Роль некультивируемых форм неспорообразующих бактерий в
advertisement
Иммунопатология, аллергология, инфектология Immunopathology, allergology, infectology 2010,№4:57-66 ИНФЕКТОЛОГИЯ Роль некультивируемых форм неспорообразующих бактерий в поддержании гомеостаза популяции Ю.Д. Пахомов1, Л.П. Блинкова1, Л.Г. Стоянова2 НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва, Россия 1. Малый казенный переулок 5а 8-4959161152 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова2. Ленинские горы, д. 1, стр. 12, тел. 8-495-9394545 Nonculturable forms of bacteria and their role in maintenance of population homeostasis Yu. D. Pakhomov1, L.P. Blinkova1, L.G. Stoyanova2 Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera RAMS, Moscow, Russia Lomonosov Moscow State University Аннотация Summary В условиях стресса микроорганизмы прекращают процессы, связанные с ростом и размножением, а так же в различной степени остальные обменные процессы и образуют некультивируемые или покоящиеся формы. В связи с естественной гетерогенностью популяции микроорганизмов отдельные клетки переходят в некультивируемое состояние с разной скоростью, а также различаются по глубине покоя. Выявление и изучение микроорганизмов, находящихся в некультивируемом (покоящемся) состоянии в различных биотопах (почва, вода, организм человека, животных, простейших, пищевые продукты и т.д.) является важной микробиологической проблемой. Целью настоящего обзора является анализ литературных данных о некультивируемых (покоящихся) формах патогенных и сапрофитных микроорганизмов, а так же информации о методах их обнаружения и рекультивации. In stressful conditions microorganisms shut down all processes associated with growth and multiplication, and, to different extent, all other metabolic pathways, and form nonculturble or dormant forms. Due to natural heterogeneity some cells become nonculturble faster than others, and also there are variations in depth of dormancy. Identification and study of nonculturable (dormant) microorganisms in different ecosystems (soil, water, human or animal body, protozoa, food etc.) is a crucial microbiological problem. The aim of this review is data analysis on nonculturable (dormant) forms of pathogenic and saprophytic microbes, their detection and resuscitation. Ключевые слова Key words Некультивируемое состояние бактерий, рекультивация. Nonculturable state, dormancy, detection, resuscitation. 1. Условия образования и свойства жизнеспособных некультивируемых форм. Многие патогенные и сапрофитные микроорганизмы, находясь в природных и искусственных системах, (например, организм человека и животных, почва, природные водоёмы, водопровод и др.) переходят в некультивируемое состояние (НС). Это может быть вызвано различными стрессовыми факторами и в не- которых случаях является штаммоспецифичным свойством. Переходя в НС, микроорганизмы уменьшаются в размерах. Метаболизм претерпевает серьезные изменения – снижается уровень трансмембранного транспорта, дыхания и синтеза макромолекул [1 - 15]. Показано, что патогенные микроорганизмы – Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica, Aeromonas hydrophila, Shigella dysenteriae, эн- Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2010 N°4 57 Ю.Д. Пахомов, Л.П. Блинкова, Л.Г. Стоянова теропатогенные штаммы E. coli и др. сохраняют активность факторов вирулентности при переходе в НС. Несмотря на неспособность к образованию колоний клетки могут синтезировать токсины, некоторые виды сохраняют способность к адгезии на клетках человека в культуре ткани с последующим возвратом в культивируемое состояние. [16 - 21]. 2. Условия образования и структура покоящихся клеток неспорообразующих микроорганизмов (ЦПК). ЦПК образуются грамположительными и грамотрицательными бактериями, а также археями и эукариотическими организмами (дрожжами) на постстационарной стадии развития культур при таких модификациях условий роста, которые стимулируют биосинтез фактора d1. Это связано с лимитированием по источникам N [22 - 24], что стимулирует липогенез, а также по O2 и P, приводящим к повышению уровня восстановителей в клетке. Лимит по N и P является достаточно стандартным экологическим фоном. Количество образующихся ЦПК может составлять 1090% от начального числа КОЕ [24]. Еще одним фактором образования покоящихся клеток может быть ассоциация с другими бактериями и простейшими. В этом случае ПК образуются либо для переживания неблагоприятных условий совместно с простейшими [25], либо в ответ на воздействие токсичных экзометаболитов, например, сине-зеленых водорослей [1]. Образование ЦПК также происходит в автолизирующихся суспензиях, типичных для стареющих микробных культур, когда из лизирующихся клеток высвобождается фактор d 1, что приводит к повышению его концентрации до порогового уровня. Благодаря природной гетерогенности популяции по чувствительности к ауторегуляторным факторам, автолизирующиеся клетки популяции высвобождают факторы анабиоза. Это дает возможность остальным клеткам перейти в покоящееся состояние, причем количество образуемых культурой ЦПК прямо зависит от скорости автолиза [26]. Образование ЦПК вызывает так же экзогенное внесение аутоиндуктора анабиоза, что происходит в естественных условиях, когда, концентрация факторов d1 достигает порогового значения (при вымораживании или пересыхании почв или при стоке из вышележащих горизонтов). Спорообразующие микроорганизмы мо- 58 гут формировать ЦПК в случаях, когда образование спор невозможно, например, при повышении концентрации глюкозы in vitro [24, 27] в вечномерзлых почвах [28] и других. В значительных количествах ЦПК выделяются из экстремальных биотопов, таких как вечномерзлые почвы. Там клетки могут сохранять целостность структуры и способность к возобновлению активного роста в течение длительного срока (вероятно, вплоть до нескольких миллионов лет) [28 - 30]. При переходе в покоящееся состояние клетки проходят через промежуточную стадию, в которой они в несколько раз уменьшаются в размерах и приобретают коккоидную форму. При высевах такие клетки дают мелкие колонии. Эта же стадия наблюдается при процессах пробуждения [30]. Свойства ПК зависят так же от стратегии роста, которую реализуют микроорганизмы. Так, в экспериментах Лойко Н.