ОЦЕНКА ЗДОРОВЬЯ СРЕДЫ В РАЙОНЕ ХИМИЧЕСКОГО
реклама
ОЦЕНКА ЗДОРОВЬЯ СРЕДЫ В РАЙОНЕ ХИМИЧЕСКОГО ПРЕДПРИЯТИЯ: СРЕДНЯЯ ВОЛГА (САМАРСКАЯ ОБЛАСТЬ) 113 ВВЕДЕНИЕ ................................................................... 116 Краткая характеристика района исследования ................................................ 116 Места взятия проб ............................................................................................. 117 Общая характеристика состояния биоты .......................................................... 118 Растительный мир ............................................................................................. 118 Животный мир ................................................................................................... 118 РЕЗУЛЬТАТЫ ОЦЕНКИ .............................................. 123 НАЗЕМНЫЕ ЭКОСИСТЕМЫ ........................................................... 123 Растения ......................................................................................... 123 Стабильность развития .......................................................................... 123 Клевер луговой (Trifolium pratense) ................................................................ 123 Береза повислая (Betula pendula) .................................................................... 124 Физиологический подход. Оценка фотосинтеза ................................... 125 Клевер луговой (Trifolium pratense) ................................................................ 126 Береза повислая (Betula pendula) .................................................................... 126 Млекопитающие ........................................................................... 128 Стабильность развития .......................................................................... 128 Рыжая полевка (Clethrionomys glareolus) ......................................................... 128 Малая мышь (Apodemus uralensis) .................................................................. 130 Цитогенетический гомеостаз ................................................................. 132 Частота хромосомных аберраций ......................................................... 132 Рыжая полевка (Clethrionomys glareolus) ......................................................... 132 Микроядерный тест ............................................................................... 133 Рыжая полевка (Clethrionomys glareolus) ......................................................... 133 Малая мышь (Apodemus uralensis) .................................................................. 134 Иммунный статус ................................................................................... 135 Морфологические исследования клеток периферической крови ........ 136 Общая оценка иммунного статуса .......................................................... 137 Оценка функциональной активности иммунной системы .................... 138 Физиологический подход. Оценка процессов роста ............................. 141 Малая мышь (Apodemus uralensis) .................................................................. 141 114 Заключение по наземным экосистемам ................................... 145 ВОДНЫЕ ЭКОСИСТЕМЫ ................................................................ 145 Рыбы ............................................................................................... 146 Стабильность развития .......................................................................... 146 Лещ (Abramis brama) ........................................................................................ 146 Плотва (Rutilus rutilus) ...................................................................................... 147 Цитогенетический гомеостаз. Микроядерный тест ............................... 149 Лещ (Abramis brama) ........................................................................................ 149 Оценка мутагенной активности. Тест Эймса .......................................... 150 Гистология репродуктивной системы ..................................................... 151 Земноводные ................................................................................ 154 Стабильность развития .......................................................................... 154 Озерная лягушка (Rana ridibunda) ................................................................... 154 Цитогенетический гомеостаз. Микроядерный тест ............................... 156 Озерная лягушка (Rana ridibunda) ................................................................... 156 Иммунный статус .................................................................................... 157 Морфологические исследования клеток периферической крови озерной лягушки (Rana ridibunda) ................... 157 Общая оценка иммунного статуса озерной лягушки (Rana ridibunda) . 158 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ БИОТЕСТИРОВАНИЕ ПРОБ ВОДЫ ...... 160 Токсикологический тест на ракообразных: Daphnia magna и Ceriodaphnia affinis ........................................................................................ 160 Генетический тест. Тест на сестринские хроматидные обмены у рыб Notobranchius rachowi ...................................................................................... 164 Заключение по водным экосистемам ....................................... 165 ЗАКЛЮЧЕНИЕ .............................................................. 166 115 ВВЕДЕНИЕ Настоящая публикация представляет результаты интегральной биологичес> кой оценки состояния среды в районе г. Чапаевска Самарской области. Работа проводилась по заказу администрации г. Чапаевска в рамках проекта по оценке экологической ситуации для государственной экологической экспертизы Гос> комэкологии РФ для объявления г. Чапаевска зоной экологического бедствия. Материал во всех точках и пробы воды были собраны во время экспедицион> ной поездки в июне 1994 г. Краткая характеристика района исследования Оценка проводилась в районе г. Чапаевска Самарской области, крупном цен> тре химической и военно>химической промышленности с населением более 90 тыс. человек. Главными источниками загрязняющих веществ среди промышлен> ных предприятий являются Чапаевский завод химических удобрений (ЧЗХУ), за> вод «Полимер» и ряд других предприятий. Кроме того, в окрестностях города построен Центр по уничтожению химического оружия, производившегося в г. Ча> паевске на производственных площадях нынешнего ЧЗХУ вплоть до 60>х годов. В атмосферном воздухе города содержится более 100 химических веществ, эффективность очистки которых очень низкая — около 70%. Многие из них — вещества 1>го и 2>го класса опасности: диоксины, фураны, ртуть , хлористый водород и др. Так, только количество диоксинов в почве превышает в 400> 700 раз установленные в России нормативы. Проводившаяся в 1994 году сне> говая съемка выявила на территории города обширные очаги аэротехноген> ных загрязнений: превышение фона по кадмию — в 180 раз, ртути — в 89, ди> оксинов — в 60, толуолу — в 24 раза. Сильно загрязнены и водные экосистемы: содержание диоксинов в подземных водах достигает 21 пг/дм3, концентра> ции фенолов превышают ПДК в 9 раз, ксилолов и бериллия — в 3 раза. Силь> но загрязнена вода в р. Чапаевка — сброс сточных вод составляет половину среднего многолетнего расхода воды. Кроме самого города ощутимый вклад в загрязнение реки вносят сельскохозяйственные угодья, животноводческие фермы и. т.д. В целом вода в реке характеризуется как «грязная» , концентра> ция в донных отложениях одного только гексахлорана достигает 40 ПДК. 116 Столь ощутимое антропогенное воздействие не могло не отразиться на показателях здоровья населения: заболеваемость населения раком легких и нарушение репродуктивной функции женщин (выкидыши и преждевремен> ные роды) выше на 30>50%, чем в других городах одной из самой экологи> чески неблагополучных по России Самарской области. По результатам проведенной комплексной интегральной оценки качества среды город Чапаевск отнесен к разряду территорий экологического кризиса и экологического бедствия (Государственный доклад, 1994). Места взятия проб Биологическая оценка состояния среды проводилась дифференцирован> но по наземным и водным экосистемам. Как по наземным, так и по водным экосистемам анализ проводился в реперных точках, где и был собран матери> ал по разным видам живых существ. Проводилось также биотестирование образцов воды. Наземные экосистемы Для общей характеристики растительности было проведено геоботаничес> кое описание в 26 точках, представляющих все основные типы местообитаний. Более детальная интегральная оценка здоровья среды проводилась по 7 базовым точкам: • точка 1 — лесополоса вдоль железной дороги на территории города (меж> ду заводами «Полимер» и ЧЗХУ); • точка 2 — лесополоса у ЧЗХУ (на противоположном берегу р. Чапаевки); • точка 3 — лесополоса у завода «Полимер»; • точка 4 — зона отдыха на берегу озера Ильмень; • точка 5 — окрестности деревни Ясная Поляна (в 10 км от г. Чапаевска, условный контроль). Точка 1 служит для характеристики ситуации сложившейся вследствие как общей антропогенной нагрузки в городе, так и в результате химического заг> рязнения, вызванного работой заводов. Точки 2 и 3 в большей степени характеризуют воздействие заводов. Точка 4 (оз. Ильмень), хотя и находится невдалеке от ЧЗХУ, в соответствии с розой ветров не подвержена интенсивному воздействию атмосферного заг> рязнения со стороны завода и оценивается в качестве условного контроля. Точка 5 (Ясная Поляна) взята в качестве условного контроля для характе> ристики фонового состояния в исследуемом районе. В этом месте дополни> тельно выбрана точка 5а — на окраине лесного массива вдоль сельскохозяй> ственных полей для ориентировочной оценки влияния сельскохозяйственной деятельности. Водные экосистемы Оценка водных экосистем проводилась в 5 базовых точках: • точка 1 — створ выше города (первый створ), р. Чапаевка; 117 • точка 2 — городская зона отдыха, озеро Ильмень; • точка 3 — участок р. Чапаевки, примыкающий к заводу химических удоб> рений; • точка 4 — район сброса сточных вод в р. Чапаевку (второй створ); • точка 5 — створ ниже города (третий створ), р. Чапаевка. Точка 1 взята в качестве условного контроля для характеристики фонового состояния в исследуемом районе. Рыбы для анализа отлавливались непосред> ственно в реке, земноводные — в небольшом замкнутом водоеме, располо> женном в том же месте. Точка 2 рассматривалась в качестве относительного контроля. Точка 3 служила для оценки ситуации в наиболее загрязненном районе. Точка 4 характеризует ситуацию непосредственно в районе сброса сточных вод. Точка 5 взята ниже по течению, относительно места сброса сточных вод. Пробы воды Для биотестирования качества воды были использованы следующие пробы: • проба 1 — вода после биологической очистки; • проба 2 — вода, сбрасываемая в реку; • проба 3 — вода после станции обезжелезивания; • проба 4 — питьевая вода (квартира на ул. Медицинская). Общая характеристика состояния биоты Общая характеристика состояния представлена в виде рекогносцировоч> ной оценки биоразнообразия растений и двух групп животных (рыб для вод> ных и млекопитающих для наземных экосистем). Растительный мир Обобщенное состояние растительности района исследований можно при> знать неудовлетворительным, соответствующим чрезвычайной экологической ситуации (табл. 1). Этот вывод следует из сопоставления оценок параметров растительности, выбранных в качестве индикационных. Животный мир Детальная характеристика состояния животного мира с оценкой биораз> нообразия по отдельным группам является самостоятельной большой зада> чей, которая не ставилась в качестве основной в данном проекте по двум при> чинам. Это требует длительного многолетнего исследования с учетом возмож> ных сезонных изменений, с привлечением большого числа различных специ> алистов. Даже при получении всех этих данных они в большей степени будут характеризовать возможные изменения вследствие общего антропогенного пресса, тогда как локальные воздействия, связанные в первую очередь с хи> мическим загрязнением, оценка последствий которого и является главной за> дачей работы, могут происходить и без ощутимых изменений на уровне био> разнообразия. 118 Таблица 1. Оценка состояния растительного покрова г. Чапаевска и его окрестностей (относи> тельные величины) Уровни оценок № Параметры Экологическое Черезвычайная Относительно бедствие экологическая удовлетв. ситуация 1 Обеднение флоры 2 Снижение плотности + (на 60>70%) — — — + (30>40%) — популяций видов>индикаторов из степных злаков и разнотравья 3 Доля площади коренных ассоциаций + (ок.3>4%) — — 4 Изменение состава зональных степей — + (20>30%) — — + (сильная) — — + (ок. 1/3) — — + (сильное) — 8 Заболевание древостоя — + (сильное) — 9 — + (местами высокая) — — + (высокая, сбой) — — + (на 30>50%) — + (исчезновение, сокращение ареала практически всех степных и лесных видов) — — (смена доминантов) 5 Трансформация возрастного спектра популяций доминантов 6 Лесистость, % от оптимальной для региона 7 Повреждение древостоя атмосферными выбросами Площадь посевов, поврежденных болезнями и вредителями 10 Пастбищная дигрессия степной растительности 11 Снижение продуктивности природных пастбищ 12 Изменение в размещении и состоянии популяций редких видов В связи с этим был проведен лишь рекогносцировочный анализ по двум группам: рыбам для водных и млекопитающим для наземных экосистем. Рыбы Результаты получены при участии Ю.