Влияние условий сублимационного высушивания пробиотиков

СИБИРСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ № 2`2009 (выпуск 2)
Целью данной работы явилось изучение влияния условий сублимационного высушивания препаратов лактобактерина и бифидумбактерина на
установках ТГ-50.4 и BOC Edwards на специфическую активность препаратов.
ОРГАНИЗАЦИЯ
ПРОИЗВОДСТВА
МЕДИЦИНСКИХ
ПРЕПАРАТОВ
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
УДК 636.049.6.
Т.Д. Лимарева, В.Н. Девякович,
М.И. Демешева, Л.Н.Мезенцева, Е.В. Рузавина
E-mail: dem @virion.tomsknet.ru.
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ
СУБЛИМАЦИОННОГО ВЫСУШИВАНИЯ
ПРОБИОТИКОВ
НА СПЕЦИФИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ
Филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ в г. Томск
«НПО «Вирион»
ВВЕДЕНИЕ
В качестве исследуемого материала были использованы полуфабрикаты и готовые серии лактобактерина и бифидумбактерина производства НПО «Вирион». Препараты были высушены на вакуумносушильных установках ТГ-50 и BOC Edwards в режимах, утверждённых действующими регламентами
производства. В качестве ксеропротекторов использовали сахарозо-желатиново-молочную среду, которую добавляли к микробной суспензии в количестве
50%. Препараты разливали во флаконы ФИ-1-5: лактобактерин – по 2,2 мл; бифидумбактерин – по 1,8 мл.
На рисунке 1 (кривая АВ1С1) представлены процессы замораживания лактобактерина и бифидумбактерина в сублиматоре BOC Edwards. Замораживание препаратов вели до температуры не выше минус 42°С в течение не менее 5 часов при температуре полок не выше минус 50°С. Конечная температура замораживания препаратов не выше минус 42°С.
При использовании для сублимационного высушивания установки ТГ-50 предварительное замораживание лактобактерина и бифидумбактерина осуществляли в низкотемпературных прилавках TV-1000,
охлаждённых до температуры не выше минус 50°С
(рис. 1, АВ2С2). Полуфабрикаты загружали в морозильную камеру. Начальная температура продукта
при загрузке составляла (22±2)°С. Длительность замораживания продукта при температуре не выше
минус 42°С не менее 16 часов, после чего замороженный полуфабрикат загружали в камеру сублиматора.
На рисунке 2 представлен процесс сублимационного высушивания препаратов на установке BOC
Edwards. По окончании замораживания препаратов
сублиматор переводили на режим высушивания.
Охлаждали конденсатор до температуры не выше
минус 40°С, включали вакуумный насос. При дости-
Т,°С
Метод сушки биоматериалов из замороженного
состояния в вакууме является наиболее перспективным и удобным для практических целей. Этот метод
получил название сублимационного высушивания.
В настоящее время в технологии производства
сухих форм пробиотиков широко используется сублимационная сушка. Сублимация – наиболее надёжный и мягкий из известных способов удаления
воды из биологически активных ве30
ществ. Лиофилизированные препараA
ты сохраняют свою биологическую ак20
тивность в течение длительного срока
10
с минимальными потерями по коли0
честву живых микробных клеток [1].
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16
10
Выживаемость микроорганизмов
B1
B2
20
при высушивании зависит от большого количества факторов, среди кото30
рых важное место занимают биологиC1
C2
40
ческие особенности микробов, связан50
ные с их видовой специфичностью,
60
условия культивирования и технолоt.час
гические возможности процесса лиоВ сублимационной установке BOC Edwards
В низкотемпературном прилавке НС 280/75
Температура конденсатора
фильной сушки, обусловленные имеющимися видами оборудования [2].
Рис. 1. Кривые замораживания пробиотиков
68
Т.Д. Лимарева, В.Н. Девякович и др.
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ВЫСУШИВАНИЯ ПРОБИОТИКОВ ...
