Шарапова Ольга Андреевна Специальность 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации
реклама
На правах рукописи Шарапова Ольга Андреевна РЕКОМБИНАНТНЫЕ ФРАГМЕНТЫ АЛЬФАФЕТОПРОТЕИНА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ СОЗДАНИЯ ЛЕКАРСТВ АДРЕСНОЙ ДОСТАВКИ Специальность 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 г. Работа выполнена в лаборатории биохимии Курчатовского центра нано-, бионаук, информационных и конвергентных технологий с источниками синхротронного излучения и нейтронов и социогуманитарных наук Национального Исследовательского Центра Курчатовский Институт Научные руководители: член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Северин Евгений Сергеевич доктор биологических наук Федоров Алексей Николаевич Официальные оппоненты: Долгих Дмитрий Александрович доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, руководитель подразделения Лунин Владимир Глебович доктор биологических наук, Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалея Российской академии медицинских наук, заведующий лабораторией Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский университет дружбы народов Защита состоится «14» июня 2012 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии имени А.Н.Баха Российской академии наук; 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2. С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН; 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 1. Автореферат разослан « » _______ 2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Орловский Александр Федорович 2 Общая характеристика работы Широко применяемым методом в противоопухолевой терапии является химиотерапия. Эффективность химиопрепаратов обеспечивается тем, что все они, в силу природы своего действия, особенно эффективно убивают активно делящиеся и метаболизирующие клетки. К сожалению, помимо опухолевых клеток, такими же характеристиками в норме обладают клетки костного мозга, желудочно-кишечного тракта и волосяных фолликул (Альбертс Б. и др., 1993). Как следствие, весь спектр побочных эффектов от химиотерапии связан с воздействием препарата на нормальные активно делящиеся клетки организма. Одним из перспективных способов повышения эффективности химиопрепаратов является их адресная доставка к опухолевым клеткам. Суть метода состоит в том, что химиопрепарат пришивается к векторной молекуле, которая обеспечивает доставку лекарства к определенному виду клеток. Адресность доставки обеспечивается за счет специфических, характерных только для клеток мишеней молекул на их поверхности. В связи с этим в качестве векторной молекулы могут быть использованы моноклональные антитела (МоАТ), полученные к какой-либо молекуле на поверхности клетки мишени, либо белки, рецепторы которых должны присутствовать на поверхности клеток мишеней. Одним из перспективных кандидатов, способных обеспечить адресность доставки лекарства является альфа-фетопротеин человека (АФП). АФП является белком, характерным для эмбрионального периода развития человека (Bergstrand C.G., Czar B., 1956). В постэмбриональный период развития этот белок начинает синтезироваться только в процессе канцерогенеза (Abelev G.I., 1971, Gillespie J.R., Uversky V.N., 2000). АФП проникает в клетки с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза (Villacampa M.J. et al., 1984). Рецептор АФП (РАФП) так же является онкофетальным белком, т.е. в постэмбриональный период развития экспрессируется только на поверхности опухолевых клеток (Geuskens M. et al., 1991, Ницветов М.Б. и др., 2005). Этот факт позволяет использовать АФП как векторную молекулу для адресной доставки химиопрепаратов к опухолевым клеткам. Показано, что конъюгаты природного АФП с цитостатиками ингибировали рост опухолевых клеток in vitro и in vivo (Ницветов М.Б., 2001, Severin S.E. et al., 1997, Северин С.Е. и др., 1999). Использование природного АФП ограничено техническими и этическими причинами, так как его единственным источником является абортивный материал. По этой причине необходимо использовать его рекомбинантные формы. Известно, что участок связывания с рецептором находится в С-концевом домене, поэтому для целей адресной доставки является оптимальным использование рекомбинантных белковых фрагментов на основе С-концевого домена АФП (Mizejewski G.J., 2001). 3 Одной из главных проблем при использовании рекомбинантных белков является их получение в функциональной форме. В большинстве случаев, при продукции белков в больших количествах в бактериальной системе, они формируют в клетках так называемые тельца включения (ТВ), которые состоят из белка в агрегированном состоянии (Bowden G.A. et al., 2006, Ventura S., Villaverde A., 2006). Для получения функционально активного белка необходимо проводить процедуру его ренатурации. К сожалению, не существует универсальных и эффективных методик ренатурации. Это ограничивает круг рекомбинантных белков, используемых в производстве и научных исследованиях. Для гидрофобных белков с большим количеством дисульфидных связей эта проблема является особенно сложной. Именно такими характеристиками обладает С-концевой домен АФП. Разработка эффективной методики его ренатурации является основной трудностью при получении его в функциональной форме. Решение этой проблемы носит не только частный характер. Разработка, на примере АФП, общей методики ренатурации, подходящей для схожих по свойствам белков, позволит существенно расширить круг белков, получаемых с помощью рекомбинантных технологий в бактериальных системах экспрессии. В отношении АФП это позволит получать функциональный белок в достаточных количествах для создания его конъюгатов с цитостатиками, что само по себе также является сложной задачей. Цель и задачи работы. Целью данной работы был отбор оптимальных фрагментов АФП для адресной доставки цитостатиков в опухолевые клетки, их эффективное получение и создание на их основе конъюгатов с модельными цитостатиками. