http://www.enu.kz УДК 663.15 ВЛИЯНИЕ в

http://www.enu.kz
УДК 663.15
ВЛИЯНИЕ в-ГАЛАКТОЗИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ДРОЖЖЕЙ ВИДА
KLUYVEROMYCES LACTIS НА СИНТЕЗ ОЛИГОСАХАРИДОВ В МОЛОЧНОЙ
СЫВОРОТКЕ
Сәуірбаева А.Т., Кукишева А.А., Турумбетова Ж.Ж.
Казахский национальный аграрный университет, Алматы, Казахстан,
aziza_s_t@mail.ru
http://www.enu.kz
Сегодня в мире известно более 20 различных олигосахаридов, из которых
доказанным пребиотическим эффектом обладают лактулоза, лактитол, соевые
олигосахариды, лактитол-олигосахариды, фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды и
др. Методы получения олигосахаридов основаны на прямой их экстракции из
растительного сырья, ферментативном либо кислотном гидролизе полисахаридов
соответствующего состава, ферментативном либо химическом синтезе из простых
углеводов [1]. Галактоолигосахариды (олигогалактозиллактоза, олигогалактоза,
трансгалактоолигосахариды) являются производными лактозы и в натуральном виде
содержатся в грудном молоке и тканях некоторых растений, например лука, чеснока,
соевых бобов, цикория, топинамбура. Галактоолигосахариды, как и другие
олигосахариды, практически не разрушаются в верхних отделах желудочно-кишечного
тракта, в неизмененном виде поступают в толстую кишку, где и ферментируются
присутствующей там микрофлорой, преимущественно бифидо- и лактобактериями,
реализуя свое пребиотическое действие. Галактоолигосахариды стимулируют
перистальтику кишечника и устраняют его дисфункции, способствуют усвоению кальция
и магния, активируют специфические и неспецифические системы защиты
макроорганизма, оказывая не связанное с жизнедеятельностью кишечной микробиоты
иммуномодулирующее, гипохолестеринемическое и гипогликемическое действие, снижая
риск развития кариеса и опухолей. Сегодня галактоолигосахаридами обогащают детское
питание, фруктовые соки, безалкогольные напитки, молочные продукты, сухие завтраки,
корма для животных и т. д. [2].
Наиболее перспективным и экологически безопасным способом получения
галактоолигосахаридов является ферментативное трансгликозилирование лактозы in vivo
и in vitro с участием в-галактозидазы. В качестве наиболее доступного и дешевого
источника получения олигосахаридов, на наш взгляд, выгодно использовать молочную
сыворотку. Применение сыворотки, содержащей олигосахариды, в производстве про- и
пребиотических продуктов , позволит решить одну из главных проблем отрасли расширение ассортимента и увеличение объемов производства продуктов
функционального питания. Молочная сыворотка – побочный продукт производства сыров,
творога, казеина и других молочно-белковых продуктов. Мировые ресурсы этого вида
сырья исчисляются десятками миллионов тонн в год, тогда как степень утилизации
сыворотки в перерабатывающей промышленности и сельском хозяйстве ничтожно мала. В
молочной сыворотке углеводом, пригодным для спиртового брожения, является лактоза.
Лактоза – дисахарид, при гидролизе распадающийся на глюкозу и галактозу. Характерной
особенностью лактозы является ее медленное расщепление в организме. В то же время
взрослый организм человека и животных зачастую неспособен усваивать лактозу, что
связано с потерей способности продуцировать в-галактозидазу – фермент, расщепляющий
молочный сахар на моносахариды. В связи с этим актуальным является изучение
физиологических свойств коллекционных культур, в частности лактозосбраживающих
дрожжей рода Kluyveromyces. Одной из наиболее ценных групп культур, представляющих
интерес для биотехнологической промышленности, являются дрожжи вида Kluyveromyces
lactis, сбраживающие лактозу молочной сыворотки до этанола.
http://www.enu.kz
Поэтому в наших работах объектами исследования служили штаммы
лактозосбраживающих дрожжей вида Kluyveromyces lactis, поддерживаемых методами
лиофилизации, криоконсервации и субкультивирования. Дрожжевые грибы вида K. lactis
сохраняют высокий уровень сбраживающей активности и продукции этанола на молочной
сыворотке при хранении различными методами. Подтверждено, что метод хранения не
влияет на морфологические характеристики культуры. Высокие результаты
выживаемости получены при культивировании дрожжей, хранившихся методами
субкультивирования и криоконсервации. Лишь немногочисленные представители
дрожжевой флоры способны утилизировать лактозу молочной сыворотки брожением [3].
в-галактозидаза (лактаза, в-галактозид-галактогидролаза) – фермент класса гидролаз,
катализирующих отщепление концевого нередуцированного остатка в-D-галактозы в в-Dгалактозидах, в том числе в составе лактозы. Фермент обнаруживается в некоторых
растениях, физиологической нормой представляется также его наличие в тканях органов
человека и животных, однако наиболее распространенным источником в-галактозидазы
являются микроорганизмы различных таксономических групп.
По исследованиями Хамагаевой И.С. было доказано, что трансгликозилирующая
активность Я-галактозидазы способствует накоплению в молоке олигосахаридов.
