И.Р. Яхин, О.В. Рытченкова

УДК: 573.6.086.835:579.8
И.Р. Яхин, О.В. Рытченкова
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия
ИССЛЕДОВАНИЕ РОСТА ДРОЖЖЕЙ KLUYVEROMYCES LACTIS И
KLUYVEROMYCES
MARXIANUS
НА
ОТХОДАХ
МОЛОКОПЕРЕРАБАТЫВАЮЩИХ ПРЕДПРИЯТИЙ
The possibility of fermentation the yeast Kluyveromyces lactis and Kluyveromyces
marxianus on lactose medium was researched. It was established, that these cultures almost
completely digest lactose and accumulate enzyme β-galactosidase in the late logarithmic growth
phase. The conditions of enzyme extraction from biomass were selected.
Исследована возможность культивирования дрожжей Kluyveromyces lactis и Kluyveromyces marxianus на лактозосодержащей питательной среде. Установлено, что данные
культуры практически полностью усваивают лактозу и накапливают фермент βгалактозидазу в конце логарифмической фазы роста. Подобраны условия экстракции фермента из биомассы.
Основным побочным продуктом переработки молока на сыр, творог и
казеин является молочная сыворотка, содержащая более 70% лактозы, около
30% сывороточных белков, минеральные соли и все водорастворимые витамины. После выделения из молочной сыворотки сывороточных белков мембранным фракционированием, остается пермеат, содержащий низкомолекулярные компоненты (депротеинизированная молочная сыворотка). Благодаря наличию в своем составе значительного количества лактозы молочная
сыворотка и пермеат молочной сыворотки являются богатой комплексной
питательной средой для биотехнологической переработки. Процесс гидролиза лактозы до глюкозы и галактозы у микроорганизмов связан с наличием
у них фермента β-галактозидазы. При этом некоторые из них являются активными продуцентами этого фермента [1]. Препараты на основе βгалактозидазы используются в пищевой промышленности для получения
безлактозных продуктов и в фармацевтической промышленности для получения лекарственных средств.
Из литературных данных известно, что дрожжевые культуры Kluyveromyces lactis и Kluyveromyces marxianus являются активными продуцентами
β-галактозидазы. При этом для их культивирования используются питательные среды на основе натуральной и депротеинизированной молочной
сыворотки, которые могут содержать дополнительные источники минеральных веществ и факторов роста [2,3].
Поэтому, целью данной работы является исследование роста дрожжевых культур Kluyveromyces lactis и Kluyveromyces marxianus на пермеате
молочной сыворотки и подбор оптимальных условий выделения фермента βгалактозидазы из биомассы исследуемых культур.
Глубинное культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, (объем питательной среды 100 мл) при постоянном перемешивании со скоростью 150 об/мин. За единицу активности фермента принима-
33
ли количество образующейся в результате гидролиза глюкозы (мкмоль) за 1
минуту на 1 грамм абсолютно сухой веса биомассы.
На первом этапе в качестве контрольного эксперимента проводили
культивирование дрожжевых культур на синтетической лактозосодержащей
среде следующего состава: KH2PO4 –5 г/л; (NH4)2SO4 -2 г/л; MgSO4*7H2O –
0,4 г/л; дрожжевой экстракт –2 г/л; лактоза -50 г/л; рН 5,5 (таблица 1).
Табл. 1. Основные параметры культивирования дрожжевых культур
на синтетической лактозосодержащей среде
Культура
Kluyveromyces Kluyveromyces
lactis
marxianus
Параметры кривой роста
Время лаг-фазы, ч
4
3
Удельная скорость роста, ч-1
0,23
0,24
Максимальное накопление биомассы, г/л
2,8
3,92
Степень потребления субстрата, %
87,3
88,6
Экономический коэффициент
0,07
0,1
При культивировании продуцента в объеме культуральной жидкости
протекают два неразрывно связанных, хотя зачастую раздельных во времени
процесса – увеличение биомассы микроорганизма и накопление в микробной клетке фермента. Для определения времени максимального накопления
β-галактозидазы в биомассе культивирование проводили на синтетической
питательной среде и определяли активность фермента в биомассе в различные фазы кривой роста (рисунок 1).
Из представленных данных видно, что максимальное накопление фермента
β-галактозидазы происходит в конце логарифмической фазы роста, то есть в
начале фазы замедления роста. Поэтому в последующих экспериментах
определение максимальной активности β-галактозидазы определяли на 1720 часу роста. Для этого отделяли биомассу от надосадочной жидкости центрифугированием. Промывку биомассы и проведение экстракции проводили
с использованием фосфатного буферного раствора рН 7,0. Для экстракции
фермента использовали физическое воздействие (перетирание со стеклом,
ультразвуковое излучение) и химическое воздействие (органические растворители, детергенты). Сравнительный анализ использованных методов показал, что наибольшая степень выхода фермента в раствор происходит при
действии толуолом в количестве 2 % от объема суспензии биомассы.