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи: 1. Отбор фрагментов АФП для адресной доставки цитостатиков в опухолевые клетки. Клонирование фрагментов и экспрессия с высокой эффективностью в бактериальной системе экспрессии. 2. Создание высокоэффективной методики выделения и получения функционально активного рекомбинантного фрагмента АФП. 3. Сравнительный физико-химический и функциональный анализ фрагментов АФП. 4. Получение конъюгата фрагмента АФП с отобранным цитостатиком. Проверка функциональной активности полученного конъюгата. Основные положения, выносимые на защиту 1. Два фрагмента АФП с 404 по 595 (rAFP3D595) и с 404 по 609 (rAFP3D 609) а.о. полноразмерного белка были клонированы и экспрессированы в виде телец включения в клетках E.coli с высокой эффективностью. 4 2. Отработана эффективная методика выделения и очистки белков и их ренатурация методом разбавления. Проведен сравнительный анализ эффективности процедур выделения и ренатурации разных фрагментов АФП. 3. Показано сходство исследованных физико-химических свойств ренатурированных рекомбинантных фрагментов и природного АФП. 4. На примере фрагмента АФП показана возможность эффективного способа ренатурации иммобилизованного на смоле гидрофобного, содержащего большое количество S-S связей белка. 5. Флуоресцентно меченный рекомбинантный фрагмент АФП in vitro проникал в опухолевые клетки, так же как и природный полноразмерный АФП. При этом в нормальные клетки он не проникал. 6. Получен конъюгат рекомбинантного фрагмента АФП с ципрофлоксацином, который подавлял рост опухолевых клеток in vitro в концентрациях по ципрофлоксацину значительно меньших, чем свободный цитостатик. Научная новизна и практическая ценность работы. На основании анализа первичной структуры АФП и его модели пространственной структуры был отобран С-концевой домен белка, соответствующий третьему домену. Были клонированы и экспрессированы два варианта С-концевого фрагмента АФП в клетках E. coli: с 404 по 595 а.о. (аминокислотных остатка) (rAFP3D595) и с 404 по 609 а.о. (rAFP3D 609) полноразмерного белка. Белки экспрессировались в виде ТВ, т.е. в денатурированной форме. Была отработана методика ренатурации с помощью быстрого разбавления в большом избытке ренатурирующего буфера. Выход белка составил не менее 50% с чистотой порядка 95%. В качестве альтернативного метода ренатурации была выбрана ренатурация иммобилизованного на смоле белка. Для ренатурации рекомбинантных фрагментов АФП была использована металло-аффинная Ni-смола. Было показано, что выход ренатурированного белка сильно зависел от химической природы основы смолы: при переходе от агарозных оснований к оксиду кремния выход ренатурированного белка возрастал значительно. Выход ренатурированного белка составил порядка 100% с чистотой не менее 98%. При разработке методик ренатурации фрагментов особое внимание уделялось не только эффективности процедуры, но и ее продуктивности, т.е. потраченным времени и материалам на единицу ренатурированного белка. При сравнении этих характеристик ренатурация на смоле была значительно более продуктивна, чем ренатурация разбавлением. 5 Созданная методика ренатурации иммобилизованного белка на смоле на основе оксида кремния впервые обеспечила высокоэффективную ренатурацию сложного для сворачивания белка. Разработанный подход позволит расширить спектр рекомбинантных белков, используемых в научных исследованиях и в промышленном производстве. Было показано, что фрагменты rAFP3D595 и rAFP3D609 in vitro проникали в клетки, несущие РАФП, также как и природный АФП. При этом в нормальные клетки организма они не проникали. Была разработана методика получения конъюгата фрагмента АФП с ципрофлоксацином, который in vitro подавлял рост опухолевых клеток в концентрациях на порядок меньше чем для свободного ципрофлоксацина и не влиял на рост нормальных клеток. Полученные данные свидетельствуют о том, что С-концевой фрагмент АФП может быть использован в качестве векторной молекулы для адресной доставки химиопрепаратов к опухолевым клеткам. Создание лекарств на его основе будет способствовать значительному повышению эффективности применяемых химиопрепаратов и позволит начать использовать новые не применявшиеся ранее. Апробация работы Результаты работы были доложены на заседании ученого совета МНИИМЭ; на заседании ученого совета НБИКС-центра; на 12-ой Международной Пущинской ШколеКонференции Молодых Ученых в 2008 г.; на 16-ой Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» в 2008 г. (Москва); на 3-ей Научнопрактической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии» в 2009 г. (Москва); на 9-ой Курчатовской молодежной научной школе в 2011 г. (Москва). Публикации По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, включая 4 статьи, 4 тезиса сообщений и 3 российских патента. Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 115 страницах печатного текста, иллюстрирована 28 рисунками и 4 таблицами. Список цитированной литературы содержит 218 наименований. 