Г. и др. [31] показано, что бактерии Thioalkalivibrio versutus AL-2, которых можно отнести к К-стратегам, в сгущенных суспензиях образуют на несколько порядков больше ЦПК, чем относящиеся к r-стратегам Thioalkalimicrobium aerophilum AL-3, а в стационарных культурах дольше сохраняют жизнеспособность. Однако ПК штамма AL-3 были значительно устойчивее к повышенным температурам. ЦПК характеризуются увеличением светопреломления (рефрактерности) до величин свойственных эндоспорам и уменьшением объема клеток вследствие обезвоживания протопласта [32], гранулярной цитоплазмой, а так же агрегацией рибосом. Клеточная стенка утолщенная, состоящая из нескольких слоев, различающихся по электронной плотности. При этом у Micrococcus luteus обнаружено, что внутренний слой, прилежащий к мембране, проявляет устойчивость к лизоциму, в то время как внешние разрушаются [23]. В то же время ЦПК микрококка после инкубации с лизоцимом изменяют свою структуру и становятся похожими на вегетативные. Цитологический анализ показывает, что внешний слой клеточной стенки является исходным, предсуществующим и общим для 2-3 клеток. Внутренние же слои образуются de novo [33]. Выделяемые из природных источников микроорганизмы окружены достаточно толстым (0.15 – 0.4 мкм) аморфным электроннопрозрачным полисахаридным покровом, состоящий из Immunopathology, Allergology, Infectology 2010 N°4 Инфектология: Роль некультивируемых форм неспорообразующих бактерий в поддержании гомеостаза популяции двух или трех слоев. Внешний слой органоминеральный, сходный с капсулярным веществом и слизями. Его полисахаридный матрикс включает минеральные частицы, защищает клетки от повреждения кристаллами льда, от воздействия токсических агентов и служит для прикрепления к минеральным частицам [27 - 29]. Эти частицы имеют вид игольчатых кристаллов, пластинок и гранул с высокой электронной плотностью что свидетельствует о наличии в их составе металлов. Внутренний, слой в свою очередь, так же подразделяется на два субслоя, различающихся по электронной плотности – менее плотный внутренний и более плотный наружный. В мембране ПК наблюдается большое количество интрамембранных частиц, которые до двух раз крупнее, чем в мембранах вегетативных клеток [34]. Они распространены по мембране неравномерно, имеются гладкие, лишенные интрамембранных частиц участки [23]. ЦПК грамотрицательных микроорганизмов имеют увеличенное периплазматическое пространство [35]. Нуклеоид в ЦПК конденсированный и имеет вид агрегированных электронноплотных фибрилл ДНК [23, 35]. ЦПК более устойчивы к автолизу и воздействиям неблагоприятных факторов, (высокие температуры, ультрафиолетовое излучение, литические ферменты, некоторые спирты). Метаболическая активность в таких клетках полностью отсутствует [35]. Синтезы ДНК и РНК, белка, фосфолипидов, активности всех деполимераз ингибированы [32]. Кроме изменения в структуре клетки, происходят так же изменения в ее химическом составе, а именно в содержании основных элементов: калия (вторичный клеточный эффектор), кальция (участвует в создании трансмембранного потенциала), фосфора (входит в состав нуклеотидов), и серы (компонент белка). При этом содержание фосфора обычно понижено, а кальция – повышено, что видимо, отражает изменение ионного гомеостаза в клетках. Так, для ЦПК Bacillus cereus соотношение Ca/K в 4-5 в раз выше, а P/S в 2.5-4 раза ниже, чем у вегетативных клеток. Для Micrococcus luteus характерно увеличение содержания кальция, а вот калий незначительно повышен, это, вероятно, связано с тем, что среда для получения ЦПК культуры обогащена ионами K + и из-за изменения проницаемости мембраны ток ионов направлен внутрь клетки [36]. Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2010 N°4 3. Регуляция образования ЦПК аутоиндуторами анабиоза Переход клеток микроорганизмов в анабиотическое состояние осуществляется под действием аутоиндуктора, обозначенного как фактор d1 [22], По своей природе он относится к алкилоксибензолам (АОБ) [37]. Фактор d1 накапливается в клетках и культуральной жидкости во время роста культуры. Он представляет собой смесь изомеров и гомологов, различающихся составом заместителей в ароматическом кольце и длиной алкильного радикала, что определяет их амфифильные свойства [35]. В зависимости от величины pH АОБ растворяются либо в водной фазе (pH ?7,0), либо в мембранных липидах (pH<7). Благодаря этому свойству они накапливаются в клетках, вызывая переход в анабиотическое состояние, или выходят в окружающую среду, приводя к ослаблению блокировки метаболизма и, в итоге – к прорастанию ПК. Важным является аутоиндуктор автолиза, выделяемый культурой на всех стадиях роста [38], который обозначен как фактор d2. По химической природе он является смесью ненасыщенных жирных кислот [39], вызывающей лизис большей части популяции с одновременным высвобождением из клеток питательных веществ и дополнительных количеств фактора d1. Фактор d1 не обладает видоспецифичностью, но микроорганизмы различаются как по продуктивности, так и по чувствительности к их воздействию [40]. Это позволяет фактору d1 выступать в качестве регулятора на уровне сообществ [37], а так же дает возможность контроля развития промышленных популяций, ассоциаций и консорциумов. Продуктивность по АОБ у клеток, выделяемых из природных источников, существенно выше, чем у коллекционных штаммов, что, вероятно, обусловливает их высокую выживаемость в таких местообитаниях как вечномерзлые почвы [37]. Обладая антиоксидантной активностью, алкилоксибензолы, накапливающиеся в клетках стационарной фазы и ПК, участвуют в формировании неферментативной антиоксидантной защиты мембранных липидов и других клеточных структур [41]. Это является особенно важным в условиях ингибирования метаболических активностей клетки. ElRegistan G.I. et al., [41], а так же Ильинская О.