ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ РАН УДК 57.021;615.277.3;543.421

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ
ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ РАН
УДК 57.021;615.277.3;543.421
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО НАКОПЛЕНИЯ
ПЛАТИНОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ
С ПРИМЕНЕНИЕМ АТОМНО-АБСОРБЦИОННОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Методическое пособие
Комлева Н.В.
Черноголовка – 2012
УДК 57.021;615.277.3;543.421
Н.В. Комлева. Определение внутриклеточного накопления платиновых
соединений с применением атомно-абсорбционной спектрометрии: методическое
пособие. – Черноголовка, 2012. – 17 с., ил.
Методическое пособие предназначено для студентов, аспирантов и научных
сотрудников, выполняющих исследовательские работы.
В методическом пособии рассматривается проведение экспериментальной
работы на культуре клеток эукариот, подготовка образцов к атомноабсорбционному анализу и проведение измерения платины в биологических
образцах методом атомно-абсорбционной спектрометрии.
Список лит. – 8.
Одобрено на заседании семинара
биологических процессов ИПХФ РАН.
отдела
кинетики
Рецензенты: к.б.н. Т.А. Раевская, к.б.н. Ю.И. Митрохин.
2
химических
и
СОДЕРЖАНИЕ
1. Проведение эксперимента по обработке клеток эукариот комплексами
платины…………………………………………………………………………
1.1. Культивирование эукариотических клеток……………………………...
1.2. Проведение эксперимента с обработкой клеток
химическими соединениями…………………………………………………..
2. Определение внутриклеточного содержания платины в клетках эукариот...
2.1. Измерение количества белка в образце по Лоури………………………
2.2. Мокрое озоление биологического материала…………………………...
2.3. Определение количества платины в образцах методом атомной
абсорбционной спектроскопии…………………………………………….
Список использованной литературы……………………………………………..
Библиографический список………………………………………………………
3
4
4
8
10
10
12
13
17
17
1. ПРОВЕДЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТА ПО ОБРАБОТКЕ
КЛЕТОК ЭУКАРИОТ КОМПЛЕКСАМИ ПЛАТИНЫ
1.1. Культивирование эукариотических клеток
Работу с клеточными культурами проводят в специализированной
лаборатории, оснащенной необходимым оборудованием и лабораторной посудой.
Основные требования, предъявляемые к работе на клеточных культурах эукариот,
связаны с физиологическими особенностями этих клеток. Для манипуляций и
культривирования клеток эукариот необходимо обеспечить следующие условия:
- все манипуляции с клетками должны проводиться в стерильных
условиях;
- для поддержания культуры необходимо создание оптимальной
среды для роста и размножения клеток;
Все манипуляции производятся стерильной посудой в асептических
условиях. Для организации асептических условий рекомендуется работать с
использованием газовой или спиртовой горелки. Для стерилизации стеклянной
посуды применяется автоклавирование или выдерживание в сухожаровом шкафу
при температуре 160°С в течение 30 мин. Пластиковая посуда, как правило,
применяется одноразовая и приобретается в стерильной герметичной упаковке.
Растворы для проведения работ, как правило, приобретаются стерильными. При
необходимости растворы стерилизуются автоклавированием либо фильтрацией
через стерилизующие фильтры с размером пор не более 0.22 мкм.
Для обеспечения стерильности проведения работ используются ламинарные
шкафы, в которых предусмотрен ламинарный поток воздуха, ограждающий
внутреннее рабочее пространство от внешней среды (рис. 1).
Для создания необходимой среды инкубации применяются CO2-инкубаторы,
обеспечивающие необходимый температурный, газовый и влажностный режим
содержания клеток (рис. 2). Обычные условия культивирования эукариотических
клеток:
- температура – 37°С;
- содержание CO2 – 5%;
- влажность – 95%.
Для поддержания стерильности помещение и ламинарный шкаф оснащены
бактерицидными лампами, которые необходимо включать на 10-30 минут (в
зависимости от мощности и конструкции лампы) перед началом и в конце работы.
