Kang, 2010 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici и его расы Phoma tracheiphila Phytophthora spp. Древесные культуры Древесные культуры, рододендрон и другие Злаки Яблоня Табак 1.4.12. ПЦР в формате FLASH Для идентификации грибных патогенов применяется и метод ПЦР в формате FLASH (FLuorescent Amplification ― based Specific Hybridization) (Лаптинов, Болдырева, 2005). В этом методе используются флуоресцентно меченые праймеры или зонды, с помощью которых происходит обнаружение и локализация грибных 61 патогенов в составе проб. Регистрация флуоресценции происходит непосредственно на детекторе флуоресценции после окончания реакции, или с помощью конфокальной микроскопии (Bridge at al., 1998). Результаты, полученные с детектирующего амплификатора или специализированного флуориметра, обрабатываются с помощью автоматизированной системы фиксирования данных, которая позволяет эффективно документировать, хранить и распечатывать результаты анализа (Лаптинов, Болдырева, 2004). Российскими исследователями были созданы системы диагностики фитопатогенов разных систематических групп: вирусов, бактерий, нематод и грибов, в том числе патогенов картофеля и томата (Рязанцев и др., 2009). Абрамовой были разработаны системы для идентификации 9 видов грибных патогенов зерновых культур (Абрамова, 2013). Также были созданы системы для диагностики токсиногенных грибов рода Fusarium (Рязанцев, 2008; Стахеев, 2009). Таким образом, опираясь на литературные данные, можно сделать вывод, что ПЦР в реальном времени и ПЦР в формате FLASH обладают целым рядом преимуществ по сравнению с методами анализа ПЦР с использованием электрофореза и являются наиболее эффективными для рутинной диагностики патогенов картофеля. 1.4.13. Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) Эффективной альтернативой ПЦР является петлевая изотермическая амплификация (Loop mediated isothermal amplification, LAMP), которая дает возможность проведения изотермической амплификации без использования термоциклера (Notomi et al., 2000). Для осуществления реакции необходимо наличие набора из четырёх или шести олигонуклеотидных праймеров с 6 (8) сайтами связывания в различных регионах гена-мишени, и термофильные ДНК-полимеразы из Geobacillus stearothermophilus для амплификации ДНК (Bst полимераза). Метод позволяет менее чем за 1 час специфически амплифицировать ДНК-мишени, используя только термоблок. Продукты 62 амплификации могут быть обнаружены при визуальном осмотре непосредственно в пробирках с использованием SYBR Green I или путем измерения степени прозрачности, а также с помощью электрофореза на агарозном геле. Метод LAMP подходит для полевых испытаний и является потенциально ценным для лабораторий, не имеющих ПЦР оборудования. Этот метод применялся для обнаружения Fusarium graminearum в зараженных семенах пшеницы (Abd - Elsalam et al., 2011) и для обнаружения Phytophthora ramorum и P. kernoviae в образцах полевых растений (Tomlinson et al., 2007, 2010). 1.4.14. Гибридизация ДНК Методы блот-гибридизации или Саузерн-блоттинга с использованием выбранных зондов из библиотек ДНК были широко распространены и пользовались большой популярностью для идентификации патогенов растений до внедрения методов на основе ПЦР (Takamatsu et al., 1998; Levesque et al., 1998; Xu et al., 1999). В последнее время для выявления и дифференциации фитопатогенных грибов были разработаны новые методы, основанные на гибридизации. 1.4.15. Микрочипы ДНК микрочипа представляют собой набор видоспецифичных олигонуклеотидов или кДНК (проб), иммобилизованных на твердой подложке, которая подвергается гибридизации с меченой ДНК-мишенью. ДНК-мишень представляет собой меченый фрагмент, амплифицированный с помощью ПЦР с универсальными праймерами, охватывающими видоспецифичные области геномной последовательности. При гибридизации пробы и мишени детектируется флуоресцентный сигнал, который позволяет определить в мишени относительное содержание нуклеиновых кислот. Метод, как правило, используется для изучения экспрессии генов, но также применяется для идентификации и дифференциации патогенов растений (Anderson et al., 2006; Lievens, Thomma, 2005). Вначале 2000 гг это был один 63 из удобных методов для количественного выявления нескольких патогенов, присутствующих в 1 образце (растение, почва, вода) или в одном анализе (Lievens et al., 2005). Специфика технологии ДНК микрочипов позволяет точно определять SNP (Single Nucleotide Polymorphism – одиночный нуклеотидный полиморфизм). Данную технологию применяли для обнаружения патогенов растений с помощью специфических олигонуклеотидов, созданных для ITS региона (Anderson et al., 2006; Izzo, Mazzola, 2009). Другие микрочипы с ITS и рРНК генами позволили обнаружить и количественно оценить несколько патогенов томатов (Verticillium, Fusarium, Pythium и Rhizoctonia) (Lievens et al., 2005), провести мониторинг видового разнообразия Phytophthora в почвенных и водных образцах (Chimento et al., 2005), идентификацию и дифференциацию токсин-производящих и непродуцирующих токсины видов Fusarium в зерновых культурах (Nicolaisen et al., 2005). Кроме того, были разработаны ДНК микрочипы для одновременного обнаружения более чем 40 различных грибов патогенов растений и 10 почвенных бактерий, которые часто встречаются в тепличных культурах. Данный микрочип-ДНК Multiscan® (http://www.dnamultiscan.com/) используется во всем мире компаниями, предлагающими услуги по диагностике заболеваний. 1.4.16. ДНК – баркодинг ДНК - баркодинг (штрих - кодирование ДНК) является таксономически значимым методом, в котором для идентификации и определения принадлежности к конкретному виду используются сравнительно короткие нуклеотидные последовательности ДНК организма. Данный подход был применен для идентификации видов Phytophthora. Для этого созданы две базы данных: Phytophthora Database (http://www.phytophthoradb.org/) на основе последовательностей девяти локусов, в том числе ITS региона, LSU, ядерного рибосомного гена, 64 кодирующего 60S белок L10, β - тубулина, енолазы, белка теплового шока 90, белка TigA, и TEF 1; митохондриального гена cox II и области между cox I и cox II генами (Park et al., 2008). Другая база Phytophthora-ID (http://phytophthora-id.org) создана на основе последовательностей ITS и cox I и cox II регионов (Grunwald et al., 2011). Большое количество работ было проведено и для видов Fusarium. Для него существуют базы онлайн, например Fusarium Comparative Genomics Platform (FCGP), который содержит геномы четырех видов, поддерживает просмотр и анализ генома, характеристики нескольких семейств генов и функциональных групп (http://www.fusariumdb.org, Park, et al., 2011). Существует проект по штрих кодированию ДНК патогенов растений, карантинных для Европы (van Doorn et al., 2009). Несмотря на многочисленность проведенных к настоящему моменту экспериментов, применяемых методов и технологий для определения патогенных грибов, полученных экспериментальных данных пока недостаточно для однозначной идентификации видов родов Phytophthora, Alternaria, Colletotrichum в России. Работа в этом направлении имеет значительный потенциал для дальнейших молекулярно-генетических исследований по идентификации и систематизации видов данных родов. 65 Глава II. Материалы и методы исследований 2.1. Выделение возбудителей листовых пятнистостей из растительного материала Пораженные листья растений поверхностно стерилизовали 2%-м раствором перманганата калия в течение 1 минуты и промывали стерильной водой. Затем их помещали во влажные камеры (стерильные чашки Петри) на стерильные стекла инкубировали препаровальной поверх увлажненной фильтровальной бумаги и в течение 1-7 суток при 22-25оС, после чего стерильной иглой под бинокулярным микроскопом снимали с поверхности пораженных органов споры, мицелий или склероции гриба и помещали их на агаризованную среду на основе пивного сусла с добавлением антибиотика. После нескольких суток инкубации колонии разделяли на чистые культуры, без примесей сопутствующих микроорганизмов, и загрязненные. С края чистых культур брали агаровый блок с мицелием и переносили его на скошенную агаризованную среду в пробирке для хранения. Из загрязненных культур под бинокулярным микроскопом снова выделяли конидии, гифы или склероции нужного вида гриба и переносили на агаризованную среду в чашку Петри. Далее процедура повторялась. 2.2. Микроскопирование и определение видовой принадлежности изолятов Определение видовой принадлежности выделенных изолятов проводили методом микроскопирования и морфометрии на микроскопе «Микмед 1», вар. 2-20. Морфологические признаки изучаемых видов сравнивали со стандартными характеристиками из определительной литературы (Билай, 1988; Simmons, 2007; Bensch et al., 2010; Seifert, 2011), или с материалом, представленным на сайте http://www.q-bank.eu/Fungi/. Для морфологического определения видовой принадлежности Alternaria, изоляты выращивали и идентифицировали по методике Симмонса 66 (Simmons, 1992, 2007). При этом учитывали такие признаки, как тип ветвления конидий, характеристику поверхности спор, их размер и др. Изоляты выращивали на картофельно-морковном агаре (КМА) в чашках Петри при 25°С и естественном фотопериодизме. Микроскопирование проводили на 7-10 день роста. Стимуляцию конидиальных спороношений у изолятов A. solani, вызывали УФ - излучением с длиной волны 260 нм в течение 180 сек. (лампа Mineralight, модель CS-215, мощность - 30 Вт), расстояние до культуры - 7 см. Для определения видовой принадлежности использовали определитель Симмонса, 2007 (Simmons, 2007). 2.3. Коллекция штаммов, использованных в работе В работе было использовано 369 изолятов грибов, приведенных в таблице 2.1., выделенные автором и сотрудниками кафедры микологии и альгологии из пораженных образцов, собранных в разных регионах (табл. 2.1.). Таблица 2.1. Коллекция фитопатогенных грибов и грибоподобных организмов, использованных в работе. Место сбора, растениехозяин Год сбора Сколько изолятов выделено ― 2006 16 ― 2006 3 2006 2007 2007 2012 2014 2014 5 7 7 2 2 2 44 2006 3 2007 30 Координаты Alternaria solani Приморский край, картофель Хабаровский край, картофель Хабаровский край, томат Астраханская обл., томат Марий-Эл, томат Рязанская обл., картофель Воронежская обл., томат Москва, Solanum dulcamara Всего Alternaria solani ― 47°17'22"N 47°20'53"E 56°37'03"N 47°48'43"E 55º02’20’’N, 41º37’14’’E 51°37'11"N, 40°11'29"E 55º42’17’’N, 37º31’30’’E Alternaria alternata Приморский край, картофель Астраханская обл., томат ― 47°17'22"N, 47°20'53"E 67 Ленинградская обл., 59°43'04"N 30°20'50"E картофель Марий-Эл, томат 56°37'03"N 47°48'43"E Московская обл., томат 55°40'32"N 36°41'40"E Татарстан, картофель 55°42'37"N, 49°10'31"E Костромская обл., 57°28'15"N 43°17'35"E картофель Ленинградская обл., 59°43'04"N 30°20'50"E картофель Костромская обл., 57°28'15"N 43°17'35"E картофель Монголия, картофель 47°51'25"N, 106°40'23"E Московская обл., 55°40'44", 37°59'35" картофель Рязанская обл., картофель 55º02’20’’N,41º37’14’’E Московская обл., картофель 55°40'44", 37°59'35" Казахстан, картофель 51°11'49"N 71°41'23"E Московская обл., картофель 55°38'08"N, 36°56'14"E Костромская обл., 57°41'28"N 41°02'22"E картофель Московская обл., картофель 55°38'08"N, 36°56'14"E Краснодарский край, томат 45°13'03"N, 36°41'25"E Воронежская обл., томат 51°37'11"N, 40°11'29"E Москва, Solanum dulcamara 55º42’17’’N, 37º31’30’’E Москва, Solanum dulcamara 55º42’17’’N, 37º31’30’’E Костромская обл., 57°41'28"N 41°02'22"E картофель Всего Alternaria alternata Thanatephorus cucumeris (Rhizoctonia solani) Москва, Solanum dulcamara 55º42’17’’N, 37º31’30’’E Phytophthora infestans Ленинградская обл., 59°43'04"N 30°20'50.4"E картофель Московская обл., 55°38'08" 36°56'14" картофель Костромская обл., 57°28'15"N 43°17'35"E картофель Астраханская обл., томат 47°17'22"N 47°20'53"E Костромская обл., 57°28'15"N 43°17'35"E картофель Смоленская обл., ― картофель Московская обл., 55º37’56’’N, 36º56’52’’E картофель Московская обл., 55°40'44"N, 37°59'35"E картофель Рязанская обл., картофель 55º02’20’’N, 41º37’14’’E Московская обл., 55°40'44"N, 37°59'35"E картофель 2007 10 2007 2007 2008 24 4 14 2008 13 2008 14 2010 22 2011 14 2011 7 2012 2012 2012 2013 12 18 5 23 2013 19 2014 2014 2014 2014 2015 15 4 11 2 7 2015 4 275 2013 2 2008 3 2008 4 2008 14 2008 3 2009 9 2009 4 2011 9 2012 11 2012 54 2013 13 68 Москва, Solanum dulcamara 55º42’17’’N, 37º31’30’’E Всего Phytophthora infestans Botritys cinerea Pers. Москва, Solanum dulcamara 55º42’17’’N, 37º31’30’’E Fusarium oxysporum Schltdl. Москва, Solanum dulcamara 55º42’17’’N, 37º31’30’’E Phoma sp. Saccardo Москва, Solanum dulcamara 55º42’17’’N, 37º31’30’’E Coniothyrium sp. Москва, Solanum dulcamara 55º42’17’’N, 37º31’30’’E 2013 2 126 2015 4 2015 4 2015 6 2015 2 2.4. Фиксированный материал Для предотвращения развития сапротрофной микобиоты пораженный материал фиксировали в 70% этаноле непосредственно на поле. Небольшая часть образцов была фиксирована в СТАВ-буфере; образцы с близлежащих полей (Москва, Московская обл.) на поле закладывали в жидкий азот, а после доставки в лабораторию хранили при –20С. Всего зафиксировано и использовано в работе 520 образцов листьев картофеля и томата с симптомами пятнистостей, собранных в 9 регионах России (табл. 2.2.). Фиксированные и замороженные образцы использовали для выделения ДНК и анализа видового состава по структуре участков ДНК. Таблица 2.2. Происхождение образцов листьев картофеля и томата Место сбора (регион, область) Координаты Растениехозяин Количество зафиксированных образцов (листьев) Сбор 2014 г. Ростовская обл., Аксайский рн, с. Большие Салы Краснодарский кр., Армавирский р-н Ставропольский кр., опытные поля Кисловодской Высокогорной Научной Станции, плато Шатжадмас Ставропольский кр., г. Кисловодск Краснодарский кр., Славянский р-н Краснодарский кр., Темрюкский р-н, п. Стрелка Воронежская обл., Панинский 47°21'55"N 39°42'39"E 45°12'27"N 40°50'50"E 43°44'13"N 42°40'06"E 43°53'13"N 42°42'50"E 45°11'41"N 37°42'02"E 45°11'56"N 37°17'43"E 51°34'08"N S. lycopersicum 13 S. lycopersicum 27 S. tuberosum 32 S. lycopersicum 17 S. lycopersicum 19 S. lycopersicum 15 S. tuberosum 28 69 р-н, д. Сергеевка 40°11'43"E Воронежская обл., Панинский р-н, пос. Михайловский Краснодарский кр., Темрюкский р-н, п. Веселовка Краснодарский кр., п-ов Тамань, ст. Атамань Краснодарский кр., Анапский р-н, с. Джигинка Респ. Северная Осетия-Алания, Пригородный р-н, с. Михайловское Москва, Ботанический сад МГУ 51°37'11"N 40°11'29"E 45°07'50"N 36°54'10"E 45°13'10"N 36°41'45"E 45°07'26"N 37°22'01"E 43°06'46"N 44°38'04"E МО, Одинцовский р-н, д. Волково, Костромская обл., с. Нежитино Респ. Татарстан, г. Казань, опытные поля ГНУ ТатНИИСХ МО, Одинцовский р-н, Раменки МО, опытные поля ВНИИКХ Краснодарский кр., Туапсинский р-н Краснодарский кр., Анапский р-н Краснодарский кр., ст. Благовещенская МО, ВНИИКХ МО, Михнево, опытные поля ФГБНУ "Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства'' Респ. Татарстан, г. Казань, ТатНИИСХ Костромская область, Костромской р-н, п/о Минское Рязанская область, с. Ардабьево S. lycopersicum 17 S. lycopersicum 8 S. lycopersicum 18 S. lycopersicum 16 S. tuberosum 8 55º 42’ 17’’N, Solanum 37º 31’ 30’’E dulcamara Сбор 2013 г. 55°40'32.7"N S. lycopersicum 36°41'40.2"E 57°28'15.1"N S. tuberosum 43°17'35.5"E 55°42'37.2" S. tuberosum 49°10'31.7" 55°38'08.2" 36°56'14.7" S. tuberosum 55°40'44.2" S. tuberosum 37°59'35.0" Сбор 2012 г. 44°10'17.4"N S. lycopersicum 39°04'07.5"E 45°04'38.2"N S. lycopersicum 37°12'44.5"E 45.057919, S. tuberosum 37.114615 55°40'44.2" S. tuberosum 37°59'35.0 55°34'43.2"N 37°40'30.6"E 55°42'37.2" 49°10'31.7" 57°41'28.7"N 41°02'22.4"E 55º 02’ 20’’ 41º 37’ 14’’ 8 10 15 87 25 28 44 8 39 S. lycopersicum 8 S. lycopersicum 8 S. tuberosum 14 S. tuberosum 8 70 2.5. Искусственное заражение листьев 2.5.1. Культивирование сортов картофеля и томата В работе использовали сорта картофеля разных групп спелости Российской и Белорусской селекции. Ранние – Зорачка и Лилея белорусская; среднеранние – Бриз, Манифест, Романо, Невский; среднеспелые – Волат, Лад, Скарб и Янка; среднепоздние – Вектар белорусский, Журавинка и Рагнеда (всего 13 сортов), а также коммерческие сорта крупноплодного томата – Дубрава, Томск, Ля-Ля-Фам, Верлиока, Бычье сердце. Все растения выращивали на обогащенном торфяном субстрате (производство ЗАО «МНПП «ФАРТ») при 20-24С и естественном фотопериодизме в изолированной от внешней среды теплице; для посадки использовали оздоровленные пробирочные необходимости, во время растения. вегетации Полив проводили растения по мере удобрениями не подкармливали. Для заражения брали листья 4-6 ярусов, считая от верхушки (средний ярус). Заражение проводили во влажных камерах, представляющих собой чашки Петри, на дно которых помещали увлажненную стерильной дистиллированной водой фильтровальную бумагу. На увлажненную бумагу клали предметные стекла, а на них - предназначенный для заражения лист. 2.5.2. Происхождение изолятов В работе использовали изоляты, выделенные в чистые культуры из пораженных образцов картофеля и томата (таблица 2.3). Выделение изолятов проводили со свежесобранных листьев и клубней картофеля, а также листьев и плодов томата. Клубни картофеля брали в течение 10-30 дней после уборки, выделение проводили только с конидиеносцев, появившихся на живой ткани клубня. Пораженные образцы закладывали во влажные камеры; выделение проводили с границы живой и здоровой ткани. Штамм PPL 31 был передан сотрудниками лаборатории микологии и фитопатологии ВНИИ защиты растений. 71 Таблица 2.3. Характеристики использованных в работе изолятов. Название штамма Видовая принадлежность RPL 16 A. alternata RPL 21 A. alternata KPT 1 A. alternata KPT 4 A. alternata METL 5 A. alternata METL 12 A. alternata MTF 7 A. alternata PPL 31 A. solani VTL 16 A. solani Регион выделения Рязанская обл. Рязанская обл. Костромская обл. Брянская обл. Респ. МарийЭл Респ. МарийЭл Московская обл. Приморский край Воронежская обл. Растение-хозяин, сорт, орган Картофель, сорт Рагнеда, лист Картофель, сорт Рагнеда, лист Картофель, сорт Удача, клубень Картофель, сорт Брянская роза, клубень Крупноплодный томат, лист Крупноплодный томат, лист Крупноплодный томат, плод Год выделения Картофель, лист 2006 Крупноплодный томат, лист 2014 2012 2012 2013 2013 2007 2007 2013 2.5.3. Получение инокулюма и заражение растений Для получения инокулюма изоляты выращивали на картофельноморковной агаризованной питательной среде в течение времени, необходимого для формирования конидий (7-10 дней). Конидии A. alternata смывали с колоний в стеклянных чашках Петри, добавляя 10 мл стерильной воды. Для получения конидий A. solani применяли другой метод: после инкубации в течение 7-10 дней удаляли воздушный мицелий, после чего чашки облучали ультрафиолетом и помещали в холодильник (+5С) на ночь. Для заражения использовали суспензию конидий в концентрации 100 шт/мкл. Через 3 дня инкубации споры смывали с поверхности среды 10 мл стерильной дистиллированной воды. На поверхность листа дозатором наносили каплю (10 мкл) суспензии конидий и столько же стерильной воды в контроле. Учет заражения проводили на 7-е сутки инкубирования при комнатной температуре. Все эксперименты проводили в 3-х повторностях. 72 2.6. Подготовка материала для анализа ферментативной активности Грибы выращивали на жидкой картофельной среде (Valueva et al., 2013). Через 5, 10, 18 суток роста мицелий отбирали на предварительно взвешенный бумажный фильтр Whatman No. 41. После отбора на фильтр, мицелий отмывали от остатков среды стерильной дистиллированной водой, высушивали в течение 8 часов (дальнейшей потери веса при более длительном периоде сушки не наблюдали) при температуре 90°C, охлаждали в десикаторе и взвешивали. Культуральную жидкость, оставшуюся после извлечения мицелия, использовали при оценке ферментативной активности. Работа выполнялась совместно с Н.Н. Кудрявцевой в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН. 2.6.1. Оценка ферментативной активности Ферментативную активность сериновых протеиназ определяли по методу Эрлангера (Erlanger et al., 1961) с использованием синтетических субстратов: BAPNA (Nα-benzoyl-DL-arginine-nitroanilide) при оценке трипсиноподобной активности и Z-AALpNA (N-carbobenzyloxy-L-Ala-L-AlaL-Leu-pNa) при оценке субтилизиноподобной активности. Начальная концентрация субстрата составляла 0.5 ммоль. Одна единица активности (U) – количество фермента, которое гидролизует 1 нмоль субстрата за 1 мин. Все эксперименты, связанные с оценкой ферментативной активности, выполняли в 3-х повторностях. 2.7. Выделение ДНК 2.7.1. Выделение ДНК из мицелия грибов Наращивание мицелия для выделения ДНК проводили в чашках Петри на жидкой гороховой среде. При достижении необходимой биомассы мицелий снимали с чашек, отмывали стерильной дистиллированной водой, подсушивали, при необходимости хранили в микропробирках при –20С несколько дней до начала выделения. 73 Выделение ДНК из штаммов проводили по ниже приведенной стандартной методике (Колесников и др., 2003): 1. Небольшой фрагмент мицелия растирали с жидким азотом в стерильной керамической ступке; 2. В пробирку с 0,25 мл растёртого мицелия добавляли 700 мкл лизирующего СТАВ - буфера и инкубировали при 65°C в течение часа; 3. К полученной смеси добавляли 500 мкл хлороформа и центрифугировали 10 мин. при 13 000 об./мин.; 4. Отбирали 500 мкл надосадочной жидкости, добавляли к ней ещё 500 мкл хлороформа и повторяли центрифугирование; 5. К полученному супернатанту добавляли 400 мкл изопропанола и 60 мкл 5М ацетата калия, центрифугировали 10 мин при 13 000 об/мин.; 6. Выпавший осадок ДНК дважды промывали охлаждённым 70 %-ным этанолом и ресуспендировали в 100 мкл деионизированной воды. ДНК хранили при температуре -20ºС. Состав лизирующего СТАВ буфера: 0,2 М Tris pH 8; 2 М NaСl; 0,05 М ЕDTA; 2 % CТАВ. 2.7.2. Выделение ДНК из растительного материала Выделение ДНК проводили из фиксированных в 70 % спиртовом растворе пораженных листьев картофеля и томата. Листья предварительно отмывали в стерильной дистиллированной воде, затем подсушивали на фильтровальной бумаге. Фрагмент листовой пластинки с большим очагом поражения или целую листовую пластинку с множественными очагами поражения растирали в стерильной ступке с жидким азотом. Дальнейшее выделение ДНК проводилось с использованием стандартного CTAB метода, описанного в разделе 2.7.1. 74 2.8. Измерение концентрации ДНК Для постановки ПЦР - реакции, а также при клонировании, требовалось определение концентрации ДНК, выделенной из листьев, так как полученные растворы сильно отличались по концентрации и по чистоте ДНК. Определение концентрации ДНК в растворе проводилось на спектрофотометре «NanoDrop 2000» (фирмы “ Thermo scientific”, США). Спектр одного из исследованных образцов ДНК, показатели концентрации и степень чистоты ДНК представлены на рисунке (рис. 2.1.). Рис. 2.1. Определение концентрации ДНК, выделенной из фиксированного листа картофеля. На рисунке стрелками обозначены концентрация ДНК (выделено зеленым цветом) и показатели чистоты ДНК. По отношению 260/280 определяют примесь белкового загрязнения (чистая ДНК имеет соотношение A260/280 около 1,8-1,9). По отношению 260/230 нм определяют примесь загрязнения органическими соединениями (для чистого образца ДНК A260/230 около 1,8). Измерение концентрации и чистоты выделенной ДНК проводили при длине волны 260 нм. Оценку чистоты препаратов ДНК проводили путем измерения соотношений оптической плотности раствора ДНК при 280, 260 и 230 нм. Для работы использовали только образцы с показателями 1,8-2,4. 75 После определения концентрации, рабочий раствор ДНК доводили до значения 50 нг/мкл. 2.9. Условия проведения классической ПЦР Для проведения ПЦР использовали амплификатор «Biometra T1». ПЦР проводили в микропробирках на 250 мкл; для амплификации использовали готовые наборы «PCR Core» производства компании «Изоген». Температуру отжига для каждого праймера определяли с помощью программы Oligo или заимствовали из литературных источников, а также определяли опытным путем. Производством праймеров занималась компания «Евроген». Объем реакционной смеси во всех случаях составлял 25 мкл. Минеральное масло для предотвращения высыхания проб не применяли, так как амплификатор оборудован нагревающейся крышкой. Температурно-временные параметры амплификации для праймеров включали предварительную денатурацию при 96С (1 мин.), 30 циклов, состоящих из денатурации при 94С (45 с.), отжига праймеров при соответствующей для них температуре (табл. 2.4) – 30 сек., элонгации 72С (90 с.); финальный досинтез 72С (6 мин.). Таблица 2.4. Использованные в работе праймеры. Название праймера Последовательность 5’ –3’ ITS 5 ITS 4 ITS GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS1-F CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA M13f Alternaria GACACCCCCCGCTGGGGCACTGC GACCTTTGCTGATAGAGAGTG GGTTGGTCCTGAGGGCGGGCGA GACACCCCCCGCTGGGGCACTGC GGTTGGTCCTGAGGGCGGGCGA Для клонирования CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC M13r AGCGGATAACAATTTCACACAGGA ITS 5 MR SR Inf.pr Inf. obr. Температура Ссылка на отжига публикацию 60 50 55 60 52 60 60 60 46 White et al., 1990 Gardes, Bruns, 1993 Кокаева, Еланский, 2012 Messing et al., 1981; Hong, 1981 76 Результаты амплификации регистрировали после электрофоретического разделения в 1,5% агарозном геле с добавлением бромистого этидия в гель-документирующей системе Quantum-ST-4-1500 (Япония). Размер продукта ПЦР измеряли, используя маркеры молекулярного веса GeneRuler™ 100+ п.н. и Fast Ruler™ (Fermentas). Для проверки контаминации реакционной смеси и эффективности ПЦР в каждый эксперимент включали отрицательный (вода, свободная от ДНК и РНК) и положительный контроли (известная ДНК, дающая ампликон определенного размера). 2.10. Подготовка проб к анализу нуклеотидной последовательности Для определения последовательностей нуклеотидов амплифицированные фрагменты вырезали из агарозного геля после электрофоретического разделения и очищали с помощью набора CleanUp Standart производства компании «Евроген» в соответствии с инструкциями производителя: 1. К вырезанным фрагментам геля, помещенным в микроцентрифужную пробирку, добавляли равный объем связывающего буфера. 2. Инкубировали 10 минут на водяной бане при 60°C с периодическим перемешиванием содержимого до расплавления геля. 3. Полученную смесь переносили в спин-колонку и инкубировали 2 минуты при комнатной температуре; центрифугировали 1 минуту при 13000 об/мин. 4. Вносили в колонку 500 мкл отмывочного раствора; центрифугировали 15 секунд при 13000 об/мин. 5. Повторно добавляли 500 мкл отмывочного раствора и центрифугировали 1 минуту. 