Н. и др. [42] показали, что АОБ играет важную роль в защите клеток микроорганизмов от различных стрессов. В ответ на стрессовые 59 Ю.Д. Пахомов, Л.П. Блинкова, Л.Г. Стоянова воздействия, такие как, например, тепловой шок, уровень их биосинтеза резко повышается [41]. Фактор d 1 способен образовывать межмолекулярные водородные связи, вступать в гидрофобные и ионные взаимодействия [35, 43]. Эти свойства определяют механизм их действия при развитии метаболического блока в клетке. АОБ модифицируют мембранные липиды, вследствие чего увеличивается ее микровязкость из-за образования водородных связей между ароматическим кольцом АОБ и молекулами фосфолипидов [44]. Это приводит к увеличению проницаемости мембраны для одновалентных катионов, несущих гидратационые рубашки, и затем к обезвоживанию протопласта клетки. В мембране так же образуются микропоры, через которые происходит выход воды из клеток. Вследствие снижения жидкости мембран ингибируются их транспортные, энергопродуцирующие и другие функции, прекращаются синтетические процессы, а так же активность связанных с мембраной интегрированных в нее ферментов (деполимераз и автолизинов). Это обеспечивает структурную целостность клеточных оболочек ПК. Обусловленное дегидратацией мембраны ингибирование клеточных ферментов усиливается еще и тем, что молекулы АОБ образуют комплексы с молекулами биополимеров за счет слабых физико-химических взаимодействий, изменяя их конформацию [41, 45]. Это было показано Беспаловым М.М. с соавторами [46] в опытах по снятию спектров флуоресценции индивидуальных АОБ и РНКазы, а так же их смесей в различных пропорциях. Смесь, содержащая 0.1 мМ АОБ и 0.5 мкМ РНКазы, имела спектр флуоресценции, отличный от спектров индивидуальных веществ. Комплексообразование фактора d 1 с молекулами ферментов приводит к изменению их пространственной структуры. В случае если АОБ имеет короткий алкильный радикал, ферментативная активность сохраняется или даже увеличивается. При длинноцепочечном радикале происходит ее ингибирование. В обоих случаях структура белка становится более стабильной и повышается устойчивость к неблагоприятным воздействиям [46]. Образование молекулами АОБ комплексов с внутриклеточными белками приводит к стабилизации последних в отношении повреждающих факторов, таких как активные формы кислорода, g-излучение и высокая 60 температура [41, 42, 46]. Кроме того, фактор d1 взаимодействуют с ДНК, придавая компактность ее структуре и способствуя сохранению целостности [35, 47], стимулируя при этом фенотипическую диссоциацию [25, 35, 42, 48] Растворимость АОБ в воде крайне низка. Истинный раствор он образует только при концентрации ниже 0.09% (4.5 мМ) (эта концентрация названа критической концентрацией мицеллообразования, ККМ), а стабильный раствор – только при концентрации до 0.05% (2.5 мМ). При более высоких концентрациях происходит образование мицелл [45]. В этой же работе показано, что фактор d 1 может ингибировать активность ферментов как при концентрациях ниже ККМ, так и, присутствуя в смеси в виде мицелл. Это, видимо, связано с тем, что в мицеллярной форме он служит матрицей, на которой иммобилизуются ферменты. Эффективность ингибирования ферментативной активности фактором d 1 зависит так же от pH. В опытах с химотрипсином [45] показано, что концентрация, при которой его активность ингибируется на 50% при pH 6.0 существенно ниже (0.005%, 0.25мМ), чем в реакционной среде с pH 7.8 (0.2% 10 мМ). В закисленной среде уже при концентрации фактора 0.1% (5 мМ) активность фермента не выявляется. При воздействии аномально высоких концентраций фактора d 1 в клетках происходят необратимые изменения и при внешнем сохранении целостности и морфологии такие клетки, названные «микромумиями», не способны восстанавливать пролиферативную активность. Если на клетки воздействуют АОБ в концентрациях на уровне 10 -3М, происходит полное разрушение цитоплазматической мембраны у большинства клеток. У клеток, сохранивших участки мембраны, наблюдаются крупные внутримембранные частицы. Цитоплазма становится мелко гранулированной, однородной. Подобные «микромумии» образуются так же в количестве около 3-4% в длительно хранящихся концентрированных суспензиях клеток [49]. Ильинская О.Н. и др., [50] показали, что фактор d 1 в зависимости от концентрации и гидрофобности (длины алкильного радикала) может вызывать мутации типа замены пар оснований и сдвига рамки считывания что, возможно, обусловлено алкилирующим действием АОБ. Для C6-АОБ данное действие не выявлялось при концентрациях выше 3 мкг/мл. Это, Immunopathology, Allergology, Infectology 2010 N°4 Инфектология: Роль некультивируемых форм неспорообразующих бактерий в поддержании гомеостаза популяции может быть связано с защитой молекулы ДНК фактором d1 против собственного действия, а так же с его ростингибирующей активностью. При попадании в благоприятные для роста и размножения условия ПК начинают процесс прорастания. Первичным событием этого процесса является нарушение физико-химических связей в комплексах клеточных биополимеров и мембранных структур с фактором d 1. Процесс инициируется условиями среды и приводит к выходу АОБ из клеток в среду. Если плотность клеток слишком велика то концентрация фактора будет также высокой, что воспрепятствует его дальнейшей диффузии и как следствие – снятию метаболического блока. 