ратории оборудование, реагенты и материалы, имеющие сер-

СТАНДАРТИЗАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ, ПЕРЕДАВАЕМЫХ ПОЛОВЫМ ПУТЕМ
ратории оборудование, реагенты и материалы, имеющие сертификат качества и действующий срок годности. Применялись стандартные питательные среды для культивирования
микроорганизмов, комплект для экспресс-диагностики мочи.
Видовая принадлежность уропатогенов и чувствительность
к АМП определялась на анализаторе Vitek 2 (BioMerieux).
Интерпретация результатов проводилась с учетом этиологической значимости, количества, степени патогенности уропатогенов и частоты их выделения при ИМВП (инфекции
мочевыделительных путей).
Было исследовано 266 образцов мочи от детей с ИМП из
отделения урологии. Образцы мочи до назначения АБТ, согласно инструкции по забору материала, отбирались в универсальные одноразовые контейнеры методом, назначенным
врачом-клиницистом в каждом конкретном случае. Из контейнера производился забор материала в пробирку системы
Vacutainer (для микроскопии осадка) и посев на систему
«ДипСтрик». После оформления сопроводительного направления, согласно утвержденной форме (строго указано время
забора материала), образцы доставляли в лабораторию. Аналитический этап включал: 1. Метод предварительной оценки
наличия бактерий в моче (микроскопия осадка на анализаторе UF 1000i); 2. Метод культурального исследования мочи традиционным методом (несекторный посев на кровяной
агар и Уриселект 4) и сопоставление полученных результатов
с результатами тест-системы «ДипСтрик». Результаты учитывали через 24–48 ч после инкубации при 35–37oC. Из 266
образцов мочи, посеянной обычным несекторным методом
и методом ДипСтрик, был получен результат «роста нет» в
74 и 76% соответственно. Образцы мочи, «отрицательные»
при исследовании на наличие микроорганизмов на анализаторе UF 1000i, показали результат «роста нет» при посеве,
выполненном как традиционным методом, так и экспрессметодом «ДипСтрик». Уропатогены при традиционном методе посева и посева методом «ДипСтрик» выделялись соответственно: E. coli 57% и 55%; Kl. Pneumoniae 12 и 11,8%;
E. faecalis – 20 и 19%; E. faecium 4 и 3,5%; Ps. aerugenosa – 3,1
и 2,9%; S. aureus – 3,1 и 3,0%; S. Saprophyticus – 2,5 и 2,5%;
P. mirabilis – 1,5 и 1,5%; P. vulgaris – 1 и 1%. Степень бактериурии выделенных уропатогенов при традиционном методе посева и ускоренном методе посева на «ДипСтрик» составила соответственно: 10*2–2,9% и 3,0%; 10*4–42% и 42;
10*5–50% и 50,5; 10*6–4,4 и 5%.
Таким образом, при исследовании мочи традиционным
культуральным методом и экспресс-методом «ДипСтрик»
были получены сопоставимые результаты. Ускоренный метод культуральной диагностики МВП при помощи тестсистемы «ДипСтрик» обеспечивает высокую чувствительность и специфичность для негативных образцов и с ростом
первичных патогенов (Е. coli, Р. mirabilis, Enterococcus spp) в
количестве 10*4, 10*5, 10*6. Высокая бактериальная концентрация (10*7 и >) предполагает субкультивирование для последующей идентификации. На основе особенностей роста
и результатов ориентировочной или окончательной (для Е.
coli) идентификации выросших на тест-системе «ДипСтрик»
колоний, по результатам микроскопии осадка, определению
лейкоцитов диагноз ИМВП может быть уверенно установлен
и назначена адекватная АБТ в течение первых 24 час.
СТАНДАРТИЗАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ
ИНФЕКЦИЙ, ПЕРЕДАВАЕМЫХ ПОЛОВЫМ ПУТЕМ
А. Е. Гущин, Г. А. Шипулин. Особенности стандартизации молекулярных методов в диагностике инфекций,
передаваемых половым путем. ФБУН ЦНИИ эпидемиологии, Москва
В настоящее время для диагностики инфекций, передаваемых половым путем, все чаще используются молекулярные
методы. Так, для Mycoplasma genitalium ПЦР – единственный метод диагностики, доступный в рутинной практике, для
Chlamydia trachomatis – предпочтительный метод диагностики (в соответствии с международными рекомендациями). Из
всех используемых методов выявления Neisseria gonorrhoeae
и Trichomonas vaginalis ПЦР обладает наибольшей диагностической чувствительностью.