для приготовления суспензии для приёма внутрь и
местного применения».
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета Excel.
Для выявления статистической значимости результатов использовали критерий t Стъюдента [3].
РЕЗУЛЬТАТЫ
И ОБСУЖДЕНИЕ
На рисунке 1 приведены кривые замораживания
пробиотиков: в сублимационной установке BOC
Edwards (кривая АВ 1 С 1 )
Рис. 2. График сублимационноговысушивания пробиотиков
и
в низкотемпературном
на установке ВОС Edwards и ТГ-50
прилавке TV-1000 (кривая
жении температуры конденсатора не выше минус АВ2С2). Общеизвестно, что степень повреждения
40°С и стабилизации вакуума в камере сублимато- биоструктур особенно зависит от глубины и скоросра не более 13,3 Па начинали подогрев полок: каж- ти замораживания на предварительном этапе [4].
дый час на 5°С до температуры плюс 30°С. ОкончаСкорость охлаждения до температуры минус
ние процесса высушивания определяли по коли- (10-15)°С на сублимационной установке BOC Edчеству положительных температур препарата. Поло- wards (кривая 1, участок АВ1) в два-три раза прежительную температуру препарат должен иметь не вышает скорость охлаждения препаратов до этих
менее 7 час. Общая продолжительность высушива- же температур в низкотемпературном прилавке
ния препаратов – не менее 27 час.
TV-1000 (кривая 2, участок АВ2). Длительность полПри высушивании препаратов в вакуумно-су- ного замораживания препаратов при температуре не
шильной установке ТГ-50 (рис. 2) полки сублимато- выше минус 42°С составляет не менее 5 час на устара охлаждали до температуры не выше минус 25°С, новке BOC Edwards и не менее 16 час – в низкотемконденсатор – до температуры не выше минус 50°С. пературном прилавке TV-1000.
Замороженный полуфабрикат максимально быстро
Из литературы известен факт повреждающего
выгружали из морозильной камеры, загружали в ка- действия кристаллов льда на клетки биоматериалов
меру сублиматора, включали вакуумный насос. В те- [1]. При этом форма клеток и другие факторы их
чение 30-60 мин препарат самоохлаждался под ваку- жизнедеятельности лучше сохраняются в процессе
умом. При достижении температуры препарата не быстрого замораживания (рис. 1, кривая АВ1С1). При
выше минус 42°С и стабилизации вакуума не более медленном замораживании (рис. 1, кривая АВ2С2)
13,3 Па начинали подогрев полок следующим обра- кристаллы льда формируются преимущественно
зом: три часа – до температуры минус 40°С, затем по- вне клеток, в результате клетки обезвоживаются,
догрев на 5-10°С в час до температуры плюс 20°С. что вызывает сгущение их содержимого и изменение
Температуру плюс 20°С выдерживали не менее 1 ча- рН среды.
са. Затем вели подогрев полок до температуры плюс
Таким образом, на этапе замораживания повреж30°С. Конечная температура продукта – не выше дение клеток происходит:
плюс 30°С. Длительность процесса высушивания
1) за счёт перепада температур и механического
определяли по количеству положительных значений повреждения клеток при образовании и росте кристемператур препарата, которое должно быть не ме- таллов льда (быстрое замораживание) и 2) за счёт
нее 10 часов для бифидумбактерина и 12 час – для денатурации белка при пребывании клеток длительлактобактерина. Общая длительность высушивания ное время в концентрированных растворах электробифидумбактерина не менее 38 час, лактобактерина литов и механического повреждения клеток при рос– не менее 45 час.
те кристаллов льда (медленное замораживание).