Ю. Дгебуадзе, Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН. Анализ состава рыбного населения проводился по результатам обловов 5> ти базовых точек водныx экосистем. Данные, характеризующие видовой со> став и соотношение отдельных видов в уловах, представлены в таблице 2. Были рассчитаны доли каждого вида в уловах и коэффициент (индекс) видового разнообразия Шенона: 119 Таблица 2. Результаты рекогносцировочной оценки биоразнообразия рыб (доля каждого вида в уловах, в %, и величина показателя разнообразия Шеннона) в разных точках (1 >5). Точки сбора 1 2 3 4 5 72,6 21,2 62,5 51,0 58,5 Синец (Abramis ballerus) 0 1,1 0 4,8 0 Густера (Blicca bjoerkna) 0 0 1 11,5 0 Плотва (Rutilus rutilus) 17,9 65,9 5,25 9,6 41,5 Красноперка 0.94 0 30,2 0 0 Уклея (Alburnus alburnus) 2,8 0 0 23,1 0 Чехонь (Pelecus cultratus) 0,94 0 0 0 0 0 1,1 0 0 0 Лещ (Abramis brama) (Scardinius erythrophthalmus) Язь (Leuciscus idus) Вьюн (Misgurnus fassilis) 0,94 0 0 0 0 Окунь (Perca fluviatilis) 0,94 7,0 0 0 0 Щука (Esox lucius) H 2,8 3,5 0 0 0 0,395 0,430 0,379 0,561 0,294 H = E((n/N) lg(n/N)), где n — численность вида в данной точке, N — количество особей всех ви> дов, пойманных в данной точке. Следует отметить, что использование индекса Шенона, как, впрочем, и дру> гих аналитических индексов, в целях биоиндикации в последнее время под> вергается довольно аргументированной критике (см., например, Воробейчик и др., 1994). Тем не менее этот показатель довольно часто фигурирует в ихти> ологической литературе. Проведенные наблюдения показали, что видовое разнообразие, оценен> ное по спискам обнаруженных видов, достигает максимума в точке, располо> женной выше по течению относительно города и в озере Ильмень. В точках 3> 5, характеризующихся наибольшим загрязнением, число обнаруженных ви> дов рыб существенно ниже, достигая минимума (всего 2 вида — плотва и лещ) в точке 5, расположенной ниже по течению относительно города. Иную картину демонстрируют изменения индекса видового разнообразия Шенона. В связи с тем, что антропогенное воздействие часто сопряжено с суще> ственной эвтрофикацией водоемов, в соответствующих местах растет числен> ность и биомасса некоторых видов. В результате наблюдается некоторое уве> личение показателей видового разнообразия, как это произошло в точке 4. Результаты, полученные в настоящем исследовании, оказались в значи> тельной степени сходными с аналогичными материалами, полученными для других загрязненных рек средней полосы (Kesminas et al.,1994; Соколов и др., 1994). Общая схема реакции рыбного населения водоемов на загрязнение выглядит примерно одинаково: в месте сброса загрязняющих веществ резко 120 сокращается список наблюдаемых видов, хотя некоторые из них (обычно плот> ва) могут иметь большую плотность; на отдаленных от источника загрязнения участках (ниже по течению в случае водотоков) число видов растет, а также вследствие эвтрофикации существенно увеличивается численность отдельных видов, что часто приводит к высоким показателям индексов видового разно> образия. Млекопитающие Результаты получены при участии Б.И.Шефтеля, Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н.Северцова РАН. Анализ млекопитающих также производился по данным отловов в 5 базо> вых точках по наземным экосистемам. Результаты проведенных оценок по представленности отдельных видов и по коэффициенту видового разнообра> зия приведены в таблицах 3 и 4 и на рисунках 1 и 2. Таблица 3. Результаты рекогносцировочной оценки биоразнообразия млекопитающих (доля каж> дого вида) в разных точках (1–5). № A.ura> M.mus> Cl. gla> M. ar> A. ag> A. fla> М. mi> S. lensis culus reolus valis rarius vicolus nutus araneus 1 66,6 33,3 — — — 2 16,6 — 41,6 25 3 45 — 50 — 4 56,7 — 37,3 — — 5 27,0 15,6 5,2 12,5 29,1 — — — — — 0,75 15,9 2,5 — — 2,5 — — 5,97 10,4 — — Максимальным видовым разнообразием характеризуются точки 5 (Ясная Поляна) и 2 (лесополоса у ЧЗХУ), пониженным — точки 3 (лесополоса у Поли> мера) и 4 (оз. Ильмень), при минимальном — в точке 1 (в городе). Эти данные хорошо согласуются с общими различиями между сравниваемыми местооби> таниями (продуктивностью, богатством почвы и растительного покрова) и сте> пенью рекреационной нагрузки. Наиболее богатые местообитания (поймен> ный лес в Ясной Поляне и порослевая дубрава у ЧЗХУ, высокая пойма) имеют наиболее высокое видовое разнообразие. Более бедные (лесополоса у Поли> мера и порослевая дубрава у оз. Ильмень, к тому же подверженная рекреаци> онной нагрузке) имеют сниженное разнообразие. Наиболее бедная по про> дуктивности и подверженная сильной рекреационной нагрузке лесополоса на Таблица 4. Результаты рекогносцировочной оценки биоразнообразия млекопитающих (вели> чина показателя разнообразия Шенона) разных точках (1 –5). Точки Коэффициент видового разнообразия 1 2 3 4 5 0,277 0,579 0,386 0,371 0,717 121 территории города имеет обедненное разнообразие видов, что обычно и на> блюдается в городских лесных посадках. В то же время точка 2 (у ЧЗХУ), несмотря на высокий уровень загрязнения, характеризуется высоким биоразнообразием как по числу представленных здесь видов, так и по величине коэффициента видового разнообразия Шено> на, что, по>видимому, определяется как общим богатством местообитания, так и эвтрофикацией, связанной с загрязнением. 12 2 РЕЗУЛЬТАТЫ ОЦЕНКИ Оценка здоровья среды проводилась отдельно по наземным и водным эко> системам в ряде реперных точек. НАЗЕМНЫЕ ЭКОСИСТЕМЫ Характеристика состояния наземных экосистем проводилась по модель> ным фоновым видам: • растений; • млекопитающих. РАСТЕНИЯ Интегральная оценка состояния растений проводилась с использованием следующих подходов: • морфологического (оценка уровня стабильности развития); • физиологического (оценка интенсивности процессов фотосинтеза). В качестве модельных объектов были выбраны два вида: • береза повислая (Betula pendula) из древесных растений; • клевер луговой (Trifolium pratense) из травянистых растений. Стабильность развития Стабильность развития оценивали по уровню флуктуирующей асимметрии. Клевер луговой (Trifolium pratense) Оценка стабильности развития проводилась в пяти точках. Для анализа бра> ли по 2 листа с 20 растений в каждой точке. 123 Для оценки стабильности развития клевера лугового (Trifolium pratense) были использованы 9 морфологических признаков (Захаров и др., 2000) 1 — число жилок второго порядка, отходящих от средней жилки и не доведенных до края листа; 2 — число жилок второго порядка, замкнутых на соседние жилки; 3 — число многократно разветвленных жилок второго порядка; 4 — число однократно разветвленных жилок второго порядка; 5 — длина хорды на среднем листочке; 6 — длина супротивных боковых листочков; 7 — ширина супротивных боковых листочков; 8 — длина хорды на каждом из боковых листочков; 9 – ширина хорды на каждом из боковых листочков. Стабильность развития оценивалась по величине флуктуирующей асиммет> рии листа. Величина флуктуирующей асимметрии оценивалась с помощью ин> тегрального показателя — среднего относительного различия между сторонами на признак. Величина интегрального показателя стабильности развития в точ> ках 1, 2, 3, 4, и 5 равна соответственно 0,025, 0,022, 0,023, 0,021 и 0,020. Таким образом, обнаружено снижение показателя от точки 1 к точке 5. Максимальный уровень зафиксирован в центре города (точка 1). Величина показателя в точке 1 значимо отличается показателей в выборках из точек 4 и 5 (p<0,05). Береза повислая (Betula pendula) Стабильность развития оценивали в пяти точках. Для анализа использова> ли по 10 листьев с укороченных побегов из нижней части кроны от нескольких деревьев из каждой точки (с семи деревьев — в точке 1; с восьми — в точке 2 и с десяти — в точках 3, 4, 5). Для оценки стабильности развития березы повислой (Betula pendula) были использованы 5 мор> фологических признаков (Захаров и др., 2000) 1>5 — промеры листа: 1 — ширина половинки листа (измерение проводили посередине листовой пластинки); 2 — длина второй от основания листа жилки второго порядка; 3 — расстояние между основаниями первой и второй жилок второго порядка; 4 — расстояние между концами этих жилок; 5 — угол между главной жилкой и второй от основания листа жилкой второго порядка. Уровень стабильности развития оценивался по величине интегрального показателя — среднего относительного различия между сторонами на признак. Для выборок из точек 1, 2, 3, 4 и 5 были получены результаты: 0,0573±0,0040, 0,0525±0,0033, 0,0510±0,0031, 0,0442±0,0026 и 0,0440±0,0022 соответ> ственно. Cравниваемые выборки можно разделить на три группы: две точки имеют сходные низкие значения (выборки 4, 5), статистически значимо (p<0,05) от них отличаются по более высоким и сходным между собой значе> ниям выборки вблизи двух основных предприятий города (из точек 2 и 3). Максимальные величины характерны для центра города (точка 1) (рис. 1). 124 Стабильность развития Рисунок 1. Величина интегрального показателя стабильности развития (среднее относительное раз> личие между сторонами на признак) в выборках березы повислой (Betula pendula) из разных точек (1>5). Точки: точка 1 — лесополоса на территории города (между заводами «Полимер» и ЧЗХУ); точка 2 — лесополоса у ЧЗХУ; точка 3 — лесополоса у завода «Полимер»; точка 4 — озеро Ильмень (условный кон> троль); точка 5 — 10 км от г. Чапаевска (условный контроль). Использование интегрального показателя (среднего относительного раз> личия между сторонами на признак) позволило сопоставить эти результаты с ранее полученными данными для других районов с разным уровнем стресси> рующего воздействия среды. Для древесных растений величина показателя была проранжирована по пятибалльной шкале по степени отклонения от нор> мы: до 0,040 — 1 балл (условная норма); 0,040>0,044 — 2 балл; 0,045>0,049 — 3 балл; 0,050>0,054 — 4 балл и выше 0,054 — 5 балл (критическое состояние). По разработанной нами пятибалльной шкале отклонений состояния орга> низма от нормы по уровню стабильности развития ситуация в точке 1 соот> ветствует критическому состоянию (пятый балл), в точках 2 и 3 — существен> ным отклонениям (четвертый балл), в точках 4, 5 (условно>контрольные точ> ки) — незначительным отклонениям от нормального состояния в популяци> ях растений (второй балл). Полученные результаты свидетельствуют о существенном изменении состо> яния растений в районах подверженных сильному антропогенному воздействию, по сравнению с условным контролем. Степень отклонения состояния от условно нормального повышается с усилением общего антропогенного пресса. Физиологический подход. Оценка фотосинтеза Для оценки физиологического статуса растительного организма исполь> зовались люминесцентные методы. Эти методы позволяют получить инфор> 125 мацию о состоянии фотосинтетического аппарата растений. Для характерис> тики работы фотосинтетического аппарата применялся метод индукции быст> рой флуоресценции хлорофилла. Клевер луговой (Trifolium pratense) Для исследования брали по 2 листа с 25 растений клевера. Полученные данные, отражающие эффективность использования энергии в первичных реакциях фотосинтеза, а следовательно, и состояние фотосинте> зирующей системы, свидетельствуют о подавлении фотохимической актив> ности фотосистемы II в хлоропластах листьев клевера в районе исследования в целом (рис. 2). Величина Fv/Fm в выборках листьев клевера лугового в точ> ках 1>5 равна соответственно: 0,812± 0,0042 > 0,837±0,0055 > 0,829±0,0046 > 0,808±0,0056 > 0,821±0,0035. Значительное снижение даже на этом фоне наблюдается в точках 1 (при наибольшей суммарной антропогенной нагрузке) и 4 (вероятно, это связано с локальным загрязнением почвы). Важно, что максимальное снижение интен> сивности прцессов фотоситеза соответствует данным, полученным при иссле> довании березы. Показатель фотосинтеза Рисунок 2. Величина показателя эффективности фотосинтетических процессов (Fv/Fm) в выбор> ках клевера лугового (Trifolium pratense) из разных точек (1>5). Точки: точка 1 — лесополоса на территории города (между заводами «Полимер» и ЧЗХУ); точка 2 — лесополоса у ЧЗХУ; точка 3 — лесополоса у завода «Полимер»; точка 4 — озеро Ильмень (услов> ный контроль); точка 5 — 10 км от г. Чапаевска (условный контроль). Береза повислая (Betula pendula) Для исследования брали листья из нижней части кроны берез в каждой точке с 5 деревьев по 10 листьев. Сорванные листья выдерживали в прохладном, темном месте в течение 2>6 ч. Время темновой адаптации 1 минута. Получали индукционные кривые флу> 126 Показатель фотосинтеза Рисунок 3. Величина показателя эффективности фотосинтетических процессов (Fv/Fm) в выбор> ках березы повислой (Betula pendula) из разных точек (1>5). Точки: точка 1 — лесополоса на территории города (между заводами «Полимер» и ЧЗХУ); точка 2 — лесополоса у ЧЗХУ; точка 3 — лесополоса у завода «Полимер»; точка 4 — озеро Ильмень (услов> ный контроль); точка 5 — 10 км от г. Чапаевска (условный контроль). оресценции хлорофилла для оценки эффективности протекания первичных фотосинтетических процессов. Величина отношения Fv/Fm в выборках листьев березы повислой повы> шается от точки 1 (центр города) к точке 5 (рассматриваемой в качестве услов> ного контроля) (рис. 3), и равно в точках 1>5 соответственно: 0,808±0,0057 > 0,835±0,0067 > 0,835±0,0055 > 0,855±0,0032 > 0,865±0,0035. По величине этого показателя сравниваемые выборки можно pазделить на три группы. Выборки из точек 4 и 5 имеют сходные высокие значения, статисти> чески значимо (p<0,01) от них отличаются выборки из точек 2 и 3 (вблизи двух предприятий города), они имеют сходные низкие значения. Минимальным зна> чением характеризуется точка 1 (центр города), которая статистически значимо отличается от точек 2 и 3 (р<0,01) и от контрольных точек 4 и 5 (р<0,001). Полученные данные свидетельствуют о наличии тенденции к снижению интенсивности фотосинтетических процессов в районах г. Чапаевска, подвер> женных наиболее сильному влиянию негативных средовых факторов. *** Оценка состояния проводилась для двух видов растений при использо> вании двух подходов. Оба использованных подхода в отношении обоих ви> дов дают сходные результаты. 