Показано, что олигосахариды индуцируют синтез собственной Я-галактозидазы у
бифидобактерий, которые способны активно сквашивать молоко без добавления факторов
роста. В результате катализируемой ферментом реакции трансгликозилирования из
лактозы образуются галактоолигосахариды различной степени полимеризации [4]. Среди
факторов, оказывающих влияние на ферментативные процессы, особое место занимает
концентрация самого фермента. Известно, что скорость биохимических реакций определяется
числом столкновений реагирующих молекул и ионов, т.е. сближением на расстояние, в
пределах которого проявляются силы их взаимодействия. Надо полагать, что при выбранной
концентрации субстрата увеличение количества фермента с одинаковой активностью будет
ускорять ферментативные процессы. Однако определение минимальной дозы фермента,
обеспечивающей наибольший выход продуктов реакции, в практическом аспекте имеет
решающее значение [5].
Результаты исследований влияния концентрации фермента на образование
олигосахаридов в сывороточном концентрате представлены в рисунке 1. Условия
ферментации: концентрация лактозы - 42%; продолжительность - 3 ч; температура 30°С; рН 6,8. Из таблицы видно, что увеличение дозы Я-галактозидазы до 20 Е на 1 мл
сыворотки повышает концентрацию олигосахаридов в сгущенной сыворотке. Однако
дальнейшее увеличение концентрации фермента лишь ускоряет гидролитические процессы.
Так, синтез олигосахаридов уменьшается с 12 до 7,5%, а содержание глюкозы и галактозы
увеличивается до 15 и 12.8% соответственно.
http://www.enu.kz
16
15
14
11,8
12
12
%
10
8
7,8
8
6
13
11
8,5
10
9
12,8
7,5
5,2
4
15
4,5
2
3
0
0
5
лактоза,%
20
30
доза фермента, Е/мл сыворотки
олигосахариды, %
глюкоза, %
40
45
галактоза, %
Рисунок 1 − Влияние концентрации фермента на образование олигосахаридов в
сывороточном концентрате
Анализ полученных данных дает основание считать оптимальной дозой фермента,
обеспечивающей максимальный выход олигосахаридов при температуре 30°С, 20 Е на 1
мл сыворотки. Эффективность биотехнологических процессов во многом определяется
длительностью получения конечного продукта. При изучении ферментативных процессов
важно установить время достижения максимального эффекта, в противном случае может
измениться направленность реакции (синтез побочных продуктов, изменение свойств
целевого продукта и др.). Результаты исследования влияния продолжительности ферментации
сывороточного концентрата Я-галактозидазы на выход олигосахаридов и степень
гидролиза лактозы представлены на рисунке 2. Как показывает рисунок, степень гидролиза
лактозы возрастает в течение всего периода ферментации и достигает наибольшего значения
к концу эксперимента. Кривая синтеза олигосахаридов имеет иной характер. Так, через 2 ч
ферментации в реакционной среде обнаруживается максимальное количество
олигосахаридов. Дальнейшее увеличение продолжительности ферментации приводит к
уменьшению содержания олигосахаридов, что, вероятно, связано с последующим их
гидролизом.
Результаты данной серии эксперимента показали, что продолжительность ферментации
сгущенной сыворотки в течение 2-х часов при заданных условиях концентрацией лактозы-42%;
при температуре -30 °С; рН 6,7 является наиболее оптимальной.
http://www.enu.kz
70
60
50
40
%
45
30
35
20
10
0
63
58
15
27
21
18
22
13
5
30
60
90
120
150
8
180
продолжительность ферментации, минут
степень гидролиза лактозы, %
количество олигосахаридов, %
Рисунок 2 − Влияние продолжительности ферментации на степень гидролиза лактозы
и образование олигосахаридов: доза фермента - 20 Е на 1 мл концентрата;
концентрация лактозы-42%; температура-30 °С; рН 6,7
В результате исследовании было также установлено, что под действием -галактозидазы
максимальный синтез олигосахаридов отмечен при температуре 30°С, концентрации фермента
20Е на 1 мл сыворотки, концентрации лактозы 42 % и продолжительности ферментации в
течение 3ч. Выделены и идентифицированы олигосахариды, 54% которых представлены
дисахаридами, в том числе содержание аллолактозы составило 34%.
Список использованной литературы:
1 Дудикова Г.Н. Коллекция культур микроорганизмов для пищевой и перерабатываемой
промышленности //Биотехнология. Теория и практика. – 2001. − №3 −4. − С.79 −82.
2 Просеков А.Ю. Современные аспекты производства продуктов питания/
А.Ю.Просеков. – Кемерово: Кузбассвузиздат – АСТШ – Университеты России, 2005. –
370 с.
3 Серикбаева А.Д. Изучение состава и свойств молочной сыворотки //Здоровье и болезнь. −
Алматы, 2009. − № 5 (81).−С.129− 131.
4 Хамагаева И.С. Теоретическое обоснование и разработка технологии кисломолочных
продуктов на основе использования − галактозидазы и бифидобактерий: дисс... докт. техн.
наук. − М., 1996. − 456с.
5 Synthesis of galactooligosaccharides from lactose using beta-galactosidase from
Kluyveromyces lactis: Studies on batch and continuous UF membrane-fitted bioreactors / S.
Chockchaisawasdee [et al.] // Biotechnol. Bioeng. – 2005. – Vol. 89, N 4. – P. 434–443.