Оценку специфической активности препаратов
На рисунке 2 представлены кривые высушивапо количеству живых микробных клеток проводили ния препаратов. Важнейшими режимными параметсогласно ФСП 42-0504722405 «Бифидумбактерин рами, обеспечивающими качество сухого продукта,
сухой, лиофилизат для приготовления суспензии является температура (отрицательная – при сублидля приёма внутрь и местного применения» и ФСП мации и положительная – при досушивании) и дли42-0504729805 «Лактобактерин сухой, лиофилизат тельность её поддержания в материале. Длитель69
ОРГАНИЗАЦИЯ ПРОИЗВОДСТВА МЕДИЦИНСКИХ ПРЕПАРАТОВ
ность этапа сублимации пропорциональна объёму
препаратов. Длительность этапа досушивания зависит от времени достижения остаточной влажности
не выше допустимой.
При сублимационном высушивании препаратов
на установке BOC Edwards окончание процесса определяют по количеству положительных температур
препарата. Положительную температуру препарат
должен иметь не менее 7 час. Общая продолжительность высушивания – не менее 27 час (рис. 2).
При сублимационном высушивании на ТГ-50
процесс идёт медленнее, и длительность его также
определяется количеством положительных температур препаратов: не менее 10 час для бифидумбактерина и не менее 12 час для лактобактерина. Общая
продолжительность высушивания: не менее 38 час
для бифидумбактерина и не менее 45 час для лактобактерина (рис. 2).
Одним из основных показателей качества пробиотиков является жизнеспособность микробных
клеток после сублимационной сушки (специфическая активность). В таблицах 1 и 2 представлены реТаблица 1
Количество живых микробных клеток бифидумбактерина до и после сублимации
Сублимационное высушивание на BOC Edwards
№ серии
Количество живых микробных клеток
препарата
КОЕ/мл (M±m)
До сушки
После сушки
8
297
(8,5±0,5) ×10
(2,0±1,0) ×108
303
(1,5±0,5) ×109
(2,5±0,5) ×108
9
305
(1,5±0,5) ×10
(3,5±0,5) ×108
298
(2,0±1,0) ×109
(3,5±0,5) ×108
300
(9,0±1,0) ×108
(3,0±0,5) ×108
9
302
(2,0±0,0) ×10
(3,5±0,5) ×108
305
(1,5±0,5) ×109
(1,2±0,5) ×108
314
(8,5±0,5) ×108
(2,0±0,1) ×108
9
316
(1,0±0,0) ×10
(1,0±0,0) ×108
317
(1,0±0,0) ×109
(1,0±0,0) ×108
320
(7,0±0,1) ×108
(2,0±0,0) ×108
8
321
(8,5±0,5) ×10
(2,0±0,1) ×108
Итого
(1,2±1,01) ×109
(2,43±1,6) ×108
Сублимационное высушивание на ТГ-50
№ серии
Количество живых микробных клеток
препарата
КОЕ/мл (M±m)
До сушки
После сушки
9
299
(1,5±0,5) ×10
(8,2±0,8) ×107
301
(1,5±0,5) ×109
(7,0±0,5) ×107
9
304
(1,0±0,5) ×10
(1,3±0,2) ×108
306
(1,0±0,0) ×109
(1,3±0,6) ×108
312
(1,0±0,0) ×109
(8,6±0,6) ×107
8
313
(9,0±0,0) ×10
(7,2±0,2) ×107
315
(1,0±0,0) ×109
(1,0±0,3) ×108
318
(2,0±0,0) ×109
(1,2±0,5) ×107
8
319
(7,5±0,1) ×10
(8,8±0,4) ×107
–
–
–
–
–
–
–
–
–
9
Итого
(1,2±0,67) ×10
(9,6±0,43) ×107
Таблица 2
Количество живых микробных клеток лактобактерина до и после сублимации
Сублимационное высушивание на BOC Edwards
№ серии
Количество живых микробных клеток
препарата
КОЕ/мл (M±m)
До сушки
После сушки
61
7,2±0,07
2,7±0,14
63
8,6±0,14
2,3±0
64
8,6±0,21
2,3±0
66
8,2±0,14
2,3±0,14
67
8,0±0
2,3±0
68
7,8±0,21
2,7±0,14