127 Полученные данные свидетельствуют о том, что нарушения стабильно> сти развития в условиях химического загрязнения (в точках 1, 2, и 3) сопро> вождаются снижением интенсивности процессов фотосинтеза. Причем мак> симальные нарушения морфогенетических процессов и фотосинтетичес> ких реакций у березы повислой и клевера лугового наблюдаются в точке 1, в центре города. По>видимому, это является результатом комплексного воз> действия нескольких источников загрязнения. Наиболее высокий уровень стабильности развития и фотосинтетических процессов отмечен у расте> ний в контрольной точке 5, находящейся на максимальном удалении от ис> точников загрязнения. Ситуация в точках 4>5 соответствует слабым откло> нениям от нормы (2 балл по пятибалльной шкале), в точках 2>3 — суще> ственным отклонениям от нее (порядка 4 балла), при максимальных нару> шениях в точке 1 (5 балл). Высокая скоррелированность (r=0,905, p<0,01) не связанных между собой напрямую морфогенетических и фотосинтетических нарушений по> зволяет говорить об изменении состояния растений в целом в исследуе> мых популяциях в условиях химического загрязнения и общего антропо> генного стресса. МЛЕКОПИТАЮЩИЕ Интегральная оценка состояния популяций проводилась с использовани> ем следующих подходов: • морфологического (оценка уровня стабильности развития); • цитогенетического (учет частоты хромосомных аберраций и микроядер); • иммунологического (общая оценка иммунного статуса, анализ морфологии клеток периферической крови и оценка функциональной активности иммун> ной системы); • физиологического (оценка процессов роста). Для характеристики экосистем в качестве модельных обьектов были ис> пользованы фоновые виды мелких млекопитающих: • рыжая полевка (Clethrionomys glareolus); • малая мышь (Apodemus uralensis). Стабильность развития Стабильность развития оценивалась по уровню флуктуирующей асим> метрии. Рыжая полевка (Clethrionomys glareolus) Объем выборок на участках с разным уровнем загрязнения составил: в точке 2 (лесополоса у завода ЧЗХУ) — 24 особи; в точке 3 (лесополоса у завода «По> лимер») — 14 особей и в точке 4 (лесополоса на берегу оз. Ильмень, условный контроль) — 21 особь. 128 Для оценки стабильности развития были использованы 10 краниологических признаков, число отверстий для выхода кровеносных сосудов и нервов (Захаров и др., 2000): 1 — на верхнечелюстной кости (в районе диастемы), перед коренными зубами (1) 2 — на скуловом отростке верхнечелюстной кости (0>1); 3 — на основной затылочной кости (0>1); 4 — подъязычное отверстие (вместе с дополнительными) (1); 5 — на предчелюстной кости (над инфраорбитальным каналом (1); 6 — на латеральной поверхности лобной кости (позади слезной) (1); 7 — в нижней части орбитальной поверхности лобной кости (над орбитальной вырезкой) (1); 8 — в верхней части мозговой пластинки лобной кости под теменным гребнем (1); 9 — на чешуйчатой кости (1); 10 — на сосцовой части каменистой кости (1). *В скобках указана условная «норма» (наиболее обычное значение или диапазон значений при> знака), отклонения от которой учитывались как мелкие фенодевианты. Дисперсия асимметрии оказалась выше (по 9 признакам) в выборке из точки 2, чем в выборке из точки 4 (p<0,05 по критерию знаков). По 4 призна> кам дисперсии в точке 2 значимо выше (в одном случае p<0,05; в трех — p<0,01). В точке 3 дисперсия асимметрии также выше по сравнению с точкой 4 по 7 признакам (при значимых различиях, p<0,01, по двум из них). По непараметрическому ранговому критерию Фридмана изменения диспер> сий асимметрии от точки 4 к точкам 2 и 3 происходят согласованно и не случай> Стабильность развития Рисунок 4. Величина интегрального показателя стабильности развития (средняя частота асим> метричного проявления на признак) в выборках рыжей полевки (Clethrionomys glareolus) из разных точек (2>4). Точки: точка 2 — лесополоса у ЧЗХУ; точка 3 — лесополоса у завода «Полимер»; точка 4 — озеро Ильмень (условный контроль). 129 Таблица 5. Величина интегральных показателей стабильности развития (средняя частота асим> метричного проявления на признак — А, средняя величина асимметрии на признак — Б и среднее число мелких фенодевиантов на признак — В) в выборках рыжей полевки (Clethrionomys glareolus) из разных точек (2>4). Точка А Б В 2 0,47±0,03 0,55±0,05 0,73±0,05 3 0,45±0,05 0,51±0,07 0,69±0,07 4 0,31±0,04 0,34±0,04 0,62±0,06 но (χ2 =6,2; p<0,05 при df=2). В соответствии с этим суммы рангов для десяти использованных признаков увеличиваются от точки 4 к точке 2: 14 > 21 > 25. Величина основного интегрального показателя стабильности развития, средней частоты асимметричного проявления на признак оказалась минималь> ной в точке условного контроля (различия статистически значимы при срав> нении точек 2>4 и 3>4, p<0,05) (рис. 4). По пятибалльной шкале оценки от> клонений уровня стабильности развития от нормы ситуация в условно конт> рольной точке может быть охарактеризована как условно>нормальная (1 балл), в точках 2 и 3 как существенно отклоняющаяся от нормы (4 балл). Два других интегральных показателя стабильности развития, cредняя ве> личина асимметрии (различия между контролем и остальными выборками статистически значимы, p<0,05) и частота фенодевиантов обнаруживают ту же тенденцию — величина показателей выше в окрестностях предприятий, по сравнению с условно> контрольной точкой (табл. 5). Малая мышь (Apodemus uralensis) Объем выборок из четырех точек составил: точка 2 — 17 особей, точка 3— 15 особей, точка 4— 30 особей, точка 5 — 23 особи. Для оценки стабильности развития были использованы 10 краниологических признаков, число отверстий для выхода кровеносных сосудов и нервов (Захаров и др., 2000): 1 — на верхнечелюстной кости в районе диастемы, перед коренными зубами (2)*; 2 — на скуловом отростке верхнечелюстной кости (0); 3 — на основной клиновидной кости между непостоянным и овальным отверстиями (0>1); 4 — на основной затылочной кости (0); 5 — подъязычное отверстие, вместе с дополнительными (1); 6 — на предчелюстной кости, над инфраорбитальным каналом (1); 7 — на латеральной поверхности лобной кости, позади слезной (0); 8 — в нижней части орбитальной поверхности лобной кости, над орбитальной вырезкой (1); 9 — в верхней части мозговой пластинки лобной кости под теменным гребнем (1>2); 10 — в районе затылочных мыщелков (2>3). *В скобках указана условная «норма» (наиболее обычное значение или диапазон значений при> знака), отклонения от которой учитывались как мелкие фенодевианты. По величине асимметрии по отдельным признакам прослеживается та же тенденция, что и у рыжей полевки: значения дисперсий асимметрии по боль> 130 шему числу признаков выше в популяциях, обитающих вблизи предприятий, по сравнению с популяциями из условно чистых мест обитания. Это дополнительно подтверждается величиной суммарных значений ран> жированных дисперсий 10 исследованных признаков в точках 2 — 5 (соответ> ственно, 29 > 31 > 23 > 17; p>0,05 по критерию Фридмана). Все три использованных интегральных показателя стабильности развития оказались существенно ниже в выборках из условно>контрольных точек 4 и 5 (при значимых различиях по средней частоте асимметричного проявления на признак и средней величине асимметрии, p<0,05 между выборками из точек 4 и 5 и из точки 2)(рис. 5, табл. 6). По пятибалльной шкале оценки изменений состояния организма по уров> ню стабильности развития ситуация в условно>контрольных точках 4 и 5 соот> ветствует норме (первый балл), в точке 3 отклонениям среднего уровня (тре> тий балл), в точке 2 — существенным отклонениям от нормы (четвертый балл). Таблица 6. Величина интегральных показателей стабильности развития (средняя частота асим> метричного проявления на признак — А, средняя величина асимметрии на признак — Б и среднее число мелких фенодевиантов на признак — В) в выборках малой мыши (Apodemus uralensis) из раз> ных точек (2>5). Точка А Б В 2 0,45±0,04 0,51±0,05; 0,54±0,06 3 0,41±0,05 0,45±0,06 0,48±0,07 4 0,32±0,03 0,38±0,03 0,42±0,04 5 0,31±0,04 0,36±0,05 0,46±0,04 Стабильность развития Рисунок 5. Величина интегрального показателя стабильности развития (средняя частота асиммет> ричного проявления на признак) в выборках малой мыши (Apodemus uralensis) из разных точек (2>5). Точки: точка 2 — лесополоса у ЧЗХУ; точка 3 — лесополоса у завода «Полимер»; точка 4 — озеро Ильмень (условный контроль); точка 5 —10 км от г. Чапаевска (условный контроль). 131 Анализ стабильности развития выявил сходную тенденцию в изменении интегральных показателей асимметрии у обоих видов млекопитающих. Это позволяет предположить наличие четкой тенденции к снижению стабильнос> ти развития в окрестностях химических предприятий по сравнению с услов> ным контролем. В балльном выражении по пятибалльной шкале отклонения от нормы ситуация для обоих видов в условно контрольных точках соответ> ствует норме (первый балл), в зоне воздействия, около территории заводов — четвертому баллу. Таким образом, по степени отклонения от нормы полученные данные сви> детельствуют о существенных изменениях состояния организма под действи> ем исследуемого антропогенного воздействия. Цитогенетический гомеостаз В качестве цитогенетического подхода использовался учет хромосомных аберраций и микроядерный тест. Частота хромосомных аберраций Частота хромосомных аберраций учитывалась у одного вида мелких мле> копитающих. Рыжая полевка (Clethrionomys glareolus) Исследовано из точки 2 — 6, из точки 3 — 7 и из точки 5 — 5 особей. Данные представлены на рис. 6 и в табл. 7. Наиболее часто встречающийся тип аберраций у рыжей полевки (Clethrionomys glareolus) во всех исследованных точках — хроматидные деле> ции (табл. 7). Частота клеток с ними значимо выше в точках 2 и 3, расположен> ных вблизи химических предприятий по сравнению с условно>контрольной точкой 5 (p<0,02 и p<0,01 соответственно). Несмотря на небольшой объем проанализированного материала, в зоне интенсивного химического загрязнения (в точке 3) была обнаружена клетка с редко встречающимся типом нарушения хромосомной структуры — с центри> Таблица 7. Частота клеток с разными типами хромосомных нарушений, в %, в выборках рыжей полевки (Clethrionomys glareolus) из разных точек (2, 3, 5). В скобках указано абсолютное число абер> рантных клеток. Точки 2 3 5 Число особей 6 7 5 Число клеток 221 301 175 с хроматидными делециями 9,04 (20) 9,30 (28) 2,85 (5) с центрическими кольцами — 0,33 (1) — 9,04 ±1,49 (20) 9,63±1,80 (29) 2,85±0,79 (5) Аберрантные клетки: Общее число аберрантных клеток 132 Цитогенетический гомеостаз Рисунок 6. Частота аберрантных клеток (%) в выборках рыжей полевки (Clethrionomys glareolus) из разных точек (2, 3, 5). Точки: точка 2 — лесополоса у ЧЗХУ; точка 3 — лесополоса у завода «Полимер»; точка 5 — 10 км от г. Чапаевска (условный контроль). ческим кольцом. В норме частота этого типа нарушений крайне низка. По сум> марной частоте аберрантных клеток сходные высокие значения имеют полев> ки из точек интенсивного химического загрязнения 2 и 3. Результаты получен> ные для особей из этих точек статистически значимо отличаются от значений, полученных для особей из условного контроля (точка 5) (p<0,02 и p<0,01 со> ответственно). Частота аберрантных клеток в точке 5 (рассматриваемая в ка> честве контроля) соответствует норме (в качестве спонтанного принят уровень до 3,5%) — 1 баллу по условной пятибалльной шкале. В точках 2 и 3 частота хромосомных нарушений существенно выше и соответствует 3>4 баллу откло> нения от нормы. Микроядерный тест Результаты получены А.В.Чеховичем, Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН. Микроядерный тест проводился для двух видов мелких млекопитающих. Рыжая полевка (Clethrionomys glareolus) Исследовано из точки 2 — 10, из точки 3 — 12, из точки 4 — 10 и из точки 5 — 5 особей. Был произведен подсчет частоты индуцированных микроядер в 1000 нор> мохромных эритроцитах (НХЭ) периферической крови от каждой особи рыжей полевки (Clethrionomys glareolus). Оценку статистической значимости различий проводили с помощью t>критерия Стьюдента с ϕ>преобразованием Фишера. Частота микроядер у полевок с территории промышленных предприятий (точки 2 и 3) значительно выше, чем в точке 4 (озеро «Ильмень») и 5 (зона отдыха «Ясная поляна») (табл. 8, рис. 7). Статистически значимые различия по этому показателю обнаружены между полевками из точек 2 и 4, 3 и 4 (p<0,01 и p<0,02 соответственно). 133 Таблица 8. Частота эритроцитов с микроядрами, в ‰, в периферической крови рыжих полевок (Clethrionomys glareolus) из разных точек (2>5). В скобках указаны абсолютные значения. Точки 2 3 4 5 Число особей 10 12 10 5 Число клеток 10000 12000 10000 5000 Частота 2,0 (20) микроядерных клеток 1,83 (22) 0,80 (8) 1,0 (5) Цитогенетический гомеостаз Рисунок 7. Частота эритроцитов с микроядрами, в ‰, в периферической крови рыжих полевок (Clethrionomys glareolus) из разных точек (2>5). Точки: точка 2 — лесополоса у ЧЗХУ; точка 3 — лесополоса у завода «Полимер»; точка 4 — озеро Ильмень (условный контроль); точка 5 —10 км от г. Чапаевска (условный контроль). Малая мышь (Apodemus uralensis) Исследовано из точки 2 — 13, из точки 3 — 12, из точки 4 — 11 и из точки 5 — 10 особей. Был произведен подсчет частоты индуцированных микроядер в 1000 нор> мохромных эритроцитах (НХЭ) периферической крови от каждой особи ма> лой мыши (Apodemus uralensis). Оценку статистической значимости различий Таблица 9. Частота эритроцитов с микроядрами, в ‰, в периферической крови малых мышей (Apodemus uralensis) из разных точек (2>5). В скобках указаны абсолютные значения. Точки 2 3 4 5 Число особей 13 12 11 10 Число клеток 13000 12000 11000 10000 Частота 4,15 (54) 3,42 (41) 2,09 (23) 2,80 (28) микроядерных клеток 134 Цитогенетический гомеостаз Рисунок 8. Частота эритроцитов с микроядрами, в ‰, в периферической крови малой мыши (Apodemus uralensis) из разных точек (2>5). Точки: точка 2 — лесополоса у ЧЗХУ; точка 3 — лесополоса у завода «Полимер»; точка 4 — озеро Ильмень (условный контроль); точка 5 —10 км от г. Чапаевска (условный контроль). проводили с помощью t>критерия Стьюдента с ϕ−преобразованием Фишера. Величина показателя, как и у рыжей полевки, оказалась существенно выше в точках 2 и 3 по сравнению с точками 4 и 5 (табл. 9, рис. 8). Различия между точками 2 и 4 статистически значимы (p<0,01). Оценка цитогенетического гомеостаза в популяциях домовой мыши по ча> стоте аберраций хромосом свидетельствует о его нарушении в точках 2 и 3 по сравнению с условно>контрольной точкой 5. В балльном выражении по пяти> балльной шкале отклонения от нормы ситуация для домовой мыши в услов> но>контрольной точке соответствует норме, в точках 2 и 3 обнаружено значи> тельное отклонение от условной нормы. Данные микроядерного теста, характеризующего мутагенность среды, не> смотря на некоторые межвидовые различия, однозначно свидетельствуют о неблагоприятности ситуации в точках 2 и 3. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о существенных изменениях в состоянии организма под действием исследуемого антропоген> ного воздействия. Иммунный статус Результаты получены В.И.Старостиным и Э.