6. Переносили колонку в чистую пробирку и вносили 30-50 мкл буфера для элюции, после чего центрифугировали 30 секунд при 13000 об/мин. После выделения фрагментов ДНК из геля проводили измерение концентрации полученной ДНК по методике, описанной в разделе 2.8. Для 77 секвенирования готовили образцы с концентрацией 15-50 нг/мкл. Секвенирование ДНК проводилось в компании «Евроген» по методу Сэнгера. При секвенировании использовали те же праймеры, с помощью которых проводилась амплификация исследуемого участка. Определение всех последовательностей проводили с использованием прямых и обратных праймеров. Клонированные образцы ДНК для секвенирования готовили путем выделения плазмидной ДНК и ее очистки. Процедура выделения плазмидной ДНК описана в разделе 2.13.5. 2.11. Анализ нуклеотидных последовательностей и построение кластерных дендрограмм. Результаты секвенирования содержали хроматограмму для каждого образца и текстовой файл с ее расшифровкой (последовательностью нуклеотидов) (рис. 2.2.). Рис. 2.2. Образец хроматограммы секвенированной последовательности ДНК. Анализ хроматограмм проводили с помощью программ «ChromasLite» и «BioEdit». Нуклеотидные последовательности участков генов изучаемых видов анализировали с помощью программного обеспечения «BioEdit» и базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). 78 Полученные при секвенировании нуклеотидные последовательности ДНК анализировали с помощью программы «Mega». Филогенетические деревья строили с использованием «метода максимального правдоподобия» (Maximum likelihood). 2.12. Постановка ПЦР «в реальном времени». Амплификацию и детекцию ДНК в реальном времени проводили на амплификаторе CFX96 Touch (Bio-Rad, США) со специфичными к видам Alternaria праймерами и зондами (дизайн праймеров и подбор условий амплификации описан в главе Результаты). При оптимизации ПЦР «в реальном времени» для каждого из подобранных зондов продолжительность подбирали циклов температурный амплификации, режим, число и концентрацию зондов и праймеров. 2.13. Клонирование ПЦР – продуктов исследуемых патогенов Клонирование продуктов ПЦР осуществляли с помощью набора для быстрого клонирования клонировать ПЦР Quick–TA фрагменты kit без (Евроген). Набор предварительной позволяет обработки эндонуклеазами рестрикции или экзонуклеазами. Клонирование проводилось с использованием pAL2–T вектора, представляющего линеаризованную плазмиду с выступающими фосфорилированными 3'-концевыми тимидинами. Клонирование продуктов ПЦР состояло из нескольких этапов: подготовка продуктов ПЦР (очистка, описана в разделе 2.10), лигирование, трансформация E.coli. 2.13.1. Лигирование 1. Для лигирования использовали 2-3 пробирки по 20 мкл свежеприготовленных ПЦР-продуктов, представленных четкой единичной полосой на электрофоретическом геле. Перед лигированием ПЦР–продукты одного образца ДНК соединяли из 2-3 пробирок, очищали от праймеров и 79 примесей с помощью набора CleanUp Standart (Евроген) по технологии, описанной в разделе спектрофотометре. Для 2.10. Измеряли дальнейшей концентрацию работы отбирали ДНК на продукт с концентрацией не ниже 7 нг/мкл. 2. Для лигирования использовали реактивы производства «Евроген» – pAL2-T вектор, Quick – TA T4 ДНК лигаза, 10х буфер для лигирования. Состав смеси для лигирования: 10х буфер для лигирования 1 мкл pAL-TA-вектор 1 мкл Quick – TA T4 ДНК лигаза 1 мкл ПЦР продукт 50 – 100 нг MQ до 10 мкл Расчет количества ПЦР–продукта зависел от его концентрации (по формуле). В реакцию было использовано 3-10 кратное количество ПЦРпродукта, при этом его концентрация в лигазной смеси должна была быть не менее 50 нг на 10 мкл: X (нг)вставки = 3-10 избыток вставки x длина вставки (п.о.) x количество вектора (нг) / 3000 (п.о.) длина pAL-TA-вектора 3. Смесь инкубировали 16 ч при 14С. После окончания реакции смесь помещали в морозильник на –20С. 2.13.2. Трансформация E. coli Для трансформации использовали компетентные клетки Escherichia coli линии dh5α. 2.13.2.1.Получение компетентных клеток 1. Отдельную колонию E. coli наращивали в жидкой среде LB, инкубировали при 200 об/мин на круговом шейкере в течение 18 часов, 80 полученную культуру разбавляли в 100 раз и растили при тех же условиях до оптической плотности ОD600=0,4-0,5; 2. Клетки осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 12 мин (при 0...+4С); 3. Ресуспендировали в 50 мл (0,5 исходного V культуры) ледяного 100 мМ CaCl2 при +4С, клетки осаждали при 1500 об/мин в течение 12 мин (при 0...+4С); 4. Ресуспендировали в 5 мл (0,05 V выращенной культуры) 100 мМ CaCl2 при +4С; 5. Выдерживали при +4С 1 ч; затем смешивали с 2,5 мл (½V) 45% глицерина (–20С); 6. Смесь хранили малыми аликвотами (по 300 мкл) в 1,5-мл пробирках при температуре –75С. 2.13.2.2. Трансформация 1. Клетки размораживали на льду и аккуратно перемешивали. В пробирку с клетками (300 мкл) вносили 10 мкл лигазной смеси и смешивали. Инкубировали на льду (в холодильнике) 20 мин. 2. В твердотельном термостате на 42С выдерживали 45cек. После нагрева пробирку переносили на лед на 3 мин. 3. 600 мкл аликвоты LB (заранее нагретой до 37С) вносили в смесь. Инкубировали 1 час при 37С на качалке при 225 об/мин. 4. Суспензию клеток 100 мкл высевали на агаризованную среду LB в чашки Петри с добавлением ампициллина (100 мг/мл), X-Gal 40 мкл (2% р-р в диметилформамиде) на чашку, IPTG 40 мкл (100 мМ р-р) на чашку для сине - белой селекции трансформантов. Суспензия распределялась по поверхности агара стерильным шпателем. 5. Чашки инкубировали сутки при 37С. 81 6. Проводили скрининг белых колоний. Стерильными зубочистками отбирали белые колонии, переносили в 0,2 мл микропробирки для ПЦР, содержащие 10 мкл стерильной воды, а также пересевали на агаризованную среду LB в чашки Петри. 7. Отобранные в микропробирки «клоны» хранили в морозильнике. 2.13.3. Скрининг клонов Первичный скрининг клонов осуществляли с помощью сине-белой селекции (синие – нет вставки, белые – есть вставка), отбирали белые колонии. Для скрининга, определения клонов с нужной вставкой, проводили амплификацию с М13-праймерами (табл. 2.4.). Вместо ДНК в реакцию добавляли 1 мкл из смеси «клонов» в микропробирках. Затем продукты амплификации анализировали на электрофорезе. Клоны, несущие вставку, соответствовали размеру клонированного продукта плюс 220 п.н. из фланкирующих участков вектора. 2.13.4. Рестрикционный анализ клонов Для рестрикции клонов использовали эндонуклеазу рестрикции MspI и буфер В производства компании Сибэнзим. 5 мкл 1,5х рестриктной смеси (Буфер В – 1,5 мкл, MspI- 0,5 мкл, mQ – 3 мкл) вносили в пробирку с продуктом амплифицикации со вставкой. Инкубировали при 37С в течение ночи. Реакцию останавливали замораживанием. Рестрикционную смесь анализировали с помощью электрофореза в 3% агарозном геле. 2.13.5. Выделение плазмидной ДНК После рестрикционного анализа из отобранных образцов проводили выделение плазмидной ДНК (согласно протоколу Lee, Rasheed, 1990): 82 1. Колонию переносили в микробиологическую пробирку с жидкой средой LB и инкубировали в течение ночи при 37С на качалке, 200-300 об/мин; 2. Ночную культуру помещали в микропробирку объемом 2 мл, клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин - 30 сек, супернатант удаляли; 3. Дополнительно центрифугировали 10 сек, остатки среды отбирали с помощью аспиратора медицинского; 4. Осадок ресуспензировали в 200 мкл раствора "1" (табл. 2.5.а), встряхивали на вортексе в течение 5 сек; проводили инкубацию при комнатной температуре 5 мин; 5. Добавляли 400 мкл раствора "2" (табл. 2.5.б), встряхивали и перемешивали; инкубировали 5 мин при 0С; 6. Добавляли 200 мкл холодного 10М AcONH4, инкубировали 5 мин при 0С; центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин; 7. Супернатант переносили в пробирку с 500 мкл изопропанола; инкубировали при комнатной температуре 10 мин; центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин; 8. Супернатант удаляли, центрифугировали 1мин для удаления остатков изопропанола; 9. Добавляли 100 мкл 2М AcONH4, смешивали на вортексе в течение 20 мин; инкубировали 5 мин при комнатной температуре; центрифугировали 5мин при 13000 об/мин; 10. Cупернатант переносили в пробирку со 100 мкл изопропанола; инкубировали 10 мин при комнатной температуре; центрифугировали 10 мин, 13000 об/мин; 11. Осадок промывали 200 мкл 70% EtOH, добавляли 75 мкл смеси ТЕ и РНКазы А (RNaseA, 20 мкл RNaseA на 2 мл ТЕ); инкубировали 15 мин при 37C; 83 12. Добавляли 25 мкл 10М AcONH4 и 100 мкл изопропанола; инкубировали 10 мин при комнатной температуре; центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин; 13. Ресуспендировали в 25 мкл TE. Таблица 2.5. Состав растворов для выделения плазмидной ДНК. Раствор №1 на 200 мл Концентрация Кол-во Глюкоза 50mM 5,56 г Tris Cl, pH 8.0 EDTA 25mM 5,0 мл 10mM 4,0 мл 186 мл H2O (mQ) а Раствор №2 на 11 мл NaOH SDS H2O (mQ) Концентрация Кол-во 0,2N 2,2 мл 1% 1,1 мл 7,7 мл б 84 Часть III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Глава 3.1. Молекулярная идентификация видового состава грибов и грибоподобных организмов в пораженных растительных тканях В работе проводилось изучение видового состава фитопатогенных грибов листьев картофеля, томата и паслена красного, выделенных в чистую культуру. В результате были выявлены виды: Phytophthora infestans, Alternaria solani, A. alternata (на картофеле и томате), которые составляли подавляющее большинство из выделенных патогенов (полный список видов приведен в главе 2.3. в разделе Материалы и методы). Нами была выдвинута гипотеза, что виды, выделяемые в чистую культуру, могут не в полной мере отражать весь видовой состав патогенной микобиоты листьев растений. Это может быть связано с тем, что многие фитопатогенные виды не способны расти на питательной среде, либо не образуют спор и потому незаметны при выделении. Поэтому, для наиболее полного анализа фитопатогенной микобиоты целесообразно использовать методы, основанные на анализе структуры участков генома. Для изучения возбудителей пятнистостей листьев картофеля, томата, и паслена красного было проведено прямое секвенирование ядерных рибосомных генов и межгенных спейсеров (ITS) грибной ДНК, а также метод клонирования с последующим секвенированием тех же участков ДНК. В процессе работы из отдельных фиксированных простых листьев с симптомами некроза или пятнистости, собранных из различных регионов России (точные координаты и описание мест сбора представлены в главе Материалы и методы) выделяли тотальную ДНК. Далее была осуществлена амплификация участка ITS с помощью праймеров ITS1f/ITS4 и получены фрагменты ДНК длиной 500-600 пн, в большинстве случаев в виде смеси (рис. 3.1.). 85 Рис. 3.1. Электрофореграмма амплифицированных фрагментов ДНК с праймерами ITS1f/ITS4 из пораженных листьев картофеля (указаны стрелкой). Результаты секвенирования (по Сэнгеру) полученных ПЦР-продуктов показали, что во всех исследуемых образцах присутствует смесь различных нуклеотидных последовательностей, что затрудняет их идентификацию (флуоресцентный детектируемый сигнал, состоящий из двурядных пиков на хроматограмме) (рис. 3.2.). Рис. 3.2. Хроматограмма последовательностей прямого секвенирования фрагментов ДНК из пораженных листьев картофеля. Поэтому, с целью идентификации возбудителей, предположительно находящихся в смеси ДНК, был использован метод клонирования в бактериях с последующим секвенированием клонов. 3.1.1. Рестрикционный анализ клонов Для использования при анализе клонов необходим подбор эндонуклеаз рестрикции, которые бы имели сайты узнавания в регионе ITS разных видов грибов, потенциально связанных с листьями картофеля и томата. Поиск эндонуклеаз рестрикции проводился in silico с помощью программы CLC SequenceViewer 7.5 (QIAGEN). Для анализа были взяты эндонуклеазы рестрикции, представленные в таблице 3.1. 86 Таблица 3.1. Эндонуклеазы рестрикции, использованные в анализе in silico. Название EcoRI SmaI SalI PstI XhoI EcoRV HaeIII BglII MspI XbaI HindIII BamHI Сайт узнавания Gaattc Cccggg Gtcgac Ctgcag Ctcgag Gatatc Ggcc Agatct Ccgg Tctaga Aagctt Ggatcc Длина 6 6 6 6 6 6 4 6 4 6 6 6 Для выбора эндонуклеаз рестрикции в программу CLC SequenceViewer были введены последовательности ITS видов грибов, ассоциированных с листьями пасленовых (из литературных источников, глава ), проведен анализ предполагаемых эндонуклеаз рестрикции, мест их посадки и возможных профилей рестрикции (рис. 3.3.). 87 Рис. 3.3. Подбор ферментов для рестрикционного анализа in silico в программе CLC SequenceViewer. В результате, для дальнейшего анализа in vitro, была отобрана эндонуклеаза рестрикции MspI. В последующем рестрикционный анализ проводился для всех клонированных образцов, образующих ПЦР-продукт с универсальными праймерами M13, амплифицирующими несущий вставку фрагмент плазмидной ДНК. Рестрикционный анализ амплифицированных фрагментов рДНК, трансформированных в плазмиды показал, что использование эндонуклеазы рестрикции MspI позволяло выявлять разнообразие образцов (плазмидной ДНК со вставкой). В некоторых случаях, даже не зная результатов секвенирования, возможно определение принадлежности данного образца к определенному таксону грибного патогена (рис.3.4.-3.7.). Таким образом, 88 эндонуклеаза рестрикции MspI могла быть использована для отбора клонов с различающимися вставками. Рис.3.4. Рестрикционный анализ клонов из образца №226 листа картофеля. 2, 3 - Alternaria alternata, 6 - A. solani, 8 - Epicoccum nigrum, M- Маркер длин фрагментов 1 kb DNA Ladder. Рис. 3.5. Рестрикционный анализ клонов из образца листа паслена сладко-горького №249. 7 - Cladosporium herbarum, 8 - Thielavia basicola, 9 - Colletotrichum acutatum, 11 Mycosphaerella sp., 12 - Phoma herbarum, 15 - Alternaria alternata, 17 – Pezizomycotina, MМаркер длин фрагментов 1 kb DNA Ladder. Рис. 3.6. Рестрикционный анализ клонов из образца листа картофеля №240. (1-7, 10, 12 - 15 были секвенированы). 1 - Cladosporium cladosporoides, 3, 7,- Cladosporium tenuissimum, 2 - Alternaria alternata, 4 - Tolypocladium inflatum, 5 - Rhodotorula glutensis, 6 - Hanaella oryzae, M- Маркер длин фрагментов 1 kb DNA Ladder. 89 Рис. 3.7. Рестрикционный анализ клонов из образца листа томата №82. 1, 3, 5, 6 - Septoria lycopersici, 2 - Podosphaera, 4 - Alternaria alternata, M- Маркер длин фрагментов 1 kb DNA Ladder. 3.1.2. Исследование видового состава грибов и организмов в пораженных листьях Solanum tuberosum грибоподобных Клонирование было проведено для образцов ДНК 12 листьев картофеля из разных мест сбора. Из нескольких сотен проанализированных белых колоний для дальнейших исследований были отобраны образцы, имеющие соответствующую вставку. Наличие вставки определяли с помощью ПЦР со стандартными M13 праймерами, непосредственно используя в реакции снятые стерильно белые колонии. После проведения электрофореза фрагменты, несущие вставку, имели размер 500-600 пн плюс 220 пн из фланкирующих участков вектора (рис. 3.8.). В случае отсутствия вставки амплификаты имели размер 220 пн. Рис. 3.8. Электрофореграмма скрининга клонов на наличие вставки. Для секвенирования из клонов каждого образца исследуемого пораженного листа отбирали по 10 образцов выделенной плазмидной ДНК с разными рестрикционными профилями (использовали рестриктазу MspI) (рис. 3.4., 3.6.). Всего было секвенировано 113 образцов плазмидной ДНК. 90 Все последовательности ДНК были идентифицированы, ни одна из них не была определена как химерная (анализ проводили с помощью алгоритма Uchime программы Usearch v8.1). Полученные последовательности были проверены по гомологии с последовательностями из Генбанка (GenBank, www.ncbi.nlm.nih.gov). Процент совпадений составил 98-100%. Выявленные последовательности были депонированы в базу данных Генбанк. В таблице 3.2. указаны номера, процент гомологии с последовательностями из Генбанка и число совпадающих нуклеотидов. 91 Таблица 3.2. Гомология последовательностей ITS рДНК из пораженных листьев S. tuberosum. Номер, под которым полученная последовательность депонирована в Генбанк KU182490 KU182491 KU182492 KU182493 KU182494 ― ― KU182495 KU182496 KU182497 KU182498 JX901773 KU182499 KU182500 KU182501 KU182502 KU182503 KU182504 KU182505 KU182506 KU182507 ― Ближайшее совпадение с Генбанк, номер последовательности Alternaria alternata (KJ082099.1) Fusarium sp. (HQ674657) Alternaria infectoria (KR094444) Colletotrichum coccodes (AJ301957) Alternaria solani (AY154716) Colletotrichum gloeosporioides (AJ301972) Phytophthora infestans (FJ801899) Cladosporium tenuissimum (AJ300331) Cladosporium cladosporioides (AY251074) Cladosporium herbarum (AF455404) Phoma sp. (JX160059) Mycosphaerella (EU019297) Tolypocladium inflatum (AB255606) Epicoccum nigrum (KF512824) Saccharomyces sp. Cryptococcus tephrensis (DQ000318) Dioszegia crocea (AJ581068) Rhodotorula glutinis (KJ46390) Hannaella oryzae (JQ753959) Rhodotorula ingeniosa (NR_111080) Cryptococcus sp. (JF495244) Sporobolomyces sp. (KP100170 ) Совпадение с ГенБанк число процент совпадающих совпадения нуклеотидов 575/575 100% 561/561 100% 588/591 99% 594/595 99% 604/605 99% 594/597 99% 660/661 99% 591/592 99% 576/576 100% 568/568 100% 570/578 99% 525/529 98% 571/571 100% 481/482 99% 447/455 98% 542/550 99% 495/502 99% 544/545 99% 488/492 99% 602/604 99% 559/562 99% 544/547 99% Количество образцов, в которых была получена последовательность 26 1 1 1 8 1 2 26 4 15 1 1 1 3 1 4 2 3 3 1 5 3 92 Полученные с помощью клонирования результаты показали, что в исследуемых образцах пораженных пораженных листьев присутствовали комплексы видов грибов и грибоподобных организмов (табл. 3.3.) Таблица 3.3. Исследованные образцы и идентифицированные виды. Исходный образец Результаты клонирования (кол-во образцов) № 42, Ставропольский край, КВНС*, 2014 Cladosporium herbarum (3) Cladosporium tenuissimum (6) Cryptococcus sp. (2) Cladosporium tenuissimum (7) Cladosporium cladosporoides (1) Cladosporium herbarum (3) Epicoccum nigrum (2) Ascomycota (1) Mycosphaerella sp. (1) Cryptococcus sp. (2) Saccharomyces sp. (1) Cladosporium herbarum (1) Dioszegia crocea (1) Phytophthora infestans (1) Alternaria alternata (2) Alternaria alternata (2) Alternaria solani (1) Epicoccum nigrum (1) Alternaria alternata (2) Cladosporium tenuissimum (3) Tolypocladium inflatum (1) Rhodotorula glutinis (1) Hannaella oryzae (2) Phytophthora infestans (1) Cladosporium cladosporoides (1) Fusarium sp. (1) Rhodotorula glutinis (1) Rhodotorula ingeniosa (1) Sporobolomyces sp. (3) Cladosporium cladosporoides (2) Cladosporium tenuissimum (1) Cryptococcus sp. (1) Alternaria alternata (1) № 45, Ставропольский край, КВНС, 2014 № 52, Ставропольский край, КВНС, 2014 № 226, Респ. Северная Осетия, СКНИИГПСХ*, 2014 № 240, Респ. Северная Осетия СКНИИГПСХ, 2014 № 241, Респ. Северная Осетия, СКНИИГПСХ, 2014 Colletotrichum gloeosporoides (1) Hannaella oryzae (1) 93 № 2, Московская обл., ВНИИКХ*, 2012 г. Alternaria solani (7) Alternaria alternata (2) Alternaria infectoria (1) № 3, Московская обл.,ВНИИКХ, 2012 г. Alternaria alternata (5) Alternaria alternata (8) Colletotrichum coccodes (1) Phoma sp. (1) Cladosporium tenuissimum (4) Cladosporium herbarum (4) Cryptococcus sp. (1) Cladosporium herbarum (2) Alternaria alternata (3) Cladosporium tenuissimum (4) Cladosporium tenuissimum (1) Cladosporium herbarum (2) Cryptococcus sp. (2) Alternaria alternata (1) Epicoccum nigrum (1) № 4, Московская обл., ВНИИКХ, 2012 г. № 200, Воронежская обл., Панинский р-н, 2014 № 201, Воронежская обл., Панинский р-н, 2014 № 202, Воронежская обл., Панинский р-н, д. Сергеевка, 2014 Прим. КВНС - Кисловодская высокогорная научная станция Института физики атмосферы РАН на плато Шаджатмас, СКНИИГПСХ - Северо - Кавказский НИИ горного и предгорного сельского хозяйства, ВНИИКХ - ВНИИ картофельного хозяйства имени А.Г.Лорха. В результате использования метода клонирования было выделено 22 таксона грибов и грибоподобных организмов. При секвенировании 113 клонированных образцов в 46 из них были идентифицированы виды рода Cladosporium, в 35― р. Alternaria, 1- Fusarium sp., 2- Phytophthora infestans, 2 вида рода Colletotrichum, и в 1-м - Phoma sp. Наибольшее количество образцов составили виды рода Cladosporium и Alternaria. Результаты клонирования показали, что на каждом листе с симптомом некроза в среднем присутствует 4 уникальных таксона. Fusarium и Phytophthora в данном эксперименте были выявлены исключительно в образцах, собранных на опытных участках СКНИИГПСХ. Виды рода Colletotrichum были выявлены в одиночных клонах из образцов СКНИИГПСХ и с опытного участка ВНИИКХ в Московской области. Число и разнообразие выявленных патогенов зависело от места произрастания растения хозяина Solanum tuberosum. Так, например, в образцах картофельных листьев из ВНИИКХ, собранных в 2012 г., 94 идентифицированные представлены последовательности преимущественно видами грибных р. патогенов были причем были Alternaria, обнаружены как крупноспоровый вид A. solani, так и мелкоспоровые A. alternata и A. infectoria. Всего из 30 полученных клонов с 3-х образцов половина была представлена A. alternata, 7 клонов A. solani и 1 A. infectoria. Colletotrichum coccodes и Phoma sp. были выявлены каждый только в 1-м из клонов. Таким образом, были обнаружены представители 3-х родов. Полученные результаты, вероятно, могут свидетельствовать о том, что, возможно в год взятия образцов, наибольшее распространение на полях ВНИИКХ получили виды рода Alternaria (табл. 3.3.). Напротив, на полях КВНС из 30 случаев с клонированными образцами ДНК, в 21 клоне идентифицированы различные виды рода Cladosporium, а Alternaria была обнаружена только в 2-х случаях. Остальные выявленные виды были представлены дрожжевыми формами, также являющимися обычными представителями микобиоты. В Воронежской области наибольшее распространение получили виды рода Cladosporium (17), A. alternata (4), 1- Epicoccum nigrum (1), остальные принадлежали к виду Cryptococcus, не являющегося типичным патогеном листьев картофеля, однако, вероятно, оказывающий свое влияние на развитие патогенных грибов. Таким образом, в Воронежской области были выявлены только представители видов 2-х родов, относящихся к известным патогенам листьев картофеля (табл. 3.3.). На опытных полях СКНИИГПСХ были выявлены виды 5 родов Alternaria, Cladosporium, Fusarium, Phytophthora и Colletotrichum, причем из 30-ти клонов 5 составляли A. alternata, 1- A. solani, 8- Cladosporium, 1Fusarium, 1- Phytophthora и 1- Colletotrichum (табл. 3.3.). Следует отметить, что по данным ряда авторов, прямое секвенирование является эффективным и относительно простым методом для идентификации грибов в образцах окружающей среды (Horton, Bruns, 2001; Сурина 2015), 95 однако разрешающей способности этого метода в наших исследованиях было недостаточно. Таким образом, в результате клонирования и секвенирования выделенной ДНК из ассоциаций грибов и грибоподобных организмов, обнаруженных на листьях картофеля из 4-х регионов России, были идентифицированы следующие виды: Alternaria alternata, Alternaria solani, Alternaria infectoria, Cladosporium cladosporioides, Cladosporium herbarum, Cladosporium tenuissimum, Colletotrichum coccodes, Colletotrichum gloeosporioides, Epicoccum nigrum, Fusarium sp., Mycosphaerella sp., Phoma sp., Phytophthora infestans, Tolypocladium inflatum, Saccharomyces sp., Cryptococcus sp., Cryptococcus tephrensis, Dioszegia crocea, Hannaella oryzae. Большинство выявленных видов были описаны ранее в литературе как самостоятельные патогены картофеля (Воловик, Кладова, 1969; Воловик и др., 1974; Воловик, Литун, 1975; Попкова и др., 1980; Чумаков, Захарова, 1990; Иванюк и др., 1994; Захаренко, 2003). В то же время некоторые из найденных нами видов описаны в литературе как представители микрофлоры здоровых растений. В Новой Зеландии (O’Callaghan, 2005) проводилось исследование эндофитных грибов, ассоциированных со здоровыми растениями картофеля. Авторами было определено, что в среднем на каждом листе встречалось более 2-х разных видов. Максимальное число видов доходило до 6. При этом в эпифитной филлоплане доминировали дрожжи. Среди выделенных ими видов Alternaria sp., Cladosporium sp., Colletotrichum sp., Epicoccum sp., Phoma sp. встречались и в эпифитной, и в эндофитной микрофлоре, а Fusarium - только в эпифитной. Виды Aureobasidium pullulans, Cladosporium herbarum, Colletotrichum coccodes, Phoma sp. были выделены из листьев картофеля с симптомами некротических поражений в Ленинградской области (Ганнибал, 2007). Некоторые идентифицированные виды не получили широкой известности в качестве патогенов картофеля. Tolypocladium inflatum – почвообитающий гриб, его половая стадия Elaphocordyceps subsessilis (= 96 Cordyceps subsessilis) является патогеном насекомых (Hodge et. al., 1996), однако в ряде работ был описан как эндофит растений (Holdenrieder, Sieber 1992; Hanada et. al., 2010). Необходимо отметить, что выявленный нами вид ранее на картофеле не был обнаружен, о чем свидетельствует отсутствие литературных данных. Род Mycosphaerella является самым большим родом среди фитопатогенных грибов. Mycosphaerella sp. описана как патоген картофеля в Бразилии (Hanlin, 1992; Mendes et. al., 1998), а M. solani отмечалась патогеном картофеля в Индексе Болезней растений США (Anon., 1960). В нашей работе впервые в России представитель данного рода выявлен на картофеле. Epicoccum nigrum может являться и патогеном растений и эндофитом (Schol-Schwarz, 1959). Гриб был описан на картофеле в Папуа Новой Гвинее (Shaw, 1984), также встречается и на других видах пасленовых: на Nicotiana tabacum (Sutton, 1993), Solanum melongena (Sarbhoy, 1971), Solanum erianthum (Mercado Sierra, 1984; Arnold, 1986), и на других растениях часто вызывает заболевания, характеризующиеся некротическими поражениями листьев (Mahadevakumar et al., 2014). Данный вид ранее также не был указан в отечественной литературе в качестве патогена картофеля. 3.1.3. Видовой состав грибов и грибоподобных организмов пораженных листьях Solanum lycopersicum в Для исследования видового состава грибных патогенов листьев томата было отобрано 7 образцов из 5 различных регионов сбора (см. Материалы и методы и табл.). Всего было проанализировано 200 белых колоний (несущих вставку), для 75 из которых были определены нуклеотидные последовательности (табл. 3.4.). Эксперимент проводился по принципу, описанному выше для образцов картофеля. Отбор клонов осуществлялся по наличию вставки 97 соответствующего размера (500-600 пн) (рис. 3.10.) и рестрикционного анализа с помощью эндонуклеазы рестрикции MspI (рис.3.7.). Рис. 3.10. Электрофореграмма скрининга клонов образца №82 на наличие вставки. M- Маркер длин фрагментов 1 kb DNA Ladder. Выделенные для анализа клоны были секвенированы и полученные последовательности проверены по гомологии с последовательностями из Генбанка. Процент совпадений составил 97-100%. Часть полученных последовательностей депонирована в базу данных Генбанк. В таблице 3.4. представлены номера, процент гомологии с последовательностями из Генбанка и число совпадающих нуклеотидов. 