4. Фенотипическая вариабельность в популяции микроорганизмов и ее роль в поддержании гомеостаза популяции. Несмотря на то, что каждая клетка оснащена всем необходимым для успешной борьбы со стрессами, жизнь в популяции дает ряд дополнительных преимуществ, из которых наиболее очевидным является гетерогенность особей. Так, например, в предположительно однородной культуре E. coli методом градиентного центрифугирования выделено 5 и 10 разных фракций в экспоненциальной и стационарной фазах соответственно [51]. Очевидно, что абсолютная гомогенность недостижима и не желательна для выживания. Несмотря на строгую регуляцию клеточных процессов огромным количеством обратных связей, они зависимы от спонтанных изменений состава клеточного содержимого [52]. Эта гетерогенность имеет разные причины. Например, показано, что примерно 10 -3 клеток имеют дупликацию участка хромосомы [53]. Она нестабильна и может исчезать в следующих поколениях. Однако пока она существует, уровень содержания белков, кодируемых этой областью, будет повышенным [54]. Кроме того, асимметричное разделение белков и мРНК во время деления так же может играть некоторую роль, особенно при низкой концентрации белков. Влияние этой гетерогенности на выживание обусловлено неодинаковым уровнем белков, необходимых для переживания стрессов, приводя к образованию либо очень устойчивых, либо очень чувствительных форм из-за временного повышения или понижения концентраций необходимых белков. Например, для белков теплового шока GroEL, экспрессируемых на низ- Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2010 N°4 ком уровне, показано, что in situ наблюдается гетерогенность содержания groEL мРНК в индивидуальных клетках [55]. Популяция, пережившая стресс, становится такой же гетерогенной, как родительская популяция. Таким образом, преимуществом этой неоднородности будет то, что при стрессе у какой-то части популяции будет шанс его пережить и колонизировать «очищенную нишу» или новую среду обитания. А вновь образованная популяция не будет генетически отличаться от исходной, сохраняя физиологическое разнообразие необходимое для дальнейшего выживания [52]. Пример гетерогенности популяции и её результатов наблюдали так же Gonzales-Pastor J.E. et al. [56]. При недостатке питательных веществ в клетках культуры Bacillus subtilis активируется белок SpoOA и инициируется процесс споруляции. А так же еще два оперона skf и sdp. Первый кодирует киллерный белок и систему его экскреции из клетки, а SdpC синтезирует сигнальную молекулу, активирующую транскрипционный фактор YvbA как в клетках с активным SpoOA, так и во всех остальных. Клетки с неактивным SpoOA не имеют насоса для выделения киллерного белка и гибнут. В свою очередь, YvbA увеличивает их чувствительность к этому белку, и усиливает выделение энергии клетками с активным SpoOA. Это, а так же потребление веществ, выделенных отмершими клетками, позволяет отложить дальнейшее развитие энергоемкого процесса споруляции. Поскольку поздние этапы формирования эндоспор необратимы, клеткам выгодно задержать их, чтобы, в случае внезапного появления питательных веществ, они могли быстрее на них среагировать и начать ростовые процессы [56]. 5. Связь покоящегося состояния и фенотипической диссоциации. Процессы фазовых переключений, происходящие в клетках микроорганизмов, проявляются фенотипически в виде различия в морфологии колоний и физиолого-биохимических признаках. Эти различия обозначаются как фенотипическая диссоциация вида/ штамма микроорганизма [48]. Переход микроорганизмов в ПС осуществляется под действием ауторегуляторного фактора d 1. Этот фактор (АОБ) способен, как указано раньше, образовывать комплексы с макромолекулами, в том числе с ДНК, с помощью гидрофоб- 61 Ю.Д. Пахомов, Л.П. Блинкова, Л.Г. Стоянова ных связей, что показано при снятии спектров флуоресценции индивидуального C6-АОБ и его смеси с ДНК. При этом наблюдали смещение максимума поглощения в коротковолновую область [43]. Со временем, по всей видимости, кроме взаимодействий между молекулами АОБ и ДНК происходит образование надмолекулярных комплексов в виде мицеллоподобных структур вокруг цепей ДНК при локальном превышении критической концентрации мицеллообразования. Взаимодействие ДНК-АОБ стабилизирует структуру ДНК за счет слияния соседних комплексов в один (см. раздел факторы анабиоза). [43, 47]. Все эти процессы оказывают влияние на репликацию и транскрипцию, приводя к внутригеномным перестройкам, обусловливающим фенотипическую диссоциацию [42, 50]. Опыты показывают, что при возврате клеток из состояния покоя к активному росту и размножению, наблюдается повышение уровня фенотипической диссоциации. При образовании ПК с помощью химических аналогов фактора d1 уровень ее зависит от концентрации фактора [48, 35]. Более того, обработка АОБ таких генетически стабильных образований как споры бацилл приводит к расщеплению основного варианта на несколько [48]. 6. Выход микроорганизмов из состояния покоя Одним из свойств, полученных в периодической культуре жизнеспособных некультивируемых или ПК, является возможность их возврата к активному росту и размножению. Морфология клеток при этом так же восстанавливается [57 – 59] Однако основной проблемой при реанимации покоящихся или некультивируемых клеток является доказательство того, что происходит именно реанимация, а не рост недетектируемой активной части популяции [12]. Для доказательства истинной реанимации некультивируемых клеток используют метод предельных разведений, когда в конечных разведениях шанс присутствия активных клеток исчезающе мал [58, 59]. Кроме того, например, для Vibrio vulnificus показано, что динамика увеличения числа КОЕ в условиях инкубации при комнатной температуре и отсутствия питательных веществ отражает именно возврат к росту некультивируемых клеток, поскольку увеличение численности с недетектируемого уровня до 5х104 за 1 час в данном режиме не- 62 возможно за счет деления остаточных активных клеток [60]. Во многих случаях для успешного выхода микроорганизмов из состояния некультивируемости достаточно снятия неблагоприятного воздействия. Например, для Vibrio parahaemolyticus и Vibrio vulnificus, переходящих в НС при инкубации при низких температурах, достаточно инкубации НК при комнатной температуре с последующим посевом культуры на богатую среду [12, 60, 61]. При этом показано, что богатые питательные среды плохо подходят для реанимации из НС [60]. Однако установлено что клетки E. coli [62] и Vibrio vulnificus [63] могут быть реанимированы на богатой среде при наличии в ней антиоксидантов, таких как каталаза или пируват натрия. Kong I.