В.Чернышовой, Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН. В рамках иммунологического подхода была проведена общая оценка им> мунного статуса, исследована морфология клеток периферической крови и оценена функциональная активность иммунной системы. 135 Морфологические исследования клеток периферической крови Морфологические исследования проведены с использованием перифери> ческой крови мышевидных грызунов — малой мыши (Apodemus uralensis) и рыжей полевки (Clethrionomys glareolus). Отлов производился в четырех точ> ках, подверженных антропогенному воздействию разной интенсивности: в точках 2, 3 и 4. Контролем служила точка 5. Объем выборок в точках составил: точка 2 — 7 особей Cl. glareolus; точка 3 — 15 особей A. uralensis; точка 4 — 6 особей Cl. glareolus и 5 особей A. uralensis; точка 5 — 8 особей A. uralensis. Анализ лейкограмм периферической крови мышевидных грызунов из 4 точек с разным уровнем техногенного загрязнения выявил ряд отклонений в морфологическом составе крови. 1) Во всех группах исследованных животных обнаруживаются незрелые, юные формы миелоцитов (0,5>1%), а также заметное количество палочкоя> дерных лейкоцитов (в среднем 2>5%), что не свойственно нормальным лей> кограммам мышей. 2) Во всех группах (кроме выборки из точки 5) заметно снижена доля сег> ментоядерных нейтрофилов, особенно у животных из точек 2 и 3, где их со> держание в 2,4 раза меньше нормы. 3) Число эозинофилов превышает норму в 2>4 раза. 4) В крови большинства животных из точек 3 и 4, а также у двух мышей из точки 2 выявляется группа лимфоидных клеток с необычными морфологичес> кими признаками. Эти клетки характеризуются достаточно высоким соотноше> нием цитоплазмы и ядра, выраженным перинуклеарным пространством, блед> но>голубой окраской цитоплазмы, в которой выступает азурофильная зернис> тость в виде мелких распыленных гранул или более крупных включений темно> вишневого или фиолетового цвета. Гранулы имеют тенденцию преимуществен> ной локализации в центральной области клетки. Морфология наблюдаемых клеток позволяет отнести их к категории больших гранулярных (зернистых) лим> фоцитов. Число таких клеток составляет в среднем 1,5>3%, достигая в отдель> ных случаях 11>14%. В популяции лимфоидных клеток наблюдались также и дру> гие клеточные формы, не встречающиеся обычно в периферической крови в норме. К их числу можно отнести лимфоциты с выраженной фрагментацией ядер, вследствие чего они иногда оказываются почти полностью разделенными на отдельные части. Подобные клетки в единичном количестве обнаруживают> ся почти у всех животных из точки 4, и особенно заметны, достигая 3>4 %, у животных из точки 2. Кроме того, в крови животных из точек 2 и 3 выявляются единичные лимфоциты с признаками плазматизации (эксцентрично располо> женное ядро, выраженное перинуклеарное пространство, резко базофильная цитоплазма), что свидетельствует об их активации. 5) В крови животных из всех изученных групп отмечается тенденция к по> вышенному содержанию моноцитов. Необходимо отметить, что у значитель> ной части моноцитов, особенно у животных из точек 2, 3 и 4, наблюдалась вакуолизация цитоплазмы, а также грубые азурофильные включения, что при> давало этим клеткам сходство с макрофагами. Наблюдаемые изменения мо> 136 гут свидетельствовать о повышении фагоцитарной активности моноцитов, приводящей впоследствии к нарастанию дегенеративных процессов и гибели клеток. 6) Среди форменных элементов периферической крови у животных из то> чек 2, 3 и 4 обнаруживаются (иногда в заметных количествах > свыше 10%) клетки с патологически фрагментированным ядром и одновременно явлени> ями кариолизиса. Возможно, морфология таких клеток обусловлена наруше> ниями процесса сегментации нейтрофильных миелоцитов, либо связана с фрагментацией (и распадом) ядер агранулоцитов. Обобщая приведенные выше отклонения морфологического состава пе> риферической крови, можно прийти к заключению, что наибольшие отклоне> ния от нормы выявляются в точке 3, а также в точках 2 и 4; точка 5 может счи> таться относительно чистой. Необходимо отметить, однако, что среди 15 жи> вотных, отловленных в точке 3, выявляется группа из 5 животных, у которых каких>либо заметных отклонений в периферической крови не обнаружено, что, возможно, объясняется неравномерным загрязнением этой территории. Общая оценка иммунного статуса Результаты получены Е.И.Исаевой, Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАН. Объектом исследования явилась периферическая кровь мышей в четырех группах из точек 2 (5 особей малой мыши Apodemus uralensis и 4 особи рыжей полевки Clethrionomys glareolus, выловленных 30 мая 1994 г., а также 4 особи A. uralensis и 4 особи Cl. glareоlus, пойманных 10 июня 1994 г.). Группа живот> ных, обитающих в точке 3, состояла из шести малых мышей и пяти рыжих по> левок. Группа животных из точки 4 включала 15 особей A. uralensis. Пять жи> вотных A. uralensis представляли точку 5. Показатели иммунного статуса каждой группы сопоставляются между собой и с показателями условно>контрольных групп животных из точек 4 и 5. В таблице 10 представлены результаты изучения иммунного статуса мы> шевидных грызунов, обитающих в разных экологических зонах. При анализе иммунограмм исследуемых групп животных выявлены суще> ственные различия как в составе популяций клеток, так и в состоянии иммун> ной системы. Прежде всего необходимо отметить более низкое количество лейко> цитов у животных из точек 2 и 3 по сравнению с выборками из точек 4 и 5. Лейкопения у животных, обитающих в точках 2 и 3, обусловлена нейтро> пенией, умеренно выраженной лимфопенией, при снижении содержания Т>лимфоцитов, В>лимфоцитов, Т>хелперов, адгезивной и фагоцитарной активности нейтрофилов и значительном повышении количества нулевых клеток. Анализ иммунограмм двух видов грызунов в разных экологических усло> виях обитания показал различный характер реакции на воздействие внешней среды. Если сравнить иммунограммы животных, обитающих в точке 2, то вид> но, что A. uralensis, по>видимому, либо подвергаются меньшим нагрузкам со 137 Таблица 10. Среднее число лейкоцитов (109/л L, X±m) у малой мыши (Apodemus uralensis) и рыжей полевки (Clethrionomys glareolus) в выборках из разных точек (2>5). В скобках приведены минимальные и максимальные значения. Вид Tочка 2 Точка 3 Точка 4 Точка 5 A. uralensis 3,93±0,32 (2,7>4,7) 1,79±0,22 (1,3>2,7) 5,63±0,23 (4>6) 5,67±0,27 (4>7) Cl. glariolus 2,36±0,26 3,65±0,35 (1,3>3,4) (2,7>4,1) стороны внешней среды, либо более устойчивы к воздействию неблагоприят> ных факторов, чем Cl. glareolus . В то же время характер наблюдаемых изменений у A.uralensis и Cl. glareolus , выловленных в точке 2, был од> нотипным. На фоне лейкопении установлены отклонения в содержании нейтрофилов — их количество понижено по сравнению с животными из точки 5. Обнаружено также снижение абсолютного числа лимфоцитов, сдвиг в сторону большего содержания нулевых клеток. На фоне измене> ния формулы крови наблюдалась тенденция к понижению функциональ> ной активности и количеств Т>лимфоцитов, Т>хелперов, абсолютного числа В>лимфоцитов, фагоцитирующей и адгезивной активности нейт> рофилов. Указанные изменения в иммунограмме свидетельствуют о наличии вто> ричной иммунологической недостаточности. Все эти признаки в сумме указы> вают на резкое угнетение иммунной системы организма. Та же картина наблюдается у A. uralensis и Cl. glareolus, обитающих в точ> ке 3. У животных этой группы отмечена лейкопения, обусловленная низким содержанием нейтрофилов, низкое содержание Т>лимфоцитов и В>лимфо> цитов, а также уменьшение числа Т>хелперов, адгезивной и фагоцитарной активности нейтрофилов, повышение содержания нулевых клеток. Однако, индекс напряженности превышал фоновое значение (2,6>3,2, при среднем показателе 2,9). Сочетание фактора уменьшения адгезивной активности ней> трофилов с высоким индексом нагрузки свидетельствует об активации им> мунной системы. Изменения в иммунограмме животных, обитающих в точке 4, связаны толь> ко со снижением числа лимфоцитов. Таким образом, наибольшие изменения выявлены у животных, обитаю> щих в точке 2, у которых наблюдаются симптомы вторичного иммунодефици> та. В менее экстремальных условиях обитания находятся животные из точки 3, у которых тем не менее отмечена та же тенденция к изменению иммунограм> мы. Точка 4 более благоприятна для обитания. Оценка функциональной активности иммунной системы В работе использовались рыжие полевки и малые мыши, отловленные в точках 2, 3, 4 и 5. Кроме того, животные из точки 2 были разбиты на 2 группы и исследованы дважды: через 5 и 14 суток после привоза. 138 Активность фактора некроза опухолей (ФНОα) Появление в сыворотке ФНОα является одним из наиболее ранних и дос> товерных показателей активации клеток макрофагального ряда. В нормаль> ных условиях ФНОα в сыворотке не обнаруживается. В данном эксперименте изучались сыворотки животных двух видов: Cl. glareolus и A. uralensis. Сыворотки от взрослых самцов смешивали по 2 или 3 образца в одну пробу. Из точки 3 поступил материал только от самок, поэто> му сравнивать результаты, полученные на сыворотках животных из точки 3, с остальными результатами неправомерно. Сравнению подлежали лишь резуль> таты, полученные на животных из точек 2, 4, и 5. Забор сывороток осуществ> лялся дважды: первый раз — на 5 день после поступления животных в лабора> торный виварий, второй раз — через 9 дней после первого эксперимента. В результате проведенных исследований было установлено, что ФНОα ре> гистрируется в сыворотке животных только одного из исследованных видов (Cl. glareolus) в точке 2 — 40,7±0,01 ед/мл в первом эксперименте и в точке 4 — 80±0,012 ед/мл во втором эксперименте (табл. 11). Полученные результаты позволяют сделать вывод, что рыжие полевки, по> видимому, более чувствительны к воздействию исследуемых факторов внеш> ней среды, чем малые мыши. Таблица 11. Активность ФНО в сыворотках грызунов, отловленных на территориях с разной сте> пенью загрязнения. Точки Вид Активность ФНО (усл.ЕО) Эксперимент №1 2 A. uralensis 0 2 Cl. glareolus 40,7±0,01 2 A.uralensis 0 Эксперимент №2 2 Cl. glareolus 0 3 A.uralensis 0 3 Cl. glareolus 0 4 A.uralensis 0 4 Cl. glareolus 80,0±0,012 Масса тимуса Существенных различий в массе тимуса у мышей A.uralensis из разных то> чек выявлено не было (табл.12). У рыжих полевок (табл. 13) из точки 2 масса тимуса не отличалась от массы тимуса, наблюдаемой у животных точки 4, толь> ко после 9>дневного содержания в виварии. Тимусы животных из точки 3 были несколько меньше тимусов полевок точки 4. 139 Таблица 12. Пролиферативная активность спленоцитов (имп/мин) и масса тимуса (мг) малых мышей (Apodemus uralensis) из разных точек (2>5). № точки 2 (5 дней после завоза) Включение 3Н>тимидина (имп/мин) Среда Конканавалин А Липополисахарид 6194±1135 68993±8669 (11,1)* 17975±4029 (2,9) 70426±6658 (11,5) Масса тимуса 47±1,6 2 (14 дней после завоза) 6146±1297 19643±2456 (3,2) 53±5,7 3 10266±1593 128380±5804 (12,5) 29390±5256 (2,9) 43±3,9 4 26030±4116 130089±8142 (5,0) 38327±2900 (1,5) 35±1,7 5 14855±2244 123865±5127 (8,3) 42905±6375 (2,9) 39±4,5 * В скобках дан индекс стимуляции Таблица 13. Пролиферативная активность спленоцитов (имп/мин) и масса тимуса (мг) рыжих полевок (Clethrionomys glareolus) из разных точек (2>4). Включение 3Н>тимидина (имп/мин) Среда Конканавалин А Липополисахарид Масса тимуса 2 (5 дней после завоза) 20997±1711 211542±16766 (10,1)* 44240±4864 (2,1) 43±6,3 2 (14 дней после завоза) 20130±2002 77±11,0 № точки 147784±8032 (7,3) 18029±1583 (0,9) 147272±6774 (6,7) 24807±3788 (1,1) 61±1,4 40083±3659 173372±4959 (4,3) 32951±2525 (0,8) 73±7,8 3 21858±2684 4 * В скобках дан индекс стимуляции Пролиферативная активность лимфоцитов Спонтанная пролиферация спленоцитов У животных исследованных видов наблюдаются примерно одинаковые изменения спонтанной пролиферации спленоцитов в 4 изученных точках (табл. 12, 13). Наиболее сильная пролиферация зарегистрирована в точке 4, наи> более слабая — в точках 2 и 3. Следует отметить, что эксперименты, проведенные через 5 и 14 суток после привоза грызунов, дали идентичные результаты. Индуцированная пролиферация (реакция бласттрансформации) Способность реагировать на Т>клеточный митоген у малых мышей (A. uralensis), выловленных в 3, 4 и 5 точках, была примерно одинаковой, тог> да как у мышей, выловленных в точке 2, ответ был достоверно подавлен и не восстанавливался в течение 9 суток содержания в лабораторном виварии. Эти данные указывают на возможное нарушение Т>звена иммунитета у животных, обитающих в точке 2. У рыжих полевок из точек 2 и 3 реакция спленоцитов на конканавалин А была также ниже реакции спленоцитов полевок из точки 4, причем после де> вятидневного содержания животных из точки 2 в виварии ответ их спленоци> тов на КонА снижался, что подтверждает их большую чувствительность к не> благоприятным воздействиям внешней среды, либо свидетельствует о боль> шей загрязненности среды их обитания. 140 Таблица 14. Индексы отклонений значений ряда иммунологических показателей млекопитаю> щих (C.g.— рыжая полевка, Clethrionomys glareolus, и A.u.— малая мышь, Apodemus uralensis) из раз> ных точек (2>4). Исследуемые параметры Спонтанная Точки пролиферация Кон А масса тимуса ЛПС C.g. Средний ИО (X±m) A.u. C.g. A.u. C.g. A.u. C.g. A.u. 2 7,6 4,8 4,7 1,5 5,3 4,5 3,4 4,1 4,4±0,7 3 3,9 4,5 0,1 1,5 2,3 2,5 2,2 1,6 2,3±0,5 4 4,3 > 0,4 — 1,2 — 1,1 — 1,8±1,0 Липополисахарид (ЛПС) — более слабый стимулятор лимфоцитов, чем конка> навалин А. Поэтому на фоне высокой спонтанной пролиферативной активности лимфоцитов часто не удается получить высокий индекс стимуляции. В то же время отсутствие подавления спонтанной пролиферации после добавления в культуру липополисахарида может указывать на то, что спонтанно пролиферируют главным образом нечувствительные к липополисахариду клетки (т.