98 Таблица 3.4. Гомология последовательностей ITS рДНК из пораженных листьев S. lycopersicum. Номер, под которым полученная последовательность депонирована в Генбанк KU245683 Ближайшее совпадение с Генбанк, номер последовательности Совпадение с ГенБанк число процент совпадающих совпадения нуклеотидов Количество образцов, в которых была получена последовательность Cladosporium herbarum ( HG798775 ) Neocamarosporium goegapense (=Phoma betae) (KJ869163) 585/591 99% 5 564/572 97% 1 KU245686 KU245687 Alternaria alternata (KP985749) Septoria lycopersici (DQ841156) Podosphaera fusca (EU159425) 608/608 548/550 550/558 100% 99% 99% 22 11 2 KU245688 Cladosporium fulvum (AF393701) 560/561 99% 10 KU245689 Peyronellaea glomerata (Phoma glomerata) (AY183371) 566/570 Alternaria infectoria (NR_131263) 558/561 Thanatephorus cucumeris (=Rhizoctonia solani) (HQ185373 ) 682/685 KU245684 KU245685 ― KU245690 99% 99% 99% 6 1 1 Didymella lycopersici (=Phoma lycopersici) (GU237848) Дрожжи 486/ 486 100% KU245691 Dioszegia hungarica (NR_073227) 482/484 99% 1 KU245692 Candida albicans (KC954541) Cryptococcus tephrensis (DQ000318) 575/577 99% 544/563 97% 1 1 ― KU245693 1 99 Во всех исследованных образцах листьев томата, как и в листьях картофеля, было выявлено несколько видов грибов и грибоподобных организмов (табл. 3.5.). Таблица 3.5. Исследованные образцы и идентифицированные виды. Результаты клонирования Исходный образец (кол-во образцов) № 4, Ростовская область, сорт Dioszegia hungarica (1) Линда, 2014 Cladosporium herbarum (3) Neocamarosporium goegapense (1) Alternaria alternata (4) Boletaceae (1) Rhizoctonia solani (1) Candida albicans (1) № 82, КВНС, Кисловодск, 2014 Septoria lycopersici (7) Podosphaera fusca (1) Alternaria alternata (2) Cladosporium cladosporioides (1) 76, КВНС, Кисловодск, 2014 Septoria lycopersici (8) Podosphaera fusca (1) Alternaria alternata (1) 100, Краснодарский край, Passalora fulva Славянск-на-Кубани (=Cladosporium fulvum) (3) Peyronellaea glomerata (6) Alternaria alternata (1) 110, Ставропольский край, Cladosporium fulvum (7) Темрюкский р-н Didymella lycopersici (Phoma) (1) 12, Ростовская область, сорт Alternaria alternata (9) Линда, 2014 Septoria lycopersici (3) Cladosporium herbarum (1) Alternaria infectoria (1) Cryptococcus tephrensis (1) 208, Воронежская обл, Панинский Cladosporium herbarum (5) р-н, 2014 Alternaria alternata (5) Прим.: КВНС - Кисловодская высокогорная научная станция Института физики атмосферы РАН, филиал в г. Кисловодск В таблице 3.5. представлены результаты секвенирования клонов, полученных с помощью клонирования выделенных образцов рДНК ITS региона из пораженных участков листьев томата. В результате исследования полученных клонов было выявлено 13 таксонов грибов и грибоподобных организмов (табл. 3.4.). 100 Встречаемость Alternaria alternata была относительно высокой и данный вид был идентифицирован в 22-х полученных клонах взятых образцов рДНК пораженных листьев томата из исследованных регионов России (табл. 3.5.). Реже встречались Septoria lycopersici (11), Passalora fulva (=Cladosporium fulvum) (10), Peyronellaea glomerata (=Phoma glomerata) (6), Cladosporium herbarum (5). Podosphaera fusca (2), а виды Neocamarosporium goegapense (=Phoma betae), Rhizoctonia solani, Candida albicans, Dioszegia hungarica, Cladosporium cladosporioides, Didymella lycopersici, Alternaria infectoria, Cryptococcus tephrensis ― одиночно. Таким образом, в среднем на каждом листе томата с симптомом некроза присутствовало 3 уникальных таксона. В результате проведенных исследований на пораженных листьях томата были выявлены виды Alternaria alternata, Alternaria infectoria, Cladosporium herbarum, Didymella lycopersici (=Phoma sp.), Neocamarosporium goegapense (=Phoma betae), Passalora fulva (=Cladosporium fulvum), Peyronellaea glomerata (= Phoma glomerata), Podosphaera fusca, Septoria lycopersici, Thanatephorus cucumeris (=Rhizoctonia solani), Candida albicans, Cryptococcus tephrensis, Dioszegia hungarica Некоторые из этих видов не являются типичными представителями фитопатогенной микобиоты томата. В то же время анализ литературных данных показал, что выявленные виды были ранее описаны как известные патогены не только на томате, но и на других растениях. Podosphaera fusca ―паразит растений. Гриб является одним из возбудителей мучнистой росы многих сельскохозяйственных культур. Нами не было обнаружено сообщений о присутствии этого вида на растениях томата. Однако, патоген был найден на территории бывшего Советского союза на Nicotiana alata (Braun, 1995), и на Solanum macrocarpum в Корее (Cho et al., 2004). Neocamarosporium goegapense (=Phoma betae, Pleospora betae) ― известный патоген растений, вызывающий зональную пятнистость листьев. 101 Вид был найден на томате в Индии (Mathur, 1979) и на картофеле в Танзании (Ebbels, Allen, 1979). Нами не было найдено литературных данных о патогенном воздействии данного вида на растения томата в России. Peyronellaea glomerata (=Phoma glomerata) вызывает заболевания у широкого круга растений хозяев. Гриб был выделен из почвы и ризосферы растений; распространен в почве, на семенах, и растительных остатках. Патогенность этого возбудителя была доказана на клубнях и листьях картофеля (Kranz, 1963). P. glomerata была выявлена на томате в Нидерландах и на картофеле в Германии (Aveskamp, de Gruyter, 2010). Thanatephorus cucumeris фитопатологическим обществом http://www.apsnet.org/) считается (=Rhizoctonia (American возбудителем Американским solani) Phytopathological листовых Society, пятнистостей томата, причем отмечено, что симптомы поражений похожи на симптомы поражений Alternaria alternata. Данный патоген является одним из самых агрессивных возбудителей болезней листьев Nicotiana tabacum (Gonzalez et al., 2011) и болезней стеблей и корней Solanum lycopersicum (Taheri, 2015). 3.1.4. Видовой состав грибов и грибоподобных пораженных листьях Solanum dulcamara организмов в Для исследования патогенов растений паслена сладко-горького были отобраны пораженные листья (4 образца), собранные на территории Московского Университета имени М.В.Ломоносова (г. Москва, Воробьевы горы) вдали от посадок картофеля и томата. Эксперимент проводился аналогично приведенным выше для образцов картофеля и томата и включал клонирование и секвенирование выделенных клонов. Всего было проанализировано 137 белых колоний, для 39 из которых были определены нуклеотидные последовательности (табл. 3.6.). 102 Таблица 3.6. Гомология последовательностей ITS рДНК из пораженных листьев Solanum dulcamara. Номер, под которым полученная последовательность депонирована в Генбанк KU366278 KU366277 KU366279 KU366276 KU366280 ― ― ― ― ― KU366281 KU366282 ― ― KU366283 Совпадение c ГенБанк Cовпадение с Генбанк, номер последовательности Alternaria alternata (KJ082099) Aureobasidium pullulans (AF455533) Cladosporium cladosporioides (KT223338) Cladosporium herbarum (KR817913) Cladosporium tenuissimum (AJ300331) Colletotrichum acutatum (AJ301971) Colletotrichum gloeosporioides (KP903594) Cryptococcus sp. (KF225836) Mycosphaerella sp. (GU214690) Pezizomycotina (1) (FJ861449) Pezizomycotina (2) (GU184034) Phialophora sp. (GU212370) Phoma herbarum (JQ282910) Phoma sp. (FJ903335) Phytophthora infestans (AM412177) Thielavia basicola (KP101210 ) число совпадающих нуклеотидов процент совпадения Количество образцов, в которых была получена последовательность 607/609 604/606 451/451 451/451 590/591 617/619 475/488 558/567 561/569 544/546 586/587 473/484 495/500 368/373 338/339 325/333 99% 99% 100% 100% 99% 99% 97% 98% 99% 99% 99% 97% 99% 97% 99% 97% 2 1 4 2 5 1 1 4 1 1 7 1 4 3 1 1 103 Таблица 3.7. Исследованные образцы и идентифицированные виды. Исходный образец № 243, Москва, МГУ № 244, Москва, МГУ № 246, Москва, МГУ № 249, Москва, МГУ Результаты клонирования (кол-во образцов) Pezizomycotina (2) Pezizomycotina (1) Colletotrichum gloeosporioides (1) Cladosporium tenuissimum (5) Phialophora sp. (1) Cryptococcus sp. (1) Phytophthora infestans (1) Phoma herbarum (1) Alternaria alternata (1) Cladosporium cladosporioides (3) Cryptococcus sp. (2) Phoma sp. (3) Pezizomycotina (3) Cladosporium cladosporioides (1) Thielavia basicola (1) Cryptococcus sp. (1) Cladosporium herbarum (1) Aureobasidium pullulans (1) Cladosporium herbarum (1) Thielavia basicola (1) Colletotrichum acutatum (1) Mycosphaerella sp. (1) Phoma herbarum (3) Alternaria alternata (1) Pezizomycotina (1) Использование технологии клонирования и секвенирования позволило выявить 16 различных видов грибов и грибоподобных организмов (табл. 3.6.). У 7 образцов не удалось установить видовую принадлежность. Наибольший процент сходства полученных последовательностей с базой данных Генбанка указал принадлежность исследуемых клонов к подотделу Pezizomycotina (все аскомицеты, способные к образованию плодовых тел). Однако нуклеотидные последовательности этих клонов неоднородны, клон 243-9 из образца 243 сильно отличается от остальных при построении филогенетической кладограммы и выпадает в отдельную кладу (рис. 3.11.). 104 Поэтому в работе полученные клоны рассматриваются как 2 разных таксона Pezizomycotina (1) и Pezizomycotina (2). Рис. 3.11. Дендрограмма, полученная с помощью метода максимального правдоподобия (maximum likelihood) по последовательностям клонов, принадлежащих Pezizomycotina (дендрограмма получена с помощью программы Mega). В результате клонирования и секвенирования видов грибов и грибоподобных организмов на листьях паслена сладко - горького были найдены следующие cladosporioides, таксоны: Cladosporium Alternaria herbarum, alternata, Cladosporium Cladosporium tenuissimum, Colletotrichum acutatum, Colletotrichum gloeosporioides, Mycosphaerella sp., Pezizomycotina (1), Pezizomycotina (2), Phialophora sp., Phoma herbarum, Phoma sp., Phytophthora infestans, Thielavia basicola, Aureobasidium pullulans, Cryptococcus sp. Важно отметить, что среди перечисленных видов некоторые представляют особый интерес, так как не имеют широкого распространения на растениях семейства пасленовых. Часть из них приводится ниже. Aureobasidium pullulans дрожжеподобный гриб, который обнаруживается повсеместно в различных средах обитания (почва, вода, воздух и пр.). Вид широко известен как представитель эпифитной флоры растений (Кудряшова, 1997). Данный вид был описан в качестве патогена томата в Бразилии (Mendes et al., 1998) и США (Anon., 1960). Гриб также был 105 выделен в Ленинградской области из листьев картофеля с симптомами пятнистостей (Ганнибал, 2007). В России отсутствует подтверждение патогенного статуса данного вида из литературных источников. В то же время в ряде работ A. pullulans описывается как антагонист широкого спектра патогенных микроорганизмов, включая некоторые виды Alternaria (van den Heuvel, 1969; Fokkema, Lorbeer, 1974; Pace, Campbell, 1974; Rai, Singh,1980; Brame, Flood, 1983). В нашей работе данный вид был обнаружен в образце, в котором также присутствовала рДНК Alternaria alternata. Взаимодействие между этими видами может представлять интерес для дальнейших исследований. Colletotrichum acutatum распространен по всему миру, вызывает заболевания: антракноз, некрозы листьев и другие. Субстратом обитания патогена являются живые листья. Хозяевами являются многие растения из разных семейств. Вид неоднократно был описан на томате (Guerber et al., 2003; Jelev et al., 2008; Bobev, 2009; Vichova et al., 2012), перце (Jelev et al., 2008) и Solanum betaceum (Jones, Perez, 2012). Colletotrichum gloeosporioides является одним из наиболее распространенных патогенов растений рода Colletotrichum. Патоген является причиной потери урожая многих культур по всему миру. Он поражает растение в качестве вторичного возбудителя поврежденной ткани, а также может существовать в качестве сапрофита. Пораженные листья образуют рельефные некрозы темного цвета (Waller et al., 1992). Вид описан на Solanum melongena, как на листьях (McKenzie, 2013), так и на плодах (Weir et al., 2012). Представители Phialophora sp. выступают в качестве паразитов и в качестве сапрофитов (McColloch, 1944; Barnett, Hunter, 1972). Виды рода Phialophora не были описаны на паслене, однако встречаются на других пасленовых культурах, в частности Phialophora richardsiae описана на томате в Польше (Mulenko et al., 2008), Phialophora parasitica - на картофеле в Греции (Thanassoulopoulos, Giapanoglou, 1994). Гриб не характеризуется 106 большим распространением среди семейства пасленовых, однако у многих других растений вызывает болезни листьев и стеблей (Hughes et al., 2009; Liu et al., 2013). Thielavia basicola является почвообитающим патогеном, который вызывает заболевания более чем у 200 видов растений (CAB International; Johnson, 1916; Otani, 1962; Shew and Meyer, 1992). Гриб найден на томате в Италии (Greuter et al., 1991) и является одной из основных причин гнилей корней и стеблей табака (Tai, 1979). Следует отметить, что с пораженных листьев паслена сладко-горького нами также были выделены в чистую культуру следующие виды: Phoma sp., A. alternata, Сoniothyrium sp., P. infestans, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Thanatephorus cucumeris. Некоторые из них не были ранее обнаружены в России и на культурных видах пасленовых. Так, например, если виды Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Thanatephorus cucumeris были описаны в ряде работ (Чумаков, Захарова, 1990; Поликсенова, 2008), то виды рода Сoniothyrium не получили широкой известности в качестве патогенов растений семейства Solanaceae. Однако, сразу два вида из этого рода: Coniothyrium cereal и Coniothyrium fuckelii (= Paraconiothyrium fuckelii) были найдены на растениях картофеля в Польше (Mułenko et al., 2008), а вид Coniothyrium korovinii был найден на листьях дерезы (Lycium ruthenicum) на территории бывшего СССР (Gaponenko, 1965). Таким образом, учитывая эти данные, всего на листьях S. dulcamara нами было обнаружено 19 видов. Создание и секвенирование библиотек клонов из проб окружающей среды является методом, который чаще используется для изучения грибных сообществ, связанных с корнями (Douhan et al., 2005; Renker et al., 2006; Smith et al., 2007; Smith et al., 2007; Morris et al., 2008), а также для почвенных субстратов (Anderson et al., 2003; Landeweert et al 2003; Jumpponen 2003, 107 2007). Из двух использованных в работе подходов, прямого секвенирования и клонирования с последующим секвенированием, последний метод демонстрирует большую точность и информативность выявляемых данных в случае работы с сообществами растительной сферы. В настоящее время изучение сообществ, обитающих в сходных условиях, является одним из актуальных вопросов экологии грибов. С одной стороны виды, занимающие одну экологическую нишу, существующие в ограниченном пространстве с лимитирующими условиями жизнедеятельности, во избежание конкуренции должны быть разделены в пространстве или во времени согласно закону конкурентного исключения Г.Ф. Гаузе. Однако совместное присутствие грибов в одной экологической нише показано разными исследователями (Симонян, 1974; Дудка, 1990; Зайцева, 2007). В работе (Зайцева, Сафин, 2007) было показано, что виды Phytophthora infestans и Alternaria solani не имеют антагонистических отношений во время развития заболевания фитофтороза и альтернариоза на растениях картофеля. Полученные нами результаты также позволяют предположить, что одновременное присутствие нескольких видов грибов, имеющих фитопатогенное значение в пределах одного пораженного листа (пятна или некроза) свидетельствует о возможности заражения растения не одним, а комплексом из нескольких видов патогенных грибов. В то же время совместное присутствие ДНК нескольких видов может объясняться сменой одних видов патогенных грибов другими (или постепенной заменой) вследствие изменения температурных условий, влажности и т.д. Следует учитывать и то, что заражение может быть вызвано одним биотрофным видом, а пораженные им ткани могут колонизироваться гемибиотрофными или некротрофными видами. В настоящее время изучение синергетических взаимоотношений типа патоген-патоген представляет особый интерес. Такие заболевания возникают в результате сети взаимодействий широкого спектра микроорганизмов. 108 Однако при исследовании воздействия патогена на растение заражение обычно производят одним предполагаемым возбудителем в монокультуре. Следовательно, наши знания о возможном комплексном взаимодействии, приводящем к более тяжелым заболеваниям, ограничены. К таким выводам приходят и другие исследователи, которые считают, что взаимодействие между различными патогенами, ведущее к более тяжелым заболеваниям, встречается чаще, чем считалось ранее (Begon et al., 2006). Таким образом, изучение таких взаимодействий в растениях может способствовать лучшему пониманию микробного патогенеза и эволюции и, как следствие, развитию эффективных стратегий борьбы с болезнями. В последние годы появился ряд работ, в которых приводятся результаты и некоторые меры борьбы с подобными сложными заболеваниями (Gleason et al., 2011; Clark et al., 2012; Martin et al., 2013; Freeman et al., 2014). Аналогичные исследования проводились на томате, картофеле и паслёне. Изучение сердцевинных некрозов стеблей томата выявило ассоциации между бактериями Pseudomonas corrugata и P. mediterranea (Moura et al., 2005), P.corrugata и P. marginalis (Kudela et al., 2010). На клубнях картофеля был обнаружен комплекс микроорганизмов, состоящий из бактерий Candidatus liberibacter solanacearum и Candidatus liberibacter psyllaurous (Wen et al., 2009). В Иране на листьях картофеля также были обнаружены и исследованы ассоциации Alternaria tenuissima, A. dumosa, A. arborescens, A. infectoria и A. interrupta (Ardestani et al., 2010). Также есть данные о смешанных инфекциях у картофеля с симптомами увядания Verticillium dahlia и Pectobacterium sp. (Dung et al., 2013). Взаимодействие между различными грибными патогенами активно исследуется в настоящее время. Так, например, болезнь, характеризующаяся увяданием молодой виноградной лозы, распространена по всему миру. В качестве возбудителя этого заболевания указываются следующие виды: Ilyonectris sp., Phaeomoniella chlamydospora, Togninia sp. и неидентифицируемые виды семейства Botryosphaeriaceae (Mugnai et al., 1999; 109 Gramaje, Armengol, 2011). Причем возбудители варьируют между регионами - прозводителями. Недавние исследования показали, что несколько видов грибов, принадлежащих к Botryosphaeriaceae и Ilyonectria sp., вызывают резкое увядание виноградной лозы в полевых условиях (Whitelaw-Weckert et al., 2013). Аналогичные лабораторные эксперименты подтвердили, что совместное заражение изолятами Ilyonectria и Botryosphaeriaceae приводит к усилению тяжести заболевания по сравнению с заражением монокультурой Ilyonectria (Whitelaw-Weckert et al., 2013). Различные возбудители, выделенные на протяжении всего ареала возделывания, скорее всего, вместе коэвоэлюционировали из-за тесных связей межу ними. Однако, до этих исследований причиной болезни считался только один возбудитель в зависимости от региона возделывания. Многочисленные примеры сосуществования патогенов на сельскохозяйственных культурах также описаны в Великобритании (Fitt et al., 2006). Такие комплексные заболевания включали септориоз листьев пшеницы, вызванные Septoria tritici и Stagonospora nodorum; болезнь стеблей пшеницы Oculimacula yallundae и О. acuformis, рак стеблей рапса, вызываемый Leptosphaeria biglobosa и L. maculans. Другое комплексное заболевание пшеницы фузариозная корневая гниль - вызывается группой видов рода Fusarium. В Польше с этим заболеванием связывают четыре вида: Fusarium graminearum, F. poae, F. culmorum, F. sporotrichioides, несмотря на то, что их распространенность различается от одного географического региона к другому (Kuzdraliński et al., 2014). В Восточной Польше большинство полей пшеницы были поражены, по крайней мере, одним или двумя видами Fusarium, причем наличие F. graminearum способствовало возникновению F. culmorum. Большой экономически значимый урон во всем мире наносит фузариоз колосьев, часто сопряженный с загрязнением зерна микотоксинами, производимые грибом во время патогенеза (McMullen et al., 2012). Более 16 известных видов из комплекса видов F. graminearum были описаны как 110 возбудители фузариоза колоса (O’Donnell et al., 2008; Yli-Mattila et al., 2009; Sarver et al., 2011). Исследования, проведенные в Бразилии, показывают, что распространенность видов Fusarium меняется от одного географического региона к другому (Del Ponte et al., 2014). Наши текущие знания в отношении механизмов, которые объясняют географическую изменчивость и распространенность конкретных возбудителей в растениях, пострадавших от того или иного сложного заболевания очень бедны. Возможно, что такие изменения связаны с экологическими предпочтениями этих патогенов. Кроме того, абиотические факторы и культуры также могут влиять на этот вариант распространенности возбудителя. Известно, что черная пятнистость гороха может быть вызвана тремя патогенами (Le May et al., 2009). Однако недавно было обнаружено, что еще четыре патогенных организма Phoma koolunga (Davidson et al., 2009), Phoma herbarum (Li et al., 2011), Boerema exigua var. exigua (Li et al., 2012), и Phoma glomerata (Tran et al., 2014) ассоциированы с этим заболеванием. Все эти грибы являются некротрофами широкого профиля, что способствует колонизации новых сред обитания. Вполне возможно, что эти патогены используют синергизм в качестве стратегии, для того чтобы заразить как можно больше разнообразных растений, что может также объяснять, почему некоторые болезнетворные микроорганизмы встречаются чаще других в данной среде или растении - хозяине. Пятнистость листьев эвкалипта является сложным заболеванием, вызываемым многочисленными видами грибов рода Teratosphaeria (Crous et al., 2009). В Южной Африке выявлены два вида гриба (Teratosphaeria juvenalis и T. verrucosa), которые сосуществуют на одних и тех же листьях, и даже в одних пятнах. Важным фактором также является временная очередность заражения хозяина различными патогенами. Это положение было подтверждено работами ряда авторов. Le May и соавторы (2009) показали, что одновременное заражение растений двумя патогенными грибами 111 Mycosphaerella pinodes и Phoma medicaginis var. pinodella, связанными с болезнью листьев бобовых, ограничивало развитие заболевания и воспроизводство грибов. Тем не менее, когда растения предварительно инокулировали одним патогеном, а затем другим, наблюдалось заметное увеличение тяжести заболевания. Однако в Индии были получены другие результаты (Sagar, Sugha, 1997). Авторами было показано, что некрозы листьев гороха, вызываемые Phoma medicaginis var.pinodella меньше у растений ранее зараженных патогеном корней F. oxysporum f. sp. pisi. Порядок или последовательность заражения разных патогенов и их трофический статус могут влиять на характер их взаимодействия в период возникновения и развития заболевания. Как уже было описано выше, найденный нами на листьях томата дрожжевой гриб Aureobasidium pullulans представляется в качестве антагониста широкого спектра патогенных микроорганизмов, включая Alternaria solani (Brame, Flood, 1983). Таким образом, совместное присутствие патогенов на растении может привести к антагонизму и/или синергизму, на что, вероятно, может влиять порядок их ассоциации с зараженным растением и другие факторы. В то же время совместное присутствие ДНК нескольких видов может объясняться сменой одних видов патогенных грибов другими (или постепенной заменой) вследствие изменения температурных условий, влажности и т.д. Также, заражение может быть вызвано одним (биотрофным видом), а пораженные им ткани могут колонизироваться гемибиотрофными или некротрофными видами. Исходя из представленных данных следует, что необходимы углубленные исследования временного аспекта при заражении различными патогенными микроорганизмами и их взаимодействия, как между собой, так и с растением. 112 Поверхность листьев растения обеспечивает также среду обитания непатогенных микроорганизмов, что может быть важным фактором, определяющим тяжесть заболеваний, вызванных патогенами (Potter, 1910). Степень активности этих микроорганизмов может быть ограничена климатом, регионом произрастания растения, характером поверхности листа, в том числе его морфологией и химическим составом, а также физиологией растения - хозяина (Dickinson, 1973). Важным фактором является возраст листа и степень воздействия антропогенного фактора. В настоящее время нет сомнений, что применение фунгицидных препаратов может влиять на сапрофитную филлоплану растений и ингибировать ее рост и развитие. В то же время мало что известно о влиянии фунгицидов на поселяющиеся на листьях бактерии, не являющихся патогенными (Dik, 1991; Andrews, Hirano, 2012; Romero et al., 2014). Данных о влиянии фунгицидов на непатогенные грибы накоплено значительно больше (Bainbridge, Dickinson, 1972; Kuthubutheen, Pugh, 1978; Mónaco et al., 2001; Karlsson et al., 2014). Бэйнбридж и Диккенсон (Bainbridge, Dickinson, 1972) в качестве доминантных представителей грибной филлопланы картофеля определили Aureobasidium pullulans, Sporobolomyces и Cladosporium sp. Представители 2-х последних родов были также выявлены и в нашей работе. Этими исследователями было показано, что применение некоторых фунгицидов привело к значительному снижению роста популяции филлопланы грибов. Причем основной эффект воздействия пришелся на дрожжи. Данные исследования показали, что значительная доля микобиоты поверхности листа подвержена воздействию фунгицидов широкого спектра действия. Однако, многочисленные специфичные системные и другие препараты, эффективные против ограниченной группы патогенов, могут не оказывать никакого воздействия на грибы - сапрофиты. Например, Sporobolomyces является таким грибом, на который не влияют многие фунгициды (Dickinson, 1972). Этот вид был выявлен и в наших исследованиях. 