В связи с тем, что УФ-облучатели часто вызывают образование озона, который
относится к вредным веществам, после облучения помещения необходимо
провести его проветривание. Чтобы избежать этой необходимости, для облучения
помещения можно использовать безозоновые УФ-облучатели типа «F15T8».
4
Стерилизующий
фильтр
Ультрафиолетовый
облучатель
Ламинарный
поток
воздуха
Рабочая зона
Принципиальная схема устройства
ламинарного шкафа
Ламинарный шкаф II класса защиты БАВп-01–
«Ламинар-С» 1,2 («Ламинарные системы, Россия»)
Рис. 1. Ламинарный шкаф для работы с клеточными культурами.
Регулятор
CO2
Стерилизующий
фильтр
Рабочая
зона
Баллон
с CO2
Поддон
с водой
Термостатирующая
рубашка
Принципиальная схема устройства
СО2-инкубатора
СО2-инкубатор СВ 53 («Binder», Германия)
Рис. 2. СО2-инкубатор для работы с клеточными культурами.
Выращивание клеток производится в культуральной посуде – чашках Петри,
планшетах или флаконах разного объема (рис. 3).
Спецодеждой для работы с клеточными культурами являются халаты и
обувь, которые должны храниться отдельно от другой спецодежды, по
возможности, в помещении, оборудованном УФ-облучателями. Кроме того, для
работы с клеточной культурой применяются шапочки и перчатки.
5
Рис. 3. Стандартная посуда для работа с клеточными культурами.
Клетки выращиваются в специализированной инкубационной среде, состав
которой для каждой клеточной линии подбирается индивидуально. Для
большинства линий клеток, в том числе для клеток линии HeLa, приемлемой
является среда Игла (ЕМ) или среда Игла, модифицированная по Дульбекко
(ДМЕМ). В качестве необходимой добавки в инкубационную среду вносят
сыворотку животных. Вид вносимой сыворотки зависит от линии клеток. Для
большинства клеточных линий лучшей является эмбриональная сыворотка (чаще
всего, эмбриональная телячья сыворотка), которая содержит необходимые для
размножения клеток ростовые факторы. Обычное количество сыворотки
составляет 10% об.
Клетки линии HeLa являются адгезионной культурой, т.е. они прикрепляются
ко дну культуральной посуды. При микроскопическом наблюдении клетки,
растущие в оптимальных условиях, должны иметь четкие границы и типичную
морфологию для данной линии (рис. 4).
Для экспериментальной работы клетки необходимо снять с культуральной
посуды. С этой целью применяется раствор, содержащий трипсин и ЭДТА
(0.05%). Клетки инкубируются в присутствии трипсина при температуре 37°С в
течение 5-10 мин, после чего собираются центрифугированием.
Для поддержания культуры производится периодическое снятие клеток и
пересев в новую культуральную посуду. Периодичность пересева зависит от
свойств клеточной линии и от разведения при пересеве. Разведение при пересеве
– это отношение количества отобранной для дальнейшей инкубации культуры к
общему объему культуры. Так, если клетки, выращенные в объеме 10 мл, снять
трипсином и ресуспендировать в объеме 10 мл, то получится исходное
разведение. Если отобрать 1 мл клеток в исходном разведении и довести объем
свежей инкубационной средой до 10 мл, то получится разведение при пересеве
1:10. Для клеток HeLa при разведении 1:10 периодичность пересевов составляет
около 3-4 суток.
При подготовке к эксперименту осажденные после трипсинизации клетки
ресуспендируются в инкубационной среде, после чего производится их подсчет.
Для подсчета клеток применяется камера Горяева или автоматический счетчик
клеток. Недостатком первого метода является относительно большая
6
продолжительность процедуры. Недостаток второго метода состоит в
необходимости приобретения дорогостоящего оборудования.
После определения концентрации клеток готовится клеточная суспензия в
рабочем разведении. Типичные количества клеток, необходимые для проведения
экспериментов на клетках HeLa, приведены в таблице 1.
Рис. 4. Типичная морфология клеток линии HeLa.