е. Т>лимфоциты). Наиболее слабая реакция на липополисахарид выявлена у животных из 2 и 3 точек, причем у рыжих полевок через 9 суток после пребывания в виварии ответ на ЛПС полностью отсутствовал, а у малых мышей в аналогичных усло> виях, он, напротив, несколько усиливался. Оценка общего состояния территорий производилась по формуле: ИО=10 (к>о)/к, где к — значение исследуемого параметра в контрольной точке 5, о — значение того же параметра в опытной точке, ИО — индекс отклонения пара> метра от условной нормы. В точках, принятых за контроль, ИО не превышает (по данным, полученным в различных районах России и Украины) 1,88±0,33. Включить данные по ФНОα в анализ не представляется возможным. Данные, полученные при анализе остальных параметров, приведены в табл. 14. Таким образом, особенно сильные отклонения от нормы выявлены в точ> ке 2, в точке 4 ситуация не отличается от контрольных значений. Полученные данные позволяют сделать следующие выводы. Экологичес> кие условия в точке 2 оказывают иммунодепрессирующее воздействие на спон> танный пролиферативный потенциал спленоцитов мышевидных грызунов, а также на функциональную активность Т> и В> лимфоцитов. В точках 4 и 3 ста> тистически значимых сдвигов в иммунной системе по сравнению с конт> рольным уровнем не наблюдается. Физиологический подход. Оценка процессов роста Результаты получены Г.А.Клевезаль, Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН. Малая мышь (Apodemus uralensis) Исследованы верхние резцы малой мыши (Apodemus uralensis). Обьем выборок на исследованных участках составил: точка 2 — 19 особей, точка 3— 17 особей, точка 4 — 20 особей и точка 5 — 20 особей. 141 Таблица 15. Возрастной соста выборок малой мыши (Apodemus uralensis) из разных точек (2>5). Точки Общее кол>во Возрастные группы 1>2 3>4 5>6 8 6 5 2 19 3 5 6 6 17 4 10 3 7 20 5 12 6 2 20 Возрастной состав исследованных выборок представлен в таблице 15. Воз> растные группы были выделены по степени стертости коренных зубов. Различия даже наиболее различающихся распределений 3>го и 5>го стати> стически не значимы (r=0,93; I=5,14; p>0,05). Ширина предентина у всех мышей была больше в лабиально>латеральной части полости пульпы. Распределения балльных оценок даны в табл. 16. Сходство между распределениями невелико, распределение 2 статисти> чески значимо отличается от всех остальных распределений: r2>3 = 0,74; I = 16,6; p<0,01 r2>4 = 0,59; I = 29,42; p<0,01 r2>5 = 0,74; I = 13,44; p<0,05. По среднему баллу на особь четко объединяются группы 2+3 и группы 4+5. Различия между ними статистически значимы (t=5,77, p<0,001). Интерглобулярный дентин либо отсутствовал, либо был выражен в малой, сред> ней, редко в большой степени. Распределения балльных оценок даны в табл. 17. Хотя по среднему баллу на особь группы 2 и 5 не различаются, они все же значимо различаются по распределению оценок: r = 0,76; I = 17/4; p<0,05. Нет различий по средним показателям и между объединенными выборка> ми 2+3 и 4+5 (t=0,24). Суточные слои в целом были хорошей контрастности. Распределения бал> льных оценок степени четкости слоев в разных группах дано в таблице 18. Таблица 16. Распределения балльных оценок ширины предентина выборках малой мыши (Apodemus uralensis) из разных точек (2>5). Точки 2 142 Средний балл на особь Баллы 0 1 2 3 4 5 6 6 5 3 5 > > > 1,37 3 7 3 3 2 2 > > 1,35 4 2 0 4 4 3 7 0 3,35 5 1 2 2 8 3 2 2 3,20 Таблица 17. Распределения балльных оценок наличия интерглобулярного дентина выборках малой мыши (Apodemus uralensis) из разных точек (2>5). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 2 4 3 1 3 0 3 3 1 1 > > > Средний балл на особь 3,26 3 2 > 2 1 4 2 3 1 1 > > 1 4,53 4 1 3 1 1 6 3 3 1 1 > > > 4,00 5 5 1 2 2 2 > 4 > 1 > 1 > 3,42 Точки Баллы Выборки 2 и 5 значимо не различаются (t=0,69), но значимые различия обнаружены между объединенными выборками 2+3 и 4+5 (t=2,03, p<0,05). Ширина суточных слоев варьировала от 10 до 16,6 мкм, средние значения для разных точек различались незначительно (табл. 19), но все же значимые различия обнаружены между объединенными выборками 2+3 и 4+5 (t=2,70, p<0,05). У некоторых особей были обнаружены узкие, шириной в 1>2 суточных слоя, полоски усиленной, акцентированной, окраски (по типу кальцио>травмати> ческой реакции дентина), от 0 до 4 полос у одной особи. Они встречались не часто, но все же чаще в выборках 2 и 3, чем в выборках 4 и 5 (табл. 20). Различия между выборками 2 и 5 статистически значимы (t=1,98, p<0,05). Патологические изменения дентина были обнаружены только у 1 особи, из выборки 4. У нее были изменены форма полости пульпы, наружная поверх> ность зуба, направление дентиновых канальцев. При этом не отличались от среднего ни четкость, ни ширина суточных слоев. Ширина предентина в норме варьирует от половины до полной шири> ны суточного слоя. Очень малая ширина предентина свидетельствует об уг> нетении аппозиционной активности одонтобластов, большая ширина пре> дентина связана с нарушением процесса нормальной его кальцинации. Принимая нашу балльную оценку, при данной ширине суточных слоев сред> няя ширина предентина должна была бы быть равной 4 баллам. Ширина предентина у мышей в точках 2 и 3 существенно меньше, а ширина у мы> шей в точках 4 и 5 приближается к нормальной. Различия между этими дву> Таблица 18. Распределения балльных оценок степени четкости суточных слое в выборках малой мыши (Apodemus uralensis) из разных точек (2>5). 11 Средний балл 12 на особь Баллы Точки 3 4 5 6 7 8 9 10 2 > 2 2 5 6 2 1 > 1 > 6,60 3 1 6 5 3 2 > > > > > 5,23 4 2 1 1 3 7 > 2 2 1 1 7,15 5 > 2 3 9 2 1 > 2 > > 6,26 143 Таблица 19. Ширина суточных слоев (латеральная + медиальная стенки резца), мкм, в выбор> ках малой мыши (Apodemus uralensis) из разных точек (2>5). Точки n X σ 2 13 11,48 1,14 3 21 11,66 1,42 2+3 34 11,66 1,28 4 27 12,76 1,85 5 32 12,26 1,46 4+5 59 12,49 1,65 мя группами выборок статистически значимы (t=5,77; p<0,001). Полученный результат дает основание говорить о некотором угнетении аппозиционной деятельности одонтобластов в точках 2 и 3. Это должно было бы привести к заметному уменьшению ширины суточных слоев у особей из этих точек, по> скольку ширина суточных слоев является показателем интенсивности и про> лиферационного, и аппозиционного роста резцов. Однако, ширина суточных слоев различалась мало, хотя и отмечено статистически значимое ее умень> шение в точках 2+3. Статистически значимо, выборки 2+3 и 4+5 различались по четкости (контрастности) суточных слоев, которая отражает четкость суточ> ного ритма роста скелета. В точках 4+5 четкость слоев была несколько выше. Различий по количеству интерглобулярного дентина не выявлено. Следовательно, между более загрязненными точками (2+3) и менее заг> рязненными (4+5) не выявлено различий в характере кальцинации, но выяв> лено слабое угнетение ростовых процессов в точках 2+3. Четкий градиент, параллельный градиенту загрязнения, прослеживался в увеличении частоты встречаемости акцентированных полос дентина аналогич> ных кальцио>травматической реакции дентина. Кальцио>травматическая ре> акция дентина > явление известное в одонтологии как неспецифический ответ дентина на широкий спектр воздействий, включая хирургическую травму зуба, резкое изменение уровня гормона в крови, введение ряда химических веществ в организм. Характер этих полос у мышей свидетельствует о сильном, но крат> ковременном стрессирующем воздействии, гормональном или химическом. Таблица 20. Частота встречаемости акцентированных полос в выборках малой мыши (Apodemus uralensis) из разных точек (2>5). 144 Точки n X σ 2 19 0,63 1,26 3 17 0,47 0,62 4 20 0,25 0,44 5 20 0,05 0,22 Млекопитающие (малая мышь, Apodemus uralensis) с участков с большим загрязнением показали статистически значимое угнетение процессов роста. Кроме того, выявлено увеличение частоты случаев кратковременных сильных стрессирующих воздействий на мышей по мере увеличения степени загрязне> ния места взятия выборки. *** Оценка проводилась для двух видов млекопитающих при использовании ряда подходов. Результаты большинства использованных подходов дают до> статочно четкую картину происходящих изменений. По большинству парамет> ров у обоих видов обнаружены значительные различия между выборками из разных точек. Анализ популяций млекопитающих в первую очередь базиро> вался на интегральной характеристике состояния организма по стабильности развития. Результаты, полученные для выборок из точек 2 и 3, расположенных вблизи предприятий, по большинству признаков статистически значимо от> личаются от результатов, полученных для выборок из точек 4 и 5 (условный контроль). Степень изменения состояния млекопитающих в точках 2 и 3 соот> ветствует 4 баллу пятибалльной шкалы отклонения от нормы (сильное откло> нение от нормы), ситуацию в точках 4 и 5 можно охарактеризовать первым баллом (нормальное состояние).Использование генетических тестов (частота аберраций хромосом и микроядерный тест) также свидетельствует о небла> гополучной ситуации в точках 2 и 3 (3>4 балл пятибалльной шкалы отклоне> ния от нормы), где наблюдается повышенная мутагенная активность. Различия между выборками 2+3 и 4+5 наблюдаются даже по показателям ростовых процессов, которые отличаются несколько меньшей чувствительно> стью по сравнению с другими показателями, их изменения имеют место лишь при существенном отклонении в состоянии организма. Заключение по наземным экосистемам Оценка, проведенная для растений и млекопитающих, свидетельствует о наличии серьезных негативных последствий воздействия города Чапаевска для здоровья среды. Эти изменения значительны (достигая критического пятого балла пятибалльной шкалы отклонений от нормы у растений). Этот пример демонстрирует одну из самых высоких степеней отклонения от нормы за всю нашу практику проведения таких оценок. ВОДНЫЕ ЭКОСИСТЕМЫ Характеристика водных экосистем проводилась по модельным фоновым видам: • рыб; • земноводных. Оценка водных экосистем проводилась в 5 базовых точках (см. раздел ме> ста взятия проб). 145 РЫБЫ Оценка состояния популяций рыб проводилась с использованием двух подходов: • морфологического (оценка уровня стабильности развития); • цитогенетического (микроядерный тест). В качестве дополнительных характеристик были использованы тесты: • тест Эймса на мутагенную активность; • гистология репродуктивной системы. В качестве модельных обьектов были использованы два вида рыб: • лещ (Abramis brama); • плотва (Rutilus rutilus). Стабильность развития Стабильность развития оценивали по уровню флуктуирующей асимметрии. Лещ (Abramis brama) Объем выборок составил в точке 1 (р. Чапаевка, створ выше города) — 20 особей, в точке 2 (городская зона отдыха) — 14 особей, в точке 3 (участок реки рядом с предприятием) — 13 особей, в точке 4 (место сброса сточных вод пред> приятия) — 22 особи, в точке 5 (р. Чапаевка, створ ниже города) — 20 особей. Для оценки стабильности развития леща (Abramis brama) были использованы 7 меристических признаков (Захаров и др., 2000). Признаки 1>7, количество: 1 — лучей в грудных плавниках (17)*; 2 — лучей в брюшных плавниках (9); 3 — лучей в жаберной перепонке (3); 4 — жаберных тычинок на 1>й жаберной дуге (24>25); 5 — глоточных зубов (5); 6 — чешуй по боковой линии (прободенных сенсорными канальцами) (52>54); 7 — чешуй по боковой линии, до конца чешуйчатого покрова(52>54). *В скобках указана условная «норма» (наиболее обычное значение или диапазон значений при> знака), отклонения от которой учитывались как мелкие фенодевианты. Дисперсия асимметрии для большинства признаков у леща оказалась ниже в выборках из обоих условно>контрольных точек (точки 1 и 2), чем в осталь> ных. Значения дисперсий у рыб из точки 3 для всех признаков выше (по трем признакам значимо, p<0,01), чем в условно контрольных точках. Суммы ран> гов (в соответствии с критерием Фридмана) для дисперсий в точках 1>5 оказа> лись, соответственно: 13>12>30>22>28; (χ2=15,8; p<0,01). Два интегральных показателя стабильности развития (средняя частота асим> метричного проявления на признак и средняя величина асимметрии) обнаружи> вают сходную тенденцию: их величина возрастает от условно>контрольных точек 146 Стабильность развития Рисунок 9. Величина интегрального показателя стабильности развития (средняя частота асим> метричного проявления на признак) в выборках леща (Abramis brama) из разных точек (1>5). Точки: точка 1 — створ выше города (первый створ), р. Чапаевка; точка 2 — городская зона отды> ха, озеро Ильмень; точка 3 — участок р. Чапаевка, примыкающий к заводу химических удобрений; точка 4 — район сброса сточных вод в р. Чапаевка (второй створ); точка 5 — створ ниже города (тре> тий створ), р. Чапаевка. (точки 1 и 2) к точкам 3>5 (рис. 9, табл. 21). По обоим интегральным показателям выборка леща из точки 1 (контроль) значимо отличается (p<0,01) от точек 3, 4, 5. По пятибалльной шкале оценки изменения состояния организма по ста> бильности развития ситуация в точке 1 может быть охарактеризована как ус> ловно нормальная (1 балл), в точке 2 как отклоняющаяся от нормы (3 балл) и в точках 3>5 как критическая (5 балл). По среднему числу мелких фенодевиантов точка 1 (контроль), а также точ> ки 4 и 5 статистически значимо отличаются от точки 3 (p<0,05). Плотва (Rutilus rutilus) Общий объем выборок составил в точке 1 — 17 особей, в точке 2 — 23 особи, в точке 3 — 20 особей, в точке 4 — 10 особей, в точке 5 — 20 особей. Таблица 21. Величина интегральных показателей стабильности развития (средняя частота асим> метричного проявления на признак — А, средняя величина асимметрии на признак — Б и среднее чис> ло мелких фенодевиантов на признак — В) в выборках леща (Abramis brama) из разных точек (1>5). Точка А Б В 1 0,27±0,04 0,41±0,09 0,54±0,08 2 0,38±0,05 0,60±0,10 0,70±0,06 3 0,50±0,04 0,96±0,10 0,90±0,08 4 0,49±0,03 0,95±0,08 0,69±0,05 5 0,46±0,04 0,95±0,15 0,66±0,07 147 Для оценки стабильности развития плотвы (Rutilus rutilus) были использованы 6 меристических признаков (Захаров и др., 2000). Признаки 1>6 — количество: 1 — лучей в грудных плавниках (17>18)*; 2 — лучей в брюшных плавниках (9); 3 — лучей в жаберной перепонке (3); 4 — жаберных тычинок на первой жаберной дуге (12); 5 — чешуй по боковой линии ( прободенных сенсорными канальцами) (41>42); 6 — чешуй по боковой линии, до конца чешуйчатого покрова (40>43). *В скобках указана условная «норма» (наиболее обычное значение или диапазон значений при> знака), отклонения от которой учитывались как мелкие фенодевианты. Дисперсии асимметрии по всем признакам оказались выше в выборках из точек 3 и 5, чем в точках 1 и 2 (значимо выше (p<0,05) не более, чем по 2 признакам). При использовании непараметрического критерия Фридмана асимметрия в популяции выражается суммой ранжированных значений дис> персий асимметрии. Для популяций из точек 1>5 эти значения были: 17>18>23> 9,5>22,5 (χ2 = 8,04, df>4, p>0.05). Низкая сумма рангов для точки 4 может быть следствием малого объема выборки (10 экз.). Два интегральных показателя стабильности развития (средняя частота асим> метричного проявления на признак и средняя величина асимметрии) обнаружи> вают сходную тенденцию: их величина минимальна в условно>контрольной точке Стабильность развития Рисунок 10. Величина интегрального показателя стабильности развития (средняя частота асим> метричного проявления на признак) в выборках плотвы (Rutilus rutilus) из разных точек (1>5). Точки: точка 1 — створ выше города (первый створ), р. Чапаевка; точка 2 — городская зона отды> ха, озеро Ильмень; точка 3 — участок р. Чапаевка, примыкающий к заводу химических удобрений; точка 4 — район сброса сточных вод в р. Чапаевка (второй створ); точка 5 — створ ниже города (тре> тий створ), р. Чапаевка. 