113 Опираясь на литературные данные и собственные результаты, можно сделать вывод, что необходимы дальнейшие исследования дрожжевых (дрожжеподобных) грибов на поверхности листьев. Важной задачей является определение видового состава этих грибов, а также обнаружение их присутствия до и после обработки фунгицидами. Сокращение популяции грибов филлопланы может влиять на два аспекта: 1) во время физиологически активного периода жизни листа взаимоотношения между ними и патогенными микроорганизмами играют первостепенную роль; 2) по мере старения листа они могут играть роль в самом процессе старения и последующего разложения отмирающих тканей. Взаимодействие между сапрофитами и патогенными микроорганизмами может приводить к снижению количества заболеваний. Это может быть связано с конкуренцией между организмами за поверхностные питательные вещества, которые обычно присутствуют в очень низких концентрациях, или с индукцией сапрофитами фитоалексинов (Bailey, 1971; Blakeman, 1973; Wood, 2012). В данной работе мы поднимаем многие вопросы, связанные с взаимным влиянием патогенных и непатогенных организмов, которые требуют дальнейшего тщательного изучения. Таким образом, обобщая литературные и собственные данные, можно заключить, что в механизмы объясняющие распространенность того или иного возбудителя на растениях, их географическую изменчивость и совместное сосуществование на листьях, могут вносить свой вклад следующие факторы: очередность заражения; абиотические условия; заселенность непатогенными микроорганизмами; регион произрастания растения; физиология растения хозяина; биохимический состав листа; возрастные особенности листьев; антропогенное влияние. В результате проведенных исследований была выяснена и показана важность изучения комплекса патогенов и значение их состава для определения первичности возникновения синергетических и/или 114 антогонистических взаимоотношений. Особый интерес эти проблемы представляют в свете борьбы с вредоносными заболеваниями паслёновых, приносящие наибольший экономический урон в производстве конечной продукции. Глава 3.2. Конструирование тест-систем для идентификации видов рода Alternaria Анализ литературных и полученных нами данных показал, что в ряде регионов России наибольшей распространённостью на пораженных листьях пасленовых, наряду с Phytophtora infestans, обладали виды рода Alternaria. Потери урожая картофеля и томата от альтернариоза в отдельные годы составляют 10-90% (Иванюк, 2003; Сhaerani, Voorips, 2006). Известно, что виды Alternaria могут иметь свои биологические особенности и различаться по таким практически важным показателям, как агрессивность, вирулентность к разным сортам картофеля и томата, токсигенность, оптимум роста при разных температурах, выживаемость в зимних условиях (Иванюк и др., 2005; Козловский, Филиппов, 2007; Орина, 2011). Разные виды отличаются и по своей устойчивости к фунгицидам (Побединская, 2012). Крупноспоровый вид A. solani зачастую вообще не дает конидиального спороношения на питательной среде (Орина, 2011). Поэтому идентификация, не зависящая от морфологических параметров, является необходимым этапом для его обнаружения. Отработанный нами подход для ПЦРидентификации патогенных видов в фиксированном материале подходит для этой задачи. В наших исследованиях была поставлена задача конструирования собственных тест-систем на основании нуклеотидных последовательностей, полученных из изолятов, собранных в разных регионах России. Этот подход является обязательным для получения эффективных тест-систем, в отличие 115 от обычной процедуры подбора праймеров на основании нуклеотидных последовательностей из базы данных Генбанк. 3.2.1. Выделение изолятов Alternaria Изоляты возбудителей альтернариоза были выделены из образцов листьев, клубней картофеля и плодов томата с симптомами альтернариоза, собранных лично автором, а также коллективом лаборатории микологии и теоретических основ фитопатологии. Коллекция чистых культур грибов рода Alternaria, получена из 14-ти регионов России, Монголии и Казахстана в 2007-2015 гг. (таблица 2.1.) и насчитывает 320 изолятов. Часть изолятов была передана для анализа из ВНИИ фитопатологии; лаборатории микологии и фитопатологии ВНИИ защиты растений (ВИЗР). Информация о точных местах сбора, и количестве выделенных изолятов приведена в главе 2.3. в разделе Материалы и методы. Морфологическое определение видовой принадлежности, выделенных в чистую культуру изолятов, проводилось по методике, предложенной Симмонсом (Simmons, 1992, 2007). На основании морфологических характеристик изолятов было выделено 3 вида: Alternaria alternata, A. infectoria, A. solani. 3.2.2. Вирулентность штаммов Alternaria sp. к сортам картофеля и томата До недавнего времени считалось, что поражать растения способен лишь крупноспоровый вид A. solani, в то время как мелкоспоровый A. alternata является вторичным фитопатогеном и способен заражать растения лишь в комплексе с A. solani, либо существовать сапротрофно на некрозах листьев и других органах, вызванных другими фитопатогенами (Орина, 2011). Однако, к настоящему времени накопились данные, что A. alternata может самостоятельно вызывать заражения (Kapsa, Osowski, 2012; Tegge, Stammler, 2014). В то же время до сих пор малоисследованными остаются вопросы 116 вирулентности и агрессивности штаммов A. alternata в отношении растений картофеля и томата. Заражение листьев проводили суспензией конидий 7 штаммов A. alternata и одним штаммом A. solani. Для заражения были взяты 13 сортов картофеля и 5 сортов томата. Методика заражения и подробности выращивания растений картофеля и томата описаны в главе Материалы и методы. Результаты заражений растений разных сортов картофеля приведены в таблице 3.7., томата - в таблице 3.8. Таблица 3.7. Патогенность выделенных штаммов, исследованная на сортах картофеля. Диаметр некроза*, мм Исследуемый сорт картофеля Невский Лад Волат Бриз Зорачка Манифест Вектор Журавинка Романо Скарб Рагнеда Янка Лилея Всего поражаемых сортов Средний диаметр некроза A. alternata картофель, листья ** картофель, клубни** томат, плод** RPL 16 18 4 3 10 3 2 8 5 0 0 0 0 0 RPL 21 20 4 3 10 3 2 0 5 2 5 0 0 0 KPT 1 15 25 6,5 30 8 3 15 0 5 20 0 7 0 KPT 4 10 24,5 10 5 15 5 0 20 20 6 20 0 5 MTF 7 8 9 10 4,1± 1,7* 4,2± 1,7 10,3 ±3,1 A. solani томат, листья** картофель, листья** METL 12 3 15 3 20 3 0 15 10 2 0 0 0 0 PPL 31 15 3 3 25 3 3 8 0 0 0 0 0 0 METL 5 10 5 10 15 4 8 20 10 10 4 20 0 0 11 7 11 8 8 10,8 ±2,6 4,6±2,4 8,9±2, 1 5,5±2, 2 7,8±2,7 10 8 10 20 7 15 5 0 0 27 0 0 0 Кол-во вирул-ых изолятов 8 8 8 8 8 7 6 5 5 5 2 1 1 * Результаты средних значений трех повторностей эксперимента; ** происхождение изолята Alternaria; RPL 16, RPL 21, KPT 1, KPT 4, MTF 7, METL5, METL 12, PPL 31 – коллекционные названия выделенных штаммов. 117 Таблица 3.8. Патогенность выделенных штаммов на сортах томата. Исследуемый сорт томата Диаметр некроза*, мм A. alternata A.solani Томат, плод Томат, листья MTF 7 METL 5 METL 12 VTL 16 Дубрава Томск Ля-ля-фам Верлиока Бычье Сердце Кол-во вирулентных изолятов 10 10 5 18 5 5 10 0 0 35 15 5 4 3 3 5 0 0 5 2 0 20 0 5 2 Всего 4 4 1 5 поражаемых Сортов Средний 6±2.1 9.6±4.5 2±2 13±6.7 диаметр некроза, мм * Результаты средних значений трех повторностей эксперимента В результате проведенного эксперимента было показано, что все исследованные изоляты A. alternata, выделенные с листьев картофеля и томата, плодов томата и клубней картофеля, инфицировали листья картофеля, а изоляты с листьев и плодов томата успешно заразили листья томата (табл. 3.8., рис. 3.12.). а б Рис. 3.12. Заражение томата сорта Бычье Сердце мелкоспоровым видом A. alternata штамм METL5 (а); картофеля сорта Бриз штаммом MELT12 (б). Результаты были статистически обработаны с использованием дисперсионного анализа (ANOVA) в программе STATISTICA. Анализ показал, что на диаметр некроза оказывают значимое влияние и сорт 118 растения, и штамм гриба и их сочетание (p<0,05). (p < 0,05 для всех вариантов). Результаты статистического анализа приведены в Приложении 1. Заражение разных сортов картофеля выявило существенные различия в вирулентности тестируемых изолятов. Так, все изучаемые изоляты смогли заразить сорта картофеля Невский, Лад, Волат, Бриз, Зорачка. Наиболее устойчивыми оказались сорта Лилея белорусская и Янка (поразились только 1 изолятом) и Рагнеда (поразилась 2 изолятами). Вместе с тем указанные сорта, а также Романо и Журавинка, не поразились изолятом A. solani (таблица 3.7.). Исследования на листьях томата показали, что только сорт Дубрава поразился всеми исследуемыми изолятами, сорта Бычье сердце и Верлиока поразились только одним из трех исследованных штаммов A. alternata и A. solani (таблица 3.8.). Ни один из выделенных изолятов не показал себя вирулентным в отношении всех исследуемых сортов картофеля. Наибольшей вирулентностью отличались 2 изолята, выделенные из клубней картофеля (KPT 1 и KPT 4), и один - из листьев томата METL 5, которые смогли заразить листья в 10-11 из 13 исследованных сортов. Наименьшей вирулентностью отличался штамм, выделенный из пораженного плода томата (MTF 7), заразивший листья 7 сортов. Изолят A. solani (PPL 31) не показал высокой вирулентности, заразив листья 8 из 13 сортов картофеля. Аналогичная ситуация наблюдалась при изучении вирулентности в отношении сортов томата. Листья всех исследуемых сортов были заражены только изолятом A. solani. Изоляты A. alternata, выделенные с плода (MTF 7) и с листа (METL 5) томата, заразили листья 4 сортов, а изолят METL 12 листья только 1 сорта (таблица 3.8.). В работе был рассмотрен только один компонент агрессивности ― диаметр некроза на зараженном листе. Исследования показали, что наиболее агрессивными в отношении листьев картофеля разных сортов были штаммы, выделенные из клубня картофеля (KPT 1 и KPT 4) и METL 5 из листа томата 119 (средний размер диаметра некроза у всех пораженных сортов составил 8,910,8 мм). Эти же штаммы были вирулентны в отношении максимального числа сортов картофеля (поражали листья 10 - 11 сортов, таблица 3.7.). Изоляты METL 5 и KPT 4 вызвали значительные некрозы (диаметром по 20 мм) на листьях сорта Рагнеда, который не поразился другими изолятами, включая A. solani. Изолят KPT 4 был единственным, заразившим сорт Лилея белорусская, а KPT 1 - сорт Янка. Сильные отличия в диаметрах некрозов отмечены и при заражении сортов томата (таблица 3.8.). Штамм METL 12 заражал листья сорта Дубрава, но не инфицировал остальные сорта. Штамм METL 5 вызывал сильное поражение листьев сортов Дубрава и Бычье сердце (диаметры поражения 18 20 мм), а штамм A. solani значительно поражал сорт Дубрава (диаметр - 35 мм). Результаты проведенных экспериментов показали наличие внутривидовых различий в вирулентности и агрессивности у A. alternata в отношении листьев разных сортов картофеля и томата. Некоторые изоляты заражали сорта, не поражаемые другими изолятами, что может свидетельствовать об экспрессии генов специфической устойчивости к A. alternata у исследованных сортов картофеля и томата. 3.2.3. Изучение активности сериновых протеиназ, секретируемых двумя различающимися по вирулентности штаммами A. alternata На двух штаммах, различавшихся по патогенности, нами совместно с институтом биохимии имени А.Н. Баха РАН проводилось изучение активности сериновых протеиназ. Данная работа осуществлялась в связи с тем, что большую роль в питании фитопатогенов, к которым относятся и возбудители альтернариоза, играют секретируемые во внешнюю среду гидролитические ферменты, которые делают макромолекулярные соединения доступными для использования в пищевых целях. К группе гидролитических ферментов относятся и протеазы. Внеклеточные протеазы, 120 выделяемые грибами, способны мацерировать ткани растения и разрушать компоненты клеточной стенки, что позволяет преодолевать естественную резистентность растения-хозяина. Таким образом, они выполняют функцию не только пищеварительных ферментов грибов, но и во многих случаях участвуют в процессе патогенеза (Dunaevskii et al., 2006). В настоящее время имеются данные, позволяющие предположить, что сериновые экзопротеиназы, секретируемые некоторыми растительными патогенными грибами, могут рассматриваться как факторы патогенности. Так, в работе (Dunaevskii et al., 2006) было показано, что фитопатогенные грибы, в том числе и A. alternata, секретируют в окружающую среду трипсиноподобные и субтилизиноподобные протеазы. Хотя синтез протеиназ – конститутивный, спектр протеаз фитопатогенных видов, в том числе и некротрофных, должен отличаться от спектра протеаз сапротрофов. Проведенная работа показала (табл. 3.9.), что различия в активности сериновых протеиназ наблюдаются не только на межвидовом, но и на внутривидовом уровне и связаны с вирулентностью и агрессивностью штаммов. Таблица 3.9. Динамика секреции сериновых протеиназ штаммами METL 5 и METL 12. Активность сериновых протеиназ, U*^ сухого мицелия Штамм Сутки роста METL 12 METL 5 Трипсиноподобная (субстрат BApNa) 5 10 18 8** 162 4,2 0 298 2,9 Субтилизиноподобная (субстрат Z-AAL) 5 10 18 22 14092 433 46 1635 36 * U - количество фермента, которое гидролизует 1 ПМ субстрата за 1 мин. ** - представлены данные, усредненные по 3-м повторностям. Биохимический анализ показал, что динамика секреции сериновых протеиназ была схожей для обоих штаммов: повышение активности с 5 до 10 суток роста и резкий спад к 18 суткам. У обоих изолятов максимальная 121 активность секретируемых протеиназ наблюдалась на 10 сутки роста (табл. 3.9.). Оба изолята, исследованные по активности, были выделены из живого листа томата с симптомами поражения альтернариозом. Возможно, различия в секреции трипсиноподобных и субтилизиноподобных протеиназ связаны с различиями штаммов по трофической приуроченности: более патогенный с высоким уровнем трипсиноподобной активности штамм METL 5 способен поражать живые ткани листьев, а значительно менее агрессивный и вирулентный METL 12 с высоким уровнем субтилизиноподобной активности, развивается на отмершей ткани и активно утилизирует субстрат как сапротроф. Полученные нами данные соответствуют результатам других исследователей. Так, в работе Дунаевского и др. (2006) показано, что сапротрофные Penicillium виды Trichoderma chrysogenum harcianum, отличаются Penicillium высокой terlikowskii, активностью субтилизиноподобных протеиназ и не производят трипсиноподобные протеиназы, в то время как фитопатогенные виды Alternaria alternata, Botrytis cinerea, Ulocladium botrytis наряду с субтилизиноподобной производят и трипсиноподобную протеиназу. По мнению Дунаевского и др. (2006) высокий уровень трипсиноподобной активности внеклеточных сериновых протеиназ наблюдается у изолятов с высокой патогенностью, в связи с чем этот показатель может использоваться в качестве маркера при исследовании вирулентности и агрессивности разных видов грибов. Наша работа показывает, что секреция трипсиноподобных протеиназ связана с патогенностью и на внутривидовом уровне. 3.2.4. Определение нуклеотидных последовательностей видов Alternaria После идентификации видов по морфологическим признакам было проведено определение нуклеотидных последовательностей 2-х участков генома: 122 1) Участок ядерных рибосомных генов: часть малой (18S), большой (26S) и 5,8S субъединиц рДНК, а также межгенные транскрибируемые спэйсеры (ITS) (рис. 3.13.). Рис. 3.13. Схема строения ядерных рибосомных генов (стрелками обозначена локализация ITS5- ITS4 праймеров). 2) Участок гена митохондриальной большой субъединицы рДНК. Эти два участка широко используются при исследованиях разных видов грибов, в т.ч. и рода Alternaria (White T.J. et al, 1990; Ma, Michailides, 2004; Luo et al., 2007; Peever et al., 2004). 3.2.4.1. Анализ нуклеотидных последовательностей ядерных рибосомных генов Для секвенирования ITS участка отобраны образцы ДНК 9 штаммов A. solani, 25 штаммов A. alternata и единственного штамма A. infectoria, выделенных из растений картофеля и томата из разных регионов России. По результатам секвенирования длина определенных нуклеотидных последовательностей ITS региона составила 595 пн для A. alternata, 605 пн для A. solani, 627 пн для A. infectoria (включая последовательности праймеров). Полученные последовательности были секвенированные депонированы в базу нуклеотидные данных ГенБанк (табл.3.10.). Анализируемые последовательности штаммов были почти идентичными за исключением одной делеции основания Т в 508 положении, которая присутствовала только у двух штаммов TPL50 и PPL23 (рис. 14.). Рис. 3.14. Фрагмент последовательности секвенированных ITS участков генома мелкоспоровых изолятов Alternaria. 1 - 5’-3’ нуклеотидная последовательность рДНК, идентичная для большинства мелкоспоровых штаммов, 2 - нуклеотидная последовательность рДНК штаммов TPL50 и PPL23 с делецией. 123 Таблица3.10. Номера последовательностей ITS регионов в ГенБанке. Вид A. solani A. alternata A. infectoria Название штамма Номер в ГенБанк 104-021 KJ538958 104-031 KJ538959 043-021 KJ538961 044-011 KJ538960 A07AhTL14ё/2 KF998550 A07AhTL125 KF709040 A07AHTF11a KF998551 A07MykTL41/2 KF709035 A07MeTL31/2 KF709036 A07MeTL49/2 KF998552 A08TPL50 A7METL12b A08TPL8a A10PKL44 106-021 A10KPLu3b KF998553 KF998554 KF998555 KF998556 KF998557 KF998559 A10PKL23 KF709043 128-021 KF709044 146-021 KF709045 A10KPLu9 KF709046 A08TPL21 KF709047 A10KPL6 KF709048 A08TPL61 KF998549 A10KPL10 KF709037 A10KPL6 KF709038 A10KPL15 KF709039 A10KPL11a KF709041 A10KPL64 KF709042 A10KPL9 KF709048 A07MPL06-3 KJ538950 A07AHTF1g A07NPL5 KJ538951 KJ538952 A07MistTL3/1 KJ538953 A. alternata clone KU182490 10KKLU5a KF998558 124 Последовательности нуклеотидов ITS штаммов A. solani также были идентичны у пяти из шести исследованных штаммов, за исключением трех замен С→G в 48, 56 и 72 положениях и вставки С в положении 73 у штамма 104-031, а также делеции Т в 520 положении у штамма A07AhTL14ё/2 (рис. 3.15.). Рис. 3.15. Фрагмент последовательности секвенированных ITS участков генома крупноспоровых изолятов Alternaria. 1- 5’-3’ нуклеотидная последовательность ДНК, идентичная для большинства крупноспоровых штаммов, 2 - нуклеотидная последовательность ДНК штамма 104-031 с заменами. ITS последовательность принадлежащего к виду участка A. infectoria, генома штамма значительно 10KKLU5a, отличалась от последовательностей остальных штаммов (рис. 3.16.). При сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей ITS крупноспоровых и мелкоспоровых штаммов Alternaria (рис. 3.17.) выявлены значительные различия в последовательностях ДНК, а именно делеции, замены и вставки. У мелкоспоровых штаммов обнаружено 11 делеций, из них три del – 3 G, 5 C и 3 Т. Делеции A не было найдено. У крупноспоровых штаммов, наоборот, были выявлены три случая делеции – del A, других делеций не обнаружено. У мелкоспоровых штаммов выявлено 13 замен – это 4 однонуклеотидные замены С→Т, С→А (4) и по одной А→Т, Т→G, Т→С, С→G и G→Т. Обнаружена одна вставка 7 Т в положении c 505 по 511. 125 Рисунок 3.16. Сравнение ITS5-ITS4 последовательностей мелкоспоровых (Query) и A. infectoria (Sbjct) штаммов с помощью алгоритма BLAST. В результате мелкоспоровых (Query) сравнительного и A. infectoria анализа (Sbjct) последовательностей штаммов обнаружено присутствие у штамма A. infectoria 33 вставки нуклеотидов (одна из них длиной в 20 пн.), 3 делеции – A, C, T и 28 замен (1- , 2-х и 3-х-нуклеотидные). 126 Рис. 3.17. Сравнение ITS последовательностей штаммов A. solani (Query) и A. alternata (Sbjct). Сравнение последовательностей ITS A. solani и A. alternata также показало существенные отличия между ними. Анализ секвенированных последовательностей с помощью алгоритма BLAST выявил высокую степень гомологии (> 98%) с последовательностями тех же групп видов Alternaria (крупно - или мелкоспоровых), депонированными в базу ГенБанк другими исследователями. 127 3.2.4.2. Анализ последовательности нуклеотидов участка гена mt LSU рДНК В работе проанализированы последовательности 7 штаммов A. alternata (A10KPL6, A08TPL21, A10KPL9, A10PKL44, A08TPL50, 146-021, 128-021) и 7 штаммов A. solani (044-011, A10KPL11a, A07AhTL14ё/2, 104-031, 043-021, A07MeTL31/2, A07MykTL41/2). Нуклеотидные последовательности мелкоспоровых штаммов были почти идентичными. Небольшие отличия имел только штамм A08TPL21, у которого были обнаружены две однонуклеотидные замены основания Т→А в позициях 389 и 391, и замена А→Т в позиции 390 (рис. 3.18.). Рис. 3.18. Фрагменты последовательности участка гена mt LSU рДНК A. alternata. 15’- 3’ нуклеотидная последовательность ДНК, идентичная для большинства мелкоспоровых штаммов, 2 - нуклеотидная последовательность ДНК штамма A08TPL21 с тремя заменами. Анализируемые последовательности исследованных штаммов A. solani были идентичными за исключением двух замен основания Т→G в 15 и 46 положениях и C→G в 128 положении у штамма A07AhTL14ё/2 (рис. 3.19.). Рис. 3.19. Фрагменты последовательности участка гена mt LSU рДНК изолятов A. solani. 1,3,5 - 5’- 3’ нуклеотидные последовательности ДНК, идентичные для большинства штаммов A. solani, 2,4,6 - нуклеотидные последовательности ДНК штамма с заменами. 128 Значительно более существенные отличия были выявлены между A. solani и A. alternata штаммов (рис. 3.20.). Рис. 3.20. Сравнение последовательностей участка гена mt LSU рДНК A. solani (Query) и A. alternata (Sbjct) штаммов. У крупноспоровых штаммов обнаружено 13 однонуклеотидных делеций (3 G, 7 A и 3 Т). У мелкоспоровых штаммов делеций не обнаружено, однако выявлено 4 замены: 2 - однонуклеотидные замены A→Т и по 1–ой Т→G и Т→С. На участке в положении 391 по 399 выявлена вставка 7 G. Таким образом, анализ различий на основе последовательностей ITS и участка гена mt LSU рДНК позволяет сделать заключение, что уровень делеций приблизительно одинаков, но в первом случае делеции встречаются только у мелкоспоровых штаммов, а по участку гена mt LSU рДНК - только у крупноспоровых штаммов. При сравнительном анализе различий по ITS 129 последовательностям выявляется больше замен у штаммов A. alternata (13 замен) по сравнению с 4 заменами при анализе последовательности по участку гена mt LSU рДНК. Тем не менее, последовательности обоих участков дают достаточно информации для сравнительного анализа крупноспоровых и мелкоспоровых штаммов и могут быть использованы при молекулярно - генетических исследованиях видов рода Alternaria на картофеле и томате. По полученным секвенированным последовательностям ДНК мелкоспоровых и крупноспоровых штаммов было установлено, что максимальное количество выявленных однонуклеотидных делеций обнаружено у крупноспоровых штаммов при анализе последовательности участка mt LSU рДНК, а у мелкоспоровых – при анализе ITS участков. Проведенный в нашей работе комплексный анализ секвенированных последовательностей двух выбранных участков генома Alternaria (ITS - и mt LSU участков рДНК) на картофеле и томате, в России был выполнен впервые. Полученные данные согласуются с результатами других исследователей (Edin, Andersson, 2014; Leiminger et al., 2014). 3.2.5. Подбор праймеров для идентификации видов Alternaria и проверка их видоспецифичности Целью данного раздела нашей работы являлось создание праймеров для идентификации трех видов Alternaria методом видоспецифичной ПЦР. В качестве мишени для конструирования праймеров в геномах этих видов был выбран регион ITS. Выявленные полиморфные и консервативные локусы между нуклеотидными последовательностями видов этого участка генома подходят для подбора специфических праймеров. Подбор праймеров проводили с помощью программы Oligo. Для всех трех видов к исследуемому региону были подобраны пары праймеров: прямой праймер ITS5 ( 5' – GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG) общий для двух видов A. solani и A. alternata, обратные видоспецифичные 130 праймеры были гомологичны нуклеотидным последовательностям ITS1 участка (табл. 3.11., рис. 3.21.). Данная работа выполнялась совместно с С.Н. Еланским. Табл.3.11. Последовательности праймеров для Alternaria sp. Рис. 3.21. Локализация подобранных видоспецифичных обратных праймеров для амплификации A. solani и A. alternata. 131 Для вида A. infectoria последовательности прямого праймера гомологичны участку ITS1, обратного - ITS2 (табл. 3.12., рис.3.22.). Таблица. 3.12. Последовательности праймеров для Alternaria infectoria. Рис. 3.22. Места посадки подобранных видоспецифичных прямого и обратного праймеров для амплификации A. infectoria. Пары праймеров подбирались таким образом, чтобы фланкированные ими участки генома, составили 505 пн для A. solani, 516 для A. alternata и 123 пн для A. infectoria. Сконструированные праймеры были протестированы на специфичность и чувствительность. Специфичность наборов праймеров была проверена на ДНК целевых культур и подтверждена отсутствием ПЦР продукта при амплификации ДНК видов патогенов, также встречающихся у пасленовых культур: Cladosporium fulvum, Phytophthora infestans, и на ДНК оздоровленного растения картофеля (рис. 3.23.). 132 Рис. 3.23. Специфичность и чувствительность амплификации: a- A. alternata, b- A. solani, c- A. infectoria, M- Маркер длин фрагментов 1 kb DNA Ladder. Эффективность амплификации была подтверждена с помощью серий разведений ДНК целевых видов. Минимальная концентрация геномной ДНК для амплификации составляет 1 нг/мкл для ITS5-MR, 100 пг/мкл для ITS5-SR (A. solani) и 50 пг/мкл для Inf.pr-inf.obr (A. infectoria). 3.2.6. Разработка диагностических систем для идентификации видов Alternaria с использованием ПЦР в реальном времени (РВ ПЦР) На первом этапе эксперименты в реальном времени проводились с ранее разработанными праймерами для стандартной ПЦР с использованием красителя SYBER Green. Однако, результат не удовлетворял условиям РВ ПЦР, так как амплифицированный продукт (500 пн) во много раз превышал размер оптимального (100-200 пн) для этого метода. Поэтому были разработаны специфичные к видам Alternaria праймеры и зонды на основе красителя FAM с гасителем флуоресценции RTQ1 (табл. 3.13., рис. 3.24.). Синтез праймеров и зондов проводили в компании Синтол. 133 Для подбора праймеров и зондов использовали нуклеотидные последовательности ITS региона ДНК чистых культур возбудителей альтернариоза Alternaria sр. из коллекции, собранной автором (депонированы в базе данных ГенБанк (www.ncbi.nlm.nih.gov), номера последовательностей приведены в главе 3.4.4.1.). Всего было проанализировано около 30 нуклеотидных последовательностей. Анализ последовательностей и подбор праймеров и зондов проводили с помощью программы “Primer 3”. При этом учитывалось условие наименьшей комплементарности конкретного участка рДНК аналогичным участкам других видов. Длина фрагмента ДНК, амплифицированного в процессе реакции для A. solani, составила 152 пн и 127 пн для A. alternata. Таблица 3.13. Наборы праймеров и зондов, идентификации с помощью ПЦР в реальном времени. Праймеры Последовательность A.sol.F 5’-GCCCACCACAAGGACCAACC A.sol.R 5’-ATCGATGCCAGAACCAAGAG A.alt.F 5’-TTCGCCCACCACTAGGACAAACA A.alt.R 5’-ATCGATGCCAGAACCAAGAG A.inf.F 5’-CACTGCTTCACGGCGTGCG A.inf.R 5’-GTTTGTGGTTGGTCCTGAGG разработанные для Зонды (FAM)-TTACTGACGCTGATTGCCATTGC-(RTQ1) (FAM)-TTACTGACGCTGATTGCAATTACA-(RTQ1) (FAM)-TGAATAATTCAGCAGGGCCGG-(RTQ1) 134 Рис. 3.24. Локализация зондов, прямых и обратных праймеров для видов Alternaria. В процессе оптимизации ПЦР «в реальном времени» для каждого из сконструированных зондов подбирали температурный режим, количество и продолжительность циклов амплификации, концентрацию зондов и праймеров. Температуры отжига зондов тестировались в диапазоне температур 60-65C, концентрация зонда варьировала от 5 мкМ до 15 мкМ. Оптимальной концентрацией зонда было установлено значение 10 мкМ на 20 мкл объема реакционной смеси. При других концентрациях эффективность реакции существенно снижалась и составляла менее 80%. Реакцию проводили с использованием набора GenPak® Real-Time PCR Core (ООО «Изоген», Москва) и были определены следующие температурновременные условия: 135 Протокол для A. alternata: 1) 950C 3мин, 2) 950C 15 сек, 3) 620C 30 сек + детекция, 4) 720C 10 сек, 5) назад на 2 шаг, 39 циклов, Протокол для A.solani: 1) 950C 3мин, 2) 950C 15 сек, 3) 650C 40 сек, 4) 720C 10 сек + детекция, 5) назад на 2 шаг, 39 циклов, Для проверки специфичности разработанных тест-систем были проведены контрольные реакции для ДНК патогенов картофеля, выделенной из коллекционных культур. Для этого проводили ПЦР в реальном времени с использованием специфичных зонда и праймера для A. solani и образцов ДНК разных видов (рис. 3.25.). Рис. 3.25. Контрольные реакции для избирательной амплификации A. solani. Синий график накопления ДНК - A. solani, зеленые –A. alternata и A. infectoria. Красным цветом обозначен отрицательный контроль. 