УДК 158.1 ИЗМЕНЕНИЯ В СПЕКТРЕ СВОБОДНОЙ И КОНЪЮГИРОВАННЫХ ФОРМ ИНДОЛИЛ-3-УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЭКЗОГЕННОЙ ИУК НА ПРОРОСТКИ ПШЕНИЦЫ Л. Н. Олюнина, О. М. Лабынцева, А. Г. Куватова Нижегородский госуниверситет Выявлено, что для надземных органов проростков пшеницы в поддержании ауксинового гомеостаза существенную роль играют реакции конъюгирования, в частности перевод свободной ИУК в форму ее амидных конъюгатов. Указанный механизм реализуется при низких концентрациях экзогенной ИУК (10-9 М). Для корней и в варианте с высокими концентрациями экзогенной ИУК (10-6 М) более характерно включение ИУК-оксидазного контроля, сдвиг ауксинового метаболизма в сторону окислительного распада ИУК и, соответственно, снижение пула эндогенной индолил-3-уксусной кислоты. Проблемы физиологии взаимодействия между растениями и микроорганизмами развиваются в направлении познания внутренних механизмов жизнедеятельности бактерий, а также растения-хозяина. Предполагается, что образование растительно-бактериального ассоциата в значительной степени находится под контролем фитогормонов, и в частности индолил-3-уксусной кислоты (ИУК). Ауксины, присутствуя в клетках про- и эукариот, у высших растений выполняют функции регуляторов роста, для микроорганизмов – это один из экзометаболитов, выделяющийся в значительных количествах в окружающую среду (Полевой, 1985). Конкретная роль бактериальной ИУК в функционировании ассоциата «бактерии – высшие растения» до сих пор не установлена. Наименее изученным остается биохимизм ответных реакций растения на действие данной ИУК. Задача настоящей работы состояла в исследовании влияния экзогенно введенного препарата индолил-3-уксусной кислоты на содержание различных форм эндогенной ИУК в корнях и листьях проростков пшеницы. В одной из ранее опубликованных работ (Shabajev e. a., 1993) нами были выявлены изменения в гормональном (ауксиновом) статусе указанных проростков при их инокуляции бактериями рода Pseudomonas – P. putida, P. fluorescenus. Последние являются активными продуцентами ИУК (Олюнина, Шабаев, 1996). Представлял интерес ответ на вопрос – можно ли действие бактериального инокулята на растения заменить или приравнять к действию экзогенной ИУК? Другими словами – имеет ли место адекватность ответа растений на инокуляцию и повышенное содержание (экзогенно введенной) ИУК в среде их выращивания? Объектом исследований служили проростки яровой пшеницы (сорт Московская-35). Семена стерилизовали раствором перекиси водорода (10%, 10 мин.), промывали дистиллированной водой, раскладывали в чашки Петри и проращивали в термостате (260С). Проросшие семена высаживали в пластиковые сосуды на раствор CaSO4 (5·10-4 М). При достижении проростками 7-дневного возраста в питательную среду вносили препарат индолил-3-уксусной кислоты в конечной концентрации 10-9 или 10-6 М. Контролем служили проростки, выращенные на 109 растворах без добавления ИУК. Выделение свободной ИУК и отдельных ее фракций из корней и надземных частей исследуемых проростков осуществляли согласно схеме, подробно описанной в статье А. П. Веселова и др. (1998). Связанные формы ИУК, которые представлены амидными и эфирными ее конъюгатами, определяли после щелочного гидролиза (рН 11–12, t=100°, 1 ч). Гидролизат центрифугировали и далее использовали для анализа свободной ИУК, как указано выше. Количество выделенной ИУК определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (Кудоярова и др., 1986). Как видно из данных, представленных в таблице, для 7-дневных проростков яровой пшеницы характерно присутствие в тканях высоких концентраций конъюгированных форм ИУК. Последние в листьях составляли 79.7% от общей суммы всех фракций; процент конъюгатов ИУК в корнях был ниже – 49.1%. Снижение доли связанной ИУК в клетках корня обусловлено более высокой концентрацией свободной ИУК. Факт преобладания свободной (активной) формы индолилуксусной кислоты в корнях проростков пшеницы был отмечен нами ранее и, повидимому, связан с данной конкретной стадией онтогенеза растений (Олюнина и др., 1990). Из конъюгированных форм в исследуемых проростках пшеницы повышена концентрация ИУК, входящей в состав спирторастворимой фракции. Таблица Содержание свободной и связанной форм ИУК в 7-дневных проростках яровой пшеницы Определяемая форма ИУК Свободная Связанная спирторастворимая фракция спиртонерастворимая фракция Сумма Надземная часть проростков Корни мкг ИУК/ г сырой массы нг ИУК/ растение мкг ИУК/ г сырой массы нг ИУК/ растение 0.18±0.03 0.37±0.07 10.48±1.74 20.07±4.35 0.79±0.20 0.41±0.07 31.00±8.02 15.00±2.55 0.34±0.08 18.70±1.30 0.36±0.05 13.75±2.44 0.89±0.06 49.18±2.46 1.54±0.11 59.75±4.33 Изменения в пуле эндогенных ауксинов после обогащения среды выращивания проростков экзогенной индолилуксусной кислотой происходили быстро и могли быть обнаружены уже через 15 мин. после внесения препарата. При этом интересно отметить, что наибольшее возрастание уровня ауксинов имело место в варианте с низкой (10-9 М) концентрацией экзогеннодобавленной ИУК (см. рис.). Сумма всех определяемых