148 Таблица 22. Величина интегральных показателей стабильности развития (средняя частота асим> метричного проявления на признак — А, средняя величина асимметрии на признак — Б и среднее чис> ло мелких фенодевиантов на признак — В) в выборках плотвы (Rutilus rutilus) из разных точек (1>5). Точка А Б В 1 0,24±0,03 0,35±0,08 0,53±0,07 2 0,41±0,04 0,56±0,06 0,51±0,04 3 0,50±0,03 0,67±0,06 0,95±0,05 4 0,43±0,04 0,55±0,07 0,52±0,05 5 0,38±0,05 0,68±0,10 0,57±0,06 1 и возрастает в точках 2>5 (рис. 10, табл. 22). По обоим интегральным показателям выборка плотвы из точки 1 (контроль) значимо отличается (p<0,05) от точек 3, 4, 5. По пятибалльной шкале оценки отклонений состояния организма по ста> бильности развития ситуация в точке 1 может быть охарактеризована как условно>нормальная (1 балл), в точке 2 как существенно отклоняющаяся от нормы (4 балл), в точке 3 как критическая (5 балл), в точке 4 как суще> ственно отклоняющаяся от нормы (4 балл), в точке 5 как отклоняющаяся от нормы (3 балл). Другой интегральный показатель стабильности развития — среднее число мелких фенодевиантов также оказался значимо выше (p<0,01) в выборке из точки 3, чем в других исследованных точках (точки 1, 2, 4 и 5). Морфологический анализ выявил нарушения стабильности развития у изу> ченных рыб в точках 2>5, по сравнению с точкой 1, расположенной выше г. Ча> паевска по течению и условно рассматриваемой в качестве контрольной. В бал> льном выражении по пятибалльной шкале отклонения от нормы ситуация для всех исследованных видов в условно>контрольной точке 1 соответствует норме (1 балл), в точках 3, 4 и 5 субкритической или критической (4>5 балл). Анализ стабильности развития у плотвы и леща, показал что, в точке 2 (оз. Ильмень) использовавшейся в качестве условного контроля, рыбы характе> ризуются существенными отклонениями некоторых показателей от нормы, соответствующими 3>4 баллам. Цитогенетический гомеостаз. Микроядерный тест Результат получен С.Т. Захидовым, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет. Микроядерный тест проводился для одного вида рыб. Лещ (Abramis brama) Анализ проводился для выборок из трех точек: 1, 3 и 5. В каждой точке ис> следовалось по 10 особей. Данные представлены на рис. 11 и в табл. 23. Мутагенная активность всех использованных проб относительно невысока и находится в пределах услов> 149 Цитогенетический гомеостаз Рисунок 11. Частота эритроцитов с микроядрами, в ‰, в периферической крови леща (Abramis brama) из разных точек (1, 3, 5). Точки: точка 1 — створ выше города (первый створ), р. Чапаевка; точка 3 — участок р. Чапаевка, примы> кающий к заводу химических удобрений; точка 5 — створ ниже города (третий створ), р. Чапаевка. ной нормы. Повышенной мутагенной активностью среди сравниваемых вы> борок выделяется точка 1, расположенная выше по течению реки, относитель> но города, что свидетельствует о неблагополучном общем фоновом состоя> нии в исследуемом регионе. В целом, полученные результаты согласуются с данными другого теста — теста Эймса об отсутствии явного мутагенного эффекта в точках 3 и 5. Оценка мутагенной активности. Тест Эймса Результаты получены С.В.Котелевцевым, МГУ им. М.В.Ломоносова, биологический факультет. Наименее информативным объектом с точки зрения накопления мутаген> ных соединений из водной среды является плотва. Она накапливает в основ> ном прямые мутагенные соединения типа сдвига рамки считывания, которые имеются в акваториях 2 — 5 точек (ТА 98), и типа замены оснований (ТА 100) — в 4 точке. Промутагенные соединения в тканях кишечника плотвы обнаруже> ны на обоих тестерных штаммах в 4 точке. Лещ аккумулирует прямые мутагены во всех исследуемых точках (ТА 98) и в 4 точке прямые мутагены типа замены оснований (ТА 100). Промутагенные ксенобиотики обоих типов накапливаются в тканях кишечника леща практи> чески во всех исследуемых точках. Это отличие, по>видимому, можно объяс> нить особенностями питания этого вида рыбы. 1. Во всех пяти обследованных точках в тканях рыб обнаружены прямые и промутагенные ксенобиотики. 2. Накопление прямых мутагенов (ТА 98 и ТА 100) в тканях кишечника плотвы и леща пяти исследуемых точек акваторий г.Чапаевска происходит 150 Таблица 23. Частота эритроцитов с микроядрами, в ‰, в периферической крови лещей (Abramis brama) из разных точек (1, 3, 5). В скобках указаны абсолютные значения. Точки 1 3 5 Число особей 10 10 10 Число клеток 30000 30000 28000 Частота микроядерных клеток 3,4 (103) 1,80 (55) 1,90 (55) сходным образом. Прямые мутагены типа замены оснований (ТА 98) об> наруживаются во всех пяти точках, а мутагенная активность тестерного штамма ТА 100 выявлена только в точке 4. 3. Промутагенные ксенобиотики аккумулируются в значительном ко> личестве только у лещей и во всех пяти исследуемых точках. В кишечни> ке плотвы промутагенные соединения (ТА 100) накапливаются только в точке 4. 4. Во всех пяти обследованных точках обнаружены прямые и прому> тагенные ксенобиотики; наиболее загрязненной можно считать точку 4. Гистология репродуктивной системы Результаты получены Н.В.Акимовой, Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н.Северцова РАН. На основании детального морфологического исследования состояния гонад и половых клеток у разных видов рыб — плотвы (Rutilus rutilus), крас> ноперки (Scardinius erythrophtalmus), леща (Abramis brama), выловленных в различных местах (точках) их обитания, можно сделать следующее зак> лючение: 1. Наибольшее количество различных нарушений в гамето> и гонадогенезе в одних и тех же точках обнаружено у плотвы, наименьшее — у леща. Возмож> но, это связано с тем, что среди лещей в основном были молодые, неполовоз> релые особи с гонадами на ранних стадиях развития. По нашим наблюдениям обычно различным нарушениям наиболее подвержены более продвинувши> еся в своем развитии половые клетки. 2. В точке 1 меньше трети самок плотвы (две из семи) имели отклонения от нормального развития гонад и половых клеток: большое количество остаточ> ной икры после нереста и дегенерация 8>10% ооцитов цитоплазматического роста следующей генерации половых клеток. У всех самцов плотвы отмеча> лись аномалии: лопастное строение семенников, локальное разрушение се> менных канальцев и лизис части сперматогониев. Среди самок и самцов леща только по одной особи (из шести каждого пола — 1/6 часть особей), у которых выявлены отклонения от нормального разви> тия: у самки было выметано только 19% икры; у самца были обнаружены не> большие локальные разрушения семенных канальцев и замещение генера> тивной части гонады соединительной тканью. 151 В точке 2 у двух самок плотвы (из шести) в гонадах отмечено наличие от 20 до 48% остаточных икринок, не выметанных при нересте. У четырех самцов плотвы (из пяти) выявлены локальные разрушения семенных канальцев и об> разование полостей, кроме того, наличие капсулированных образований в гонадах и их лопастное строение. У одной самки леща (из трех) около 50% ооцитов были деформированы, что служит показателем нарушения прочности их оболочек. У всех самцов леща — нормальное развитие гонад и половых клеток. В точке 3 у всех самок красноперки (7 экз.) были деформированы ооциты старшей генерации и у четырех из них отмечалась резорбция 6>13% желтко> вых ооцитов. У двух самцов красноперки (из трех) обнаружены локальные разрушения семенных канальцев и образование полостей в гонадах. У всех особей леща (пять самок и четыре самца) микроструктуры гонад и половых клеток были в норме. Следует отметить, что выявленные в гонадах единичных самок плотвы (в точках 1 и 4), а также самца леща (в точке 2) капсулы личинок паразитов мы не включили в аномалии. Однако в ихтиологической практике существует мне> ние, что заражению паразитами, как правило, в первую очередь подвергают> ся ослабленные особи. В точке 4 три из семи обследованных самок плотвы имели различные ано> малии в строении гонад и половых клеток: массовая резорбция желтковых ооцитов (90%), дегенерация части молодых ооцитов — цитоплазматического роста (11%), значительные скопления форменных элементов крови также сви> детельствуют о неблагополучном состоянии гонад. У самцов только у одной особи плотвы (из трех) выявлены небольшие отклонения от нормального раз> вития гонад. У самок и самцов леща отклонений от нормального развития гонад и по> ловых клеток не обнаружено. В точке 5 у всех самок плотвы и леща картина гамето> и гонадогенеза была нормальной. Однако у обоих обследованных самцов плотвы выявлено локаль> ное разрушение стенок семенных канальцев и образование в гонадах полос> тей, а также наличие капсулированных образований не выясненной природы. У одного самца леща (из четырех) было обнаружено замещение генератив> ной части гонады соединительной тканью. 3. Таким образом, как следует из вышеприведенных результатов морфологи> ческого исследования, во всех точках (местах обитания) присутствуют особи рыб с различными аномалиями в развитии половых клеток и желез, у одних их боль> шее количество, у других меньшее, что свидетельствует о неблагополучном су> ществовании этих популяций рыб. По степени уменьшения нарушений в разви> тии репродуктивной системы рыб места обитания (точки) можно распределить в следующем порядке: 4, 3, 2, 1, 5. При этом наиболее серьезные нарушения отме> чены в точке 4, затем в точке 3, при примерно сходной ситуации в точках 2, 1, 5. 152 *** Оценка проводилась для двух видов рыб при использовании ряда подхо> дов. Результаты большинства использованных подходов дают достаточно чет> кую картину происходящих изменений. По большинству параметров обнару> жены значительные отличия между исследованными точками. Анализ популяций рыб в первую очередь базировался на интегральной характеристике состояния организма по стабильности развития. Значимые различия между выборками рыб из точки 1 (условный контроль, первый балл по пятибалльной шкале отклонений) и выборками из других точек выявлены по большинству признаков. Степень отклонений в состоянии рыб от условной нормы во второй точке соответствует для разных видов третьему — четверто> му баллу пятибалльной шкалы отклонений от нормы (очевидное отклонение от нормы), в точке 3 (участок реки Чапаевка у завода химических удобрений) ситуацию можно охарактеризовать пятым баллом, в точке 4 (участок р. Чапа> евки в районе сброса сточных вод) отклонения соответствуют четвертому — пятому баллу (критическое состояние), в точке 5 (участок реки ниже города) диапазон отклонений больше — от третьего до пятого балла. В точках 3 и 4 обращает на себя внимание факт значительного возрастания частоты различ> ных как мелких, так и более существенных, отклонений от нормы в строении различных морфологических структур. Использование генетических тестов (микроядерный тест и тест Эймса) сви> детельствует о неблагополучии и условно>контрольных точек (1 и 2), где на> блюдается повышенная мутагенная активность. В то же время отсутствие яв> ного мутагенного эффекта в точках наибольшего загрязнения (3>5) свидетель> ствует о важности интегральной оценки здоровья среды, демонстрируя, что в ряде случаев крайне серьезное нарушение состояния организма может наблю> даться и при отсутствии явных генетических изменений и, напротив, повы> шенная мутагенная активность не всегда может иметь прямой эффект в изме> нении общего состояния организма. Ориентировочная оценка состояния репродуктивной системы свидетель> ствует о наличии определенных патологических изменений во всех исследо> ванных точках. При наиболее сильных нарушениях в точках 3 и 4. В то же вре> мя выявление определенных направленных различий требует специального длительного анализа путем сравнения достаточного материала по разным по> ловым и возрастным группам. В целом состояние популяций рыб, населяющих участок р. Чапаевка в чер> те города (точки 3 и 4) можно оценить как чрезвычайно неблагополучное вследствие сильной антропогенной нагрузки. Районы озера Ильмень (точка 2) и створа на р. Чапаевка ниже города (точка 5), хотя и в меньшей степени подвергаются антропогенному воздействию, также не могут быть признаны благополучными. 153 ЗЕМНОВОДНЫЕ Интегральная оценка состояния популяций проводилась с использовани> ем следующих подходов: • морфологического (оценка уровня стабильности развития); • цитогенетического (микроядерный тест); • иммунологического (общая оценка иммунного статуса и анализ морфоло> гии клеток периферической крови). Для характеристики экосистем в качестве модельного объекта был исполь> зован фоновый вид бесхвостых амфибий: • озерная лягушка (Rana ridibunda). Стабильность развития Оценку стабильности развития проводили по уровню флуктуирующей асимметрии. Озерная лягушка (Rana ridibunda) Объем выборок в точках составил: точка 1 — 10 особей; точка 2 — 14 особей; точка 3 — 11 особей; точка 4 — 9 особей. Для оценки стабильности развития были использованы 13 морфологических признаков (Заха> ров и др., 2000). 