136 На рисунке 3.26. представлен результат ПЦР в реальном времени с подобранной тест-системой для А. solani, с ДНК, выделенной из разных штаммов A. solani и чистых культур других видов грибов. Из него следует, что амплификация прошла только с целевой ДНК. Рис. 3.26. Контрольные реакции для избирательной амплификации A. solani. Синие линии – чистые культуры целевого вида, красные линии - негативный контроль. Серые линии – ДНК чистых культур видов Phytopthora infestans, Cladosporium sp, Colletotrichum coccodes, Fusarium oxysporum, Septoria lycopersici. К виду А. alternata также была разработана тест-система для ПЦР в реальном времени. Проведены контрольные реакции в нескольких повторностях с ДНК целевого вида, выделенного из чистой культуры, а также с ДНК A. solani. На рисунке представлен результат ПЦР в реальном времени с подобранной тест-системой. Как видно, амплификация прошла только с ДНК А. alternata, а нецелевые виды грибов не давали позитивных сигналов амплификации. В дальнейшем, проводился подбор условий для амплификации в реальном времени (в нескольких повторностях) для отработки применимости разработанных тест- систем при идентификации выделенной ДНК из пораженных листьев картофеля. В качестве исследуемых были взяты ДНК, выделенные из чистой культуры A. alternata, и полученные из образцов 137 листьев картофеля, пораженных альтернариозом. Для контроля использовался образец ДНК, выделенный из оздоровленного растения картофеля. Анализ полученных спектров флуоресценции подтвердил, что подобранная система идентификации позволяет обнаруживать целевую ДНК A. alternata не только в чистых культурах (рис.3.27.), но и в изолятах из листьев больных растений (рис. 3.28). Рис. 3.27. Контрольные реакции для избирательной амплификации A. alternata. Зеленая линия - A. alternata, синяя линия A. solani. Красная линия – отрицательный контроль. 138 Рис. 3.28. Подбор условий амплификации A. alternata. Синим цветом обозначены графики накопления ДНК чистых культур A. alternata, зеленым – избирательная амплификация целевой ДНК в образцах листьев картофеля. Зеленая линия, лежащая у базовой линии, принадлежит ДНК, полученной из листьев оздоровленного растения картофеля. Красная линия – отрицательный контроль. Для качественного и эффективного проведения РВ-ПЦР с подбором необходимых условий реакции следует иметь стандарты, которые представляют собой раститровку исследуемой ДНК известной концентрации или молярности. Для этого амплифицированная с подобранными праймерами ДНК штаммов A.solani (104-031 и A08TPL18а) была клонирована в pAL2-T вектор с помощью лигазы (методика подробно описана в главе Материалы и методы). Из выделенной плазмидной ДНК путем серийного разведения были получены стандарты (10-1, 10-2, 10-3 и 10-4) и проведены реакции с серией десятикратных разведений (рис. 3.29.). 139 Рис. 3.29. Подбор стандартов и концентрации зонда для A.solani. Для дальнейших реакций были использованы разведения 10-2, 10-3 (рис.3.30.) Рис. 3.30. Стандартные кривые отобранных концентраций в логарифмической шкале. 140 4.1. Молекулярная идентификация видов Alternaria alternata и A. solani в пораженных листьях с использованием ПЦР в реальном времени Реакция идентификации была проведена для ДНК листьев картофеля и томата с симтомами альтернариоза. Все амплификации проводились в присутствии стандартов реакции (рис. 3.31.), которые служили как в качестве положительного контроля, так и для оценки относительного количества ДНК Alternaria sp. в растительном материале. Рис. 3.31. Графики накопления ДНК при РВ-ПЦР идентификации A. alternata в листьях томата и картофеля. В реакции использованы образцы листьев томата № 2, 3, 7, 11, 37- из Ростовской области и картофеля № 57, 64 - из Ставропольского края; № 178, 183, 185, 224 – из Воронежской области; № 227, 229, 230, 231- из Респ. Северная Осетия) обозначены зеленым цветом. Синим цветом обозначены кривые стандартов реакции, красным - отрицательные контроли. 141 Рис. 3.32. Графики накопления ДНК при РВ-ПЦР идентификации A. alternata в листьях томата и картофеля, отображенные в логарифмической шкале. Из рис. 3.32. следует, что A. alternata идентифицировалась во всех исследованных образцах картофеля и томата, за исключением №2 у томата. Рис. 3.33. Стандартная прямая, построенная по значениям порогового цикла (Ct), а также полученные параметры реакции. При проведении анализа графиков накопления ДНК необходимо учитывать наиболее важные параметры (эффективность реакции, наклон стандартной прямой, коэффициент корреляции). Коэффициент корреляции R2 является мерой того, насколько точно полученные в эксперименте данные 142 соответствуют стандартной кривой. Значение R2 отражает линейность стандартной кривой. В идеале, R2 = 1, что соответствовало результату реакции. Наклон стандартной прямой является мерой эффективности реакции. Чтобы получить точные и воспроизводимые результаты, реакция должны иметь эффективность близко к 100%, что эквивалентно наклону прямой -3,32. Эффективность реакции (Е) определялась по следующей формуле: Е = 10 -1 / коэффициент наклона калибровочной линии Высокая эффективность реакции считается в диапазоне от 90 -105 %, , что соответствует наклону прямой между -3,58 и -3,10. В нашем случае эффективность Е=92,8%, наклон прямой – (-3,509), R2 =1 (рис. 3.34.). Полученные результаты демонстрируют высокую специфичность и эффективность амплификации при детекции ДНК патогена A. alternata в изолятах пораженных листьев томата. После проведения ПЦР в реальном времени продукты реакции регистрировали также и с помощью электрофореза (рис. 3.35.). Рис. 3.35. Электрофореграмма результатов амплификации. 1- 8 - стандарты реакции, 2 - 11 - образцы ДНК листьев томата из Ростовской области, M -маркер длин фрагментов M50 с шагом 50 пар оснований. 143 Таким образом, при использовании подобранных параметров температуры отжига зондов (62С) и их концентрации 0,5 мкМ на мкл, значения порогового цикла для каждого образца ДНК оставались неизменными. После проведения РВ – ПЦР были определены значения порогового цикла реакции (Ct – threshold cycle), которые отражают точки пересечения графика накопления ДНК и пороговой линии (threshold line). Значение Ct строго коррелирует с начальным количеством ДНК в пробе. Между этими величинами существует обратно - пропорциональная зависимость: чем больше значение Ct, чем позже сигнал флуоресценции поднимается выше порогового уровня, тем меньше ДНК в пробе; маленькое значение Ct – много ДНК в пробе (Ребриков и др., 2009). Полученные различия Ct могут быть результатом изначально разных количеств ДНК исследуемых образцов или коэффициентов α (неизвестный коэффициент пропорциональности), т.к. эффективность (Е) одинакова (рис. 3.36.). Рис. 3.36. Графики, отображающие значение порогового цикла амплификации исследованных образцов. У образцов, в которых флуоресценция не поднимется выше порогового уровня, гистограмма отсутствует. 144 Аналогичные реакции проводились для идентификации A. solani в листьях томата и картофеля (рис. 3.37.). Рис. 3.37. Графики накопления ДНК для РВ - ПЦР идентификации A. solani в листьях томата и картофеля. В реакции использовались образцы листьев картофеля № 71, 72 из Ставропольского края; № 179, 184, 186, 187 - из Воронежской области; № 225, 227, 229 из Респ. Северная Осетия; томата № 177 из Воронежской области. Синим цветом обозначены кривые стандартов реакции, красным - отрицательные контроли. Рис. 3.38. Графики накопления ДНК РВ-ПЦР идентификации A. solani в листьях томата и картофеля, отображенные в логарифмической шкале. 145 Рис. 3.39. Стандартная кривая, построенная по значениям порогового цикла (Ct) и параметры реакции. Положительный результат амплификации был детектирован в образцах № 179, 225, 227, 229. Эти результаты были подтверждены с помощью электрофореза (рис. 3.40.). Рис. 3.41. Электрофореграмма результатов амплификации. № 179, 184, 186, 187- из Воронежской области; № 225, 227, 229 из Респ. Северная Осетия; томата № 177 из Воронежской области, M - маркер длин фрагментов M50 с шагом 50 пар оснований. Таким образом, в результате проделанной работы нами были подобраны праймеры и зонды для ПЦР в реальном времени, которые позволяют проводить экспресс - идентификацию ДНК A. solani и A. alternata в растительном материале. Данный метод по сравнению с классическим ПЦР сокращает время проведения исследования, а также обладает повышенной чувствительностью, что позволяет проводить детекцию грибной ДНК в 146 листьях при ранних симптомах заболевания. Полученные тест - системы также можно использовать для оценки количества ДНК видов Alternaria в инфицированных полевых образцах. 4.2. Молекулярная идентификация видов Alternaria в пораженных листьях методом классической ПЦР Сконструированные праймеры для классической ПЦР были применены для тестирования ДНК из пораженных листьев картофеля и томата. Образцы электрофореграмм, полученных с помощью разработанных праймеров, приведены на рис. 3.42. Рис. 3.42. Идентификации видов Alternaria в пораженных листьях с помощью диагностических праймеров. ITS5/MR- специфичные праймеры для A. alternata , ITS5/SR - для A. solani, Inf.pr/inf.obr – для A. infectoria, М – DNA ladder 1kb., 1-20- образцы ДНК тестированных листьев картофеля из ВНИИКХ (представлена часть электрофореграммы). Работа выполнена совместно с С.Н. Еланским. Виды A. solani, A. infectoria и A. alternata были обнаружены в образцах листьев картофеля и томата практически во всех исследованных регионах России (табл. 3.14.). В части образцов пораженных листьев картофеля выявлено одновременное присутствие этих видов. В образцах 5 и 9 не выявлено A. infectoria, а в образце 10 - A.solani. 147 Табл. 3.14. Встречаемость видов возбудителей альтернариоза на листьях картофеля из различных регионов России. Номер 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Регион России, место сбора Московская обл., пос. Коренево, Московская обл., Захарово, поc. Раменки Костромская обл., с. Нежитино Костромская обл., с. Минское Рязанская обл., д. Ардабьево Респ. Татарстан, Казанский р-н Респ. Северная Осетия, с. Михайловское Воронежская обл., Панинский р-н, Число исследованных образцов только А. s. Число образцов, в которых обнаружены виды Alternaria совместно совместно только только совместно не А. s. + A.alt. + обнаружено А. alt. A. inf. А.s.+A.inf. A.alt. A.inf. 9 8 2 1 3 0 2 21 17 5 2 9 1 12 0 11 1 1 1 1 0 3 17 4 2 2 4 10 12 3 6 0 0 0 0 3 78 10 25 2 0 3 0 38 0 1 0 0 5 2 0 8 12 1 2 3 2 0 2 14 0 0 1 0 6 0 4 2 0 0 2 0 56 115 17 8 27 12 71 25 67 15 42 8 28 Ставропольский кр., КВНС* Краснодарский край, Анапский район, ст. Благовещенская 23 Всего 306 8 КВНС - Кисловодская высокогорная научная станция, гора Шатжатмас. 148 В работе представлены результаты исследований 10 посадок картофеля из 8 регионов России. В большем количестве образцов ДНК из листьев картофеля, собранных 2011-2014 гг. был выявлен мелкоспоровый вид A. alternata, который составил 37% и присутствовал во всех исследованных регионах. Крупноспоровый вид A. solani определен в 18% образцах ДНК и встречался на листьях картофеля в Московской, Костромской, Рязанской, Воронежской областях, Республиках Татарстан и Северная Осетия, Ставропольском крае и не встречался в Краснодарском крае. A. infectoria была обнаружена в 6% образцов и не встречалась в образцах в Ставропольском крае и Рязанской области. Отдельно учитывались случаи одновременного присутствия двух видов в одном образце, которые суммарно составили 16%. Комплекс A. solani и A. alternata, выявленный в 9% исследованных образцов, обнаруживался повсеместно, за исключением Рязанской области и Краснодарского края. В 4% случаев в одном образце присутствовали виды A. alternata и A. infectoria, и лишь в 3% образцов - A. solani и A. infectoria (рис. 3.43.). В 23% исследованных образцов листьев с симптомами пятнистостей не было выявлено возбудителей альтернариоза. Рис.3.43. Соотношение видов Alternaria в пораженных листьях картофеля. 149 Табл. 3.15. Встречаемость видов возбудителей альтернариоза на листьях томата из различных регионов России. Число образцов, в которых обнаружены виды Alternaria число исследованных образцов только А. s. Только А. alt. только A. inf. совместно А.s.+A.inf. совместно А. s. + A.alt. совместно A.alt. + A.inf. 20 6 8 0 0 6 0 10 2 6 0 0 1 0 13 0 7 1 0 0 0 Краснодарский край, Туапсинский р-н 20 7 4 2 0 1 0 Краснодарский край, Анапский р-н 22 8 5 2 0 2 0 Ростовская обл., Армавирский р-н 13 0 6 2 1 0 1 Ставропольский кр., КВНС 17 6 0 0 0 0 0 Всего 115 29 36 7 1 10 1 Регион России, место сбора Московская область, д. Волково Татарстан, Казанская область Ростовская обл. не обнаружено 0 1 5 6 5 3 11 31 150 При изучении встречаемости видов Alternaria на листьях томата обнаружились аналогичные результаты. Всего было исследовано 115 образцов листьев с 7 посадок томата в открытом грунте из 5 регионов России. В большинстве случаев (31%) обнаружена A. alternata. Однако данный вид не был выявлен в образцах из Ставропольского края. A. solani определен в 25% образцов ДНК, но не встречался в 2-х исследованных посадках в Ростовской области. A. infectoria была обнаружена в 6% образцах в Рязанской области, а также Краснодарском крае (табл. 3.15.). Совместное присутствие видов выявлено в 11% всех исследованных образцов, причем снова преобладал комплекс A. solani + A. alternata (9%). Встречаемость комплексов A. alternata + A. infectoria и A. solani + A. infectoria составляла по 1% в каждом случае. В 31 случае (27%), в листьях с симптомами пятнистостей не было выявлено возбудителей альтернариоза (рис. 3.44.). Рис. 3.44. Соотношение видов Alternaria в пораженных листьях томата. Таким образом, наличие видов Alternaria было исследовано в 421 образце листьев томата и картофеля, в том числе 115 образцах томата и 306 образцах картофеля. 151 Согласно литературным данным в качестве основного возбудителя альтернариоза пасленовых культур указывается A. solani (Dang et al., 2015). В то же время, наши результаты показывают, что вид А. alternata (sensu lato), в целом, чаще встречался в исследованных образцах картофеля и томата. Крупноспоровый вид А. solani в Московской области и в Краснодарском крае превосходил по встречаемости остальные виды, как в пораженных листьях картофеля, так и томата. В то же время вид не был обнаружен на листьях томата в Ростовской области и картофеля в Анапском районе Краснодарского края. Вид A. infectoria встречался значительно реже, был выявлен не во всех исследованных образцах. Однако, были обнаружены образцы, в которых встречался только этот вид, что свидетельствует в пользу возможности самостоятельного заражения растений штаммами A. infectoria. Наличие большого количества пораженных образцов с симптомами альтернариоза, в которых не было выявлено грибов рода Alternaria может объясняться тем фактом, что схожие симптомы пятнистостей были вызваны другими возбудителями (Cladosporium fulvum, Xantomonas sp. и пр.). Данная работа по идентификации возбудителей альтернариоза и изучению их распространенности на территории Российской Федерации с помощью ПЦР проводилась впервые. Работы, проводимые ранее, по изучению видов Alternaria с помощью исследования чистых культур показали схожие результаты (Ганнибал и др., 2010). Однако, нами не был обнаружен вид A. tomatophyla, описанный как основной патоген томата (Simmons, 2007). Полученные нами праймеры могут использоваться для диагностики видов Alternaria и способствовать идентификации данных видов в случаях, когда патогены образуют похожие симптомы поражения или если их идентификация по морфологическим признакам вызывает затруднения. 152 4.3. Идентификация Colletotrichum coccodes с помощью ПЦР. Colletotrichum coccodes вызывает заболевания, известные под названием антракноз (язвы на корнях, стеблях и плодах) и черная пятнистость (симптомы типа "серебристая парша" на клубнях). Общим для всех типов поражений, вызываемых C. coccodes является наличие точечных черных склероциев на пораженных тканях. ДНК этого вида также была найдена нами среди клонированных фрагментов ДНК листьев картофеля. Для избирательной амплификации C. coccodes выбраны праймеры, разработанные шотландскими исследователями (Cullen et al., 2002, таблица 3.16.). Данная пара праймеров подобрана к ITS региону рДНК и в их работе применялась во втором раунде nested ПЦР, после амплификации ITS региона. Таблица 3.16. Праймеры для избирательной амплификации C. coccodes Название праймера Cc1NF1 Cc2NR1 Последовательность Температура отжига, Авторы TGCCGCCTGCGGACCCCCCT GGCTCCGAGAGGGTCCGCCA 66 Cullen et al, 2002 Для наших исследований выбранный набор праймеров использовался для видоспецифичной ПЦР ITS региона в одном раунде. С помощью данного набора были амплифицированы ДНК из чистых культур C. coccodes, выделенных нами из клубней картофеля. Амплифицированный фрагмент составил 349 пн. Отрицательный результат получен на выборке других грибных патогенов картофеля и томата (рис. 3.45.). 153 Рис. 3.46. Электрофореграмма контрольных ПЦР амплификаций с праймерами Cc1NF1/Cc2NR1. Данный набор праймеров был проверен в амплификации с образцами ДНК, выделенных из здоровых и пораженных клубней (рис. 3.47.). Рис. 3.47. Электрофореграмма амплифицированных фрагментов ДНК C. сoccodes. 1-5 - клубни сорта Удача без симптомов поражений из Костромской области, 6 -11 пораженные клубни разных сортов из Гусь-Хрустального, 12-14 - клубни сорта Джелли, без симптомов поражений из Брянской области, 15 - 16 – положительный контроль. В результате амплификация прошла успешно с ДНК из пораженных антракнозом клубней и наблюдалось отсутствие продукта амплификации с ДНК здоровых клубней. Вероятно, в части клубней сорта Удача из Костромской области существовало скрытое поражение указанным патогеном и амплификация прошла с 1- 3 образцами. Праймеры также были протестированы для амплификации с ДНК 89 образцов, выделенных из 154 пораженных листьев картофеля, томата и паслена (табл.3.17.). Часть электрофореграммы, полученных ампликонов, приведена на рис. 3.48. Рис. 3.48. Электрофореграмма амплифицированных фрагментов ДНК C. coccodes, выделенных из фиксированных в спирте образцов листьев томата (№ 1-11) из Ростовской области. Таблица 3.17. Встречаемость С. coccodes в пораженных листьях. Число образцов, в которых присутствовал С. coccodes Регион России, место сбора Растениехозяин Число исследованных образцов Ростовская обл., около Ростова S.lycopersicum 13 7 Ростовская обл., Армавирский р-н S.lycopersicum 13 1 Ростовская обл., Армавирский р-н S.lycopersicum 12 – Ставропольский край, Славянск-на-Кубани S.lycopersicum 18 5 Ставропольский край, пос. Стрелка, Темрюкский р-н S.lycopersicum 15 – Респ. Северная ОсетияАлания, с. Михайловское S. tuberosum 10 1 Москва, Ботанический сад МГУ S. dulcamara 8 3 89 17 Всего По результатам анализа было установлено, что C. coccodes был выявлен в семи образцах ДНК пораженных листьев томата из Ростовской 155 области, пяти образцах листьев томата из Ставропольского края, в одном случае из листьев картофеля из Респ. Северной Осетии - Алании, и в трех образцах листьев паслена сладко - горького (Таблица 3.17.). Таким образом, в настоящей работе впервые были применены праймеры для идентификации C. сoccodes в фиксированных пораженных листьях картофеля и томата, и впервые в России проведена ПЦР идентификация возбудителя антракноза в клубнях. Выбранные диагностические праймеры позволяют эффективно выявлять C. сoccodes в разных органах картофеля и томата. Полученные в процессе исследования результаты подтверждают данные, установленные с помощью клонирования и секвенирования (глава 3.1.), где было обнаружено присутствие возбудителя антракноза C. coccodes на листьях картофеля. С помощью ПЦР-идентификации впервые в России патоген был обнаружен и в листьях томата. Кроме того, было показано одновременное присутствие C. coccodes в некрозах с A. alternata. Данные праймеры использовались для детекции C. coccodes в плодах авокадо, манго, маракуйи и персика в Бразилии (Tozze Júnior H. J. et al., 2015). Они были применены для подтверждения морфологической идентификации чистой культуры вида, выделенного вместе с другими видами рода Colletotrichum из пораженных плодов перца в США (Lewis Ivey et al., 2004), а также для идентификации C. coccodes в почве из полей, используемых для коммерческих посадок картофеля (Brierley et al., 2009). Данный вид обычно идентифицируют в почве и в клубнях, а его присутствие в некротизированных участках листьев до настоящего времени не было выявлено в Европе (Lees, 2003). В то же время в России C. coccodes был выделен из пораженных листьев картофеля в Ленинградской области (Ганнибал, 2007). Полученные результаты подтверждают нашу гипотезу о необходимости комплексного исследования некрозов из-за возможного развития на них нескольких видов патогенных микроорганизмов, не выявляемых при микроскопическом иссследовании. 156 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В России и странах СНГ традиционно уделяется основное внимание исследованиям наиболее опасного патогена картофеля – возбудителя фитофтороза P. infestans. Последнее время в Европе и в России стали обращать внимание на другие фитопатогенные грибы – прежде всего виды рода Alternaria и возбудителя серебристой парши клубней Helminthosporium solani. Полученные нами в результате молекулярно-генетических исследований данные показывают, что реальный спектр фитопатогенов, ассоциированных с листьями исследуемых растений, гораздо шире. Выявлено наличие достаточно большой группы грибов – паразитов листьев картофеля, томата и диких пасленовых, которые, по литературным данным, также могут вызывать тяжелые эпифитотии. Следовательно, при разработке мер защиты растений, при тестировании устойчивости сортов и сортообразцов к грибным болезням, при подборе фунгицидных препаратов следует учитывать возможность проявления эпифитотий, вызванных теми видами грибов, которым традиционно не уделяется серьезного внимания. Для идентификации фитопатогенных грибов необходимы инструменты диагностики. В работе нами были разработаны и протестированы на российских изолятах и пораженных образцах растений из разных регионов России праймеры для классической ПЦР, праймеры и зонды для ПЦР в реальном времени, предназначенные для идентификации возбудителей альтернариозов в пораженном растительном материале без выделения грибов в чистую культуру. В свете полученных данных представляет интерес продолжение исследований сезонной сукцессии микобиоты на листьях разных видов растений-хозяев в условиях агро- и естественых биоценозов. Особое внимание следует уделить оценке влияния различающимися фунгицидов по с подвижности различными в действующими растениях, на веществами, микобиоту листьев. Исследования видового состава и структуры популяций возбудителей листовых пятнистостей культурных и диких видов пасленовых важно продолжать, так как это необходимо для разработки оптимальных систем интегрированной защиты картофеля и томата от болезней. 157 ВЫВОДЫ 1. В исследованных образцах листьев Solanum tuberosum с симптомами некрозов было выявлено 19 видов грибов и грибоподобных организмов, в листьях S. lycopersicum – 13 видов, в листьях S. dulcamara – 19. Обнаружено совместное присутствие нескольких видов потенциально патогенных грибов в пределах одного некроза. Максимальное количество видов в одном образце (листовой пластинке) составило 8 видов у картофеля, 8 видов у томата, и 7 видов у S. dulcamara. 2. Установлено, что мелкоспоровый вид Alternaria alternata sensu lato способен самостоятельно заражать листья картофеля и томата разных сортов, причем вирулентость и агрессивность изолятов в отношении разных сортов сильно варьирует. 3. Разработаны системы быстрой диагностики для выявления видов рода Alternaria, возбудителей альтернариозов картофеля, томата и диких пасленовых, с помощью классической ПЦР и ПЦР в реальном времени. Разработанные системы не дают ложноположительных результатов, обладают высокой специфичностью и чувствительностью. 4. С помощью разработанных тест-систем в образцах листьев картофеля и томата были обнаружены виды A. alternata, A. solani и A. infectoria; в части образцов эти виды идентифицировались одновременно. Вид C. coccodes был выявлен в фиксированных образцах листьев всех исследуемых видов растений; в листьях томата и S. dulcamara в России он обнаружен впервые. 158 НАУЧНО - ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Полученные результаты могут быть использованы в фундаментальных научных и прикладных исследованиях. Данные, полученные в ходе работы, используются при чтении специальных курсов лекций и при проведении практических занятий для студентов Биологического факультета МГУ, а также могут быть рекомендованы для введения в учебные курсы по изучению видового состава грибов для других ВУЗов. Разработанные тест-системы для выявления и идентификации возбудителей альтернариоза могут применяться для уточнения результатов определения видовой принадлежности чистых культур изолятов грибов и для быстрой диагностики патогенов в растительном материале. Они могут быть полезны российским компаниям, выращивающим картофель и томат, для разработки и оптимизации схем защиты этих культур от болезней. Описанные методические подходы и депонированные последовательности нуклеотидов могут быть использованы для определения видового состава сообществ микроорганизмов других местообитаний и создания тест-систем на основе ПЦР для быстрой диагностики фитопатогенных грибов. 159 БЛАГОДАРНОСТИ Выражаю глубокую благодарность д.б.н. С.Н. Еланскому, который привлек меня к работе с фитопатогенными грибами, руководил моими исследованиями, помогал и всесторонне поддерживал. Я благодарна М.А. Побединской за помощь на всех этапах исследования, которую сложно переоценить. Отдельную благодарность выражаю д.б.н. А.В. Александровой за интерес к моей работе, за консультации и предоставленные технические возможности. При работе с молекулярными методами я руководствовалась советами и поддержкой к.б.н. Е.М. Чудиновой, к.б.н. Е.С. Сколотневой, к.б.н. И.С. Мажейка, д.б.н. И.В. Еланской, к.б.н. Л.Е. Михеевой, А.Ф. Белосохова. Я благодарна проф. А.В. Куракову, проф. В.В. Зинченко, д.б.н. Е.А. Климову, к.