-S et al., [64] показали, что штамм V. vulnificus, лишенный каталазной активности, оставался некультивируемым и при комнатной температуре. Авторы показали, что у этого вида бактерий понижение температуры вызывает инактивацию как каталазы, так и процесса ее синтеза de novo, а стрессовый сигма-фактор RpoS играет главную роль в переживании бактериями окислительного и других видов стресса. Следует, однако, подчеркнуть, что окислительный стресс – это лишь один из факторов, вызывающих переход в НС, так как клетки переходят в него и в присутствии каталазы [12]. Для Legionella pneumophila показано, что реанимация возможна только при совместном культивировании с Acanthamoeba castellani [65]. Во многих случаях для успешной реанимации клеток необходим подбор специфических компонентов сред. Например, для некоторых представителей актинобактерий важным является присутствие в среде дрожжевого экстракта [26, 58, 59, 66, 67], а для Tenacibaculum sp. желательным компонентом среды при реанимации некультивируемых форм является хлорид железа [68]. Еще одним способом реанимации некультивируемых форм является реанимация in vivo. Существуют работы по восстановлению пролиферативной активности с использованием мышей [69] и эмбрионов кур [70]. Возврат в активное состояние, возможно, связан с взаимодействием микроорганизмов с цитокинами хозяина [71]. При работе с Micrococcus luteus Mukamolova G.V. et al., [67] обнаружили белок, обозначенный как Rpf (Resuscitation Promoting Factor), выделяемый культурой в среду. Этот белок при добавле- Immunopathology, Allergology, Infectology 2010 N°4 Инфектология: Роль некультивируемых форм неспорообразующих бактерий в поддержании гомеостаза популяции нии в среду либо в виде препарата белка, либо в составе фильтрованного супернатанта экспоненциальной культуры вызывает активную реанимацию покоящихся клеток микрококка, а так же позволяет вегетативным клеткам этого вида расти на средах, в норме не поддерживающих их рост [67, 72]. Показано так же наличие генов гомологичных rpf у других микроорганизмов [67]. Так M. tuberculosis содержит пять генов гомологичных rpf микрококка и при выключении трех из них микроорганизм оказывается неспособным вернуться в активное состояние [73]. Для Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium smegmatis и Rhodococcus rhodochrous так же показано, что добавление к суспензии ПК культуральной жидкости из поздней экспоненциальной фазы роста существенно повышает уровень реанимации клеток [58, 66], так же как и добавление пикомолярных количеств чистого рекомбинантного Rpf [59]. Интересен так же факт, что добавление небольшого количества клеток экспоненциальной культуры Micrococcus luteus к суспензии ПК Mycobacterium smegmatis вызывает увеличение числа реанимированных клеток [58]. Недавно показано, что Rpf и подобные ему белки имеют сходство с литическими ферментами, такими как, лизоцим [74, 75]. Они так же имеют на С-конце домен, характерный для прикрепляющихся к клеточной стенке белков. Кроме того, белок обладает протеолитической активностью, на что указывает быстрая потеря его активности при хранении в чистом виде, а так же эксперименты, показавшие сходство этой активности с таковой у трипсина [75]. Наличие пептидогликангидролазной активности белков семейства Rpf позволяет предположить, что активация ПК требует гидролиза клеточной стенки, оказывая влияние на свойства клетки и способствуя выходу из нее факторов, влияющих на пробуждение [74]. 7. Детекция некультивируемых форм При диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, выделяемых из клинического материала или из природных источников, пребывание микроорганизма в состоянии некультивируемости может искажать результаты анализа. Культуральный метод в данном случае часто дает ложноотрицательные данные или заниженные результаты, так как НК не образуют колоний на питательных средах. ПЦР-диагностика анабиотических Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2010 N°4 форм затруднена, поскольку клетки могут не разрушиться при стандартных методиках лизиса, и ДНК для изучения будет недоступна [76]. Серологическая диагностика не всегда эффективна, поскольку структура поверхностных антигенов этих клеток может быть изменена, например, некоторые штаммы Tenacibaculum sp. не взаимодействуют с гомологичными сыворотками [68]. Ряд методов позволяют выявлять НК в исследуемом материале: прямой счет жизнеспособных клеток методом флуоресценции живых [77, 78]; ПЦР-диагностика [69, 77]; ПЦР с обратной транскрипцией [79, 80]; проточная цитометрия [81 – 83]; иммуноферментный анализ [84]; FISH (флуоресцентная in situ гибридизация) [85]; применение рекомбинантных бактериофагов [86]. Однако только применение комбинации нескольких методов позволит точно диагностировать возбудителя. При переходе клеток в НС возникает латентная персистенция микробов в организме хозяина [32]. В такой ситуации для реверсии клеток к нормальному физиологическому статусу эффективными могут оказаться специальные среды для роста некультивируемых микроорганизмов. После возобновления инфекции, после ремиссии заболевания, целесообразно проводить повторную диагностику (серологическую, фаговую, ПЦР-диагностику) вследствие возникших у возбудителя изменений серотипа или фаготипа, связанных с перестройкой генетического материала. Следует учитывать возможность присутствия НК в любом исследуемом материале. По-видимому, применение комбинации методов позволит более точно проводить диагностику бактериальных инфекций. Заключение Обратимый переход в некультивируемое и покоящееся состояние крайне важен для обеспечения переживания микроорганизмами неблагоприятных условий. Это четко регулируемый процесс, запускаемый определенным набором стрессовых факторов. Отсутствие способности к образованию колоний создает трудности при работе с материалом, содержащим некультивируемые формы, поскольку необходимо применять дополнительные методы для выявления микроорганизмов. Для более точной диагностики эффективно применение комбинации методик. Важна так же работа по поиску индукторов, способных вернуть искомый микроб в культивируемое состояние. 