1 — число полос на бедре (0)*; 2 — число пятен на бедре (1>2); 3 — число полос на голени (0>2); 4 — число пятен на голени (2>3); 5 — число полос на стопе (2>4); 6 — число пятен на стопе (0>2); 7 — число пятен на спине (3>8); 8 — число белых островков на плантарной поверхности 2>го пальца (0); 9 — число белых островков на плантарной поверхности 3>го пальца (0); 10 — число белых островков на плантарной поверхности 4>го пальца (4>5); 11 — число пор на плантарной поверхности четвертого пальца (5>13); 12 — число зубов на межчелюстной кости (10>11); 13 — число зубов на сошнике (2>4). *В скобках указана условная «норма» (наиболее обычное значение или диапазон значений при> знака), отклонения от которой учитывались как мелкие фенодевианты. Дисперсии асимметрии оказались выше в точках 2, 3 (по 9 признакам) и 4 (по 10 признакам), чем в контрольной точке 1. Для двух признаков из точек 2 и 3 различия с контрольной точкой статистически значимы (p<0,01 и p<0,05). При использовании непараметрического критерия Фридмана об уровне асим> метрии в сравниваемых выборках можно судить по сумме ранжированных зна> чений дисперсий. Для популяций из точек 1> 4 эти значения были: 24 > 37 > 32 > 37. 154 Стабильность развития Рисунок 12. Величина интегральных показателей стабильности развития (средняя частота асиммет> ричного проявления на признак) в выборках озерной лягушки (Rana ridibunda) из разных точек (1>4). Точки: точка 1 — створ выше города (первый створ), р. Чапаевка; точка 2 — городская зона отды> ха, озеро Ильмень; точка 3 — участок р. Чапаевка, примыкающий к заводу химических удобрений; точка 4 — район сброса сточных вод в р. Чапаевка (второй створ). Данные по интегральным показателям стабильности развития хорошо со> гласуются с результатами анализа дисперсий асимметрии (рис. 12, табл. 24). Величина интегрального показателя стабильности развития (средняя час> тота асимметричного проявления на признак) оказалась наибольшей в точке 4 (место сброса сточных вод) (табл. 24, рис. 12). По пятибалльной шкале оценки отклонений стабильности развития от нормы ситуация здесь соответствует пятому баллу (критическое состояние). В условно>контрольных точках 1 и 2 уровень отклонений от нормы соответствует второму баллу, в точке 3 — тре> тьему баллу. Результаты, полученные для выборок из точек 1 и 2, статистичес> ки значимо ниже, чем в точках 3 и 4 (p<0,05). Сходные результаты получены и с помощью двух других интегральных пока> зателей. Средняя величина асимметрии на признак в выборке лягушек из точки 1 Таблица 24. Величина интегральных показателей стабильности развития (средняя частота асим> метричного проявления на признак — А, средняя величина асимметрии на признак — Б и среднее число мелких фенодевиантов на признак — В) в выборках озерной лягушки (Rana ridibunda) из раз> ных точек (1>4). Точка А Б В 1 0,51±0,04 0,68±0,06 0,48±0,08 2 0,50±0,04 0,79±0,07 0,76±0,06 3 0,55±0,04 0,76±0,09 0,69±0,06 4 0,66±0,04 0,89±0,11 0,76±0,11 155 ниже, чем в точках 2, 3 и 4. Количество мелких фенодевиантов также мини> мально в точке 1 (различия с точками 2 и 3 статистически значимы, p<0,05). Проведенная оценка свидетельствует о нарастании степени нарушения ста> бильности развития амфибий (от 2>го до 5>го балла) в градиенте возрастания загрязнения водоемов. Наиболее существенное нарушение стабильности раз> вития наблюдается в популяции, подверженной наиболее сильному антропо> генному воздействию. Причем уровень этих отклонений соответствует 5 бал> лу пятибалльной шкалы отклонений от нормы. Цитогенетический гомеостаз. Микроядерный тест Микроядерный тест проводили для одного вида земноводных. Озерная лягушка (Rana ridibunda) Микроядерный тест был проведен для выборок из трех точек, объем вы> борок при этом составил: в точке 1 — 11 особей, точке 2 — 8 особей, точке 3 — 12 особей. У каждой особи проанализировано по 2 000 эритроцитов. Были получены следующие результаты: в точке 1 частота клеток с микрояд> рами составила 3,00 ‰, в точке 2 — 1,50 ‰, в точке 3 — 5,33 ‰ (рис. 13). Были выявлены статистически значимые различия между всеми тремя вы> борками: 1>2 (p<0,01); 1>3 и 2>3 (p<0,001). Цитогенетический гомеостаз Рисунок 13. Частота микроядерных клеток, в ‰, в нормохромных эритроцитах (НХЭ) озерной лягушки (Rana ridibunda) из разных точек (1>3). Точки: точка 1 — створ выше города (первый створ), р. Чапаевка; точка 2 — городская зона отды> ха, озеро Ильмень; точка 3 — участок р. Чапаевка, примыкающий к заводу химических удобрений. 156 Иммунный статус В рамках иммунологического подхода проводилась общая оценка им> мунного статуса и морфологические исследования клеток периферической крови. Морфологические исследования клеток периферической кроE ви озерной лягушки (Rana ridibunda) Результаты получены В.И. Старостиным и Э.В. Чернышовой, Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН. Кровь получали пункцией сердца животных, вскрытых в лабораторных ус> ловиях. Использовали по 5>10 животных из каждой точки. Анализ лейкограмм периферической крови выявил заметное снижение процентного содержания клеток нейтрофильного ряда во всех изученных груп> пах (точки 1>3). Так, в точке 3 среднее число нейтрофилов оказалось суще> ственно меньше известных из литературы значений нормы (26,5%). У живот> ных из точки 2, а также из точки 1 отмечается еще более выраженная нейтро> пения, при которой число сегментоядерных нейтрофилов может достигать крайне низких значений — 0,5>1%. Вместе с тем наряду с падением общего числа нейтрофильных гранулоци> тов отмечается «сдвиг влево», т.е. присутствие незрелых форм — миелоцитов, юных и палочкоядерных нейтрофилов; число последних может достигать у отдельных животных значительных величин — до 7>10% (в точке 3). Необхо> димо отметить, что в популяции нейтрофильных гранулоцитов как среди зре> лых (сегментоядерных), так и молодых (юных и палочкоядерных) клеточных форм часто встречаются характерные патологические изменения в виде сет> чатой структуры цитоплазмы. У животных из точки 2, а также из точки 3 повышенным оказалось число эозинофилов — 10% и 13% соответственно (при норме 6%). Среди клеток эози> нофильного ряда нередки юные формы — эозинофильные миелоциты, встречающиеся примерно у половины животных из всех изученных точек. Чис> ло базофилов у животных всех изученных групп, особенно из точек 2 и 1, было снижено по сравнению с нормой, составляющей по литературным данным 23%. В крови животных из точки 2 обнаружено повышенное содержание моноцитов. Анализ лейкограмм показал также, что в периферической крови могут быть выявлены бластные формы в виде крупных лимфоидных клеток с резко выра> женной базофилией цитоплазмы. Подобные клеточные формы встречались в единичном количестве у животных из точки 1 и чаще (1>2%) — у животных из точки 2. Таким образом, проведенный цитоморфологический анализ периферичес> кой крови амфибий свидетельствует о том, что длительное обитание живот> ных в условиях интенсивного техногенного загрязнения приводит прежде всего к резкой нейтропении, вызванной, по всей вероятности, угнетением нейтро> фильного ростка гемопоэза. Вместе с тем наряду с изменениями деструктив> 157 ного характера наблюдаются и признаки активизации как процессов крове> творения (появление юных форм гранулоцитов, бластных клеток лимфоид> ного ряда), так и защитных свойств крови (эозинофилия, моноцитоз). Обобщая выявленные изменения морфологического состава перифери> ческой крови у исследованных животных, можно заключить, что влияние тех> ногенного загрязнения выражено в той или иной степени во всех исследован> ных точках. Общая оценка иммунного статуса озерной лягушки (Rana ridibunda) Результаты получены Е.И.Исаевой, Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского РАН. Объектом исследования явилась периферическая кровь озерной лягушки (Rana ridibunda). Были проанализированы выборки из точек 1, 2 и 3. Объем выборок в точках составил: точка 1 — 10 особей; точка 2 — 5 особей; точка 3 — 7 особей и дополнительно 8 особей остромордой лягушки (Rana arvalis). При рассмотрении иммунограмм лягушек установлен лейкоцитоз (табл. 25) в точке 1, обусловленный выраженным моноцитозом и умеренной эозино> филией при снижении количества нейтрофилов, способности нейтрофилов к фагоцитозу, снижении содержания Т>лимфоцитов и Т>хелперов, возрас> тании количества нулевых клеток. Увеличение количества моноцитов может рассматриваться как благоприятный симптом, но в связи с тем, что моноци> тоз сопровождается нейтропенией, эти изменения свидетельствует о возмож> ной интоксикации. Степень снижения фонового уровня индекса напряжен> ности (менее 2) у животных этой группы свидетельствуют о наличии вторич> ной иммунологической недостаточности, что указывает на угнетение иммун> ной системы организма. Иммунограммы лягушек из точки 2 отличаются меньшими негативными изменениями. У лягушек этой группы установлена лейкопения, обусловлен> ная понижением количества содержания нейтрофилов, лимфоцитов и уме> ренным повышением количества моноцитов и эозинофилов. Кроме того, от> мечено повышение содержания нулевых клеток и понижение адгезивной и фагоцитарной активности нейтрофилов. О нарушении баланса взаимосвязей показателей иммунной системы животных свидетельствует индекс нагрузки (более 2,0), что позволяет предположить фазу активации иммунной системы при адаптации организма к неблагоприятным условиям у лягушек, обитаю> щих в этой экологической зоне. Таблица 25. Среднее значение показателя содержания лейкоцитов у двух видов лягушек из раз> ных точек (1>3), в скобках даны минимальные и максимальные значения показателей в группах. Точка 1 Лейкоциты 10/л L 158 6,42±0,6 (4,0>7,0) Rana ridibunda Точка 2 Точка 3 2,16±0,4 (1,0>3,0) 4,56±0,3 (3,0>6,2) Rana arvalis Точка 3 4,72±0,6 (3,0>6,0) Близкий к нормальному баланс параметров иммунной системы выявлен у животных из точки 3. Однако необходимо отметить повышенное содержание нулевых клеток у животных из этой точки. По характеру изменений показателей иммунной системы можно предпо> ложить более активное воздействие химических агентов на животных из точ> ки 1. Состояние иммунной системы особей из точек 2 и 3 свидетельствует о стадии адаптации организма лягушек в токсичной среде обитания. Измене> ние некоторых показателей у особей из точки 3 позволяет предположить на> личие последствий негативного воздействия внешней среды в прошлом. *** Оценка состояния организма в популяциях земноводных проводилась для одного вида при использовании ряда подходов. Результаты большинства под> ходов в целом дают четкую картину изменений, происходящих в исследован> ных точках. По большинству параметров обнаружены значительные различия между разными выборками. Анализ стабильности развития выявил сходную зависимость в изменении всех трех интегральных показателей асимметрии у озерной лягушки. Это по> зволяет предположить наличие существенного снижения стабильности раз> вития в точках сильной антропогенной нагрузки (около завода химических удобрений и в районе сброса сточных вод) по сравнению с условным контро> лем (точка 1). Кроме того, ситуация в городской зоне отдыха, озеро Ильмень (точка 2) не может быть признана благополучной. В балльном выражении по пятибалльной шкале оценки отклонений уровня стабильности развития от нормы ситуация в точках 1 (условный контроль) и 2 (городская зона отдыха) соответствует начальным отклонениям от нормы (второй балл), в зоне антро> погенного воздействия в точке 3 (район завода ЧЗХУ) зафиксированы откло> нения от нормы среднего уровня (третий балл), в точке 4 ситуацию можно оха> рактеризовать как критическую (пятый балл). Обнаруженные цитогенетические изменения свидетельствуют о наличии сильного мутагенного эффекта воды в районе завода химических удобрений (точка 3). Кроме того, в точке условного контроля, находящейся выше города по течению р. Чапаевка (точка 1), ситуацию нельзя признать благополучной, что, возможно, связано с неблагополучной фоновой ситуацией в этом регионе. Выявленные иммунологические изменения свидетельствуют о неблагопо> лучной ситуации во всех исследованных точках, включая и условно>конт> рольные точки и соответствуют 3 баллу. В целом состояние популяций лягушек, населяющих район г. Чапаевска (точки 3 и 4), можно оценить как неблагополучное, и причиной этого является сильная антропогенная нагрузка. 159 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ БИОТЕСТИРОВАНИЕ ПРОБ ВОДЫ В дополнение к натурным исследованиям качества воды по состоянию при> родных популяций рыб и земноводных в водных экосистемах было проведе> но собственно биотестирование проб воды. Таких проб в г. Чапаевске было взято 4: со станции обезжелезивания; из водопровода с ул. Медицинская; со станции биологической очистки сточных вод, а также производилось биотес> тирование сточных вод, сбрасываемых в реку. Для интегральной биологической оценки качества проб воды было исполь> зовано два теста: • тест на ракообразных (оценка общего токсического эффекта); • генетический тест (оценка частоты сестринских хроматидных обменов у рыб). Токсикологический тест. Тест на ракообразных: Daphnia magna и Ceriodaphnia affinis Результаты получены Е.Ф.