6 Содержание работы Обзор литературы В обзоре литературы приведены данные о структуре и свойствах альфа-фетопротеина человека (АФП) как одного из центральных онкофетальных белков человека. Изложена проблема ренатурации рекомбинантных белков, как одна из лимитирующих стадий при получении их в функциональной форме. Кратко изложены проблемы терапии злокачественных новообразований и современные способы их лечения. Материалы и методы Создание плазмиды для синтеза вариантов С-концевого домена АФП в E. coli Последовательность, кодирующая С-концевой домен АФП, с помощью точечного мутагенеза была оптимизирован для синтеза в бактериальной системе. На 3' конце нуклеотидной последовательности были внесены нуклеотиды, кодирующие последовательность из 7 Гис. Два варианта С-концевого домена белка: с 404 по 595 а.о. (rAFP3D595), либо с 404 по 609 а.о. (rAFP3D609) полноразмерного белка – были клонированы в модифицированную плазмиду pET11c . Синтез фрагментов АФП Полученной плазмидой, содержащей один из двух вариантов С-концевого домена АФП, трансформировали клетки E. coli штамма BL21 (DE3). Синтез белка проводили двумя методами: 1. индуцировали добавлением ИПТГ; 2. синтез методом автоиндукции. В обоих случаях белок синтезировался в виде телец включения. Выделение и очистка фрагментов АФП Процедура очистки белка заключалась в отмывке телец включения от не белковых примесей и дальнейшее максимальное растворение белка из телец включения в денатурирующих условиях (0.05 M Na3BO3 pH 8.6, 8 M мочевина, 12 мМ β–меркаптоэтанол). Не растворившийся материал отделяли с помощью центрифугирования. Растворенный белок в денатурирующих условиях очищали с помощью металло-аффинной хроматографии на Niсмоле. Ренатурация фрагментов АФП разбавлением Ренатурацию очищенных фрагментов АФП (в конечной концентрации 0.01-0.02 мг/мл) проводили быстрым разбавлением в 100-кратном избытке ренатурирующего буфера, обладающего окислительно-восстановительным потенциалом за счет содержания окисленного и восстановленного глутатионов (ФСБ pH 8.0, 5 мМ глутатион восстановленный, 1 мМ 7 глутатион окисленный). При необходимости белок после ренатурации концентрировали на Ni-смоле, либо в концентрационной ячейке. Ренатурация иммобилизованных фрагментов АФП При ренатурации на смоле фрагменты rAFP3D595 и rAFP3D609, выделенные из телец включения, наносили на металло-аффинную Ni-смолу на разной основе (агароза либо силикагель) в денатурирующих условиях. Смолу с иммобилизованным белком смешивали с ренатурирующим буфером, обладающим окислительно-восстановительным потенциалом и ренатурировали в течение 4 часов на холоду. Ренатурированный белок элюировали и при необходимости диализовали для удаления имидазола. Определение сульфгидрильных групп в ренатурированных фрагментах АФП Свободные сульфгидрильные группы в ренатурированном белке определяли по методу Эллмана (Ellman G.L., 1956). Аналитическая хроматография Аналитическую хроматографию проводили на приборе Breeze (Waters). Анализ гомогенности препарата ренатурированного белка проводили с помощью гель-фильтрации на колонке Superose12 10/300 GL и хроматографии в обращенных фазах на колонке Symmetry300 C4 5 µm 3.9x150 mm. Круговой дихроизм (КД) Исследование вторичной структуры ренатурированного белка проводилось с использованием спектроскопии КД на спектрополяриметре J-600 (Jasco) в диапазонах длин волн от 200 нм до 250 нм. Измерения проводились в 0.1 мм кювете при концентрации белка 0.41 мг/мл либо в 1 мм кювете при концентрации белка 0.03 мг/мл в ФСБ pH 7.4. Конъюгирование фрагментов АФП с флуоресцентной меткой В качестве флуоресцентной метки использовали ФИТЦ. Реакцию проводили по инструкции фирмы производителя. В обоих полученных конъюгатах rAFP3D595-ФИТЦ и rAFP3D609-ФИТЦ молярное соотношение ФИТЦ/белок составило ~2.1 к 1. Клеточные линии В качестве клеток, несущих РАФП, использовали линию клеток карциномы яичника человека SKOV3. В качестве отрицательного контроля использовали лимфоциты периферической крови здоровых добровольцев, выделенные с помощью центрифугирования крови через раствор фиколл-пак по методу Böyum (Böyum A., 1968). Анализ связывания и эндоцитоза rAFP3D595-ФИТЦ и rAFP3D609-ФИТЦ в опухолевых клетках и лимфоцитах 8 Для анализа связывания конъюгаты белка в диапазоне концентраций 0-4000 нM добавляли к суспензии клеток на холоду и инкубировали при +4оС в течение 1 ч. При исследовании эндоцитоза инкубацию проводили при 37оС. После окончания инкубации клетки отмывали и фиксировали 2% параформальдегидом. Интенсивность флуоресценции измеряли на проточном цитометре EPICS-XL (Beckman Coulter). Флуоресценция возбуждалась аргоновым лазером (длина волны возбуждения 488 нм, полоса пропускания 515-520 нм). В каждом образце (105 клеток) определяли среднее значение интенсивности флуоресценции. Конъюгирование rAFP3D609 с ципрофлоксацином Конъюгирование rAFP3D609 (концентрация ~ 1мг/мл) с ципрофлоксацином проводили с помощью карбодиимида EDC по методике производителя. Молярное соотношение rAFP3D609 к ципрофлоксацину в конъюгате составляло в среднем 1:1. Анализ цитотоксической активности конъюгата rAFP3D с цитостатиком в опухолевых клетках и лимфоцитах Клетки линии SKOV3 и свежевыделенные лимфоциты за 1 сутки до эксперимента рассевали в плотности 5000-7000 клеток в лунку. Раствор ципрофлоксацина либо конъюгата добавляли к клеткам в