Метод ПЦР является универсальным для обнаружения
различных возбудителей инфекций, передаваемых половым
путем. Однако методологические различия преаналитического и аналитического этапов могут препятствовать адекватной интерпретации получаемых результатов, а также
участию лабораторий в совместных клинических и научных
исследованиях.
Система стандартизации молекулярных методов диагностики представляет собой интегрированную систему, все
компоненты которой направлены на выявление методических и/или технических нарушений, которые могут повлиять
на аналитическую и соответственно диагностическую чувствительность исследования. Такие нарушения могут происходить на любом из этапов анализа: взятие клинического
материала, экстракция нуклеиновых кислот, амплификация,
интерпретация и учет данных в качественном и количественном формате.
В докладе будут представлены детальные практические
рекомендации по стандартизации молекулярных методов
диагностики на всех этапах исследования материала.
Д. А. Куевда, Д. Е. Киреев, Г. А. Шипулин. Опыт разработки стандартизированной технологии лабораторного
анализа вирусной нагрузки ВИЧ и вирусных гепатитов
с использованием молекулярно-биологических технологий. ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва
В настоящее время в Российской Федерации отсутствуют
единые нормативные требования к обеспечению качества и
единообразия проведения молекулярно-биологических исследований. Оценка вирусной нагрузки ВИЧ и вирусов гепатита В и С представляет современный и востребованный
вид лабораторного исследования, результаты которого существенно влияют на проводимую терапию. В связи с этим
нами была поставлена цель разработки стандартизированной
технологии лабораторного анализа вирусной нагрузки, которая позволит установить единые требования при выполнении данного вида исследования в клинико-диагностических
лабораториях (КДЛ) медицинских учреждений и достичь
унификации результатов.
Разрабатываемая стандартизированная технология включает раздел, описывающий требования к обеспечению выполнения технологии: требования к персоналу, требования
к обеспечению безопасности труда, материальные ресурсы,
необходимые для выполнения исследования, в том числе
оборудование, реактивы и расходные материалы. Раздел,
описывающий характеристики методик выполнения технологии, включает взятие образцов для анализа, рекомендованные бланки направления на исследование, оценку качества
образца, проведение предобработки образца, экстракции
нуклеиновых кислот, проведение реакции амплификации и
детекции результатов. Следующие разделы описывают правила регистрации результатов и обеспечение качества выполнения технологии, включая внутрилабораторный контроль
49
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 9, 2012
качества и внешнюю оценку качества. Таким образом, был
разработан документ, который может быть использован при
формировании нормативной базы проведения молекулярнобиологических исследований вирусной нагрузки.
М. Г. Творогова. Проблемы внешней оценки качества
молекулярно-биологических исследований. ФБУН ЦНИИ
эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва
Выявление и определение концентрации ДНК и РНК
возбудителей инфекций с помощью молекулярных биологических методов, в первую очередь ПЦР, получили широчайшее распространение в лабораторной практике и в некоторых случаях уже является основным способом выявления
инфекционного агента.
Появление ПЦР-исследований в арсенале методов диагностических лабораторий поставило задачи по разработке
правил внешнего контроля качества (ВКК), учитывающего
их особенности. Важной проблемой правильной организации ВКК является максимальное соответствие матрикса контрольных образцов (КО) биологическим образцам пациента.
Для ВКК-диагностики гематогенных инфекций при создании КО обычно используют плазму крови инфицированных
доноров, при создании КО для ВКК других инфекций может
быть использован разнообразный биологический материал
или его имитация, разведение клеточных культур возбудителя и др. Такое моделирование не всегда в полной мере отражает качество лабораторной диагностики на реальном клиническом материале и может быть причиной неадекватной
оценки работы лаборатории.
Обеспечение преемственности результатов, полученных в разных лабораториях с использованием наборов реагентов разных производителей, может быть достигнуто
только в условиях выполнения правил ВКК, учитывающего
особенности ПЦР-исследований. Сложность и многоэтапность ПЦР-исследований предъявляет особые требования
к стандартизации технологий их выполнения, указывает на
необходимость использования стандартных образцов, аттестованных относительно международных стандартов, и безусловного применения наборов реагентов, должным образом
зарегистрированных на территории РФ.
СТАНДАРТИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА
А. Б. Добровольский, Е. В. Титаева. Образование тромбина и его функции в системе гемостаза. Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздравсоцразвития РФ, Москва
До конца 80-х годов в активации свертывания крови выделяли 2 пути – внешний, инициатором которого является
тканевый фактор (ТФ), и внутренний, все компоненты которого присутствуют в плазме, а инициатором является контактная активация фактора XII (Ф ХII). Это деление соответствовало данным о влиянии дефицита факторов свертывания
на скорость образования фибрина в одном из 2 скрининговых
тестов – активированном частичном тромбопластиновом
времени (АЧТВ) или протромбиновом тесте (ПТ-тест), но не
позволяло объяснить, почему дефицит Ф XII не связан с кровоточивостью, а дефицит стоящих ниже в каскаде свертывания Ф VIII или IX проявляется в виде тяжелых геморрагий.
Объяснить это противоречие удалось благодаря исследованиям динамики образования тромбина, которые привели к существенной модификации классической схемы реакций активации свертывания крови. Было установлено, что: 1) комплекс
ТФ-фактор VIIa (теназа внешнего пути) активирует не только
фактор X, но и фактор IX; 2) теназа внутреннего пути (комплекс факторов VIIIa и IXа на поверхности активированных
тромбоцитов) активирует фактор X со скоростью в 50–100 раз
большей, чем теназа внешнего пути; 3) фактор XI активируется тромбином при участии гликопротеина Ibα тромбоцитов.
В начальном периоде активации свертывания крови тромбин образуется с низкой скоростью. Затем тромбин активирует
тромбоциты, а также Ф V и VIII, и скорость его образования
резко возрастает. Соответственно в образовании тромбина выделяют две фазы – инициации и распространения (тромбиновой вспышки). Свертывание фибриногена (образование сгустка
в клоттинговых тестах) происходит примерно в точке перехода
фазы инициации в фазу распространения, когда количество образовавшегося тромбина составляет всего ~5% от максимального. Тромбин, который образуется уже после свертывания фибриногена, играет важную роль в определении стабильности
тромбов. Об этом свидетельствует то, что дефицит факторов
VIII или IX (гемофилия А или В), определяющих фазу распространения образования тромбина, связан с кровоточивостью,
а дефицит ингибиторов, ограничивающих ее – антитромбина
или системы протеина С повышает риск тромбозов.
50
Т. В. Вавилова. Алгоритм начальной диагностики
нарушений в системе гемостаза. ГБОУ ВПО СЗГМУ
им. И. И. Мечникова, Санкт-Петербург
Отклонения в функционировании системы гемостаза,
приводящие к клиническим проявлениям в виде геморрагических и/или тромботических эпизодов, широко распространены в клинической практике. С ними сталкивается врач любой специальности, и начальные шаги в диагностике нарушений должны быть сделаны уже в лаборатории первичного
звена или любого стационара. Характер этих шагов зависит
от клинической ситуации и рабочей гипотезы, от вовлечения
тех или иных механизмов системы гемостаза.
При наличии или риске кровотечений необходимо определить характер и степень изменений в тромбоцитарном или
коагуляционном звене для построения модели дальнейшего
поиска. С этой целью необходимо выполнить основные скрининговые тесты и оценить функцию тромбоцитов.
Более сложной и комплексной задачей является определение причин состоявшегося венозного и артериального
тромбоза или невынашивания беременности. К сожалению,
в данном случае скрининговые тесты неинформативны. В
соответствии с клинической ситуацией должны быть предприняты шаги по исследованию маркеров активации свертывания, гиперактивности тромбоцитов (что само по себе
является трудной лабораторной задачей без должной стандартизации), направленный поиск наследственной тромбофилии, антифосфолипидного синдрома, определен гомоцистеин. Если тромбоэмболических осложнений нет, но предполагается их высокий риск, то степень риска оценивается
главным образом клинически в соответствии с диагнозом, по
семейному и индивидуальному анамнезу и лишь в некоторой
степени может быть дополнен лабораторными данными – характеристикой прогрессирования атеросклероза, сердечной
недостаточности, воспалительного процесса и т. д.
В диагностике синдрома ДВС должны быть использованы
простые, надежные и доступные в любой лаборатории тесты
– количество тромбоцитов, протромбиновое время, уровень
фибриногена, с меньшей надежностью – маркеры активации
свертывания крови. Все исследования должны проводиться
неоднократно и оцениваться в динамике.
А. С. Андреева. Современная стратегия диагностики
тромбофилии. ЗАО «Фирма Гален», Москва