б.н. И.В. Кузьмину, к.т.н. Ю.Ц. Мартиросян за предоставленные технические возможности. Выражаю благодарность к.б.н. Е.Ю. Благовещенской за помощь в статистической обработке данных. Благодарю за полезное обсуждение результатов, ценные советы и замечания проф. Ю.Т. Дьякова, Е.Ю. Воронинину. Я к.б.н. И.Д. благодарна Инсарову, к.б.н. М.Ю. Ф.Б. Дьякова, к.б.н. Ганнибаллу, к.б.н. З.А. Сташевски, к.б.н. Л.Ю. Доевой и к.с.-х.н. А.В. Николаеву за помощь в сборе материала и переданные образцы. Выражаю свою благодарность к.б.н. Н.Н. Кудрявцевой и всему коллективу лаборатории биохимии протеолиза Института биохимии имени А.Н. Баха РАН за плодотворное сотрудничество. Выражаю свою благодарность коллективу кафедры микологии и альгологии, коллективу ЗАО «Евроген» и особенно М.Е. Парнесу и А. Авериной, а также сотрудникам ООО «Синтол». Я благодарна своим родителям и всем друзьям, поддержавшим меня в работе. 160 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах из перечня ВАК 1. Мыца Е.Д., Побединская М.А., Кокаева Л.Ю., Еланский С.Н. Пестициды, ингибирующие образование ооспор Phytophthora infestans // Микология и фитопатология. — 2016. — Т. 50. — №1. — С. 66–69. 2. Elansky S.N., Pobedinskaya M.A., Kokaeva L.Yu., Statsyuk N.V., and Dyakov Yu.T. Phytophthora infestans populations from the European part of Russia: genotypic structure and metalaxyl resistance // Journal of Plant Pathology. — 2015. — V.97. — №3. — P. 502-510. 3. Еланский С.Н., Мыца Е.Д., Кокаева Л.Ю. Обнаружение Phytophthora infestans на Solanum dulcamara на территории ботанического сада МГУ // Микология и фитопатология. — 2015 — Т. 49. — № (6). — С. 386-388. 4. Мыца Е.Д., Еланский С.Н., Кокаева Л.Ю., Побединская М.А., Игнатов А.Н., Кузнецова М.А., Козловский Б.Е., Денисов А.Н., Жеребин П.М., Крутяков Ю.А. Новый препарат Зерокс – оценка фунгицидного и бактерицидного эффекта in vitro // Достижения науки и техники АПК. — 2014. — Т. 28. — №12. — С. 16–19. 5. Побединская М.А., Плуталов П.Н., Романова С.С., Кокаева Л.Ю., Николаев А.В., Александрова А.В., Еланский С.Н. Устойчивость возбудителей альтернариоза картофеля и томата к фунгицидам // Микология и фитопатология. — 2012. — Т.46. — В.6. — С. 401- 408. Статьи в других периодических изданиях и сборниках 6. Кокаева Л.Ю., Кудрявцева Н.Н., Побединская М.А., Зайчик Б.Т., Еланский С.Н. Вирулентность штаммов Alternaria alternata к сортам картофеля и томата // Защита картофеля. —2015. — №1. — С. 16-20. 7. Valueva T.A., Kudryavtseva N.N., Sofyin A.V., Zaitchik B.Ts., Pobedinskaya M.A., Kokaeva L.Yu., and Elansky S.N. Serine Exoproteinases 161 Secreted by the Pathogenic Fungi of Alternaria Genus // Plant Pathology & Microbiology. — 2015. — V.6. — I.6. — P. 272. 8. Еланский С.Н., Побединская М.А., Кокаева Л.Ю., Кутузова И.А., Проничева И.С., Мыца Е.Д., Климов А.И., Кузнецова М.А., Козловский Б.Е., Жеребин П.М., Денисов А.Н., Крутяков Ю.А. Новый препарат Зерокс на основе коллоидного серебра: результаты лабораторных испытаний // Защита картофеля. — 2014. — №1. — С.41-43. 9. Elansky S., Pobedinskaya M., Kokaeva L., Statsyuk N., Alexandrova A. Molecular identification of the species composition of Russian isolates of pathogens, causing early blight of potato and tomato // PPO-Special Report no. 15. — 2012. — P. 151-156. 10. Кокаева Л.Ю., Побединская М.А., Николаев А.В., Александрова А.В., Еланский С.Н. Видовой состав возбудителей альтернариоза картофеля и томата // Картофелеводство. — 2012. — Т.19. — С. 333-342. 11. Elansky S., Pobedinskaya M., Kokaeva L., Statsyuk N., Alexandrova A. Molecular identification of the species composition of Russian isolates of pathogens, causing early blight of potato and tomato // PPO-Special Report no. 15. — 2012. — P. 151-156. 12. Еланский С.Н., Побединская М.А., Плуталов П.Н., Романова С.С., Николаев А.В., Кокаева Л.Ю., Александрова А.В. Устойчивость возбудителей альтернариоза картофеля и томата к азоксистробину // Картофелеводство. — 2011. — Т.19. — С. 277-286. 13. Кокаева Л.Ю., Кокаева З.Г., Березов Ю.И., Еланский С.Н. Молекулярно – генетические подходы к исследованию фитопатогенного оомицета Phytophthora infestans // Защита картофеля. — 2011. — В. 2. — С. 29. 14. Еланский С.Н., Побединская М.А., Плуталов П.Н., Романова С.С., Кокаева Л.Ю., Александрова А.В. Устойчивость российских штаммов возбудителей альтернариоза картофеля и томата к азоксистробину // Защита картофеля. 2011 — В. 2. — С. 14-19. 162 15. Л.Ю. Кокаева, М.А. Побединская, А.В. Николаев, А.В. Александрова, С.Н. Еланский. Видовой состав возбудителей альтернариоза картофеля и томата // Картофелеводство. — 2011. — Т.19. — С. 333-342. Тезисы и материалы конференций 16. Кокаева Л.Ю., Еланский С.Н., Берёзов Ю.И. Молекулярная идентификация грибов – возбудителей листовых пятнистостей картофеля и томата // Современная микология в России. Т. 5. Ред.: Ю.Т.Дьяков, Ю.В.Сергеев. М.: Нац.акад.микологии, 2015. — С. 66–66. 17. Побединская М.А., Кокаева Л.Ю., Мыца Е.Д., Еланский С.Н. Влияние фунгицидов Максим, Скор и Зерокс, инсектицидов Актара и Танрек, гербицида Зенкор на образование ооспор оомицетом Phytophthora infestans (mont.) de Bary // Материалы 6 межрегиональной научно-практической конференции «Современная индустрия картофеля: состояние и перспективы развития». Чебоксары, 2014. C. 138–143. 18. Еланский С.Н., Побединская М.А., Кокаева Л.Ю., Кутузова И.А., Жеребин П.М., Климов А.И., Крутяков Ю.А., Кузнецова М.А., Рогожин Б.Е., Козловский А.Н., Денисов А.Н. Изучение фунгицидных свойств препарата Зерокс в лабораторных и полевых условиях // Материалы 6 межрегиональной научно-практической конференции «Современная индустрия картофеля: состояние и перспективы развития». Чебоксары, 2014. C. 143–148. 19. Еланский С.Н., Проничева И.С., Кокаева Л.Ю., Побединская М.А. Оценка эффективности некоторых коммерческих фунгицидов в отношении возбудителей болезней картофеля in vitro // Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и научное обеспечение АПК». Великие Луки, 2014. С. 16–17. 20. видового Кокаева состава Л.Ю., Еланский С.Н. Молекулярная российских штаммов возбудителей идентификация альтернариоза картофеля и томата // Современная микология России. Материалы 3-го 163 Съезда микологов России. Т. 3. М.: Национальная академия микологии, 2012. — С. 287–288. 21. Кокаева Л.Ю. Видовой состав возбудителей альтернариоза картофеля и томата // Сборник тезисов докладов международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011». Москва, 2011. — С. 152. 164 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Абрамова С.Л. Разработка систем идентификации грибов возбудителей экономически значимых болезней зерновых культур методом ПЦР // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. ― Москва ― 2013. ― 105 с. 2. Анисимов Б.В., Белов Г.Л., Варицев Ю.А., Еланский С.Н., Журомский Г.К., Завриев С.К., Зейрук В.Н., Иванюк В.Г., Кузнецова М.А., Пляхневич М.П., Пшеченков К.А., Симаков Е.А., Склярова Н.П., Сташевски З.А., Усков А.И., Яшина И.М. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков — Картофелевод — 2009. — 272 с. 3. Билай В.И., Гвоздяк Р.И., Скрипаль И.Г., Краев В.Г., Элланская И.А., Зирка Т.И., Мурас В.А. Микроорганизмы — возбудители болезней растений /. ― Киев: Наук, думка, 1988. ― 552 с. 4. Блинцов А.Н., Варицев Ю.А., Усков А.И., Варицева Г.П., Зайцев И.А., Ерохова М.Д., Еланский С.Н., Комаров А.Б., Анисимов Б.В. Новые диагностические тест-системы для иммуноферментного определения возбудителей вирусных и бактериальных болезней картофеля. / В кн.: Состояние и перспективы Инновационного развития современной индустрии картофеля. — Чебоксары: КУП ЧР «Агро-инновации» ― 2013. — C.76-81. 5. Варицев Ю.А., Мазурин Е.С., Дренова Н.В., Усков А.И., Джалилов Ф.С., Шероколава Н.А. Результаты сравнительного испытания российских и зарубежных тест-систем для выявления латентной инфекции возбудителя кольцевой гнили картофеля // Картофелеводство / сборник науч. трудов. ― Минск ― 2008. ― С. 350-357. 6. Воловик А.С., Кладова А.И. Грибные болезни картофеля // Сборник: Распространение вредителей и болезней сельскохозяйственных культур в РСФСР в 1968 г. и прогноз их появления в 1969 г. — Россельхозиздат, — 1969. — С. 126-129. 7. Воловик А.С., Литун Б.П. Вредоносность заболеваний картофеля // Защита растений — 1975. — Т. 7. — С. 4-5. 8. Воловик А.С., Литун Б.П., Федорова М.И. Вредоносность наиболее распространенных болезней картофеля в РСФСР и экономическая эффективность защитных мероприятий. / Технология производства картофеля (Научные труды). — 1974, — вып. 19. — С. 177-183. 9. Ганнибал Ф. Б. Видовой состав, таксономия и номенклатура возбудителей заболевания альтернариоза листьев картофеля // Лаборатория 165 микологии и фитопатологии им. А. А. Ячевского ВИЗР. История и современность / Под ред. А. П. Дмитриева. СПб.: ВИЗР, —2007. —C. 142148. 10. Ганнибал Ф. Б. Систематика альтернариоидных гифомицетов и их распространение в России. Проблемы микологии и фитопатологии в ХХI веке // Материалы международной научной конференции, посвященной 150летию со дня рождения члена-корреспондента АН СССР, профессора Артура Артуровича Ячевского — Национальная академия микологии, БГС, Дизайнстудия «Дозор» — СПб.: ООО «Копи-Р Групп» — 2013 — С. 62-64. 11. Ганнибал Ф.Б., Орина А.С., Левитин М.М. Альтернариозы сельскохозяйственных культур на территории России // Защита и карантин растений ― 2010. ― T. 5. — C. 30-32 12. Дорожкин Н.А., Иванюк В.Г. Альтернариевая кислота -биологически активный продукт метаболизма возбудителей ранней сухой пятнистости картофеля // Микология и фитопатология. — 1975. — Т.9. — вып.3. — С. 220-225. 13. Дудка I. O., Тихоненко Ю. Я., Бурдюкова Л. I. Гербофiльнiта фiлофiльнi мiкосинузii паразитних мiкромiцетiв в УРСР // Укр. бот. журн. 1990. — Т. 47. — № 4. — С. 5 -9. 14. Дьяков Ю.Т., Еланский С.Н. Общая фитопатология. Учебное пособие — 2016. — 230 с. 15. Дьяков Ю.Т., Еланский С.Н. Популяционная генетика Phytophthora infestans // Микология сегодня. — Национальная академия микологии — 2007 — Т. 1. — C. 107-139. 16. Еланский С.Н., Побединская М.А., Плуталов П.Н., Романова С.С., Кокаева Л.Ю., Александрова А.В. Устойчивость российских штаммов возбудителей альтернариоза картофеля и томата к азоксистробину // Защита картофеля. — 2012. — № 2. — С. 14–19. 17. Зайцева В.А., Сафин Р.И, Экологические особенности совместного развития Phytophthora infestans и Alternaria solani на листьях картофеля // Вестник Казанского ГАУ. — 2007. — №1 (5). — С.135-138. 18. Захаренко В.А. Тенденции изменения комплексов, видового разнообразия, внутрипопуляционных структур и динамики вредных организмов. — Москва, — 2003. — 31 с. 19. Иванюк В.Г., Банадысев С.А, Журомский Г.К. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков // Минск., Белпринт. — 2005. — 696 с. 166 20. Иванюк В.Г., Банадысев С.А., Журомский Г.К. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков. ― Минск: РУП "Белорусский НИИ картофелеводства"― 2003.― 550 с. 21. Иванюк В.Г., Колядко Н.Н.; Ред. Самерсов В.Ф. Болезни и вредители овощных культур - Минск — Ураджай, — 1994. — 351с. 22. Иванюк, В.Г. Банадысев С.А., Журомский Г.К. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков Минск:Белпринт 2005. 696 с. 23. Казарцев И.А. Молекулярные методы исследования грибных сообществ // Проблемы микологии и фитопатологии в XXI веке, материалы международной научной конференции. — 2013. — С. 72-75 24. Кашйап У., Эпифитная микрофлора Lycopersicon esculbntum hiix. и ее взаимоотношения с Cladospohium fulvum, Sеptoria lycopersici spsgazzini .и Bothytis cinbrea Pers. — диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. — МГУ им. М.В. Ломоносова — 1977. 25. Козловский Б.Е., Филиппов А.В. Альтернариоз картофеля // Защита и карантин растений ―2007―№ 5― C. 27-29. 26. Кокаева Л.Ю., Кокаева З.Г., Березов Ю.И., Еланский С.Н. Молекулярно — генетические подходы к исследованию фитопатогенного оомицета Phytophthora infestans // Защита картофеля. — 2011. — № 2. — С. 2–8. 27. Кокаева Л.Ю., Побединская М.А., Николаев А.В., Александрова А.В., Еланский С.Н. Видовой состав возбудителей альтернариоза картофеля и томата // Картофелеводство. — 2012. — Т.19. — С. 333-342 28. Кудряшова О.А., Изучение условий биосинтеза экстрацеллюлярных полисахаридов штаммами Aureobasidium pullulans var. aubasidani и A. pullulans var. pullulans : автореферат дис. кандидата биологических наук : 03.00.07 / Санкт-Петербург. гос. хим.-фармацевт. акад. - Санкт-Петербург, 1997. - 22 с. 29. Кузнецова М.А. Болезни картофеля при хранении // Агроном. — 2007. — №3. — С. 120 30. Лаптинов И.А., Болдырева М.Н. ПЦР-диагностика в России: современное состояние и перспективы развития // Лабораторная диагностика России 2005. 63 c. 31. Орина А. С. Видовой состав возбудителей альтернариоза пасленовых культур на территории России // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. ―Санкт-Петербург ―2011. ―26 с. 167 32. Осницкая Е.А. Болезни овощных культур/ Распространение вредителей и болезней сельскохозяйственных культур в РСФСР в 1967 и прогноз их появления в 1968 году. — М.: Россельхозиздат. — 1968. — С. 120-125. 33. Паластрова О. А. Болезни томата и обоснование мер борьбы с ними в условиях Курганской области // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук — 2006. 34. Побединская М.А., Плуталов П.Н., Романова С.С., Кокаева Л.Ю., Николаев А.В., Александрова А.В., Еланский С.Н. Устойчивость возбудителей альтернариоза картофеля и томата к фунгицидам // Микология и фитопатология. — 2012. — Т. 46, № 6. — С. 401–408. 35. Поликсенова В.Д. Микозы томата: возбудители заболеваний, устойчивость растений. — БГУ — 2008. — 159 с. 36. Попкова К.В., Шнейдер А.С., Воловик А.С., Шмыгля В.А. Болезни картофеля. — Колос, — 1980. — 304 с. 37. Пугач Н. Б. Научное творчество Р. Коха И Л. Пастера и становление фундаментальной и прикладной микробиологии // Аннали Мечниковського інституту. — 2006. — №. 3. — С. 74-101. 38. Рязанцев Д. Ю., Абрамов Д. Д., Завриев С. К. Диагностика карантинных фитопатогенов методом ПЦР в формате FLASH // Сельскохозяйственная биология. — 2009. — №. 3. — С. 114-117. 39. Рязанцев Д.Ю., Абрамова С.Л., Евстратова С.В., Гагкаева Т.Ю., Завриев С.К. Диагностика токсиногенных грибов рода Fusarium методом FLASH-PCR. // Биоорг. хим. — 2008. — Т. 35. — С. 799–807. 40. Симонян С. А., Барсегян А. М. К познанию фитоценотической роли микромицетов в различных типах растительности Армении // Микол. и фитопатол. — 1974. — Т. 8, — вып. 4. — С. 315 -322. 41. Соколова Л. М., Терешонкова Т. А., Горшкова Н. С., Леунов В. И. Причины увядания гороха овощного в Воронежской области // Защита и карантин растений. — 2013. — №. 2. — С. 41-42 42. Стахеев А.А., Рязанцев Д.Ю., Завриев С.К. Выявление новых генетических маркеров для таксономической характеристики и идентификации грибов рода Fusarium // Биоорг. хим. — Т. 37. — С. 662–671. 43. Сулимова Г.Е., Удина И.Г., Зинченко В.В. Анализ полиморфизма ДНК с использованием метода полимеразной цепной реакции. М.: МАКС Пресс. — 2006. — 77 с 168 44. Сурина Т. А. Фитофторозные корневые гнили древесных и кустарниковых растений и их диагностика: диссертация кандидата биологических наук: 501.001.46: защищена 24.04.2015. — Москва, 2015. — 163 с. 45. Тимина Л.Т., Енгалычева И. А. Патогенная микобиота на овощных культурах в условиях Центрального региона РФ // Селекция и семеноводство овощных культур. — Москва. — 2014 — Вып. 45. — С.530-539. 46. Хомяков М. Т. О роли отдельных видов грибов в искусственных фитоценозах // Биоценотические связи организмов в насаждениях искусственных фитоценозов. — Кишинёв — 1986. — С. 122 -123. 47. Чумаков А.Е., Захарова Т.И. Вредоносность болезней сельскохозяйственных культур // Агропромиздат. — 1990. — 127 с. 48. Щукина С.А., Горст К.А. Метод T-RFLP: теория и практика : литературный обзор // Животноводство России. — 2011. — N 8. — С. 4-5. 49. Abd-Elsalam K., Bahkali A., Moslem M., Amin O.E., Niessen L. An optimized protocol for DNA extraction from wheat seeds and loop-mediated isothermal amplification (LAMP) to detect Fusarium graminearum contamination of wheat grain // International journal of molecular sciences. — 2011. — V. 12. — №. 6. — P. 3459-3472. 50. Amuji C.F., Uguru M.I., Ogbonna P.E., Ugwuoke K.I., Eze I.E., Mbadianya J.I. Isolation and Identification of Fungal Pathogens associated with tomato genotypes/lines in Nsukka south-eastern Nigeria // microscope. — 2013. — V. 2. — №. 6. 51. Anderson I.C., Cairney J.W.G. Diversity and ecology of soil fungal communities: increased understanding through the application of molecular techniques // Environmental Microbiology. — 2004. — V. 6. — №. 8. — P. 769779. 52. Anderson I.C., Campbell C.D., Prosser J.I. Potential bias of fungal 18S rDNA and internal transcribed spacer polymerase chain reaction primers for estimating fungal biodiversity in soil // Environmental Microbiology. — 2003. — V. 5. — №. 1. — P. 36-47. 53. Anderson N., Szemes M., O'Brien P., De Weerdt M., Schoen C., Boender P., Bonants P. Use of hybridization melting kinetics for detecting Phytophthora species using three-dimensional microarrays: demonstration of a novel concept for the differentiation of detection targets // Mycological research. — 2006. — V. 110. — №. 6. — P. 664-671. 169 54. Andrews J. H., Hirano S. S. (ed.). Microbial ecology of leaves. — Springer Science & Business Media, — 2012. 55. Anonymous. Index of Plant Diseases in the United States. // U.S.D.A. Agric. Handb. — 1960 —531. p. 56. Arici S. E., Koc N. K. RAPD-PCR analysis of genetic variation among isolates of Fusarium graminearum and Fusarium culmorum from wheat in Adana Turkey // Pakistan journal of biological sciences: PJBS. — 2010. — V. 13. — №. 3. — P. 138-142. 57. Armengol J., Vicent A., Torn C.L., Garcua-Figueres G., Garca-Jimunez T Fungi associated with esca and grapevine declines in Spain. A three-year survey [Vitis vinifera L.] // Phytopathologia Mediterranea (Italy). — 2001. — V. 40. — P. 325–329. 58. Arnold G.R.W. Lista de Hongos Fitopatogenos de Cuba // Ministerio de Cultura Editorial Cientifico-Tecnica. — 1986. — 207 p. 59. Aroca A., Raposo R. PCR-based strategy to detect and identify species of Phaeoacremonium causing grapevine diseases // Applied and Environmental Microbiology. — 2007. — V. 73. — №. 9. — P. 2911-2918. 60. Aroca A., Raposo R., Lunello P. A biomarker for the identification of four Phaeoacremonium species using the β-tubulin gene as the target sequence // Applied microbiology and biotechnology. — 2008. — V. 80. — №. 6. — P. 1131-1140. 61. Attallah Z.K., Bae J., Jansky S.H., Rouse D.I., Stevenson W.R. Multiplex real-time quantitative PCR to detect and quantify Verticillium dahliae colonization in potato lines that differ in response to Verticillium wilt // Phytopathology. — 2007. — V. 97. — №. 7. — P. 865-872. 62. Aulakh K.S., Grover R.K. Use of oils for controlling ripe fruit rots of tomato caused by Phoma destructiva and Curvularia lycopersici // Fao Plant Protect Bull. — 1969. — P. 90-91. 63. Aveskamp M.M., De Gruyter J., Woudenberg J.H.C., Verkley G.J.M., Crous P.W. Highlights of the Didymellaceae: a polyphasic approach to characterise Phoma and related pleosporalean genera // Studies in Mycology. — 2010. — V. 65. — P. 1-60. 64. Baayen R.P., O'Donnell K., Bonants P.J.M., Cigelnik E., Kroon L.P.N.M., Roebroeck E.J.A., Waalwijk C. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease // Phytopathology. — 2000. — V. 90. — №. 8. — P. 891-900. 170 65. Badiee P., Gandomi B., Sabz G., Khodami B., Choopanizadeh M., Jafarian H. Evaluation of nested PCR in diagnosis of fungal rhinosinusitis // Iranian Journal of Microbiology. — 2015. — V. 7. — №. 1. — P. 62-66. 66. Bailey A.M., Mitchell D.J., Manjunath K.L., Nolasco G., Niblett C.L. Identification to the species level of the plant pathogens Phytophthora and Pythium by using unique sequences of the ITS1 region of ribosomal DNA as capture probes for PCR ELISA // FEMS microbiology letters. — 2002. — V. 207. — №. 2. — P. 153-158. 67. Bainbridge A., Dickinson C.H. Effect of fungicides on the microflora of potato leaves // Transactions of the British Mycological Society. — 1972. — V. 59. — №. 1. — P. 31-41. 68. Barnes C.W., Szabo L.J. Detection and identification of four common rust pathogens of cereals and grasses using real-time polymerase chain reaction // Phytopathology. — 2007. — V. 97. — №. 6. — P. 717-727. 69. Barnett H.L., Hunter B.B. Illustrated genera of imperfect fungi // Burgess, Minneapolis. — 1972. 70. Bayraktar H., Dolar F. S., Tör M. Determination of genetic diversity within Ascochyta rabiei (Pass.) Labr., the cause of Ascochyta blight of chickpea in Turkey // Journal of Plant Pathology. — 2007. — P. 341-347. 71. Beakes G.W., Glockling S.L., Sekimoto S. The evolutionary phylogeny of the oomycete “fungi” // Protoplasma. — 2012. — V. 249. — №. 1. — P. 3-19. 72. Ben‐Daniel B.H., Bar‐Zvi D.U.D.Y. Pectate lyase affects pathogenicity in natural isolates of Colletotrichum coccodes and in pelA gene‐disrupted and gene‐overexpressing mutant lines // Molecular plant pathology. — 2012. — V. 13. — №. 2. — P. 187-197. 73. Bensch K., Groenewald J.Z., Dijksterhuis J., Starink-Willemse M., Andersen B., Summerell B.A., Crous P. W. Species and ecological diversity within the Cladosporium cladosporioides complex (Davidiellaceae, Capnodiales) // Studies in Mycology. — 2010. — V. 67. — P. 1-94. 74. Bilodeau G.J., Pelletier G., Pelletier F., Levesque C.A., Hamelin R.C. Multiplex real-time polymerase chain reaction (PCR) for detection of Phytophthora ramorum, the causal agent of sudden oak death // Canadian Journal of Plant Pathology. — 2009. — V. 31. — №. 2. — P. 195-210. 75. Bindslev L., Oliver R.P., Johansen B. In situ PCR for detection and identification of fungal species // Mycological Research. — 2002. — V. 106. — №. 3. — P. 277-279. 171 76. Blancard D. Les maladies de la tomate: identifier, connaître, maîtriser. — Editions Quae — 2009. — 91 p. 77. Bobev S. Reference guide for the diseases of cultivated plants — 2009. — 466 p. 78. Borneman J., Hartin R.J. PCR primers that amplify fungal rRNA genes from environmental samples // Applied and environmental microbiology. — 2000. — V. 66. — №. 10. — P. 4356-4360. 79. Brame C., Flood J. Antagonism of Aureobasidium pullulans towards Alternaria solani // Transactions of the British Mycological Society. — 1983. — V. 81. — №. 3. — P. 621-624. 80. Brandfass C., Karlovsky P. Simultaneous detection of Fusarium culmorum and F. graminearum in plant material by duplex PCR with melting curve analysis // BMC microbiology. — 2006. — V. 6. — №. 1. — P. 4. 81. Braun U. The powdery mildews (Erysiphales) of Europe. — VEB Gustav Fischer Verlag, — 1995. — 338 p. 82. Brierley J.L., Stewart J.A., Lees A.K. Quantifying potato pathogen DNA in soil // Applied Soil Ecology. — 2009. — V. 41. — №. 2. — P. 234-238. 83. Buée M., Reich M., Murat C., Morin E., Nillson R.H., Uroz S., Martin F. 454 Pyrosequencing analyses of forest soils reveal an unexpectedly high fungal diversity // New Phytologis V. — 2009. — V. 184. — №. 2. — P. 449-456. 84. Callon C., Delbès C., Duthoit F., Montel M.C. Application of SSCP–PCR fingerprinting to profile the yeast community in raw milk Salers cheeses // Systematic and Applied Microbiology. — 2006. — V. 29. — №. 2. — P. 172-180. 85. Carisse O., Tremblay D.M., Levesque C.A., Gindro K., Ward P., Houde A. Development of a TaqMan real-time PCR assay for quantification of airborne conidia of Botrytis squamosa and management of Botrytis leaf blight of onion // Phytopathology. — 2009. — V. 99. — №. 11. — P. 1273-1280. 86. Causin R., Scopel C., Grendene A., Montecchio L. An improved method for the detection of Phytophthora cactorum (LC) Schröeter in infected plant tissues using SCAR markers // Journal of Plant Pathology. — 2005. — P. 25-35. 87. Cerkauskas R. Pepper diseases: anthracnose — Published by AVRDC — The World Vegetable Center, Publication — 2005. — 609 p. 88. Chaerani R., Voorrips R.E. Tomato early blight (Alternaria solani): the pathogen, genetics, and breeding for resistance // Journal of general plant pathology. — 2006. — V. 72. — №. 6. — P. 335-347. 172 89. Chen W.Y., Tsay J.G. Differentiation of two powdery mildews of sunflower (Helianthus annuus) by a PCR-mediated method based on ITS sequences // European journal of plant pathology. — 2008. — V. 121. — №. 1. — P. 1-8 90. Chesters C.G.C., Hornby D. Studies on Colletotrichum coccodes: II. Alternative host tests and tomato fruit inoculations using a typical tomato root isolate // Transactions of the British Mycological Society. — 1965. — V. 48. — №. 4. — P. 583-586. 91. Chimento A., Scibetta S., Schena L., Cacciola S.O., Cooke D.E.L. A new method for the monitoring of Phytophthora diversity in soil and water // Journal of Plant Pathology. — 2005. — V. 87. — №. 4. — 290 p. 92. Cho W.D., Shin H.D. List of plant diseases in Korea. Fourth edition // Korean Society of Plant Pathology — 2004 — 779 p. 93. Ciccarese F., Amenduni M., Schiavone D., Cirulli M. Occurrence and inheritance of resistance to powdery mildew (Oidium lycopersici) in Lycopersicon species // Plant Pathology. — 1998. — V. 47. — №. 4. — P. 417-419. 94. Cipriani M.G., Stea G., Moretti A., Altomare C., Mulè G., Vurro M. Development of a PCR-based assay for the detection of Fusarium oxysporum strain FT2, a potential mycoherbicide of Orobanche ramosa // Biological Control. — 2009. — V. 50. — №. 1. — P. 78-84. 95. Crous P.W., Groenewald J.Z., Summerell B.A., Wingfield B.D., Wingfield M.J. Co-occurring species of Teratosphaeria on Eucalyptus // Persoonia. — 2009. — V. 22. — P. 38. 96. Cullen D.W., Lees A.K., Toth I.K., Duncan J.M. Detection of Colletotrichum coccodes from soil and potato tubers by conventional and quantitative real‐time PCR // Plant Pathology. — 2002. — V. 51. — №. 3. — P. 281-292. 97. Dang H.X., Pryor B., Peever T., Lawrence C.B. The Alternaria genomes database: a comprehensive resource for a fungal genus comprised of saprophytes, plant pathogens, and allergenic species // BMC genomics. — 2015. — V. 16. — №. 1. — P. 239. 98. Daval S., Lebreton L., Gazengel K., Guillerm‐Erckelboudt A.Y., Sarniguet A. Genetic evidence for differentiation of Gaeumannomyces graminis var. tritici into two major groups // Plant Pathology. — 2010. — V. 59. — №. 1. — P. 165178. 99. Davidson J.A., Hartley D., Priest M., Herdina M.K., McKay A., Scott E.S. A new species of Phoma causes ascochyta blight symptoms on field peas (Pisum 173 sativum) in South Australia // Mycologia. — 2009. — V. 101. — №. 1. — P. 120128. 100. de Hoog G.S., Horré R. Molecular taxonomy of the Alternaria and Ulocladium species from humans and their identification in the routine laboratory // Mycoses. — 2002. — V. 45. — №. 7‐8. — P. 259-276. 