Минимально необходимый комплект оборудования для клеточной культуры
составляет:
- специализированное помещение с УФ-облучателями;
- ламинарный шкаф;
- СО2-инкубатор;
- инвертированный
оптический
микроскоп
(кассета
объективами подводится к образцу снизу);
- стандартный оптический микроскоп;
- камера Горяева;
- центрифуга низкоскоростная;
- холодильник для хранения реагентов;
- сухожаровый шкаф.
с
Минимально необходимый комплект реагентов и посуды для клеточной
культуры составляет:
- питательная среда;
- сыворотка;
7
- раствор трипсина;
- культуральные чашки, планшеты, флаконы;
- пипетки и дозирующие устройства.
Таблица 1. Типичные количества клеток HeLa, необходимые для проведения
экспериментов
Формат
культуральной
посуды
96-луночный
планшет
12-луночный
планшет
6-луночный
планшет
Чашка Петри
Ø 35 мм
Чашка Петри
Ø 90-100 мм
Флакон с
площадью 75 см2
Объем
инкубационной
среды на единицу
(лунка, чашка,
флакон),
мл
Количество клеток
на единицу (лунка,
чашка, флакон),
шт
Концентрация
клеток в рабочем
разведении
суспензии,
шт/мл
0.2
2.0•103-3.0•103
1.0•104-1.5•104
1.0
1.5•104-2.0•104
1.5•104-2.0•104
2.0
4.0•105-6.0•105
2.0•105-3.0•105
10.0
8.0•105-1.0•106
8.0•104-1.0•105
1.2. Проведение эксперимента с обработкой клеток
химическими соединениями
Для эксперимента клетки рассеиваются в посуде необходимого формама в
необходимом количестве. Для определения внутриклеточного накопления
комплексов платины с применением атомно-абсорбционных спектрографов AAS3 и МГА-915 необходимо использование большого количества клеток, в связи с
ограниченной чувствительностью приборов. Всего на единичное измерение в
одном образце необходимо собрать от 50 млн. клеток. Для этого необходимо
посеять около 5.0•106 клеток на флакон площадью 250-300 см2. Через 48-72 ч
после рассева клетки будут готовы к проведению эксперимента.
Для обработки клеток химическими соединениями готовят растворы
соединений в исходной концентрации, которая должна превышать конечную
концентрацию как минимум в несколько десятков раз. Для платиновых
соединений типичные конечные концентрации составляют несколько десятков
мкМ, поэтому исходные концентрации растворов составляют порядка 2 мМ.
8
Внесение веществ из исходного раствора вносится с соответствии с
формулой:
V
C кон
 (Vисх  V) ,
С исх
где V – объем вносимого в инкубационную среду вещества, Скон – конечная
концентрация вещества в инкубационной среде, Сисх – исходная концентрация
вещества в растворе, Vисх – объем инкубационной среды, в которой выращиваются
клетки.
Для определения объема V вышеуказанная формула преобразуется:
V 
C кон  Vисх
С исх  С кон
(1)
В случае, когда исходная концентрация существенно (на два и более
порядков величины) превышает конечную, формулу (1) можно упростить:
V 
C кон
 Vисх
С исх
После внесения в инкубационную среду веществ проводится инкубация
клеток в стандартных условиях (в CO2-инкубаторе) в течение требуемого
интервала времени. Для изучения динамики внутриклеточного накопления
комплексов платины обычно используются временные интервалы в 2-4 ч.
По истечении периода экспозиции необходимо собрать все клетки,
находящиеся в образце. В связи с тем, что платина-содержание соединения могут
быть токсичными для клеток, они в ходе эксперимента могут изменить
морфологию, погибнуть и утратить контакт с подложкой (рис. 5). Утратившие
контакт с подложкой клетки необходимо собрать. Для этого собирают в пробирку
всю инкубационную среду, содержащую погибшие клетки, и центрифугируют для
осаждения клеток. Клетки, не утратившие контакт с подложкой, собирают
стандартной процедурой трипсинизации. После этого все клетки объединяют и
ресуспендируют в физиологическом растворе (0.14 М NaCl) до получения
равномерной суспензии. Для большого количества клеток необходимо
использовать более 5 мл физиологического раствора.