69
7,3±0,21
2,5±0,14
71
8,5±0,14
2,05±0,07
72
7,8±0,07
2,35±0,07
73
7,8±0,07
2,05±0,07
77
8,05±0,07
2,25±0,07
79
8,0±0,14
2,05±0,07
Итого
7,97±0,4
2,3±0,2
70
Сублимационное высушивание на ТГ-50
№ серии
Количество живых микробных клеток
препарата
КОЕ/мл (M±m)
До сушки
После сушки
62
7,9±0,07
2,0±0,02
65
7,8±0,21
2,2±0,05
70
8,9±0,07
2,08±0,1
74
8,3±0,21
1,6±0,1
76
9,2±0,21
2,2±0,1
78
7,8±0,14
2,0±0
83
8,5±0,21
1,8±0,2
88
9,0±0,21
2,3±0,5
92
8,7±0
2,3±0,1
98
7,7±0,14
2,3±0,1
107
7,8±0,14
2,08±0,2
124
8,2±0,14
2,03±0,5
Итого
8,31±0,5
2,07±0,2
СИБИРСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ № 2`2009 (выпуск 2)
зультаты анализа количества живых микробных клеток в полуфабрикатах и готовых препаратах бифидумбактерина и лактобактерина до сублимационного
высушивания и после.
Как видно из таблиц, средние показатели активности жидких полуфабрикатов, предназначенных для
сушки как на BOC Edwards, так и на ТГ-50, фактически не отличались друг от друга (р>0,05; r=0,4 для
бифидумбактерина и р>0,05; r=0,15 – для лактобактерина), то есть статистически значимых различий нет.
Бифидумбактерин, высушенный на установке
BOC Edwards, имел активность микробных клеток
на порядок выше, чем препарат, высушенный на
ТГ-50 (р<0,05; r=0,32), для сухого лактобактерина выявлена аналогичная зависимость (р<0,05; r=0,0098).
ВЫВОДЫ
В результате проведённого сравнительного анализа режимов лиофильного высушивания пробиотиков на сублимационных установках BOC Edwards
и ТГ-50 установлено:
1. Наиболее критичным этапом в процессе является
замораживание. Условия замораживания в низкотемпературном прилавке TV-1000 и в установке
BOC Edwards отличаются своей скоростью и длительностью. Высокие скорости замораживания
приводят к минимальным повреждениям микробных клеток.
2. Установлено статистически значимое снижение
активности пробиотиков при сублимационном
высушивании на ТГ-50 по сравнению с BOC
Edwards.
ЛИТЕРАТУРА
1. Антонов С.Ф., Сигаев Г.И., Никонов Б.А., Кобатов А.И.
Особенности сублимационной сушки лекарственных и
диагностических препаратов в ампулах.// Биотехнология. 1998. – № 5. – С. 48-69.
2. Семёнов Г.В. Вакуумная сублимационная сушка. Основные понятия и определения. – Материалы международной научно-технической конференции. – Москва,
2005. – С. 86-92.
3. Гельман В.Я. Медицинская информатика: практикум. –
С-Пб: Питер. – 2002. – 480 с.
4. Нежута А.А., Токарик Э.Ф., Самуйленко А.Я., Безгин В.М., Сербис Е.С. Теоретические и практические основы технологии сублимационного высушивания биопрепаратов. – Курск: Изд-во КГСХА. – 2002. – 239 с.
INFLUENCE OF SUBLIMATION DRYING
OF PROBIOTICS ON THEIR SPECIFIC
ACTIVITY
T.D. Limareva, V.N. Devyakovich,
M.I. Demesheva, L.N. Mezentseva, Ye.V. Rouzavina
SUMMARY
Comparative analysis of conditions of lyophilization
of probiotics on freeze-drying devices BOS Edwards
and TG-50 was performed. Influence of conditions of
freezing and sublimation on specific activity of probiotics is demonstrated to be different.
Key words: sublimation device, liophylization, specific activity.
71