101. de Wit P.J.G.M., van der Burgt A, Ökmen B, Stergiopoulos I, Abd-Elsalam K.A. The genomes of the fungal plant pathogens Cladosporium fulvum and Dothistroma septosporum reveal adaptation to different hosts and lifestyles but also signatures of common ancestry // PLoS Genetics. — 2012. — V. 8. — №. 11. 102. Demontis M.A., Cacciola S.O., Orru M., Balmas V., Chessa V., Maserti B.E., Mascia L., Raudino F., Quirico G.M.D.S.L., Migheli Q. Development of real-time PCR systems based on SYBR® Green I and TaqMan® technologies for specific quantitative detection of Phoma tracheiphila in infected Citrus // European Journal of Plant Pathology. — 2008. — V. 120. — №. 4. — P. 339-351. 103. DeSantis T.Z., Brodie E.L., Moberg J.P., Zubieta I.X., Piceno Y.M., Andersen G.L. High-density universal 16S rRNA microarray analysis reveals broader diversity than typical clone library when sampling the environment // Microbial ecology. — 2007. — V. 53. — №. 3. — P. 371-383. 104. Dickie I.A., FitzJohn R.G. Using terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) to identify mycorrhizal fungi: a methods review // Mycorrhiza. — 2007. — V. 17. — №. 4. — P. 259-270. 105. Dickinson C.H. Interactions of fungicides and leaf saprophytes // Pesticide Science. — 1973. — V. 4. — №. 4. — P. 563-574. 106. Diguta C.F., Rousseaux S., Weidmann S., Bretin N., Vincent B., GuillouxBenatier M. Alexandre H. Development of a qPCR assay for specific quantification of Botrytis cinerea on grapes // FEMS microbiology letters. — 2010. — V. 313. — №. 1. — P. 81-87. 107. Dik A.J. Interactions among fungicides, pathogens, yeasts, and nutrients in the phyllosphere // Microbial Ecology of Leaves. — Springer New York, — 1991. — P. 412-429. 108. Dillard H.R., Cobb A.C. Survival of Colletotrichum coccodes in infected tomato tissue and in soil // Plant Disease. — 1998. — V. 82. — №. 2. — P. 235238. 109. Drenth A., Wagels G., Smith B., Sebdall B., O'Dwyer C.O., Irvine G., Irwin J.A.G. Development of a DNA-based method for detection and identification of 174 Phytophthora species // Australasian Plant Pathology. — 2006. — V. 35. — №. 2. — P. 147-159. 110. Dunaevskii Y.E., Gruban T.N., Belyakova G.A., Beloserskii M.A. Extracellular proteinases of filamentous fungi as potential markers of phytopathogenesis // Microbiologia. — 2006. — V. 75(6).— P. 747-751. 111. Dyer P.S., Furneaux P.A., Douhan G., Murray T.D. A multiplex PCR test for determination of mating type applied to the plant pathogens Tapesia yallundae and Tapesia acuformis // Fungal Genetics and Biology. — 2001. — V. 33. — №. 3. — P. 173-180. 112. Ebbels D.L., Allen D.J. A supplementary and annotated list of plant diseases, pathogens and associated fungi in Tanzania // Phytopathol.Pap — 1979. — №. 22. — P.1-89 113. Edin E. Species specific primers for identification of Alternaria solani, in combination with analysis of the F129L substitution associates with loss of sensitivity toward strobilurins // Crop Protection. — 2012. — V. 38. — P. 72-73. 114. Edin E., Andersson B. The early blight situation in Sweden — species abundance and strobilurin sensitivity // Proceedings of the 14th EuroBlight Workshop. — Limassol, Cyprus — Wageningen UR, — 2014 P. 83-84. 115. Elad Y., Williamson B., Tudzynski P., Delen N. Botrytis: biology, pathology and control. — Dordrecht, The Netherlands : Kluwer Academic Publishers — 2004. — P. 1-6. 116. Elansky S., Smirnov A., Dyakov Y., Dolgova A., Filippov A., Kozlovsky В., Kozlovskaya I., Russo P., Smart C., Fry W. Genotypic analysis of Russian isolates of Phytophthora infestans from the Moscow region, Siberia and Far East // Journal of Phytopathology. — 2001. — V. 149. — №. 10. — P. 605-611. 117. Enya J., Ikeda K., Takeuchi T., Horikoshi N., Higashi T. The first occurrence of leaf mold of tomato caused by races 4.9 and 4.9. 11 of Passalora fulva (syn. Fulvia fulva) in Japan // Journal of general plant pathology. — 2009. — V. 75. — №. 1. — P. 76-79. 118. Erwin D.C., Ribeiro O.K. Phytophthora diseases worldwide. — American Phytopathological Society (APS Press) — 1996. — 526 p. 119. Felske A., Akkermans A.D.L., De Vos W.M. Quantification of 16S rRNAs in complex bacterial communities by multiple competitive reverse transcriptionPCR in temperature gradient gel electrophoresis fingerprints // Applied and Environmental Microbiology. — 1998. — V. 64. — №. 11. — P. 4581-4587. 175 120. Fitt B.D.L., Huang Y.J., Bosch F.V.D., West J.S. Coexistence of related pathogen species on arable crops in space and time // Phytopathology. — 2006. — V. 44. — P. 163–182. 121. Fokkema N.J. Lorbeer J.W. Interactions between Alternaria porri and the saprophytic mycoflora of onion leaves // Phytopathology. — 1974. — V. 64. — №. 8. — P. 1128-1133. 122. Fourie G., Steenkamp E.T., Gordon T.R., Viljoen A. Evolutionary relationships among the Fusarium oxysporum f. sp. cubense vegetative compatibility groups // Applied and environmental microbiology. — 2009. — V. 75. — №. 14. — P. 4770-4781. 123. Gannibal P.B., Yli-Mattila T. Morphological and UP-PCR analyses and design of a PCR assay for differentiation of Alternaria infectoria species-group // Mikologiia i fitopatologiia. — 2007. — V. 41. — №. 4. — P. 313. 124. Gannibal Ph.B., Orina A.S., Mironenko N., Levitin M.M. Differentiation of the closely related species, Alternaria solani and A. tomatophila, by molecular and morphological features and aggressiveness // European Journal of Plant Pathology. — 2014. — V. 139. — №. 3. — P. 609-623. 125. Gaponenko N.I. A survey of fungi in the Bukhara region // Akad. Sa. Uzbekh — 1965. — 113 p. 126. Gardes M., Bruns T. D. ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes‐application to the identification of mycorrhizae and rusts // Molecular ecology. — 1993. — V. 2. — №. 2. — P. 113-118. 127. Garrido C., Carbu M., Fernandez-Acero F.J., Boonham N., Colyer A., Cantoral J.M., Budge G. Development of protocols for detection of Colletotrichum acutatum and monitoring of strawberry anthracnose using real‐time PCR // Plant Pathology. — 2009. — V. 58. — №. 1. — P. 43-51. 128. Geiser D.M., Jiménez-Gasco M., Kang S., Makalowska I., Veeraraghavan N., Ward T.J., Zhang N., Kuldau G.A., O’Donnell K. FUSARIUM-ID V. 1.0: A DNA sequence database for identifying Fusarium // Molecular Diversity and PCRdetection of Toxigenic Fusarium Species and Ochratoxigenic Fungi. — Springer Netherlands — 2004. — P. 473-479. 129. Gomez-Alpizar L., Saalau E., Picado I., Tambong J.T., Saborio F. A PCR‐RFLP assay for identification and detection of Pythium myriotylum, causal agent of the cocoyam root rot disease // Letters in applied microbiology. — 2011. — V. 52. — №. 3. — P. 185-192. 176 130. González E., Sutton T. B., Correll J. C. Clarification of the etiology of Glomerella leaf spot and bitter rot of apple caused by Colletotrichum spp. based on morphology and genetic, molecular, and pathogenicity tests // Phytopathology. — 2006. — V. 96. — №. 9. — P. 982-992. 131. Gonzalez M., Pujol M., Metraux J.P., Gonzalez‐Garcia V.I.C.E.N.T.E., Bolton M.D., Borrás‐Hidalgo O.R.L.A.N.D.O. Tobacco leaf spot and root rot caused by Rhizoctonia solani Kühn // Molecular plant pathology. — 2011. — V. 12. — №. 3. — P. 209-216. 132. Goud J.C., Termorshuizen A.J. Quality of methods to quantify microsclerotia of Verticillium dahliae in soil // European Journal of Plant Pathology. — 2003. — V. 109. — №. 6. — P. 523-534. 133. Gramaje D., Armengol J. Fungal trunk pathogens in the grapevine propagation process: potential inoculum sources, detection, identification, and management strategies // Plant Disease. — 2011. — V. 95. — №. 9. — P. 10401055. 134. Greuter W., Poelt J., Raimondo F. M. (ed.). A Check-list of Sicilian Fungi. — Published under the auspices of OPTIMA by the Herbarium Mediterraneum Panormitanum — 1991. — 222 p. 135. Groenewald S., Van Den Berg N., Marasas W.F., Viljoen A. The application of high-throughput AFLP's in assessing genetic diversity in Fusarium oxysporum f. sp. cubense // Mycological Research. — 2006. — V. 110. — №. 3. — P. 297-305. 136. Grunwald N.J., Martin F.N., Larsen M.M., Sullivan C.M., Press C.M., Coffey M.D., Hansen E.M., Parke J.L. Phytophthora-ID. org: a sequence-based Phytophthora identification tool // Plant Disease. — 2011. — V. 95. — №. 3. — P. 337-342. 137. Guerber J.C., Liu B., Correll J.C., Johnston P.R. Characterization of diversity in Colletotrichum acutatum sensu lato by sequence analysis of two gene introns, mtDNA and intron RFLPs, and mating compatibility // Mycologia. — 2003. — V. 95. — №. 5. — P. 872-895. 138. Guglielmo F., Bergemann S. E., Gonthier P., Nicolotti G., Garbelotto M.A. multiplex PCR‐based method for the detection and early identification of wood rotting fungi in standing trees // Journal of Applied Microbiology. — 2007. — V. 103. — №. 5. — P. 1490-1507. 139. Guillemette T., Iacomi-Vasilescu B., Simoneau P. Conventional and realtime PCR-based assay for detecting pathogenic Alternaria brassicae in cruciferous seed // Plant disease. — 2004. — V. 88. — №. 5. — P. 490-496. 177 140. Guo J.R., Schnieder F., Beyer M., Verreet J.A. Rapid Detection of Mycosphaerella graminicola in Wheat Using Reverse Transcription‐PCR Assay // Journal of phytopathology. — 2005. — V. 153. — №. 11‐12. — P. 674-679. 141. Guzmán-Plazola R.A., Fajardo-Franco M.L., Coffey M.D. Control of tomato powdery mildew (Leveillula taurica) in the Comarca Lagunera, Coahuila State, Mexico, supported by the spray forecast model Tomato // Crop Protection. — 2011. — V. 30. — №. 8. — P. 1006-1014. 142. Haase A.T., Retzel E.F., Staskus K.A. Amplification and detection of lentiviral DNA inside cells // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 1990. — V. 87. — №. 13. — P. 4971-4975. 143. Hanada R.E. Endophytic fungal diversity in Theobroma cacao (cacao) and T. grandiflorum (cupuaçu) trees and their potential for growth promotion and biocontrol of black-pod disease // Fungal biology. — 2010. — V. 114. — №. 11. — P. 901-910. 144. Hanlin R.T. Index to genera and species of ascomycetes described by AP Viegas // Mycotaxon. — 1992. — V. 43. — P. 207-230. 145. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J. Williams P.M. Real time quantitative PCR // Genome research. — 1996. — V. 6. — №. 10. — P. 986-994. 146. Hill G.T., Mitkowski N.M., Aldrich-Wolfe L., Emele L.R., Jurkonie D.D., Ficke A. Methods for assessing the composition and diversity of soil microbial communities // Applied soil ecology. — 2000. — V. 15. — №. 1. — P. 25-36. 147. Hitchcock C.J., Chambers S.M., Anderson I.C., Cairney J.W.G. Development of markers for simple sequence repeat-rich regions that discriminate between Pisolithus albus and P. microcarpus // Mycological research. — 2003. — V. 107. — №. 06. — P. 699-706. 148. Hodge K.T., Krasnoff S.B., Humber R.A. Tolypocladium inflatum is the anamorph of Cordyceps subsessilis // Mycologia. — 1996. — P. 715-719. 149. Holdenrieder O., Sieber T.N. Fungal associations of serially washed healthy non-mycorrhizal roots of Picea abies // Mycological Research. — 1992. — V. 96. — №. 2. — P. 151-156. 150. Hong S.Y., Kang M.R., Cho E.J., Kim H.K., Yun S.H. Specific PCR detection of four quarantine Fusarium species in Korea // The Plant Pathology Journal. — 2010. — V. 26. — №. 4. — P. 409-416. 151. Hooker W. J. Compendium of potato diseases. – International Potato Center, — 1981. — Т. 8. — 125 p. 178 152. Horton T.R., Bruns T.D. The molecular revolution in ectomycorrhizal ecology: peeking into the black‐box // Molecular ecology. — 2001. — V. 10. — №. 8. — P. 1855-1871. 153. Hoshino Y.T. Molecular Analyses of Soil Fungal Community-Methods and Applications. — INTECH Open Access Publisher — 2012. — 27 p. 154. Hoshino Y.T., Morimoto S. Soil clone library analyses to evaluate specificity and selectivity of PCR primers targeting fungal 18S rDNA for denaturing-gradient gel electrophoresis (DGGE) // Microbes and Environments. — 2010. — V. 25. — №. 4. — P. 281-287. 155. Huang J., Kang Z. Detection of Thielaviopsis basicola in soil with real-time quantitative PCR assays // Microbiological research. — 2010. — V. 165. — №. 5. — P. 411-417. 156. Hughes T.J., Atallah Z.K., Grau C.R. Real-Time PCR Assays for the Quantification of Phialophora gregata f. sp. sojae IGS Genotypes A and B // Phytopathology. — 2009. — V. 99. — №. 9. — P. 1008-1014. 157. Hunger R.M., McIntyre G.A. Occurrence, development, and losses associated with silver scurf and black dot on Colorado potatoes // American Potato Journal. — 1979. — V. 56. — №. 6. — P. 289-306. 158. Hyun J.W., Yi S.H., MacKenzie S.J., Timmer L.W., Kim K.S., Kang S.K., Lim H.C. Pathotypes and genetic relationship of worldwide collections of Elsinoë spp. causing scab diseases of citrus // Phytopathology. — 2009. — V. 99. — №. 6. — P. 721-728. 159. Inami K., Yoshioka C., Hirano Y., Kawabe M., Tsushima S., Teraoka T., Arie T. Real-time PCR for differential determination of the tomato wilt fungus, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, and its races // Journal of General Plant Pathology. — 2010. — V. 76. — №. 2. — P. 116-121. 160. Izzo A.D., Mazzola M. Hybridization of an ITS-based macroarray with ITS community probes for characterization of complex communities of fungi and fungal-like protists // Mycological research. — 2009. — V. 113. — №. 6. — P. 802-812. 161. Jackson J.A. Molecular Approaches to Estimating Soil Fungal Diversity and Community Shifts in in Response to Land-Use Change. — Duke University, 2010. 162. Jelev Z.J., Bobev S.G., Minz D., Maymon M., Freeman S. First report of anthracnose fruit rot caused by Colletotrichum acutatum on pepper and tomato in Bulgaria // Plant Disease. — 2008. — V. 92. — №. 1. — P. 172-172. 179 163. Jimenez-Fernandez D., Montes-Borrego M., Navas-Cortes J.A., JimenezDiaz R.M., Landa B.B. Identification and quantification of Fusarium oxysporum in planta and soil by means of an improved specific and quantitative PCR assay // Applied soil ecology. — 2010. — V. 46. — №. 3. — P. 372-382. 164. Johnson J. Host plants of Thielavia basicola // Journal of Agricultural Research. — 1916. — V. 7. — №. 6. — P. 289. 165. Johnson R.D, Johnson L.J., Kohmoto K., Otani H., Lane C.R., Kodama M., A polymerase chain reaction-based method to specifically detect Alternaria alternata apple pathotype (A. mali), the causal agent of Alternaria blotch of apple // Phytopathology. — 2000. — V. 90. — №. 9. — P. 973-976. 166. Jones R.W., Perez F.G. First report of anthracnose caused by Colletotrichum acutatum on tamarillo in the United States // Studies in Mycology. — 2012. — V. 73. — P. 37-113. 167. Jumpponen A. Soil fungal communities underneath willow canopies on a primary successional glacier forefront: rDNA sequence results can be affected by primer selection and chimeric data // Microbial Ecology. — 2007. — V. 53. — №. 2. — P. 233-246. 168. Jumpponen A. Soil fungal community assembly in a primary successional glacier forefront ecosystem as inferred from rDNA sequence analyses // New Phytologist. — 2003. — V. 158. — №. 3. — P. 569-578. 169. Kamoun S. Molecular genetics of pathogenic oomycetes // Eukaryotic cell. — 2003. — V. 2. — №. 2. — P. 191-199. 170. Kapsa J.S. Important threats in potato production and integrated pathogen/pest management // Potato research. — 2008. — V. 51. — №. 3-4. — P. 385-401. 171. Kapsa J.S., Osowski J. Host-pathogen interaction between Alternaria species and S. tuberosum under different conditions // PPO Special Report ― 2012 ― No. 15 ― P. 107-113. 172. Kårén O., Nylund J.E. Effects of ammonium sulphate on the community structure and biomass of ectomycorrhizal fungi in a Norway spruce stand in southwestern Sweden // Canadian Journal of Botany. — 1997. — V. 75. — №. 10. — P. 1628-1642. 173. Karlsson I., Friberg H., Steinberg C., Persson P. Fungicide effects on fungal community composition in the wheat phyllosphere // PLoS ONE — 2014. 180 174. Kesseli R.V., Paran I., Michelmore R.W. Analysis of a detailed genetic linkage map of Lactuca sativa (lettuce) constructed from RFLP and RAPD markers // Genetics. — 1994. — V. 136. — №. 4. — P. 1435-1446. 175. Kiss L., Takamatsu S., Cunnington J.H. Molecular identification of Oidium neolycopersici as the causal agent of the recent tomato powdery mildew epidemics in North America // Plant Disease. — 2005. — V. 89. — №. 5. — P. 491-496. 176. Kolombet L.V., Kolesova D.A., Chmyr P.G. Diagnostics of phytopathogen infection in agricultural plants as a necessary condition for optimizing current fungicide application technologies // J. of Agricultural Technology. — 2006. — 2. — P. 99–110. 177. Konstantinova P., Bonants P.J.M., van Gent-Pelzer M.P.E., van der Zouwen P., van den Bulk R. Development of specific primers for detection and identification of Alternaria spp. in carrot material by PCR and comparison with blotter and plating assays // Mycological Research. — 2002. — V. 106. — №. 01. — P. 23-33. 178. Kowalchuk G.A., Drigo B., Yergeau E.,van Veen J.A. Assessing bacterial and fungal community structure in soil using ribosomal RNA and other structural gene markers // Nucleic acids and proteins in soil. — Springer Berlin Heidelberg, 2006. — P. 159-188. 179. Kox L.F., Brouwershaven I.R., Vossenberg B.T., Beld H.E., Bonants P.J., Gruyter J. Diagnostic values and utility of immunological, morphological, and molecular methods for in planta detection of Phytophthora ramorum // Phytopathology. — 2007. — V. 97. — №. 9. — P. 1119-1129. 180. Kranz J. Vergleichende untersuchungen an Phoma-isolierungen von der Kartoffel (Solanum tuberosum) // Sydowia. — 1963. — V. 16. — №. 1962. — P. 1-40. 181. Kudela V., Krejzar V., Pánková I. Pseudomonas corrugata and Pseudomonas marginalis associated with the collapse of tomato plants in rockwool slab hydroponic culture // Plant Protection Science. — 2010. — V. 46. — №. 1. — P. 1-11. 182. Kuthubutheen A.J., Pugh G.J.F. Effects of fungicides on physiology of phylloplane fungi // Transactions of the British Mycological Society. — 1978. — V. 71. — №. 2. — P. 261-269. 183. Kuzdraliński A., Szczerba H., Tofil K., Filipiak A., Garbarczyk E., Dziadko P. Early PCR-based detection of Fusarium culmorum, F. graminearum, F. 181 sporotrichioides and F. poae on stem bases of winter wheat throughout Poland // European Journal of Plant Pathology. — 2014. — V. 140. — №. 3. — P. 491-502. 184. Lamichhane J.R., Venturi V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend // Frontiers in Plant Science. — 2015. — V. 6. — P. 385. 185. Landgraf A., Reckmann B., Pingoud A. Direct analysis of polymerase chain reaction products using enzyme-linked immunosorbent assay techniques // Analytical biochemistry. — 1991. — V. 198. — №. 1. — P. 86-91. 186. Langrell S.R.H., Glen M., Alfenas A.C. Molecular diagnosis of Puccinia psidii (guava rust)–a quarantine threat to Australian eucalypt and Myrtaceae biodiversity // Plant Pathology. — 2008. — V. 57. — №. 4. — P. 687-701. 187. Larena I., Salazar O., González V., Julián M.C., Rubio V. Design of a primer for ribosomal DNA internal transcribed spacer with enhanced specificity for ascomycetes // Journal of Biotechnology. — 1999. — V. 75. — №. 2. — P. 187-194. 188. Larsen J.E., Hollingsworth C.R., Flor J., Dornbusch M.R., Simpson N.L., Samac D.A. Distribution of Phoma sclerotioides on alfalfa and winter wheat crops in the North Central United States // Plant disease. — 2007. — V. 91. — №. 5. — P. 551-558. 189. Lawrence D.P., Gannibal P.B., Peever T.L., Pryor B.M. The sections of Alternaria: formalizing species-group concepts // Mycologia. — 2013. — V. 105. — №. 3. — P. 530-546. 190. Le May C., Potage G., Andrivon D., Tivoli B., Outreman Y. Plant disease complex: antagonism and synergism between pathogens of the Ascochyta blight complex on pea // Journal of phytopathology. — 2009. — V. 157. — №. 11‐12. — P. 715-721. 191. Lees A.K., Sullivan L., Lynott J.S., Cullen D.W. Development of a quantitative real-time PCR assay for Phytophthora infestans and its applicability to leaf, tuber and soil samples // Plant Pathology. — 2012. — V. 61. — P. 867-876. 192. Lees A.K. Hilton A.J. Black dot (Colletotrichum coccodes): an increasingly important disease of potato // Plant Pathology. — 2003. — V. 52. — P. 3-12. 193. Leiminger J., Bäßler E., Knappe C., Bahnweg G., Hausladen H. Quantification of disease progression of Alternaria spp. on potato using real-time PCR // European Journal of Plant Pathology. — 2015. — V. 141. — №. 2. — P. 295-309. 182 194. Leiminger J.H., Adolf B., Hausladen H. Occurrence of the F129L mutation in Alternaria solani populations in Germany in response to QoI application, and its effect on sensitivity // Plant pathology. — 2014. — V. 63. — №. 3. — P. 640-650. 195. Leorakkar W.M., Navarro B., Lobo M., Tukensreen L.J. Phoma audina var. crystilliniformis, a new pathogen of tomato and potato in Andes // Fito Pathologia — 1986. — V. 21. — P. 401-408. 196. Lévesque C.A., Harlton C.E., de Cock A.W.A.M. Identification of some oomycetes by reverse dot blot hybridization // Phytopathology. — 1998. — V. 88. — №. 3. — P. 213-222. 197. Lewis Ivey M.L., Nava-Diaz C., Miller S.A. Identification and management of Colletotrichum acutatum on immature bell peppers // Plant disease. — 2004. — V. 88. — №. 11. — P. 1198-1204. 198. Li Y.P., You M., Khan T., Finnegan P.M., Barbetti M.J. First report of Phoma herbarum on field pea (Pisum sativum) in Australia // Plant Disease. — 2014. — V. 98. — №. 6. — P. 790-796. 199. Li Y.P., You M.P., Finnegan P.M., Khan T.N., Lanoiselet V., Eyres N. First report of black spot caused by Boeremia exigua var. exigua on field pea in Australia // Plant Disease. — 2014. — V. 98. — №. 6. — P. 790-796. 200. Lievens B., Claes L., Vakalounakis D.J., Vanachter A.C., Thomma B.P. A robust identification and detection assay to discriminate the cucumber pathogens Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum and f. sp. radicis‐cucumerinum // Environmental Microbiology. — 2007. — V. 9. — №. 9. — P. 2145-2161. 201. Lievens B., Thomma B.P.H.J. Recent developments in pathogen detection arrays: implications for fungal plant pathogens and use in practice // Phytopathology. — 2005. — V. 95. — №. 12. — P. 1374-1380. 202. Lim Y., Kim B., Kim C., Jung H.S., Kim B.S., Lee J.H., Chun J. Assessment of soil fungal communities using pyrosequencing // The Journal of Microbiology. — 2010. — V. 48. — №. 3. — P. 284-289. 203. Lindner D.L., Banik M.T. Effects of cloning and root-tip size on observations of fungal ITS sequences from Picea glauca roots // Mycologia. — 2009. — V. 101. — №. 1. — P. 157-165. 204. Liu P., Wang X.H., Li J.G., Qin W., Xiao C.Z., Zhao X., Liu X.L. Pyrosequencing Reveals Fungal Communities in the Rhizosphere of Xinjiang Jujube // BioMed research international. — 2015. — V. 2015. 183 205. Liu Y.L., Xi P.G., He X.L., Jiang Z.D. Phialophora avicenniae sp. no V. , a new endophytic fungus in Avicennia marina in China // Mycotaxon. — 2013. — V. 124. — №. 1. — P. 31-37. 206. Long A.A. In-situ polymerase chain reaction: foundation of the technology and today's options // European journal of histochemistry: EJH. — 1997. — V. 42. — №. 2. — P. 101-109. 207. Lord N.S., Kaplan C.W., Shank P., Kitts C.L., Elrod S.L. Assessment of fungal diversity using terminal restriction fragment (TRF) pattern analysis: comparison of 18S and ITS ribosomal regions // FEMS Microbiology Ecology. — 2002. — V. 42. — №. 3. — P. 327-337. 208. Lumini E., Orgiazzi A., Borriello R., Bonfante P., Bianciotto V. Disclosing arbuscular mycorrhizal fungal biodiversity in soil through a land‐use gradient using a pyrosequencing approach // Environmental Microbiology. — 2010. — V. 12. — №. 8. — P. 2165-2179. 209. Luo Y., Ma Z., Reyes H., Morgan D., Michailides T. Using real-time PCR to survey frequency of azoxystrobin-resistant allele G143A in Alternaria populations from almond and pistachio orchards in California // Pesticide biochemistry and physiology. — 2007. — V. 88. — №. 3. — P. 328-336. 210. Lyons J.I., Newell S.Y., Buchan A., Moran M.A. Diversity of ascomycete laccase gene sequences in a southeastern US salt marsh // Microbial Ecology. — 2003. — V. 45. — №. 3. — P. 270-281. 211. Ma Z., Michailides T.J. An Allele‐specific PCR Assay for Detecting Azoxystrobin‐resistant Alternaria Isolates from Pistachio in California // Journal of Phytopathology. — 2004. — V. 152. — №. 2. — P. 118-121. 212. Mahadevakumar S., Jayaramaiah K.M., Janardhana G.R. First Report of Leaf Spot Disease Caused by Epicoccum nigrum on Lablab purpureus in India // Plant Disease. — 2014. — V. 98. — №. 2. — P. 284-284. 213. Majer D., Lewis B.G., Mithen R. Genetic variation among field isolates of Pyrenopeziza brassicae // Plant Pathology. — 1998. — V. 47. — №. 1. — P. 22-28. 214. Manter D.K., Vivanco J.M. Use of the ITS primers, ITS1F and ITS4, to characterize fungal abundance and diversity in mixed-template samples by qPCR and length heterogeneity analysis // Journal of Microbiological Methods. — 2007. — V. 71. — №. 1. — P. 7-14. 215. Mareli J.P. Solanum lycopersicum as a Model System to Study Pathogenicity Mechanisms of Moniliophthora Perniciosa, the Causal Agent of Witches' Broom Disease of Theobroma Cacao. — ProQuest — 2008. — 178 p. 184 216. Martin K.J., Rygiewicz P.T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts // BMC microbiology. — 2005. — V. 5. — №. 1. — P. 28. 217. Martin M.T., Cobos R. Identification of fungi associated with grapevine decline in Castilla y León (Spain) // Phytopathologia Mediterranea. — 2007. — V. 46. — №. 1. — P. 18-25. 218. Martin F.N., Tooley P.W., Blomquist C. Molecular detection of Phytophthora ramorum and a Phytophthora ilicis-like species associated with sudden oak death in California // Phytopathology. — 2004. — V. 94. — P. 621631. 219. Mathur R.S. The Coelomycetes of India // The Coelomycetes of India. — 1979. - 460 p. 220. Matsuda Y., Sameshima T., Moriura N., Inoue K., Nonomura T., Kakutani K., Nishimura H., Kusakari S., Tamamatsu S., Toyoda H. Identification of individual powdery mildew fungi infecting leaves and direct detection of gene expression by single conidium polymerase chain reaction // Phytopathology. — 2005. — V. 95. — №. 10. — P. 1137-1143. 221. May L.A., Smiley B., Schmidt M.G. Comparative denaturing gradient gel electrophoresis analysis of fungal communities associated with whole plant corn silage // Canadian Journal of Microbiology. — 2001. — V. 47. — №. 9. — P. 829-841. 222. McColloch L.P. A study of the apple rot fungus Phialophora malorum // Mycologia. — 1944. — P. 576-590. 223. McKay G.J., Brown A.E., Bjourson A.J., Mercer P.C. Molecular characterisation of Alternaria linicola and its detection in linseed // European Journal of Plant Pathology. — 1999. — V. 105. — №. 2. — P. 157-166. 224. McMullen M.P., Bergstrom G.C., De Wolf E., Dill-Macky R., Hershman D., Shaner G. A unified effort to fight an enemy of wheat and barley: Fusarium head blight // Plant Disease. — 2012. — V. 96. — №. 