диапазоне концентраций по ципрофлоксацину от 0 до 1000 мкМ. Инкубировали клетки в стандартных условиях 72 ч, после чего определяли их выживаемость. Для количественной оценки выживаемости клеток при инкубации в сере, содержащей цитотоксический агент, использовали МТТ-тест (Mosmann T., 1983). Статистическую достоверность полученных данных определяли, используя tкритерий Стьюдента с помощью программного обеспечения Origin (OriginLab Corporation). Как статистически значимый рассматривали уровень p<0.05. Основные результаты и их обсуждение Клонирование и синтез вариантов С-концевого домена АФП Идентичность первичных структур АФП и ЧСА составляет около 40%. На основании данных о пространственной структуре ЧСА построены теоретические модели пространственной структуры АФП. Согласно этому моделированию, для работы были отобраны два варианта С-концевого домена АФП. Первый, соответствующий на пространственной модели структурному С-концевому домену - с 404 по 595 а.о. (rAFP3D595) и второй, дополнительно содержащий не структурированный С-конец белка, - с 404 по 609 а.о. (rAFP3D609) полноразмерного белка. Уровень синтеза С-концевого фрагмента АФП в клетках E. coli штамма BL21 (DE3) был очень низким (< 100 мкг/л культуры). Известно, что в первую очередь на уровень про9 дукции человеческих белков в бактериальных клетках влияет наличие редких кодонов, т.к. наборы предпочтительных кодонов у человека и бактерий сильно различаются. Анализ нуклеотидной последовательности, кодирующей С-концевой домен АФП, показал наличие нескольких кодонов, редких для E. coli, в частности, тандем редких кодонов аргинина AGG (Арг508 и Арг509). Для проверки того, зависел ли уровень синтеза белка от наличия в его последовательности редких кодонов, была проведена экспрессия в присутствии вспомогательной плазмиды pLacIRARE, несущей набор тРНК к редким кодонам E. coli. Результаты эксперимента показали, что в данном случае уровень синтеза целевого белка резко возрос. Таким образом, для эффективной продукции С-концевого домена АФП требуется либо вспомогательная плазмида, либо замена редких кодонов в гене. Ранее было показано, что замена тандемов аргинина обеспечивает значительное увеличение уровня синтеза белков в бактериальной системе (Ivanov I. et al., 1992). С помощью точечного мутагенеза, указанный тандем AGG AGG был заменен на кодоны аргинина CGT CGC, оптимальные для E. coli, клонирован и синтезирован в клетках E. coli. Уровень продукции при этом для обоих фрагментов составил не менее 150 мг белка с литра культуры (рис. 1). Рис.1. Электрофоретический анализ (ДСН- Была проверена возможность продук- ПААГ электрофорез) экспрессии rAFP3D595 в клетках E. coli BL21 (DE3). 1 – маркеры молекулярной массы (Fermentas); 2 – индукция экспрессии исходного rAFP3D595; 3 – индукция экспрессии исходного rAFP3D595 в присутствии pLacIRARE; 4 – индукция экспрессии rAFP3D595 с замененным тандемом кодонов аргинина; 5 – клетки до индукции. Индукцию проводили в течение 3 часов при 37ºС с использованием 0.4 мМ ИПТГ. Стрелками отмечены полосы, соответствующие фрагменту rAFP3D595. На дорожку нанесен эквивалент 17 мкл культуры клеток ции белка в системе с автоиндукцией. Суть подхода состоит в использовании сред роста, позволяющих достичь достаточно высоких плотностей культуры клеток при наращивании (Studier F.W., 2006). Кроме этого, среды роста подбираются таким образом, что при начальном наращивании до высоких плотностей lac-промотор, индуцирующий синтез Т7 полимеразы (а значит и синтез целевого бел- ка), находится в репрессированном состоянии. На поздних же стадиях роста lac-промотор индуцируется под воздействием лактозы, входящей в состав сред. Таким образом, данная система позволяет исключить добавление дорогостоящего индуктора синтеза (ИПТГ), кроме 10 этого, процесс автоиндукции не требует контроля за ростом культуры с целью определения времени добавления индуктора синтеза. В процессе работы были проверены различные условия автоиндукции. Наилучший результат был получен при выращивании в среде TB при 37ºС. Индукция белка начиналась после 4.5 часов роста при оптической плотность 6.5 о.е. Рост останавливали через 27 часов роста при оптической плотности около 12 о.е. Выход целевого белка для обоих фрагментов составил не менее 200-250 мг с литра культуры. Ренатурация рекомбинантных фрагментов АФП разбавлением Так как оба фрагмента АФП синтезировались в виде телец включения, то для получения функционального белка необходимо было восстановить их третичную структуру. Сложность задачи по подбору условий ренатурации заключалась в том, что в С-концевом домене АФП содержится 12 цистеинов, которые при переводе белка в неденатурирующие условия могут образовывать межмолекулярные дисульфидные связи. Это, в свою очередь, способствует формированию сначала растворимых, а затем и нерастворимых агрегатов и, как следствие, значительно снижает выход мономерного ренатурированного белка на этой стадии. Основной задачей при ренатурации является сведение к минимуму межмолекулярных контактов белковых молекул в ходе сворачивания. В связи с этим ренатурацию чаще всего проводят при очень низких концентрациях белка, не более 0.05 мг/мл (Jaenicke R., Rudolph R., 1989). Одним из широко применяемых способов ренатурации белков является их быстрое разведение в большом избытке ренатурирующего буфера и последующей длительной инкубацией. С помощью этого метода удалось ренатурировать оба фрагмента АФП