Часть суспензии (приблизительно 1/10-1/20 объема) отбирают для
определения количества белка, основную порцию клеток используют для
измерения количества платины в образце.
9
Рис. 5. Клетки HeLa после инкубации в присутствии токсичного вещества.
2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ
ПЛАТИНЫ В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ
2.1. Измерение количества белка в образце по Лоури
Измерение белка по Лоури – это метод количественного определения белка,
основанный на измерении концентрации окрашенных продуктов реакции
пептидных связей с ионами меди. Суть метода заключается в том, что в щелочной
среде Cu2+ образуют комплекс с пептидными связями, переходя в Cu+.
Одновалентные ионы меди реагируют с реактивом Фолина-Чикалтеу
(фосфомолибденовая кислота с фенолом), образуя нестабильный продукт,
переходящий в молибденовую синь, которая характеризуется максимумом
поглощения видимого света при длине волны 750 нм. Увеличение поглощения
света при 750 нм пропорционально концентрации белка. Чувствительность метода
(нижний предел определения) составляет 10-100 мкг/мл.
Определение концентрации белка в экспериментальном образце проводят по
калибровочной кривой, которую получают с применением серии стандартных
растворов бычьего сывороточного альбумина (например, от 10 до 100 мкг белка).
На полученных данных проводят регрессионный анализ. Поскольку зависимость
поглощения от количества белка линейна, калибровочная кривая должна иметь
уравнение прямой:
(2)
y  a  bx
В ходе регрессионного анализа вычисляются коэффициенты a и b. Этот
анализ можно провести вручную, либо с использованием программного
обеспечения.
10
В комплекте ПО «Origin» линейная регрессия вычисляется путем выбора
соответствующей опции «Анализ»-«Линейная регрессия», после этого
ответствующие коэффициенты будут показаны в информационном окне (рис. 6).
Также определить эти коэффициенты можно с использованием средств MS
Office. Для это необходимо в ПО «MS Excel» выделить данные и построить по
ним график («Вставка»-«Диаграмма», выбрать параметр «Точечная диаграмма»).
На вставленной таки образом диаграмме кликнуть правой кнопкой мыши по
полученному графику и выбрать опцию «Добавить линию тренда». В
открывшемся окне во вкладке «Параметры» отметить опцию «Показать уравнение
на диаграмме». В результате будет приведен график линейной зависимости и
уравнение прямой в виде формулы (2) (рис. 7).
Рис. 6. Определение параметров линейной регрессии в ПО «Origin».
Рис. 7. Определение параметров линейной регрессии в ПО «MS Excel».
11
Калибровочная кривая готовится для каждой новой партии реактива ФолинаЧикалтеу.
Ниже приведен типичный ход промера белка по Лоури.
1.
10 мкл образца растворяются в 240 мкл 1 М NaOH.
2.
В полученный образец добавляют 65 мкл 10% доцетилсульфата
натрия и 85 мкл H2O.
3.
Готовят раствор С. Для этого смешивают растворы А и B в
пропорции 50:1.
4.
В образец добавляют 2 мл раствора С и инкубируют 10 мин при
комнатной температуре.
5.
В образец добавляют 200 мкл раствора Фолина-Чикалтеу и
инкубируют 30 мин при комнатной температуре.
6.
Интенсивность окрашивания определяют на спектрофотометре
при длине волны 750 нм.
7.
По полученным значениям поглощения A750 вычисляют
содержание белка в пробе в соответствии с полученным для
калибровочной кривой уравнением.
Реактивы и оборудование, необходимые для определения количества белка
по Лоури:
- раствор А (2% Na2CO3 в 0,1 М NaOH);
- раствора В (0,5% CuSO4•5H20, 1% цитрат натрия);
- 10% раствор додецилсульфата натрия;
- раствор Фолина-Чикалтеу (обычно приобретается готовым);
- бычий сывороточный альбумин;
- спектрофотометр.