Поскольку предварительные исследования показали, что дрожжи
Kluyveromyces lactis и Kluyveromyces marxianus способны активно расти на
лактозосодержащей питательной среде и накапливать β-галактозидазу,
дальнейшие эксперименты проводились с использованием в качестве осно-
34
Активность, ед/мин*г АСВ
вы питательной среды пермеата молочной сыворотки. Пермеат, полученный после ультраконцентрирования молочной сыворотки и выделения из
нее сывороточных белков, имел следующий состав: содержание сухих веществ – 5,6 %, из них лактозы – 47,0 г/л, низкомолекулярных пептидов – 1,5
г/л. Поскольку содержание азота и фосфора в пермеате не сбалансировано,
было исследовано влияние дополнительных источников азота и фосфора на
рост культур.
40
35
30
25
20
15
10
5
0
6
9
12
15
18
Время культив иров ания, час
K.lactis
21
24
K.marxianus
Рис. 1. Зависимость активности β-галактозидазы дрожжей
от времени культивирования на синтетической лактозосодержащей среде
Для всех вариантов питательных сред устанавливали начальное значение рН 5,5. Ввиду большого разнообразия прописей питательных сред,
использовали варианты, чаще всего встречающиеся в литературе:
1. Пермеат
2. Пермеат + (NH4)2SO4 (3г/л) + KH2PO4 (1 г/л)
3. Пермеат + (NH4)2SO4 (3г/л) + KH2PO4 (1 г/л) + дрожжевой экстракт (1 г/л)
4. Пермеат+NH4H2PO4 (4г/л) +MnSO4 (0,16г/л) + дрожжевой экстракт (1 г/л)
5. Пермеат+NH4H2PO4 (4г/л) +MnSO4(0,16г/л) + дрожжевой экстракт (10 г/л)
Табл. 2. Активность β-галактозидазы в биомассе при культивировании на пермеате
молочной сыворотки с добавлением дополнительных компонентов (ед/мин*г АСВ)
Культура
Kluyveromyces lactis
Kluyveromyces marxianus
1
16,2
Питательная среда
2
3
4
20,7
22,8
22,9
5
22,7
29,8
33,4
35,6
34,3
35,2
Анализ результатов культивирования показал, что культуры Kluyveromyces lactis и Kluyveromyces marxianus хорошо растут на данных питательных средах. Степень потребления субстрата во всех случаях составила
не менее 95%, что подтверждает высокую способность исследуемых культур
35
к синтезу фермента, расщепляющего лактозу. Выделение β-галактозидазы
из биомассы проводили с помощью подобранного ранее метода экстракции
толуолом (таблица 2).
Из представленных данных видно, что при внесении в пермеат молочной сыворотки дополнительных источников азота и фосфора, а также
дрожжевого экстракта происходит увеличение количества накопленного
фермента в биомассе исследуемых культур.
Таким образом, установлено, что пермеат молочной сыворотки может
являться основой при составлении питательной среды для культивирования
дрожжей Kluyveromyces lactis и Kluyveromyces marxianus. Данные культуры
могут
быть использованы как микроорганизмы-продуценты βгалактозидазы. Дальнейшие исследования направлены на изучение способов
концентрирования и очистки ферментного препарата.
Библиографические ссылки
1. Залашко М.В. Биотехнология переработки молочной сыворотки. М.: Агропромиздат, 1990. С. 192.
2. Effect of compressed fluids treatment on the activity, stability and enzymatic
reaction performance of β-galactosidase. / Manera A. P., Kuhn G., Polloni A.,
Marangoni M., Zabot G., Kalil S. J., Oliveira D., Treichel H., Oliveira V. J., Mazutti M.A., Maugeri F. // Food Chemistry, 2011. 125. P. 1235–1240.
3. Kippert F. A rapid permeabilization procedure for accurate quantitative determination of β-galactosidase activity in yeast cells // FEMS Microbiology Letters, 1995. Vol. 128, Issue 2. P. 201-206.
УДК 577.169
К.А. Тимошенко
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ВЫДЕЛЕНИЯ КАРОТИНОИДОВ ИЗ
ГАЛОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ HALOBACTERIUM HALOBIUM
A comparative analysis of methods for preparing the biomass of halobacteria for the extraction. Chosen the optimal extragent, as well as time and the multiplicity of extraction. The extract of carotenoids were analyzed by column chromatography.
Проведен сравнительный анализ способов подготовки биомассы галобактерий к
экстракции. Подобран оптимальный экстрагент, а так же время и кратность экстракции.
Полученный экстракт каротиноидов был проанализирован методом колоночной хроматографии.
Введение.
В настоящее время растет интерес к получению производных нукле-
36