с выходом ренатурированного белка не менее 80% с чистотой порядка 90%. В дальнейшем белок концентрировали на Ni-смоле, что повышало его чистоту, но, к сожалению, уменьшало итоговый выход белка, который составил не менее 52% с чистотой 95%. Для сравнения эффективности отработанной нами методики можно привести результаты по ренатурации полноразмерного АФП, так как подобные работы для С-концевого фрагмента никем ранее не проводились. В работе Boismenu et al при выделении и ренатурации рекомбинантного полноразмерного АФП выход составил 14% с чистотой белка 91% (Boismenu R., 1997). Ренатурация фрагментов АФП на твердой фазе Сведение к минимуму контактов между белковыми молекулами в процессе ренатурации может быть достигнуто не только посредством низкой концентрации белка, но и за счет иммобилизации белковых молекул на твердой фазе. Для этого была использована Ni-смола, на которой белок иммобилизовался за счет тага из 7 остатков гистидина на его С-конце. Такой способ иммобилизации, по нашему мнению, одновременно позволяет белковой молекуле 11 быть отделенной от других молекул, но при этом полипептидная цепь не ограничена в движении и может флуктуировать в процессе ренатурации. Первоначально для ренатурации нами была использована Ni-смола на основе агарозы, которую мы использовали для очистки белка в денатурирующих условиях. К сожалению, после ренатурации белок не элюировался со смолы высокими концентрациями имидазола ни в нативных буферах, ни в растворах с добавлением денатурирующих агентов. Исходя из этого, можно заключить, что в процессе ренатурации молекулы белка необратимо связываются с углеводной матрицей смолы – агарозой. Другим широко используемым носителем в качестве основы для смол может служить силикагель. По сравнению с агарозой, силикагель является химически инертным материалом. Поэтому была использована Ni-смола на основе силикагеля HisLink и проведена процедура ренатурации в условиях аналогичных для ренатурации разбавлением. Белок в концентрации 1 мг/мл ренатурировали на смоле в течение 1 - 24 ч. Наилучший выход ренатурированного белка составил 100% после 4 ч инкубации. Чистота ренатурированного белка составила не менее 98%. По результатам ДДС-ПААГ электрофореза при нанесении 1 мг белка весь материал связывался со смолой. В элюции после ренатурации анализ показывал наличие порядка 1 мг белка. Незначительные потери фрагментов АФП происходили в результате необратимого связывания со смолой в процессе ренатурации. Принято считать, что при ренатурации белка на смоле, упакованной в колонку, увеличение количества наносимого белка коррелирует с уменьшением выхода ренатурации изза большей агрегации белковых молекул (Stempfer G. et al., 1996). Причиной этого может быть неравномерное распределение белковых молекул по колонке в процессе нанесения. Локальное повышение концентрации белка в какой-либо части колонки может способствовать агрегации при переводе в ренатурирующие условия и тем самым уменьшать выход ренатурированного белка (Chen Y., Leong S.S.J., 2009). При изучении влияния количества нанесенного rAFP3D609 в диапазоне концентраций 0.5-10.0 мг/мл на выход ренатурации было показано, что выход белка не зависел от количества нанесенного белка в указанном диапазоне концентраций. Такой результат можно объяснить тем, что при взаимодействии белка со смолой в пробирке его распределение происходит более равномерно, чем при нанесении на смолу, упакованную в колонку. Как следствие, выход ренатурации не зависел от количества нанесенного белка. Для сравнения разных способов ренатурации rAFP3D609 был проведен контрольный эксперимент по ренатурации одного и того же количества белка (1 мг) разными способами. 12 Основные различия разработанных методик ренатурации заключались в необходимом времени ренатурации и количестве ренатурирующего буфера. Поэтому с точки зрения практического получения белка более адекватным будет сравнение продуктивности ренатурации, которая определялась по уравнению: P YM Vt 100 % (1) где P – продуктивность ренатурации (мг мл-1 ч-1), Y – выход ренатурированного белка (%), M – исходное количество белка, взятого для ренатурации (мг), V – объем ренатурирующего буфера (мл), t – время ренатурации (ч). Таблица. Сравнение экспериментальных параметров ренатурации на смоле и ренатурации разбавлением. Экспериментальный параметр Смола Разбавление Исходное количество белка, мг 1 1 Объем ренатурирующего буфера, мл 10 100 Время ренатурации, ч 4 48 Концентрация белка при ренатурации, мг/мл 0.1 0.01 Выход ренатурированного белка, %* 100 50 Чистота ренатурированного белка, %* 98 90 Продуктивность ренатурации (мг мл-1 ч-1) 2,5х10-2 1х10-4 * Определяли денситометрией электрофореграмм с помощью программы OnedScan (“Stratagen”, США). Рассчитанная по данной формуле продуктивность для ренатурации разбавлением составила 1х10-4 мг мл-1 ч-1, для ренатурации на твердой фазе – 2.5х10-2 мг мл-1 ч-1. Значительное превосходство продуктивности ренатурации на твердой фазе по сравнению с ренатурацией разбавлением связано с меньшим временем инкубации и меньшим объемом ренатурирующего буфера. При этом чистота белка после ренатурации на твердой фазе (98%) была выше, чем при ренатурации разбавлением (80%) (таблица). Одним из недостатков методики ренатурации на Ni-смоле является необходимость удалять имидазол, который используется для элюции, из образца белка. Эта процедура может быть осуществлена с помощью гельфильтрации. Однако, некоторые