63 Ю.Д. Пахомов, Л.П. Блинкова, Л.Г. Стоянова Литература 1. Солохина Л.В., Пушкарева В.И., Литвин В.Ю. Образование покоящихся форм и изменчивость Yersinia pseudotuberculosis под воздействием сине-зеленых водорослей (цианобактерий) и их экзометаболитов. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2001, 3: 17-22. 2. Романова Ю.М., Чегаева Е.В., Гинцбург А.Л. Некультивируемое состояние у патогенных бактерий: известные и возможные факторы индукции обратимого процесса. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1998; 3:3-8. 3. Николеишвили Л.Р., Подосинникова Л.С. Переход холерных вибрионов в некультивируемое состояние под влиянием некоторых абиотических факторов. Фундаментальные исследования. 2004; 2:18-21. 4. Aulet O., Silva C., Fraga S.G. et al. Detection of viable and viable nonculturable Vibrio cholerae O1 through cultures and immunofluorescence in the Tucumбn rivers, Argentina. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 2007; 40:385-390. 5. Dong-Geun L., Park S.J., Kim S-J. Influence of Pipe Materials and VBNC Cells on Culturable Bacteria in a Chlorinated Drinking Water Model System. J. Microbiol. Biotechnol. 2007; 17:1558–1562. 6. Tholozan J. L., Cappelier J. M, Tissier J. P., Delattre G., Federighi M. Physiological Characterization of Viable-butNonculturable Campylobacter jejuni Cells. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65:1110-1116. 7. Heidelberg J. F., Shahamat M., Levin M. et al. Effect of Aerosolization on Culturability and Viability of Gram-Negative Bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 1997; 63:3585–3588. resuscitation from viable but nonculturable state in Aeromonas hydrophila exposed to natural seawater at low temperature. Journal of Applied Microbiology. 2004; 97:557–565 . 19. Vora G.J., Meador C.E., Bird M.M. et al. Microarray-based detection of genetic heterogeneity, antimicrobial resistance, and the viable but nonculturable state in human pathogenic Vibrio spp. PNAS 2005; 102:19109–19114. 20. Currбs M., Magariсos B., Toranzo A. E., Romalde J. L. Dormancy as a survival strategy of the fish pathogen Streptococcus parauberis in the marine environment. Dis. Aquat. Org. 2002; 52:129–136. 21. Haque M.M., Khan S.I., Ahsan C.R. Influence of Some Physicochemical Stresses on the Survival of Vibrio cholerae O1 at Non-Culturable State. Bangladesh J Microbiol 2007; 24:133136. 22. Эль-Регистан Г.И., Дуда В.И., Козлова А.Н., Митюшина Л.Л., Поплаухина О.Г. Изменение конструктивного метаболизма и ультраструктурной организации клеток Bacillus cereus под влиянием специфического ауторегуляторного фактора. Микробиология 1979; 48:240-244. 23. Suzina N.E., Mulyukin A.L., Dmitriev V.V. et al., The structural bases of log-term anabiosis in non-spore-forming bacteria. Advances in Space Research 2005; 38:1209-1219. 24. Дорошенко Е.В., Лойко Н.Г, Ильинская О.Н. и соавт. Характеристика диссоциантов Bacillus cereus. Микробиология 2001; 70: 811-819. 8. Bode G., Mauch F., Malfertheiner P. The Coccoid Forms of Helicobacter pylori. Criteria for Their Viability. Epidemiology and Infection. 1993; 111:483-490. 25. Пушкарева В.И. Экспериментальная оценка взаимодействий Yersinia pestis EV с почвенными инфузориями и возможности длительного сохранения бактерий в цистах простейших. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2004; 4:40-44. 9. Cellini L, Allocati N, Angelucci D, Iezzi T, Di Campli E, Marzio L, Dainelli B. Coccoid Helicobacter pylori Not Culturable in Vitro Reverts in Mice. Microbiol. Immunol 1994; 38:843–850. 26. Демкина Е.В., Соина В.С., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях. Микробиология 2000; 69:383388. 10. Ganesan B., Stuart M.R., Weimer B.C. Carbohydrate Starvation Causes a Metabolically Active but Nonculturable State in Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 2007; 73:2498–2512. 27. Soina V.S., Mulyukin A.L., Demkina E.V., Vorobyova E.A., El-Registan G.I. The structure of resting bacterial populations in soil and subsoil permafrost. Astrobiology 2004; 4:345-358. 11. Porter J., Edwards C., Pickup R.W. Rapid assessment of physiological status in Escherichia coli using fluorescent probes. J. Appl. Bacteriol. 1995; 4:399- 408. 12. Oliver J.D. The viable but nonculturable bacteria. J. Microbiol. 2005; 2:93-100. 13. Federighi, M., Tholozan J.L., Cappelier J.M., Tissier J.P., Jouve J.L. Evidence of non-coccoid viable but non-culturable Campylobacter jejuni cells in microcosm water by direct viable count, CTC-DAPI double staining, and scanning electron microscopy. Food Microbiol. 1998; 15:539-550. 14. Smith B., Oliver J.D. In situ and in vitro gene expression by Vibrio vulnificus during entry into, persistence within, and resuscitation from the viable but nonculturable state. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72, 2:1445-1451. 15. Saux, M.F.-L., Hervio-Heath D., Loaec S., Colwell R.R., Pommepuy M. Detection of cytotoxin-hemolysin mRNA in nonculturable populations of environmental and clinical Vibrio vulnificus strains in artificial seawater. Appl. Environ. Microbiol. 2002; 68:5641-5646. 16. Rahman I., Shahamat M., Choudhury M.A.R., Colwell R.R. Potential virulence of viable but nonculturable Shigella disenteriae Type I. Appl. Environ. Microbiol. 1996; 62:115-120. 17. Signoretto, C., Lleт M.M., Canepari P. Modification of the peptidoglycan of Escherichia coli in the viable but nonculturable state. Curr. Microbiol. 2002; 44:125-131. 18. Maalej S., Gdoura R., Dukan S., Hammami A., Bouain A. Maintenance of pathogenicity during entry into and 64 28. Дмитриев В.В., Сузина Н.Е., Баринова Е.С., Дуда В.Е., Боронин А.М. Электронно-микроскопическое изучение ультраструктуры микробных клеток in situ в экстремальных биотопах. Микробиология. 2004; 73:832-840 . 29. Мулюкин А.Л., Сорокин В.В., Воробьева Е.