фракций в данном варианте после 20-часового экспонирования увеличивалась в листьях до 12.64 мкг⋅г сырой массы (в контроле 0.89). В корнях эти величины соответствовали: опыт – 4.80 мкг⋅г сырой массы; контроль – 1.55 мкг⋅г сырой массы. В обогащении побегов пшеницы индолил-3-уксусной кислотой (см. рис., А) большую роль играла фракция спиртонерастворимых конъюгированных форм ИУК – в основном это конъюгаты индолилуксусной кислоты с пептидами и белками. Вероятно, именно данная фракция связанной ИУК «снима110 ет» избыток гормона, который появляется в растениях при их экспонировании на среде с экзогенной ИУК. Таким образом, по-видимому, правомерно предположить, что система конъюгирования ауксинов, в частности, образования амидных конъюгатов, играет большую роль в поддержании гомеостаза свободной, активной формы ИУК в листьях проростков. А В экспозиция: ИУК, мкг⋅г-1 сырой массы 20 1 – 1.5 ч 2 – 20 ч 15 10 0.5 1 0 2 -9 10 М 1 2 -6 10 М 1 0 2 1 -9 10 М концентрация экзогенной ИУК 2 10 -6 Ряд3– спиртонерастворимая фракция связанной ИУК Ряд2– спирторастворимая фракция связанной ИУК Ряд1– свободная ИУК Рис. Влияние экзогенной ИУК на содержание свободной и связанной (спирторастворимой и спиртонерастворимой) фракций ИУК в надземной части (А) и корнях (В) проростков пшеницы В корнях кинетика изменения исследуемых форм ИУК имела несколько иной характер (см. рис., В). Корни проростков отличаются от листьев повышенной активностью ИУК-оксидазы (Олюнина и др., 1990), и не исключено, что эта органоспецифичность была определяющей в развитии их реакции на экзогенную ИУК. По мнению К. З. Гамбурга (1976), именно ИУК-оксидаза выполняет защитную функцию, предохраняя клетки растений от сверхоптимальных концентраций гормона. Поэтому снижение количества эндогенной ИУК в корнях и меньший эффект на пул ауксинов в надземной части проростков пшеницы, зафиксированные при высоких концентрациях экзогенной ИУК (10-6 М), могут быть отнесены на счет 111 увеличения активности ИУК-оксидазы. Указанная концентрация гормона, вероятно, оказалась достаточно высокой, чтобы индуцировать ИУК-оксидазную активность и, таким образом, способствовала сдвигу метаболизма ИУК в сторону ее катаболизма. Следствием этих изменений, как мы предполагаем, и было снижение общего уровня ауксинов, особенно четко выраженное в корнях в варианте с повышенной концентрацией препарата индолилуксусной кислоты. Суммируя приведенные выше данные, можно сделать следующее заключение. За счет бактериальной, экзогенной для инокулированных растений ИУК возможно возрастание уровня гормона в клетках растений. Это возрастание может служить одним из механизмов активирующего действия бактерий и, в частности, бактериальных удобрений на рост и продуктивность сельскохозяйственных культур. Однако, как свидетельствуют выполненные эксперименты, увеличение и распределение ИУК по отдельным фракциям будет в значительной степени зависеть от количества ИУК в ризосфере и, следовательно, от количества экзометаболитов бактерий, а также и экзометаболитов растений. В составе последних наиболее тесно связанными с метаболизмом ауксинов являются аминокислота триптофан и ряд фенольных соединений, которые могут выполнять функцию ингибиторов (хлорогеновая, кофейная, галловая кислоты) или активаторов (п-кумаровая, феруловая кислоты) ИУК-оксидазы. На основании наших опытов можно заключить, что данная ферментная система, так же как и реакции образования конъюгатов ИУК, являются участниками формирования ответа растений на экзогенную ИУК, в том числе, по-видимому, и ту, которая представляет собой один из экзометаболитов бактериальных клеток. ЛИТЕРАТУРА Веселов А. П., Лобов В. П., Олюнина Л. Н. Изменение содержания фитогормонов в ответной реакции растений при тепловом шоке и в период его последействия // Физиология растений. 1998. Т. 45, № 5. С. 709-715. Гамбург К. З. Биохимия ауксина и его действие на клетки растений. Новосибирск, 1976. Кудоярова Г. Р., Веселов С. Ю., Еркеев М. И., Гюли-Заде В. З., Гимаева Р. М., Загидуллин И. В., Шакирова Ф. М. Иммуноферментное определение содержания индолилуксусной кислоты в семенах кукурузы с использованием меченых антител // Физиология растений. 1986. Т. 33, № 6. С. 1221-1227. Олюнина Л. Н., Гордей В. Н., Ельцова Л. В., Анисимов А. А. Биосинтез и окисление индолилуксусной кислоты в условиях различной обеспеченности проростков пшеницы минеральным азотом // Регуляция ферментативной активности у растений: Межвуз. сб. Горький, 1990. С. 4-12. Олюнина Л. Н., Шабаев В. П. Продукция индолил-3-уксусной кислоты ризосферными бактериями рода Pseudomonas в процессе роста // Микробиология. 1996. Т. 65, № 6. С. 813817. Полевой В. В. Эволюция гормональной системы растений // Эволюция функций в растительном мире. Л., 1985. С. 216-229. Shabajev V. P., Smolin V. Yu., Oljunina L. N., Gordejeva S. P., Safrina O. S. Nitrogen fixation in the rhizosphere and growth of non-legumes inoculated with Pseudomonas genus bacteria // Abstract book of 6 simposium of biological nitrogen fixation with non-legumes. Ismailia (Egypet), 1993. P. 126. 112