гидрофобные белки, в частности фрагменты АФП, в ренатурированном состоянии при обессоливании связываются со смолой, что значительно влияет на конечный выход белка. Избежать этого можно за счет того, что белок с Ni-смолы может 13 быть элюирован в достаточно высокой концентрации. При разведении его до рабочих концентраций сниженная концентрация имидазола уже не влияет на функциональные свойства белка. При проведении процедур по ренатурации С-концевого фрагмента АФП было отмечено, что ренатурированный фрагмент rAFP3D609 более устойчив в растворе по сравнению с rAFP3D595. Физико-химический анализ ренатурированных фрагментов АФП Идентичность полученного фрагмента АФП была подтверждена методом массспектрометрического анализа и N-концевым секвенированием белка. А Б Рис. 2. Гель-фильтрация ренатурированных rAFP3D595 (А) и rAFP3D609 (Б). Скорость потока 1 мл/мин, оптическую плотность измеряли при 280 нм. Гель-фильтрация обоих фрагментов выявила один пик. Рассчитанный по времени выхода молекулярный вес С-концевого фрагмента АФП, используя калибровку со стандартами, составил ~25 кДа, что близко к теоретическому молекулярному весу этого полипептида в форме мономера. Высокомолекулярные формы и агрегаты отсутствовали в детектируемых количествах (рис. 2, А и Б). При проведении хроматографии в обращенных фазах в препара14 те детектировался только один пик с максимумом выхода около 48% ацетонитрила и отсутствие других детектируемых белковых пиков (рис. 3, А и Б). Это под- А тверждает гомогенность выделенного препарата белка. Как уже упоминалось выше, в аминокислотной последовательности фрагментов АФП присутствует 12 цистеинов, которые участвуют в об- Б разовании 6 дисульфидных связей. Отсутствие в препарате ренатурированных белков свободных сульфгидрильных групп (определяли по методу Эллмана) наряду с подавляющим Рис. 3. Обратно-фазовая хроматография ренатурированных rAFP3D595 (А) и rAFP3D609 (Б). Оптическую плотность измеряли при 214 (а) и 280 (б) нм. Хроматографию осуществляли в линейном градиенте ацетонитрила (0-100%, 60 мин) с добавлением 0.1% трифторуксусной кислоты при скорости потока 0.5 мл/мин. преобладанием мономерной формы белка (по данным гель-фильтрации) служило одним из косвенных доказательств того, что полученные белки образовали правильную конформа- цию в ходе ренатурации. Пространственная структура АФП до сих пор не определена. Так как АФП является гомологом ЧСА, принято считать, что их пространственные структуры близки. Исходя из этого предполагается, что АФП является белком с вторичной структурой, состоящей преимущественно из α-спиралей. В литературе описан анализ вторичной структуры нативного АФП методом кругового дихроизма (Leong S.S.J., Middelberg A.P., 2007, Parker M.H. et al., 2004). Профили кругового дихроизма нативного белка и его рекомбинантной формы после процедуры ренатурации схожи и имеют выраженные пики поглощения на 190, 208 и 222 нм, соответствующие, как указывают авторы, преимущественно α-спиральной структуре. В результате исследования вторичной структуры ренатурированных rAFP3D595 и rAFP3D609 с использованием спектроскопии КД и диапазонах длин волн от 200 до 250 нм было выявлено, что оба белка имеют ярко выраженные пики поглощения на 190, 208 и 222 нм (рис. 4, А и Б). Это согласуется с наличием преимущественно α-спиральной структуры. Интенсивности сигналов говорят о том, что белок очень хорошо структурирован. Общий 15 профиль эллиптичности, распределение основных пиков и их интенсивности, представленные для полноразмерного АФП в разных работах и полученные в нашей работе (рис. 4, В), соответствуют полученным нами данным для С-концевых фрагментов. Хотя сравнивать данные для полноразмерного белка и его части, одного из доменов, следует с осторожностью, можно заключить, что полученный нами целевой белок имеет структуру, близкую к таковой в нативном белке. По результатам физико-химического анализа оба фрагмент rAFP3D595 и rAFP3D609 были идентичны. Рис. 4. Спектры кругового дихроизма ренатурированных фрагментов rAFP3D595 (А), rAFP3D609 (Б) и полноразмерного нативного АФП (В) Анализ функциональных свойств рекомбинантных фрагментов АФП Накопление АФП в клетках происходит в результате рецептор-опосредованного эндоцитоза. Для подтверждения функциональности полученных нами фрагментов АФП мы провели работу по изучению специфического связывания и проникновения в клетки полученного белка. В качестве клеток, несущих рецепторы к АФП, использовали клетки карци16 номы яичника человека линии SKOV3. Контролем служили лимфоциты периферической крови здорового человека, не несущие рецепторов к АФП (Ницветов М.Б. и др., 2001). Для анализа использовали конъюгат фрагментов АФП с флуоресцентной меткой ФИТЦ (rAFP3D595-ФИТЦ и rAFP3D609-ФИТЦ). При температуре +4°С белки связываются с соответствующими рецепторами на поверхности клеток, при их наличии, но не проникают внутрь, так как при такой температуре не происходит эндоцитоза. При физиологической температуре +37°С белки, связавшиеся с рецепторами, подвергаются эндоцитозу, т.