2.2. Мокрое озоление биологического материала
Метод мокрого озоления – сжигание образца концентрированной кислотой
часто используется для изучения элеменного состава (например, методами
атомно-адсорбционной или атомно-эмиссионной спектрометрии, вольтамперометрии и др.). При этом проводят нагревание образцов для десорбции всех
форм элемента в «кислотный минерализат» - жидкий аналитический образец
определенного объема. Данная процедура помогает без потерь перевести все
металлы в раствор.
Для озоления полученные образцы клеток собирают центрифугированием,
супернатант отбрасывают, а осадок растворяют в 0.55 мл концентрированной
кислоты (обычно применяется 70% азотная кислота) в течение 24 часов при
комнатной температуре. Затем проводят кипячение образцов в течение 10 мин.
Далее образцы остужают до комнатной температуры и добавляют 0.45 мл
концентрированной перекиси водорода (30%) и вновь кипятят 10 мин.
12
Осторожно!
Концентрированная (70%) азотная кислота – это едкое вещество. При
попадании на кожу вызывает ожоги, напоминающие термические. Особая
опасность заключается в возможности поражения глаз. Для предупреждения
травматизма при работе с концентрированной азотной кислотой необходимо
применение индивидуальных средств защиты – защитных очков, резиновых
перчаток. Работы необходимо выполнять в вытяжном шкафу при включенной
приточно-вытяжной вентиляции.
Реактивы и оборудование, необходимые для мокрого озоления:
- 70% азотная кислота;
- 30% перекись водорода;
- плитка;
- вытяжной шкаф.
2.3. Определение количества платины в образцах методом атомной
абсорбционной спектроскопии
Атомно-абсорбционный анализ – это аналитический метод определения
содержания химических элементов в пробе, основанный на поглощении света
свободными атомами.
Атомно-абсорбционная спектрометрия состоит в измерении поглощения
резонансного излучения с частотой νik свободными атомами, находящимися в
газовой фазе. При этом атомы переходят из нижнего (невозбужденного)
состояния с энергией Ek в верхнее (возбужденное) состояние с энергией Ei.
Для реализации этого процесса в аналитических целях необходимо перевести
пробу в атомарное состояние и измерить ослабление интенсивности излучения,
прошедшего через поглощающую среду, обусловленное поглощением света
свободными атомами определяемого элемента.
При прохождении через поглощающую среду потока фотонов степень их
поглощения прямо пропорциональна плотности потока излучения и концентрации
поглощающих частиц. Степень поглощения для монохроматического света
единичным слоем dx можно описать посредством уравнения:
 d / dx  k C ,
где Ф – поток излучения в какой-то точке среды; C – концентрация частиц,
способных поглощать фотон; kv – коэффициент поглощения, зависящий от
природы поглощающего атома и энергии фотона.
Преобразуя и разделив переменные, получим
 d /   d ln   k Cdx
13
Если Φо – падающий поток излучения при x=0, a Ф – поток излучения,
прошедший через поглощающую среду при x=l, то, проинтегрировав выражение
(2) по всему пути излучения,

l
0
0
  d ln   kv C  dx ,
получим
ln 0  ln   kv Cl
или
ln(0 / )  A  kv Cl ,
где A называется поглощательной способностью, или оптической
плотностью, и представляет собой величину, прямо пропорциональную
концентрации С поглощающего атома. В данном случае это концентрация атомов,
находящихся в основном состоянии; kv – «линейный» коэффициент поглощения,
относящийся к бесконечно узкому интервалу частот ν±dν.
Атомно-абсорбционный спектрометр включает: независимый источник
излучения света с частотой ν, равной частоте аналитической линии определяемого
элемента; атомизатор, преобразующий пробу в атомарный пар; спектрофотометр.
Свет, прошедший сквозь атомарный пар, системой линз направляется на входную
щель спектрофотометра, интенсивность аналитической спектральной на выходе
регистрируется фотоэлектрическим методом (рис. 8).