А. и соавт. Применение метода рентгеновского анализа для выявления и предварительной оценки физиологического состояния микроорганизмов в объектах окружающей среды. Микробиология. 2002; 71:836-848. 30. Головлев Е.Л. Другое состояние неспорулирующих бактерий. Микробиология. 1998; 67:725-735. 31. Лойко Н.Г., Соина В.С., Сорокин Д.Ю. Митюшина Л.Л., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм хемолитоавтотрофных бактерий Thioalkalivibrio versutus и Thioalkalimicrobium aerophilum. Микробиология 2003; 72:328-337. 32. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина 2005. 33. Сузина Н.Е., Мулюкин А.Л., Козлова А.Н. и соавт. Тонкое строение покоящихся клеток некоторых неспорообразующих бактерий. Микробиология 2004; 73:516-529. 34. Дмитриев В.В., Сузина Н.Е., Русакова Т.Г., Гиличинский Д.А., Дуда В.И. Ультраструктурные особенности природных форм микроорганизмов изолированных из грунтов вечной мерзлоты Восточной Сибири методом низкотемпературного фракционирования. Доклады Академии Наук 2001; 378:846-849. Immunopathology, Allergology, Infectology 2010 N°4 Инфектология: Роль некультивируемых форм неспорообразующих бактерий в поддержании гомеостаза популяции 35. Мулюкин А.Л., Вахрушев М.А., Стражевская Н.Б. и соавт. Влияние микробных аутоиндукторов анабиоза - алкилоксибензолов - на структурную организацию ДНК Pseudomonas aurantiaca и индукцию фенотипической диссоциации. Микробиология. 2005; 74:157-165. growth transition to stationary phase. Mol. Microbiol. 2002; 43:269-279. 36. Мулюкин А.Л., Сорокин В.В., Лойко Н.Г. и соавт. Сравнительное изучение элементного состава вегетативных и покоящихся клеток микроорганизмов. Микробиология. 2002; 72:37-48. 53. Anderson R.P., Roth J.R. Tandem duplications in phage and bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 1977; 31:473-505. 37. Мулюкин А.Л., Демкина Е.В., Козлова А.Н., Соина В.С., Эль-Регистан Г.И. Синтез аутоиндукторов анабиоза у неспорообразующих бактерий как механизм регуляции их активности в почве и подпочвенных осадочных породах. Микробиология 2001 70:620-628. 38. Светличный В.А., Савельева Н.Д., Некрасова В.К., ЭльРегистан Г.И., Романова А.К. Органотрофный рост и синтез ауторегуляторного фактора у Pseudomonas carboxydoflava. Микробиология 1982; 51:606-610. 39. Светличный В.А., Эль-Регистан Г.И., Романова А.К., Дуда В.И. Характеристика ауторегуляторного фактора d2 вызывающего автолиз клеток Pseudomonas carboxydoflava и Bacillus cereus. Микробиология 1983; 52:33-38. 40. Мулюкин А.Л., Филлипова С.Н., Козлова А.Н. и соавт. Видонеспецифичность действия низкомолекулярных ауторегуляторов - неацилированного лактона гомосерина и гексилрезорцина - на рост и развитие бактерий. Микробиология 2006; 75:472-482. 41. El-Registan G.I., Mulyukin A.L., Nikolaev Yu.A., et al. The role of low-molecular-weight autoregulatory factors (alkylhydroxybenzenes) in resistance to radiation and heat shock. Advances in Space Research 2005; 36:1718-1728. 42. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Шмидт М.А., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л., Эль-Регистан Г.И. Роль бактериальных ауторегуляторов роста группы алкилоксибензолов в ответе стафилококков на стрессовые воздействия. Микробиология 2002; 71:23-29. 43. Давыдова О.К., Дерябин Д.Г., Никиян А.Н., Эль-Регистан Г.И. О механизмах взаимодействия ДНК с химическими аналогами микробных аутоиндукторов анабиоза. Микробиология 2005; 74:616-625. 44. Капрельянц А.С., Сулейменова М.И., Сорокина А.Д. и соавт. Структурно-функциональные изменения в бактериальных и модельных мембранах под действием фенольных липидов. Биологические мембраны 1987; 4:254-261. 45. Степаненко И.Ю., Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Роль алкилоксибензолов в адаптации Micrococcus luteus к температурному шоку. Микробиология 2005; 74:26-33. 46. Беспалов М.М., Колпаков А.И., Лойко Н.Г. и соавт. Функции аутоиндукторов анабиоза при создании метаболического блока в клетке. Микробиология 2000; 69:217223. 47. Давыдова О.К., Дерябин Д.Г., Эль-Регистан Г.И. Длительное сохранение ДНК в водных растворах в присутствии химических аналогов микробных ауторегуляторов. Микробиология. 2006; 75:662-669. 48. Хабибуллин С.С., Николаев Ю.А., Лойко Н.Г. и соавт. Ауторегуляция фенотипической диссоциации у Bacillus cereus. Журн. Микробиол. 2006; 6:9-13. 49. Сузина Н.Е., Мулюкин А.Л., Лойко Н.Г. и соавт. Тонкая структура мумифицированных клеток микроорганизмов, образующихся под влиянием химического аналога аутоиндуктора анабиоза. Микробиология. 2001; 70:776787. 50. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Зеленихин П.В. и соавт. Влияние аутоиндукторов анабиоза бактерий на геном микробной клетки. Микробиология 2002; 71:194-199. 51. Makinoshima H., Nishimura A., Ishihama A. Fractionation of Escherichia coli cell populations at different stages during Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2010 N°4 52. Aersten A., Michielis C.W. Stress and how bacteria cope with death and survival. Crit. Rev. Microbiol. 2004; 30:263-273. 54. Booth I.R. Stress in single cell: Intrapopulation diversity is a mechanism to ensure survival upon exposure to stress. Int. J. Food Microbiol. 2002; 78:19-30. 55. Holmstrom K., Tolker-Nielsen T., Molin S. Physiological states of individual Salmonella typhimurium cells monitored by in situ reverse transcription-PCR. J. Bacteriol. 1999; 181:17331738. 56. Gonzales-Pastor J.E., Hobbs E.C., Losik R. Cannibalism by sporulating bacteria. Science 2003; 305:510-513. 57. Bovill R.A., Mackey B.M. Resuscitation of “non-culturable” cells from aged cultures of Campylobacter jejuni. Microbiology 1997; 143:1575-1581. 58. Shleeva M., Mukamolova G.V., Young M., Williams H.D., Kaprelyants A.S. Formation of “non-colturable” cells of Mycobacterium smegmatis in stationary phase in response to growth under suboptimal conditions and their Rpf-mediated resuscitation. Microbiology. 2004 150:1687-1697. 59. Шлеева М.О., Мукамолова Г.В., Телков М.В. и соавт. Образование «некультивируемых» клеток Mycobacterium tuberculosis и их оживление. // Микробиология 2003 Т. 72, № 1, С. 76-83. 