е. проникают в клетки. Результаты эксперимента показаны на рисунке. Видно, что оба фрагмента эффективно связывались при +4°С с клетками линии SKOV3, но не с лимфоцитами (рис. 5, А и Б, +4°С). Данный результат говорит о специфическом связывании rAFP3D595-ФИТЦ и rAFP3D609-ФИТЦ с рецепторами к АФП на поверхности клеток SKOV3. При +37°С (рис. 5, А и Б, +37°С) наблюдается высокий уровень эндоцитоза конъюгатов в клетки SKOV3, в сравнении с этим эндоцитоз в лимфоциты шел на очень низком уровне. А Рис.5. Связывание при +4°С и эндоцитоз при +37°С ФИТЦ-меченных rAFP3D595 (А) и rAFP3D609 (Б) с клетками карциномы яичника человека SKOV3 и лимфоцитами периферической крови человека. Б При инкубации клеток линии SKOV3 с конъюгатами в присутствии 30-кратного молярного избытка природного АФП, связывание обоих фрагментов значительно ингибировалось природным АФП. Это свидетельствует о том, что полученные рекомбинантные ренатурированные фрагменты на основе С-концевого домена АФП на клетках связываются с теми же молекулами, что и природный АФП. 17 Химическое конъюгирование с ципрофлоксацином Ципрофлоксацин – синтетический антибиотик из группы фторхинолов II поколения. Он подавляет рост бактерий за счет ингибирования ферментов, в частности топоизомераз, обеспечивающих расплетание ДНК для репликации и транскрипции. Из-за способности фторхинолов ингибировать топоизомеразу не только прокариотическую, но и эукариотическую, они рассматриваются как перспективные противоопухолевые химиопрепараты. Для получения конъюгатов был отобран фрагмент rAFP3D609, так как он в ренатурированном состоянии был более устойчив в растворе. Конъюгирование rAFP3D609 и ципрофлоксацина осуществляли с помощью карбодиимида EDC. EDC активировал карбоксильную группу ципрофлоксацина, образовавшийся реакционно-способный интермедиат взаимодействовал с первичной аминогруппой на белке с образованием конъюгата rAFP3D609 с ципрофлоксацином – rAFP3D609-Cipro. Молярное соотношение rAFP3D609 к ципрофлоксацину в конъюгате составляло в среднем 1:1. Реакционную смесь диализовали для удаления не прореагировавших продуктов реакции. Цитотоксическая активность конъюгата rAFP3D609-Cipro Цитотоксическую активность препарата выражали в единицах IC50 – молярная концентрация препарата, вызывающая гибель 50% клеток. IC50 свободного ципрофлоксацина для лимфоцитов составляла 870 мкМ, для клеток SKOV3 – более 1000 мкМ. IC50 конъюгата rAFP3D-Cipro (концентрацию измеряли по ципрофлоксацину) для клеток SKOV3 составляла 50 мкМ, на лимфоциты полученный конъюгат не оказывал цитотоксического действия в диапазоне ис- Рис. 6. Выживаемость клеток линии SKOV3 и лимфоцитов периферической крови человека после 3 ч инкубации с конъюгатом rAFP3D609 с ципрофлоксацином. следуемых концентраций ципрофлоксацина (0-1000 мкМ) (рис. 6). Из результатов эксперимента видно, что в отношении опухо- левых клеток ципрофлоксацин в форме конъюгата с фрагментом АФП оказывал свое цитостатическое действие в концентрации в 20 раз ниже по сравнению со свободным цитостатиком. Таким образом, фрагмент АФП в конъюгате обеспечил более эффективную доставку ципрофлоксацина в опухолевые клетки, и конъюгирование не повлияло на биологические свойства ни белковой части, ни цитостатика. 18 Многообещающим результатом является то, что ципрофлоксацин в форме конъюгата с фрагментом АФП оказывал цитостатический эффект на опухолевые клетки в концентрациях на порядок меньше по сравнению со свободным ципрофлоксацином и не оказывал цитостатического эффекта на лимфоциты. Таким образом, отобранный рекомбинантный фрагмент АФП в форме конъюгата обеспечивал специфическую доставку цитостатика к опухолевым клеткам in vitro. Заключение Нуклеотидная последовательность, кодирующая третий домен АФП, была оптимизирована для экспрессии в бактериальной системе. Были созданы две плазмиды для экспрессии двух фрагментов АФП на основе третьего домена. Уровень индукции белка составил от 150 до 250 мг с литра культуры при разных способах индукции. Была разработана эффективная методика ренатурации белка методом разбавления, с итоговым выходом мономерной формы не менее 50% с чистотой 95%. Была разработана высокоэффективная методика ренатурации иммобилизованного на металло-хелатной смоле фрагмента АФП. Данный способ ренатурации впервые применен с высокой эффективностью для гидрофобного белка с большим количеством дисульфидных связей. Использование смолы на основе силикагеля, вместо традиционно используемых агарозных смол, позволило значительно улучшить эффективность ренатурации (от практически 0 до практически 100%). Выход ренатурированного белка составил не порядка 100% с чистотой 98%. Ренатурация белка на твердой фазе по продуктивности на два порядка превосходила ренатурацию методом разбавления. В экспериментах на клеточных культурах in vitro было показано, что по своим функциональным свойствам, т.е. способности связываться с рецептором на поверхности клеток и проникать внутрь, ренатурированные обоими способами фрагменты не уступали нативному полноразмерному АФП. Была разработана методика конъюгирования фрагмента rAFP3D609 с ципрофлоксацином. IC50 ципрофлоксацина в форме конъюгата (50 мкМ) была в 20 раз меньше, чем для свободного цитостатика (>1000 мкМ) по отношению к опухолевым клеткам. Таким образом, отобранный фрагмент АФП в форме конъюгата обеспечивал специфическую доставку цитостатика к опухолевым клеткам. Процедура конъюгирования не повлияла на биологические свойства ни белкового фрагмента, ни цитостатика. Подытожив вышесказанное, можно заключить, что отобранные в данной работе фрагменты АФП являются перспективными носителями для адресной доставки цитостатиков к опухолевым клеткам. Конъюгат фрагмента АФП с цитостатиком ципрофлоксацином как 19 модельного объекта продемонстрировал перспективность дальнейшей разработки и исследования лекарств адресного действия на основе фрагментов АФП. Выводы 1. Получены штаммы-продуценты E. coli BL21 (DE3) для получения двух вариантов С-концевого домена АФП: соответствующий структурному С-концевому домену (с 404 по 595 а.