12. — P. 1712-1728. 225. Mendes M.A.S., da Silva V. L., Dianese J.C. Fungos em plantas no Brasil. — Serviço de Produç o de Informaç o. — 1998. — 555 p. 226. Meng J., Wang Y. Rapid detection of Phytophthora nicotianae in infected tobacco tissues and soil samples based on its Ypt1 gene // Journal of phytopathology. — 2010. — V. 158. — №. 1. — P. 1-7. 227. Mercado Sierra A. Hifomicetes Demaciaceos de Sierra del Rosario, Cuba // Editorial Academica Havana. — 1984. — 181 p. 185 228. Meudt H.M., Clarke A.C. Almost forgotten or latest practice? AFLP applications, analyses and advances // Trends in plant science. — 2007. — V. 12. — №. 3. — P. 106-117. 229. Midorikawa G.E.O., Pinheiro M.R.R., Vidigal B.S., Arruda M.C., Costa F.F., Pappas G.J.Jr., Ribeiro S.G., Freire F., Miller R.N.G. Characterization of Aspergillus flavus strains from Brazilian Brazil nuts and cashew by RAPD and ribosomal DNA analysis // Letters in applied microbiology. — 2008. — V. 47. — №. 1. — P. 12-18. 230. Minerdi D., Moretti M., Li Y., Gaggero L., Garibaldi A., Gullino M.L. Conventional PCR and real time quantitative PCR detection of Phytophthora cryptogea on Gerbera jamesonii // European journal of plant pathology. — 2008. — V. 122. — №. 2. — P. 227-237. 231. Mirzaei S., Goltapeh E.M., Shams-Bakhsh M., Safaie N. Identification of Botrytis spp. on plants grown in Iran // Journal of phytopathology. — 2008. — V. 156. — №. 1. — P. 21-28. 232. Möhlenhoff P., Müller L., Gorbushina A.A., Petersen K. Molecular approach to the characterisation of fungal communities: methods for DNA extraction, PCR amplification and DGGE analysis of painted art objects // FEMS microbiology letters. — 2001. — V. 195. — №. 2. — P. 169-173. 233. Mónaco C.I., Alippi H., Mittidieri I., Nico A.I. Saprophytic fungi on tomato phylloplane: effect of fungicides and leaf position on abundance, composition and diversity // Acta Agronomica Hungarica. — 2001. — V. 49. — №. 3. — P. 243250. 234. Morgan-Jones G., Burch K. B. Studies in the genus Phoma. XI. Concerning Phoma lycopersici, the anamorph of Didymella lycopersici, causal organism of stem canker and fruit rot of tomato // Mycotaxon. — 1988. — V. 32. — P. 133-142. 235. Mouekouba L.D.O., Zhang Z.Z., Olajide E.K., Wang A.J., Wang A-X. Biological Control of Botrytis cinerea in Tomato Leaves. — International Conference on Agriculture and Biotechnology IPCBEE — 2013 — V. 60, P. 64-68 236. Moura M.L., Jacques L.A., Brito L.M., Mourao I.M., Duclos J. Tomato pith necrosis (TPN) caused by P. corrugata and P. mediterranea: severity of damages and crop loss assessment // I International Symposium on Tomato Diseases 695. — 2004. — P. 365-372. 237. Mugnai L., Graniti A., Surico G. Esca (black measles) and brown woodstreaking: two old and elusive diseases of grapevines // Plant disease. — 1999. — V. 83. — №. 5. — P. 404-418. 186 238. Mulenko W., Majewski T., Ruszkiewicz-Michalska M. A preliminary checklist of micromycetes in Poland. — W. Szafer Institute of Botany, Polish Academy of Sciences. — 2008. — P. 752. 239. Muyzer G., De Waal E.C., Uitterlinden A.G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA // Applied and environmental microbiology. — 1993. — V. 59. — №. 3. — P. 695-700. 240. Nanayakkara U.N., Singh M., Al-Mugharabi K.I., Peters R.D. Detection of Phytophthora erythroseptica in above-ground potato tissues, progeny tubers, stolons and crop debris using PCR techniques // American journal of potato research. — 2009. — V. 86. — №. 3. — P. 239-245. 241. Narayanasamy P. Microbial Plant Pathogens-Detection and Disease Diagnosis: Fungi. — Springer Science Business Media, — 2010. — V. 1. — 290 p. 242. Nicolaisen M., Justesen A.F., Thrane U., Skouboe P., Holmstrom K. An oligonucleotide microarray for the identification and differentiation of trichothecene producing and non-producing Fusarium species occurring on cereal grain // Journal of Microbiological Methods. — 2005. — V. 62. — №. 1. — P. 57-69. 243. Nikolic B., Schwab H., Sessitsch A. Metagenomic analysis of the 1aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase gene (acdS) operon of an uncultured bacterial endophyte colonizing Solanum tuberosum L // Archives of microbiology. — 2011. — V. 193. — №. 9. — P. 665-676. 244. Nishimura S., Kohmoto K. Host-specific toxins and chemical structures from Alternaria species // Annual review of phytopathology. — 1983. — V. 21. — №. 1. — P. 87-116. 245. Nocker A., Burr M., Camper A.K. Genotypic microbial community profiling: a critical technical review // Microbial ecology. — 2007. — V. 54. — №. 2. — P. 276-289. 246. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N. Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA // Nucleic acids research. — 2000. — V. 28. — №. 12. — P. 1-7. 247. Nuovo G.J. PCR in situ hybridization: protocols and applications. — Raven Press — 1994. — №. Ed. 2. 248. Nuovo G.J., MacConnell P., Forde A., Delvenne P. Detection of human papillomavirus DNA in formalin-fixed tissues by in situ hybridization after amplification by polymerase chain reaction // The American journal of pathology. — 1991. — V. 139. — №. 4. — P. 847. 187 249. O’Callaghan M., Gerard E.M., Waipara N.W., Young S.D., Glare T.R., Barrell P.J., Conner A.J. Microbial communities of Solanum tuberosum and magainin-producing transgenic lines // Plant and soil. — 2005. — V. 266. — №. 12. — P. 47-56. 250. Okubara P.A., Schroeder K.L., Paulitz T.C. Identification and quantification of Rhizoctonia solani and R. oryzae using real-time polymerase chain reaction // Phytopathology. — 2008. — V. 98. — №. 7. — P. 837-847. 251. Okubo A., Sugiyama S. Comparison of molecular fingerprinting methods for analysis of soil microbial community structure // Ecological research. — 2009. — V. 24. — №. 6. — P. 1399-1405. 252. Otani Y. Studies on the black root rot disease caused by Thielaviopsis basicola (Berk. & Br.) Ferraris // Bulletin Okayama Tobacco Experiment Station. — 1962. — V. 23. — P. 1-118. 253. Ottesen A, Pena A, White J, Pettengill J, Li C, Allard S, Rideout S, Allard M, Hill T, Evans P, Strain E, Musser S, Knight R, Brown E. Baseline survey of the anatomical microbial ecology of an important food plant: Solanum lycopersicum (tomato) // BMC microbiology. — 2013. — V. 13. — №. 1. — P. 114. 254. Pace M. A., Campbell R. The effect of saprophytes on infection of leaves of Brassica spp. by Alternaria brassicicola // Transactions of the British Mycological Society. — 1974. — V. 63. — №. 1. — P. 193-196. 255. Padmanabhan R, Mohanraj D, Alexander K.C., Jothi R. Early and rapid detection of sugarcane smut by histological/immunological methods // Detection of Plant Pathogens and Their Management. — 1995. — P. 344-356. 256. Pan L., Ash G.J., Ahn B., Watson A.K. Development of strain specific molecular markers for the Sclerotinia minor bioherbicide strain IMI 344141 // Biocontrol Science and Technology. — 2010. — V. 20. — №. 9. — P. 939-959. 257. Pannecoucque J., Höfte M. Detection of rDNA ITS polymorphism in Rhizoctonia solani AG 2-1 isolates // Mycologia. — 2009. — V. 101. — №. 1. — P. 26-33. 258. Park J., Park B., Veeraraghavan N., Blair J.E., Geiser D.M., Isard S., Mansfield M.A., Nikolaeva E., Park S.-Y., Russo J., Kim S.H., Greene M., Ivors K.L., Balci Y., Peiman M., Erwin D.C., Coffey M.D., Jung K., Lee Y.-H., Rossman A., Farr D., Cline E., Grunwald N.J., Luster D.G., Schrandt J., Martin F., Ribeiro O.K., Makalowska I., Kang S. Phytophthora database: a forensic database supporting the identification and monitoring of Phytophthora // Plant disease. — 2008. — V. 92. — №. 6. — P. 966-972. 188 259. Park B., Park J., Cheong K-C., Choi J., Jung K., Kim D., Lee Y.H., Ward T.J., O'Donnell K., Geiser D.M., Kang S. Cyber infrastructure for Fusarium: three integrated platforms supporting strain identification, phylogenetics, comparative genomics and knowledge sharing // Nucleic acids research. — 2010. — V. 39, Supplement. 1, — P. 640-646. 260. Pavón M.Á., Luna A., de la Cruz S., González I., Martín R., García T. PCRbased assay for the detection of Alternaria species and correlation with HPLC determination of altenuene, alternariol and alternariol monomethyl ether production in tomato products // Food Control. — 2012. — V. 25. — №. 1. — P. 45-52. 261. Peever T.L., Su G., Carpenter-Boggs L., Timmer L.W. Molecular systematics of citrus-associated Alternaria species // Mycologia. — 2004. — V. 96. — №. 1. — P. 119-134. 262. Petrosino J.F., Highlander S., Luna R.A., Gibbs R.A. Versalovic J. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification // Clinical chemistry. — 2009. — V. 55. — №. 5. — P. 856-866. 263. Porter‐Jordan K., Rosenberg E.I., Keiser J.F., Gross J.D., Ross A.M., Nasim S., Garrett C.T. Nested polymerase chain reaction assay for the detection of cytomegalovirus overcomes false positives caused by contamination with fragmented DNA // Journal of medical virology. — 1990. — V. 30. — №. 2. — P. 85-91. 264. Prospero S., Black J.A., Winton L.M. Isolation and characterization of microsatellite markers in Phytophthora ramorum, the causal agent of sudden oak death // Molecular Ecology Notes. — 2004. — V. 4. — №. 4. — P. 672-674. 265. Pryor B.M., Michailides T.J. Morphological, pathogenic, and molecular characterization of Alternaria isolates associated with Alternaria late blight of pistachio // Phytopathology. — 2002. — V. 92. — №. 4. — P. 406-416. 266. Qin L., Fu Y., Xie J., Cheng J., Jiang D., Li G., Huang J. A nested‐PCR method for rapid detection of Sclerotinia sclerotiorum on petals of oilseed rape (Brassica napus) // Plant pathology. — 2011. — V. 60. — №. 2. — P. 271-277. 267. Radišek S., Jakše J., Javornik B. Development of pathotype-specific SCAR markers for detection of Verticillium albo-atrum isolates from hop // Plant disease. — 2004. — V. 88. — №. 10. — P. 1115-1122. 268. Rai B., Singh D.B. Antagonistic activity of some leaf surface microfungi against Alternaria brassicae and Drechslera graminea // Transactions of the British Mycological Society. — 1980. — V. 75. — №. 3. — P. 363-369. 269. Raid R.N. Pennypacker S.P. Weeds as hosts for Colletotrichum coccodes // Plant disease. — 1987. — V. 71. — №. 7. — P. 643-646. 189 270. Ranjard L., Poly F., Mougel C., Thioulouse J., Nazaret S. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: biological and methodological variability // Applied and environmental microbiology. — 2001. — V. 67. — №. 10. — P. 4479-4487. 271. Read P.J., Hide G.A. Development of black dot disease (Colletotrichum coccodes (Wallr.) Hughes) and its effects on the growth and yield of potato plants // Annals of applied Biology. — 1995. — V. 127. — №. 1. — P. 57-72. 272. Rizatto S., Rizatto S., de Araújo Batista C.E., Bajay M.M., Sigrist M.S., Ito M. F., Monteiro M., Zucchi M.I. A new set of microsatellite markers for the genetic characterization of Ceratocystis fimbriata, an economically important plant pathogen // Conservation Genetics Resources. — 2010. — V. 2. — №. 1. — P. 5558. 273. Roberts R.G. Alternaria yaliinficiens sp. nov. on Ya Li pear fruit: from interception to identification // Plant disease. — 2005. — V. 89. — №. 2. — P. 134-145. 274. Roesch L.F.W., Fulthorpe R.R., Riva A., Casella G., Hadwin A.K.M., Kent A.D., Daroub S.H., Camargo F.A.O., Farmerie W.G., Triplett E.W. Pyrosequencing enumerates and contrasts soil microbial diversity // The ISME journal. — 2007. — V. 1. — №. 4. — P. 283-290. 275. Romero F.M., Marina M., Pieckenstain F.L. The communities of tomato (Solanum lycopersicum L.) leaf endophytic bacteria, analyzed by 16S-ribosomal RNA gene pyrosequencing // FEMS microbiology letters. — 2014. — V. 351. — №. 2. — P. 187-194. 276. Ronaghi M., Karamohamed S., Pettersson B., Uhlén M., Nyrén P. Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release // Analytical biochemistry. — 1996. — V. 242. — №. 1. — P. 84-89. 277. Rosenzweig N., Olaya G., Atallah Z.K., Cleere S., Stanger C., Stevenson W.R. Monitoring and tracking changes in sensitivity to azoxystrobin fungicide in Alternaria solani in Wisconsin // Plant Disease. — 2008. — V. 92. — №. 4. — P. 555560. 278. Rotem J. The genus Alternaria: biology, epidemiology, and pathogenicity. — St. Paul: APS Press — 1994. — 326 p. 279. Sagar V., Sugha S.K. Role of individual and combined inocula on the development of pea root rot // Indian Phytopathology. — 1997. — V. 50. — №. 4. — P. 499-503. 280. Saiki R.K. Amplification of genomic DNA // PCR protocols: A guide to methods and applications. — 1990. — V. 2. — P. 13-20. 190 281. Samuelian S.K., Greer L.A., Savocchia S., Steel C.C. Detection and monitoring of Greeneria uvicola and Colletotrichum acutatum development on grapevines by real-time PCR // Plant Disease. — 2011. — V. 95. — №. 3. — P. 298-303. 282. Sanju S., Thakur A., Siddappa S., Sreevathsa R., Srivastava N., Shukla P., Singh B.P. Pathogen virulence of Phytophthora infestans: from gene to functional genomics // Physiol Mol Biol Plants. — 2013. — V. 19 — № 2. — P. 165–177. 283. Sarbhoy A.K., Lal G., Varshney J.L. Fungi of India (1967-71) // Fungi of India– 1971. — Navyug Traders, New Delhi — 148 p. 284. Schena L., Cooke D.E.L. Assessing the potential of regions of the nuclear and mitochondrial genome to develop a “molecular tool box” for the detection and characterization of Phytophthora species // Journal of Microbiological Methods. — 2006. — V. 67. — №. 1. — P. 70-85. 285. Schmidt H., Taniwaki M.H., Vogel R.F., Niessen L. Utilization of AFLP markers for PCR‐based identification of Aspergillus carbonarius and indication of its presence in green coffee samples // Journal of Applied Microbiology. — 2004. — V. 97. — №. 5. — P. 899-909. 286. Schmidt O., Moreth U. Identification of the dry rot fungus, Serpula lacrymans, and the wild merulius, S. himantioides, by amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) // Holzforschung. — 1999. — V. 53. — №. 2. — P. 123128. 287. Schol-Schwarz M.B. The genus Epicoccum Link // Transactions of the British Mycological Society. — 1959. — V. 42. — №. 2. — P. 149-173. 288. Schumm J.W. Knowlton R.G., Braman J.C., Barker D.F., Botstein D., Akots G., Rediker K. Identification of more than 500 RFLPs by screening random genomic clones // American journal of human genetics. — 1988. — V. 42. — №. 1. — P. 143-159. 289. Seifert K.A. The genera of Hyphomycetes. — Utrecht : CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre — 2011. — 997 p. 290. Sequerra J., Marmeisse R., Valla G., Normand P., Capellano A., Moiroud A. Taxonomic position and intraspecific variability of the nodule forming Penicillium nodositatum inferred from RFLP analysis of the ribosomal intergenic spacer and random amplified polymorphic DNA // Mycological Research. — 1997. — V. 101. — №. 04. — P. 465-472. 291. Shaw D.E. Microorganisms in Papua New Guinea // Research Bulletin, Department of Primary Industry, Papua New Guinea. — 1984. — №. 33. — 344 p. 191 292. Sheridan G.E.C., Masters C.I., Shallcross J.A., Mackey B.M. Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coli Cells // Applied and Environmental Microbiology. — 1998. — V. 64. — №. 4. — P. 1313-1318. 293. Shew H.D., Meyer J.R. Thielaviopsis // Methods for Research on Soilborne Phytopathogenic Fungi. — The American Phytopathological Society, St. Paul, MN. — 1992. — P. 171-174. 294. Silvar C., Díaz J., Merino F. Real-time polymerase chain reaction quantification of Phytophthora capsici in different pepper genotypes // Phytopathology. — 2005. — V. 95. — №. 12. — P. 1423-1429. 295. Simmons E.G. Alternaria taxonomy: current status, viewpoint, challenge // Alternaria: biology, plant diseases, and metabolites — 1992. — P. 1-36. 296. Simmons E.G. Alternaria themes and variations (236-243): host-specific toxin producers // Mycotaxon. — 1999. — V. 70. — P. 325-369. 297. Simmons E.G. Alternaria themes and variations (244-286) species on Solanaceae // Mycotaxon. — 2000. — V. 75. — P. 1-115. 298. Simmons E.G. Alternaria: An Indentification Manual // CBS Fungal Biodiversity Centre. — Utrecht, Netherlands. — 2007. — 780 p. 299. Smit E., Leeflang P., Glandorf B., van Elsas J.D., Wernars K. Analysis of fungal diversity in the wheat rhizosphere by sequencing of cloned PCR-amplified genes encoding 18S rRNA and temperature gradient gel electrophoresis // Applied and Environmental Microbiology. — 1999. — V. 65. — №. 6. — P. 2614-2621. 300. Somai B.M., Keinath A.P., Dean R.A. Development of PCR-ELISA for detection and differentiation of Didymella bryoniae from related Phoma species // Plant Disease. — 2002. — V. 86. — №. 7. — P. 710-716. 301. Soyer J.L., El Ghalid M., Glaser N., Ollivier B., Linglin J. Epigenetic control of effector gene expression in the plant pathogenic fungus Leptosphaeria maculans // PLoS Genetics. — 2014. — V. 10. — №. 3. 302. Stewart J.E., Kim M.S., James R.L., Dumroese R.K., Klopfenstein N.B. Molecular characterization of Fusarium oxysporum and Fusarium commune isolates from a conifer nursery // Phytopathology. — 2006. — V. 96. — №. 10. — P. 1124-1133. 303. Stringari D. High molecular diversity of the fungus Guignardia citricarpa and Guignardia mangiferae and new primers for the diagnosis of the citrus black spot // Brazilian Archives of Biology and Technology. — 2009. — V. 52. — №. 5. — P. 1063-1073. 192 304. Sun Y.L., Park W.G., Oh H.K., Hong S.K. Plant-specific primers for the amplification of the nrDNA ITS region in fungus-associated Pulsatilla species // Journal of Medicinal Plants Research. — 2013. — V. 7. — №. 27. — P. 1969-1978. 305. Sutton B.C. Mitosporic fungi from Malawi // Mycol. Pap. — 1993. — V. 167 — P. 1-93. 306. Taheri P. Genetic Diversity of Thanatephorus cucumeris Infecting Tomato in Iran // Journal of Phytopathology. — 2015. — V. 163. — №. 1. — P. 19-32. 307. Tai F.L. Sylloge Fungorum Sinicorum // Sylloge fungorum Sinicorum. — 1979 — 1527 p. 308. Takamatsu S., Nakano M., Yokota H., Kunoh H. Detection of Rhizoctonia solani AG-2-2-IV, the causal agent of large patch of Zoysiagrass, using plasmid DNA as probe. // Annals of the Phytopathological Society of Japan. — 1998. — V. 64. — No.5 — 451 p. 309. Tegge V., Stammler G. Early Blight: Pathogenicity of Alternaria solani and Alternaria alternata and fungicidal activity // PPO Special Report ―2014― No. 16. — P. 271-273. 310. Telias A, White J.R., Pahl D.M., Ottesen A.R., Walsh C.S. Bacterial community diversity and variation in spray water sources and the tomato fruit surface // BMC microbiology. — 2011. — V. 11. — №. 1. — P. 81. 311. Tewoldemedhin Y.T., Mazzola M., Botha W.J., Spies C.F.J., McLeod A. Characterization of fungi (Fusarium and Rhizoctonia) and oomycetes (Phytophthora and Pythium) associated with apple orchards in South Africa // European Journal of Plant Pathology. — 2011. — V. 130. — №. 2. — P. 215-229. 312. Thanassoulopoulos C.C., Giapanoglou E. Two new and unusal dry rots of stored potatoes in Greece // Plant Disease. — 1994. — V. 78. — №. 9. — 924 p. 313. Thomma B.P., Van Esse H.P., Crous P.W., De Wit P.J.G.M. Cladosporium fulvum (syn. Passalora fulva), a highly specialized plant pathogen as a model for functional studies on plant pathogenic Mycosphaerellaceae // Molecular plant pathology. — 2005. — V. 6. — №. 4. — P. 379-393. 314. Thorn G. The fungi in soil // Modern soil microbiology. — 1997. — P. 63-127. 315. Tomlinson J.A., Barker I., Boonham N. Faster, simpler, more-specific methods for improved molecular detection of Phytophthora ramorum in the field // Applied and Environmental Microbiology. — 2007. — V. 73. — №. 12. — P. 4040-4047. 316. Tomlinson J.A., Dickinson M.J., Boonham N. Rapid detection of Phytophthora ramorum and P. kernoviae by two-minute DNA extraction followed 193 by isothermal amplification and amplicon detection by generic lateral flow device // Phytopathology. — 2010. — V. 100. — №. 2. — P. 143-149. 317. Tooley P.W., Bunyard B.A.,Carras M.M., Hatziloukas E. Development of PCR primers from internal transcribed spacer region 2 for detection of Phytophthora species infecting potatoes // Applied and Environmental Microbiology. — 1997. — V. 63. — №. 4. — P. 1467-1475. 318. Tooley P.W., Hatziloukas E., Scott D.L., Carras M.M. Use of ligase chain reaction for enhanced detection of Phytophthora infestans // Canadian journal of plant pathology. — 2002. — V. 24. — №. 3. — P. 294-301. 319. Torsvik V., Daae F.L., Sandaa R.A., Ovreås L. Novel techniques for analysing microbial diversity in natural and perturbed environments // Journal of biotechnology. — 1998. — V. 64. — №. 1. — P. 53-62. 320. Tozze Júnior H.J., Firmino A.C., Fischer I.H., Furtado E.L., Massola Júnior N.S. Characterization of Colletotrichum spp. isolates associated with fruit trees in the state of S o Paulo // Summa Phytopathologica. — 2015. — V. 41. — №. 4. — P. 270-280. 321. Tran H.S., You M., Li Y., Khan T.N., Barbetti M.J. First report of Phoma herbarum on field pea (Pisum sativum) in Australia // Plant Disease. — 2014. — V. 98. — №. 6. — P. 790-796. 322. Tsror L., Erlich O., Hazanovsky M. Effect of Colletotrichum coccodes on potato yield, tuber quality, and stem colonization during spring and autumn // Plant disease. — 1999. — V. 83. — №. 6. — P. 561-565. 323. Vainio E.J., Hantula J. Direct analysis of wood-inhabiting fungi using denaturing gradient gel electrophoresis of amplified ribosomal DNA // Mycological research. — 2000. — V. 104. — №. 08. — P. 927-936. 324. Valueva T.A., Kudryavtseva N.N., Sofyin A.V., Zaitchik B.T., Pobedinskaya M.A. Serine Exoproteinases Secreted by the Pathogenic Fungi of Alternaria Genus. // J Plant Pathology and Microbiology — 2015 — V. 6. — P. 272-274. 325. van den Heuvel J. Effects of Aureobasidium pullulans on numbers of lesions on dwarf bean leaves caused by Alternaria zinniae // Netherlands Journal of Plant Pathology. — 1969. — V. 75. — №. 5. — P. 300-307. 326. van Doorn R., Slawiak M., Szemes M., Dullemans A.M., Bonants P., Kowalchuk G.A., Schoen C.D. Robust detection and identification of multiple oomycetes and fungi in environmental samples by using a novel cleavable padlock 194 probe-based ligation detection assay // Applied and environmental microbiology. — 2009. — V. 75. — №. 12. — P. 4185-4193. 327. van Elsas J.D., Duarte G.F., Keijzer-Wolters A.C., Smit E. Analysis of the dynamics of fungal communities in soil via fungal-specific PCR of soil DNA followed by denaturing gradient gel electrophoresis // Journal of microbiological methods. — 2000. — V. 43. — №. 2. — P. 133-151. 328. Vancov T., Keen B. Amplification of soil fungal community DNA using the ITS86F and ITS4 primers // FEMS microbiology letters. — 2009. — V. 296. — №. 1. — P. 91-96. 329. Viaud M., Pasquier A., Brygoo Y. Diversity of soil fungi studied by PCR– RFLP of ITS // Mycological Research. — 2000. — V. 104. — №. 09. — P. 1027-1032. 330. Víchová J., Stanková B., Pokorný R. First report of Colletotrichum acutatum on tomato and apple fruits in the Czech Republic // Plant Disease. — 2012. — V. 96. — №. 5. — P. 769-769. 331. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting // Nucleic acids research. — 1995. — V. 23. — №. 21. — P. 44074414. 332. Waller J.M., Bailey J.A., Jeger M.J. Colletotrichum diseases of perennial and other cash crops // Colletotrichum: biology, pathology and control. — 1992. — P. 167-185. 333. Wani A.H. An overview of the fungal rot of tomato // Mycopathology. — 2011. — V. 9. — No.1. — P. 33-38. 334. Weir B.S., Johnston P.R., Damm U. The Colletotrichum gloeosporioides species complex // Studies in Mycology. — 2012. — V. 73. — P. 115-180. 335. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic acids research. — 1990. — V. 18. — №. 24. — P. 7213-7218. 336. Wen A., Mallik I., Alvarado V.Y., Pasche J.S., Wang X., Li W. Detection, distribution, and genetic variability of'Candidatus Liberibacter'species associated with zebra complex disease of potato in North America // Plant Disease. — 2009. — V. 93. — №. 11. — P. 1102-1115. 337. White T.J., Bruns T., Lee S., Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics // PCR protocols: a guide to methods and applications. — 1990. — V. 18. — P. 315-322. 195 338. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic acids research. — 1990. — V. 18. — №. 22. — P. 6531-6535. 339. Winton L.M., Krohn A.L., Leiner R.H. Microsatellite markers for Sclerotinia subarctica nom. prov. , a new vegetable pathogen of the High North // Molecular Ecology Notes. — 2007. — V. 7. — №. 6. — P. 1077-1079. 340. Winton L.M., Hansen E.M. Molecular diagnosis of Phytophthora lateralis in trees, water, and foliage baits using multiplex polymerase chain reaction // Forest Pathology. — 2001. — V. 31. — №. 5. — P. 275-283. 341. Wittwer C.T., Herrmann M.G., Moss A.A., Rasmussen R.P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification // Biotechniques. — 1997. — V. 22. — №. 1. — P. 130-139. 342. Wood R. Active defense mechanisms in plants. — Springer Science & Business Media — 2012. — V. 37. — 381 p. 343. Wu C.P., Chen G.Y., Li B., Su H., An Y.L., Zhen S.Z., Ye J.R. Rapid and accurate detection of Ceratocystis fagacearum from stained wood and soil by nested and real‐time PCR // Forest Pathology. — 2011. — V. 41. — №. 1. — P. 15-21. 344. Xu M.L., Melchinger A.E., Lübberstedt T. Species-specific detection of the maize pathogens Sporisorium reiliana and Ustilago maydis by dot blot hybridization and PCR-based assays // Plant Disease. — 1999. — V. 83. — №. 4. — P. 390-395. 345. Yan L., Zhang C., Ding L., Ma Z. Development of a real‐time PCR assay for the detection of Cladosporium fulvum in tomato leaves // Journal of applied microbiology. — 2008. — V. 104. — №. 5. — P. 1417-1424. 346. Yergeau E., Filion M., Vujanovic V., St-Arnaud M. A PCR-denaturing gradient gel electrophoresis approach to assess Fusarium diversity in asparagus // Journal of microbiological methods. — 2005. — V. 60. — №. 2. — P. 143-154. 347. Yin Y., Ding L., Liu X., Yang J., Ma Z. Detection of Sclerotinia sclerotiorum in planta by a Real‐time PCR Assay // Journal of phytopathology. — 2009. — V. 157. — №. 7‐8. — P. 465-469. 348. Zaccaro R.P., Carareto-Alves L.M., Travensolo R.F., Wickert E., Lemos E.G.M. Use of molecular marker SCAR in the identification of Fusarium subglutinans, causal agent of mango malformation // Revista brasileira de fruticultura. — 2007. — V. 29. — №. 3. — P. 563-570. 196 Приложение 1 Таблица дисперсионного анализа влияния факторов «штамм» и «сорт» на фактор «диаметр некроза» Фактор Штамм Сорт Штамм*Сорт Ошибка SS 2146,17 5946,78 10228,1 63,67 df 7 12 84 208 MS 306,5952 495,5653 121,7626 0,3061 F 1001,651** 1619,02** 397,8** p 0,00 0,00 0,00 SS – сумма квадратов отклонений; df – число степеней свободы; MS – средний квадрат; F – значение F-критерия. ** – фактор является значимым на уровне p<0,05. 197