Для проведения анализа платины необходимо приготовить серию разведений
платинового соединения. Для этого можно использовать цисплатин – цисдиамминодихлороплатину(II). Измерения на стандартных растворах позволяют
построить калибровочную кривую, которая затем используется для измерений в
экспериментальных образцах.
При концентрациях платины в образце больше 5 мкг/мл в качестве
атомизатора используют пламя ацетилен-воздух (установка AAS-3). Условия
определения платины в растворе следующие:
- аналитическая линия пламени – 265.9 нм;
- спектральная ширина щели - 0.30 мм;
- рабочий ток накала лампы - 5 мА.
При концентрациях платины в образце меньше 5 мкг/мл определение
платины проводят электротермической атомизацией (установка МГА-915).
Условия определения платины в растворе следующие:
- выпаривания – температура 120°С, 20 с;
- пиролиз – температура 1500°С, 10 с;
- атомизация – температура 2700°С, 2 с;
- отжиг – температура 2750°С, 2 с.
14
Концентрацию платины в образце рассчитывают по калибровочной кривой,
полученной с использованием стандартных растворов, приготовленных
непосредственно перед проведением измерений.
Принципиальная схема устройства
атомно-абсорбционного спектрометра
Атомно-абсорбционный спектрометр
МГА-915 («Люмекс», Россия)
Атомно-абсорбционный спектрометр
AAS-3 («Carl Zeiss», Германия)
Рис. 8. Атомно-абсорбционный спектрометр для определения элементного
состава образцов.
Реактивы и оборудование, необходимые для количества платины методом
атомно-абсорбционного анализа:
- серия стандартных растворов соединения платины.
- стомно-абсорбционный спектрометр;
Количество платинового комплекса, накопившегося в клетках за
определенный период инкубации, выражают в виде удельного содержания
платины на единицу измерения субстанции. За единицу измерения субстанции
может быть принята клетка, тогда содержание платинового комплекса в клетках
платины выражают в количестве платины на одну клетку. В нашем случае
содержание платиновых комплексов в клетке выражается в количестве платины
15
на мг белка. Типичные результаты измерения внутриклеточного содержания
комплексов платины приведены в таблице 2.
Таблица 2. Типичные значения внутриклеточного содержания комплексов
платины в клетках HeLa
Комплекс платины
Цисплатин
Сатраплатин
Количество белка
в образце,
мкг
3525.9
2569.4
Количество
Содержание
платины в образце, платины в клетках,
мкг
пг Pt•[мкг белка]-1
0.4
113.5
1.2
467.0
16
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Культура животных клеток. Методы: Пер. с англ./Под ред. Р. Фрешни. - М.:
Мир, 1989. – 333 с., ил.
2. Методы спектрального анализа: Учебное пособие / Ю.Я. Кузяков, К.А.
Семененко, Н.Б. Зоров. – М.: Изд-во МГУ, 1990. – 213 с.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Культура животных клеток. Методы: Пер. с англ./Под ред. Р. Фрешни. - М.:
Мир, 1989. – 333 с.ю ил.
2. Брицке М.Э. Атомно-абсорбционный спектрохимический анализ. – М:
Химия, 1982. – 224 с.
3. Методы спектрального анализа: Учебное пособие / Ю.Я. Кузяков, К.А.
Семененко, Н.Б. Зоров. – М.: Изд-во МГУ, 1990. – 213 с.
4. Прайс В. Аналитическая атомно-абсорбционная спектроскопия. – М: Мир,
1976. – 356 с.
5. Славин У. Атомно-абсорбционная спектроскопия. Пер. с англ. с доп. – Л.:
Химия, 1971. – 296 с.
6. Influence of Ashing Techniques on the Analysis of Trace Elements in Animal
Tissue I. Wet Ashing / M.S. Clegg et al. // Biological Trace Element Research. –
1981. – Vol.3, № 1. – P. 107–115.
7. Raman, infrared and XPS study of bamboo phytoliths after chemical
digestion / M. Kym et al. // Spectrochimica Acta Part A: Molecular and
Biomolecular Spectroscopy. – 2011. – Vol. 80, № 1. – P. 106–111.
8. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with
Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. №1. P. 265-275.
17