о. – rAFP3D595) и дополнительно содержащий не структурированный С-конец белка (с 404 по 609 а.о. – rAFP3D609). 2. Разработана эффективная методика ренатурации рекомбинантных фрагментов rAFP3D595 и rAFP3D609 методом быстрого разбавления. Выход ренатурированного белка составил не менее 50% с чистотой порядка 95%. 3. Впервые показана возможность высокоэффективной ренатурации гидрофобного белка с большим количеством дисульфидных связей, иммобилизованного на металлохелатной смоле. Выход ренатурированного белка составил порядка 100% с чистотой не менее 98%. Продуктивность ренатурации иммобилизованных фрагментов АФП на два порядка превышала продуктивность ренатурации методом разбавления. 4. Показано соответствие структур рекомбинантных ренатурированных фрагментов АФП и природного белка несколькими независимыми методами. Установлено, что ренатурированные фрагменты АФП представляют собой белки в форме мономеров. Показано, что все остатки цистеинов вовлечены в образование дисульфидных связей, как и в природном белке. Вторичная структура обоих фрагментов состоит преимущественно из α-спиралей и соответствует вторичной структуре нативного полноразмерного АФП. 5. Показано, что оба фрагмента АФП связывались и подвергались рецепторопосредованному эндоцитозу линией опухолевых клеток, несущих РАФП, и не проникали в нормальные клетки, не несущие РАФП (лимфоциты периферической крови человека). По способности проникать в клетки они были близки к природному АФП. 6. В экспериментах на клеточных культурах показано, что конъюгат фрагмента АФП с ципрофлоксацином подавлял рост раковых клеток в концентрации на порядок меньше, чем свободный ципрофлоксацин (IC50 50 мкМ для конъюгата и >1000 мкМ для свободного ципрофлоксацина). Конъюгат оказывал специфический цитотоксический эффект именно на раковые клетки и, в отличие от свободного ципрофлоксацина, не влиял на рост нормальных клеток. 20 Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах Шарапова О.А., Позднякова Н.В., Лауринавичюте Д.К., Юркова М.С., Посыпанова Г.А., Андронова С.М., Федоров А.Н., Северин С.Е., Северин Е.С. (2010) «Выделение и характеристика рекомбинантного фрагмента альфа-фетопротеина человека, соответствующего С-концевому структурному домену». Биоорганическая химия, 6(36): 1-9. Шарапова О.А., Юркова М.С., Андронова С.М., Федоров А.Н., Северин С.Е., Северин Е.С. (2011) «Высокоэффективная ренатурация иммобилизованного рекомбинантного Сконцевого фрагмента альфа-фетопротеина человека». Прикладная биохимия и микробиология, 5(47): 1-6. Sharapova O.A., Pozdnykova N.V., Laurinavichyute D.K., Yurkova M.S., Posypanova G.A., Fedorov A.N., Severin S.E., Severin E.S. (2010) “High-efficient expression, refolding and purification of functional recombinant C-terminal fragment of human alpha-fetoprotein”. Protein Expression and Purification, 73(1): 31-35. Sharapova O.A., Yurkova M.S., Laurinavichyute D.K., Andronova S.M., Fedorov A.N., Severin S.E., Severin E.S. (2011) “Efficient refolding of a hydrophobic protein with multiple S-S bonds by on-resin immobilized metal affinity chromatography”. Journal of Chromatography A, 1218 (31): 5115-5119. Тезисы докладов Шарапова О.А., Позднякова Н.В., Юркова М.С., Посыпанова Г.А., Федоров А.Н., Северин Е.С. (2008) «Создание векторов для адресной доставки цитостатиков на основе рекомбинантного альфа-фетопротеина человека». Сборник тезисов 12 Международной пущинской школы-конференции молодых ученых, с. 233, Пущино. Шарапова О.А. (2008) «Рекомбинантный С-концевой фрагмент альфа-фетопротеина человека как основа для адресной доставки цитостатиков». Материалы докладов XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов», с. 35, Москва. Шарапова О.А. (2009) «Рекомбинантный альфа-фетопротеин человека как основа для адресной доставки лекарств-цитостатиков». Материалы III Научно-практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии», с. 180, Москва. Северин С.Е., Северин Е.С., Федоров А.Н., Шарапова О.А., Юркова М.С. (2011) «Высокоэффективная ренатурация гидрофобного белка с большим количеством дисульфидных 21 связей, иммобилизованного на смоле». Сборник аннотаций работ IX Курчатовской молодежной научной школы, с. 140, Москва. Патенты Патент на изобретение № 2422512 от 27 июня 2011 г. Штамм Escherichia coli BL21 (DE3)/pAFP11D3-продуцент фрагмента с 404 по 609 аминокислоту альфафетопротеина человека. Северин Е.С., Лауринавичуте Д.К., Позднякова Н.В., Федоров А.Н., Шарапова О.А., Юркова М.С., Северин С.Е. Патент на изобретение № 2431639 от 20 октября 2011 г. Способ получения конъюгата фрагмента альфа-фетопротеина человека с ципрофлоксацином. Северин Е.С., Лауринавичуте Д.К., Позднякова Н.В., Федоров А.Н., Шарапова О.А., Юркова М.С., Северин С.Е. Патент на изобретение № 2448116 от 20 апреля 2012 г. Способ получения активного фрагмента альфа-фетопротеина человека. Северин Е.С., Лауринавичуте Д.К., Позднякова Н.В., Федоров А.Н., Шарапова О.А., Юркова М.С., Северин С.Е. Данное исследование проводилось при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований по программе офи_м и Фонда содействия развитию малых форма предприятий в научно-технической сфере по программе УМНИК. 22 Для заметок 23