60. Whitesides M.D., Oliver J.D. Resuscitation of Vibrio vulnificus from the viable but nonculturable state. Appl. Environ. Microbiol. 1997; 63:1002-1005. 61. Bates T.C., Oliver J.D. The viable but nonculturable state of Kanagawa positive and negative strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Microbiol. 2004; 42:74-79. 62. Mizunoe Y., Wai S.N., Takade A., Yoshida S. Restoration of culturability of starvation-stressed and low-temperature-stressed Escherichia coli O157 cells by using H2O2 degrading compounds. Arch. Microbiol. 2000; 172:63-67. 63. Bogosian G., Aardema N.D., Bourneuf E.V., Morris P.J.L., O’Neil J.P. Recovery of hydrogen peroxide-sensitive culturable cells of Vibrio vulnificus gives appearance of resuscitation from a viable but nonculturable state. J. Microbiol. 2000; 182:50705075. 64. Kong I.-S., Huelsmann A., Bates T.C., Oliver J.D. The role of reactive oxygen species in the viable but nonculturable state in Vibrio vulnificus. FEMS Microbiol. Ecol. 2004; 50:133-142. 65. Steinert M., Emцdy L., Amann R., Hacker J. Resuscitation of Viable but Nonculturable Legionella pneumophila Philadelphia JR32 by Acanthamoeba castellanii. Appl. Environ. Microbiol. 1997; 63:2047–2053. 66. Mukamolova G.V., Kaprelyants A.S., Young D.L., Young M. A bacterial cytokine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998; 95:89168921. 67. Mukamolova G.V., Yanopolskaya N.D., Kell D.B., Kaprelyants A.S. - On resuscitation from the dormant state of Micrococcus luteus. // Antonie van Leeuwenhoek 1998 V. 73, P. 237-243. 68. Masuda Y., Tajima K., Ezura Y. Resuscitation of Tenacibaculum sp., the causative bacterium of spotting disease of sea urchin Strongylocentroutos intermedius from viable but non-culturable state. Fisheries Science. 2004; 70:277-284. 69. Alam M., Sultana M., Nair G.B. et al. Viable but nonculturable Vibrio cholerae O1 in biofilms in the aquatic environment and their role in cholera transmission. PNAS 2007; 104:17801–17806. 70. Cappelier J.M., Minet J., Magras C., Colwell R. R., Federighi M. Recovery in Embryonated Eggs of Viable but Nonculturable Campylobacter jejuni Cells and Maintenance of Ability To 65 Ю.Д. Пахомов, Л.П. Блинкова, Л.Г. Стоянова Adhere to HeLa Cells after Resuscitation. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65:5154–5157. 71. Романова Ю.М., Алексеева Н.В., Степанова Т.В. Влияние фактора некроза опухолей на рост вегетативных и некультивируемых форм Salmonella. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2002; 4:20-25. 72. Mukamolova G.V., Kormer S.S., Kell D.B., Kaprelyants A.S. Stimulation of multiplication of Micrococcus luteus by autocrine growth factor. Arch. Microbiol. 1999; 172:9-14. 73. Downing K.J., Mischenko V.V., Shleeva M.O. et al. Mutants of Mycobacterium tuberculosis lacking three of five rpf-like genes are defective for growth in vivo and for resuscitation in vitro. Infection and Immunity. 2005; 73:3038-3043. 79. Veeh R.H., Shirtliff M.E., Petik J.R., et al. Detection of Staphylococcus aureus Biofilm on Tampons and Menses Components. J. Infect. Dis. 2003; 88:519-530. 80. Reichert-Schwillinsky F., Pin C., Dzieciol M., Wagner M., Hein I. Stress- and Growth Rate-Related Differences between Plate Count and Real-Time PCR Data during Growth of Listeria monocytogenes. Appl. Environ. Microbiol. 2009; 75:2132–2138. 81. Lleт M., Pierobon S., Tafi M.C., Signoretto C., Canepari P. mRNA Detection by Reverse Transcription-PCR for Monitoring Viability over Time in an Enterococcus faecalis Viable but Nonculturable Population Maintained in a Laboratory Microcosm. Appl. Environ. Microbiol. 2000; 66:4564–4567. 74. Keep N.H., Ward J.M. Cohen-Gonsaud M., Henderson B. Wake up! Peptidoglycan lysis and bacterial non-growth state. Trends Microbiol. 2006; 14:271-276. 82. Kaprelyants A.S., Kell D.B. Dormancy in stationary-phase cultures of Micrococcus luteus: flow cytometric analysis of starvation and resuscitation. Appl Environ Microbiol. 1993; 59:3187–3196. 75. Телков М.В., Демина Г.Р., Волошин С.А. и соавт. Белки семейства Rpf (Resuscitation promoting factor) являются пептидогликангилролазами. Биохимия 2006; 71:514524. 83. Diaper J.P., Edwards C. The use of fluorogenic esters to detect viable bacteria by flow cytometry. J. Appl. Bacteriol. 1994; 77:221-228. 76. Гоголев Ю.В., Горшков В.Ю., Петрова О.Е., Мухаметшина Н.Е., Агеева М.Е. Выявление и характеристика некультивируемых форм Erwinia carotovora в длительно инкубируемых культурах. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2009; 4:77-80. 77. Binsztein N., Costagliola M.C., Pichel M., et al. Viable but Nonculturable Vibrio cholerae O1 in the Aquatic Environment of Argentina. Appl. Environ. Microbiol. 2004; 70:7481–7486. 78. Albertini M.C., Accorsi A., Teodori L., et al., Use of Multiparameter Analysis for Vibrio Alginolyticus Viable but Nonculturable State Determination. Cytometry A. 2006; 69:260-265. 84. Aulet O. Silva C., Fraga S.G., et al., Detection of viable and viable nonculturable Vibrio cholerae O1 through cultures and immunofluorescence in the Tucumбn river, Argentina. Rev Soc Bras Med Trop. 2007; 40:385-90. 85. Awais R., Fukudomi H., Miyanaga K., Unno H., Tanji Y. A Recombinant Bacteriophage-Based Assay for the Discriminative Detection of Culturable and Viable but Nonculturable Escherichia coli O157:H7. A106 Biotechnol. Prog. 2006; 22:853-859. 86. Du M., Chen J., Zhang X., Li A., Li Y., Wang Y. Retention of Virulence in a Viable but Nonculturable Edwardsiella tarda Isolate. Appl. Environ. Microbiol. 2007; 73:1349–1354. Сведения об авторах: Л.П. Блинкова, Ю.Д. Пахомов, Л.Г. Стоянова. НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва, Россия1. Малый казенный переулок 5а,тел. 8-495-9161152 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова2. Ленинские горы, д. 1, стр. 12, тел. 8-495-9394545. Поступила 22.09.2010 г. 66 Immunopathology, Allergology, Infectology 2010 N°4