Исаковой, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет. На испытание были представлены 4 образца сточных вод с различным уров> нем содержания загрязняющих компонентов. Проводилась оценка токсичности образцов сточных вод в соответствии с руководством по биотестированию РД>118>02>90 на низших ракообразных Daphnia magna и Ceriodaphnia affinis. Была определена острая токсичность проб сточных вод в опытах с дафния> ми. Возраст рачков 15±9 часов. На 100 мл раствора помещали по 10 дафний, повторность каждого варианта опытов трехкратная. Исследовали неразбав> ленные сточные воды и их разведения с контрольной водой, коэффициенты разбавления (Кр) — 2, 10 и 50. Контрольной водой служила лабораторная во> допроводная отстоенная вода. Учитываемый показатель — выживаемость даф> ний. Продолжительность опытов 120 часов, на протяжении опыта рачков не кормили. Полученные результаты острых опытов были использованы для рас> чета хронического действия методами регрессионного анализа. С цериодафниями были проведены хронические опыты длительностью 14 суток до получения у рачков 4>х пометов. Возраст посадочной культуры цери> одафний 4±2 часа, на 20 мл раствора помещали по 4 рачка, повторность каж> дого варианта опыта пятикратная. Исследовали разведения сточных вод с Кр 2, 10, 50, 100. Смену растворов проводили через сутки, кормили рачков ежед> невно хлореллой. Температура воды в опытах 200С. Учитывали показатели выживаемости и размножения цериодафний. Полученные результаты обра> ботаны методами вариационной статистики. Биотестирование пробы воды, сбрасываемой в реку В опытах с дафниями было установлено, что сточная вода обладает ост> рым токсическим действием с летальным временем ЛВ50 — 20 часов. Выжи> ваемость давний в растворах сточной воды через 120 часов опыта с Кр 10 и 50 соответственно составила 76,6 и 90%. На основании этих данных были рас> 160 считаны методом наименьших квадратов уравнения регрессии гиперболичес> кой и степенной функций для установления разбавления воды, при котором за 720 часов погибнет 50% рачков. Они имели следующий вид: гипербола: t50 = 71 + 3,15ґKp; Kp за 720 час = 206 степенная: ltg50 = 23,25 > 0,65ґlg Kp; Kp50 = 204 Оба вида регрессии дают сходные результаты, что подтверждает надеж> ность расчетов. Таким образом, в опытах с дафниями было установлено, что сточная вода обладает острым токсическим действием. Расчетными методами экстраполя> ции установлено, что для устранения токсического действия полностью необ> ходимо разбавление пробы более чем в 200 раз. Хронические опыты с цериодафниями были проведены с разведениями сточ> ной воды в 2, 10, 50 и 100 раз. Результаты тестирования представлены в табл. 26. Исследуемые разбавления сточной воды не оказывали острого токсичес> кого действия на цериодафний: так, при минимальном разбавлении в 2 раза гибель цериодафний наблюдали через 6 суток после начала опытов. Сниже> ние выживаемости рачков на 14 сутки опытов, как видно из таблицы, было достоверно снижено в растворах с разбавлениями в 2, 10 и 50 раз. Наблюдения за размножением цериодафний выявили наибольший эффект в растворах с Кр 2 и 10, снижение плодовитости на 40 и 50%. Снижение пло> довитости происходило за счет удлинения сроков созревания и снижения чис> ленности молоди в пометах. Таким образом, проведенные хронические опыты на цериодафниях позво> ляют рекомендовать за допустимое разбавление для этого вида рачков раз> бавление в 100 раз. Биотестирование пробы воды со станции обезжелезивания Острые опыты на дафниях были проведены с неразведенной пробой и с Кр 2 и 10. ЛВ50 для неразведенной пробы составило 96 часов. В растворах с Кр 2 на пятые сутки опытов погибло 30% рачков, а в растворах с Кр 10 гибели дафний не происходило. Уравнения регрессии, рассчитанные для данной про> бы, имели следующий вид: Таблица 26. Влияние пробы воды, сбрасываемой в реку, на показатели жизнедеятельности це> риодафний. Выживаемость Реальная плодовитость Коэф. разбавления X±m контроль 4,0±0,0 % к конт> ролю — 100 3,8±0,5 95 0,71 18,3±0,5 102 0,71 50 3,0±1,1 75 2,50 23,8±3,3 132 3,47 10 2,2±1,5 55 5,42 6,8±1,5 38 5,1 2 0,8±1,5 17 5,98 8,7±1,2 48 5,1 td — % к конт> ролю 18,0±3,23 — X±m td — 161 Таблица 27. Влияние пробы воды со станции обезжелезивания на показатели жизнедеятельно> сти цериодафний. Выживаемость Коэф. разбавления X±m контроль 4,0±0,0 % к конт> ролю — 50 3,8±0,5 95,0 10 3,8±0,5 95,0 0,71 2 3,2±0,5 80,0 2,85 td Реальная плодовитость td — 18,0±3,2 % к конт> ролю — 0,71 19,0±0,7 105,6 1,83 8,3±4,4 46,0 5,64 12,3±6,4 68,5 2,3 X±m — гипербола: t50 = 23 + 67,5ґKp; Kp50 за 720 часов = 10. степенная: lgt50 = 90,5 > 0,89ґlgKp; Kp50 за 720 час= 13,2 Таким образом, кратковременные опыты с дафниями позволили устано> вить острую токсичность пробы со станции обезжелезивания, которая снима> ется при разбавлении пробы в 10 раз. Регрессионная экстраполяция показы> вает, что для устранения токсичности пробы воды необходимо разведение более чем в 10 раз. Хронические опыты на цериодафниях были проведены с разведениями сточной воды в 2, 10 и 50 раз, результаты представлены в таблице 27. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что сточная вода ока> зывает хроническое токсическое действие на цериодафний в растворах с Кр 2 и 10. Выживаемость рачков и их реальная плодовитость значимо снижена при минимальном разбавлении. Снижение плодовитости было обусловлено появ> лением значительного количества абортивных яиц в пометах. Таким образом, за допустимое разбавление пробы воды со станции обез> железивания для цериодафний можно принять разбавление в 50 раз. Биотестирование пробы водопроводной воды с улицы Медицинской Острые опыты с дафниями были проведены с неразбавленной пробой и растворами, Кр 2 и 10. Время гибели 50% рачков в неразбавленной пробе со> ставило 92 часа, в растворах с Кр 2 за 120 часов гибель составила 10%, в ра> створах с Кр 10 гибели дафний не наблюдали. Расчетные уравнения регрессии для данной пробы были следующие: гипербола: t50 = >44,6 + 130,3ґKp; Kp за 720 час = 6 степенная: lgt50 = 35,7 > 1,3ґlgKp; Kp за 720 час = 5 Таким образом, для устранения токсичности пробы необходимо ее разве> дение более чем 5 раз. Хронические опыты с цериодафниями проведены с рядом разбавлений пробы: Кр 2, 10, 50. Результаты представлены в табл. 28. Полученные экспериментальные данные показывают наличие хроничес> кого токсического действия пробы на цериодафний в растворах с разбавле> ниями в 2 и 10 раз. Снижение выживаемости было незначительным, в боль> шей степени проявилось действие пробы на размножение рачков. Снижение 162 Таблица 28. Влияние пробы водопроводной воды с ул. Медицинской на показатели жизнедея> тельности цериодафний. Кратность разведения Выживаемость контроль 4,0±0,0 % к конт> ролю — 50 4,0±0,0 100,0 X±m td Реальная плодовитость td — 18,0±3,2 % к конт> ролю — 0,0 14,5±3,3 80,5 1,6 X±m — 10 3,6±0,1 90,0 1,8 8,7±2,0 48,0 6,8 2 3,2±0,9 80,0 2,4 9,9±3,1 55,2 5,0 величины реальной плодовитости на 4 >50% относительно контроля было обусловлено появлением большого количества абортивных яиц в пометах по> допытных рачков. За допустимое разбавление для цериодафний следует принять разбавле> ние в 50 раз. Биотестирование пробы воды со станции биологической очистки В остром опыте с дафниями исследованы неразбавленная проба и ра> створы с Кр 2 и 10. Время гибели 50% дафний в исходной пробе — 65 ч. Разведение пробы в 2 раза снимает острую токсичность для рачков. Экстраполяция по полученным данным выживаемости дафний на срок 720 ч: гипербола: t50 = >92 + 154,5ґKp; Kp50 за 720 часов = 5,2 степенная: lgt50 = 62,8 > 1,79ґlgKp; Kp50 за 720 час = 4,0 Таким образом, по расчетным данным 50% всех дафний погибнет за 720 часов при разбавлении пробы в 4>5 раз. Таблица 29. Влияние пробы воды после биологической очистки на показатели жизнедеятельно> сти цериодафний. Выживаемость Реальная плодовитость Коэф. разбавления X±m контроль 4,0±0,0 % к конт> ролю — — 18,0±3,2 % к конт> ролю — 10 3,8±0,5 95,0 0,71 19,2±2,9 106,5 0,75 2 3,2±0,9 80,0 2,40 12,8±1,7 71,1 3,98 td X±m td — Хронические опыты с цериодафниями проведены с растворами пробы с Кр 2 и 10, результаты представлены в табл. 29. Наибольшее токсическое действие пробы было выявлено только при ми> нимальном разбавлении в 2 раза: снижение выживаемости на 20% и плодо> витости на 30%. Разбавление пробы в 10 раз снимает хроническую токсич> ность для цериодафний. 163 Таблица 30. Обобщенные результаты биотестирования проб воды. Проба Daphnia magna Ceriodaphnia affinis ЛВ 50 ЛКр50 з 1. Сточные воды 20 час. 2. Станция обезжелезивания 96 час 3. ул. Медицинская 4. Станция биоочистки Допустимые Кр 205 выживае> мость 100 плодови> тость 50 13 10 50 92 час 6 2 50 65 час 5 2 10 Сравнительная токсичность проб сточных вод Обобщенные результаты опытов по биотестированию проб воды представ> лены в табл. 30. Таким образом, все 4 образца сточных вод, представленных к испыта> нию, обладали токсичностью для использованных биотестов. Острые опыты с дафниями выявили, что наибольшей токсичностью обладала проба сточ> ных вод, сбрасываемых в реку. В таблице 30 пробы расположены в ряд по убыванию токсичности. Наименее токсична проба со станции биологичес> кой очистки. Опыты с цериодафниями позволили определить тот же поря> док снижения токсичности. Сравнение чувствительности вида по двум пока> зателям позволило установить, что в одном случае (пробы воды сточных вод) лимитирующим показателем была выживаемость, а в трех других — плодо> витость. Генетический тест. Тест на сестринские хроматидные обмены у рыб Notobranchius rachowi Для оценки мутагенной активности проб воды применяли тест на сест> ринские хроматидные обмены (СХО). В качестве тест>объекта использовали аквариумных рыб Nothobranchius rachowi (сем. Cyprinodontidae) в возрасте 1,5 месяцев. Всего было исследовано шесть проб воды: проба 1 — водопроводная вода с ул. Медицинская; проба 2 — вода после биологической очистки; проба 3 — вода со станции обезжелезивания; проба 4 — сточные воды; проба 5 — водопроводная вода г. Москва; проба 6 — позитивный контроль с циклофосфамидом (25 мг/л). Результаты анализа представлены в таблице 31. В таблице 32 представлены значения ϕ > критерия Фишера при сравнении частот СХО/хромосому для разных проб воды. 164 Таблица 31. Частота сестринских хроматидных обменов (СХО) у рыб при тестировании проб воды (1>6) № пробы Кол>во рыб Кол>во метафаз Частота метафаз СХО/хромосом 1 5 100 0,06 2 5 100 0,06 3 5 100 0,10 4 4 80 0,13 5 5 100 0,09 6 5 100 0,17 Таблица 32. Оценка значимости различий при попарных сравнениях данных по СХО, получен> ных для разных проб воды. 1 2 3 4 5 1 > > > > > 6 > 2 > > > > > > 3 17,6 17,6 > > > > 4 42,0 42,0 6,3 > > > 5 10,4 10,4 1,0 11,8 > > 33,6 8,9 46,5 > 6 100,8 100,8 Анализ полученных результатов показывает, что наибольшей мутагенной активностью обладают пробы воды 3 и 4, причем проба воды 4 по мутагенной активности сходна с таковой для позитивного контроля с циклофосфамидом. Пробы воды 1 и 2 практически не обладают мутагенной активностью, частоты СХО/ хромосому для них соответствуют спонтанному уровню, найденному для N. rachowi. Заключение по водным экосистемам Оценка, проведенная для рыб и земноводных, свидетельствует о том, что загрязнение, вызванное работой предприятий, расположенных на тер> ритории города Чапаевска, оказывает сильное негативное воздействие на состояние водных экосистем. Негативные последствия такого воздействия особенно значительны в местах, расположенных в непосредственной бли> зости от источника загрязнения (точки 3, 4). Наблюдаемые отклонения раз> личных параметров жизнедеятельности от условной нормы соответствуют здесь четвертому > пятому баллу пятибалльной шкалы, что является крити> ческим уровнем. Несмотря на то, что в озеро Ильмень городской зоны от> дыха (точка 2) сброс сточных вод не происходит, у рыб здесь обнаружены достаточно сильные нарушения стабильности развития, соответствующие 3>4 баллу. По>видимому, это следствие сильного загрязнения воздушной среды. 165 Что касается собственно тестирования проб воды с использованием раз> личных тест>объектов, то, несмотря на существенные различия применен> ных тестов, характеризующих последствия воздействия на разные стороны функционирования организма, результаты, полученные при их использова> нии, практически идентичны. Это, с одной стороны, говорит о репрезента> тивности проведенных оценок, а с другой, о комплексном характере воз> действия (токсичности) анализируемых проб. Все пробы воды, включая как сточные воды, так и водопроводную воду обладают токсичностью. Если токсичность пробы водопроводной воды с ул. Медицинской и со станции биологической очистки может быть оценена как умеренная (соответствуя 1>2 баллу пятибалльной шкалы отклонений от нор> мы), то проба воды со станции обезжелезивания обладает повышенной ток> сичностью, включая и повышение мутагенного эффекта (2>3 балл). Высокой общей токсичностью и мутагенностью обладают сточные воды, сбрасываемые в реку, — их токсичность соответствует 4 баллу. Полученные данные свидетельствуют о неблагополучном состоянии воды и необходимости принятия срочных мер для улучшения ситуации. Тот факт, что при относительно удовлетворительном качестве воды после биологичес> кой очистки, сточные воды, сбрасываемые в реку, обладают высокой токсич> ностью, однозначно свидетельствует о необходимости очистки всех стоков, включая и условно химически чистые воды. При современном состоянии дел высоко токсичные воды, попадая в реку, представляют серьезную опасность как для города, так и для других районов. Различия в общей токсичности и мутагенности, выявленные при сравнении водопроводной воды со станции обезжелезивания и с ул. Медицинская, свидетельствуют о возможных изме> нениях качества воды в разное время, что требует не только дополнительной очистки воды, но и организации постоянного контроля за ее качеством. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Целью работы являлась интегральная биологическая оценка состояния среды в районе г. Чапаевска. Суть подхода — в характеристике состояния сре> ды по состоянию живых организмов, здоровью биоты, предоставляющей воз> можность оценки последствий всего комплекса самых различных воздей> ствий (включая пресс общей антропогенной нагрузки, воздействия отдель> ных химических соединений и др.). Этот подход дает и возможность оценки благоприятности среды для человека. Для выполнения этой задачи был про> веден комплекс исследований, включающих два этапа. Первый состоял в общей характеристике состояния биоты для оценки ситуации в условиях ан> тропогенной нагрузки. Второй — в более тонкой интегральной оценке состо> яния видов живых организмов для выявления последствий воздействия пред> приятий города (связанных в прошлом с производством химического ору> 166 жия, пестицидов, удобрений и пр.) и характеристики здоровья среды. На каждом из этих этапов оценка производилась дифференцированно по на> земным и водным экосистемам. Общая характеристика состояния биоты включала анализ растений и пред> ставителей животного мира. Была произведена оценка биоразнообразия мле> копитающих. Находясь на вершине пищевых цепей, эта группа интегрально ха> рактеризует состояние экосистемы в целом. Оценка производилась в 5 точках по основным типам экосистем с разной степенью антропогенной нагрузки. Ха> рактеристика водной среды производилась по группе>индикатору — рыбам, ко> торые также, находясь на вершине пищевых цепей, отражают общую ситуацию в исследуемом местообитании (оценка проводилась также по 5 точкам). Глав> ными факторами, оказывающими влияние на состояние биоразнообразия ока> зываются продуктивность местообитания и пресс рекреационной нагрузки. В результате проведенной общей характеристики состояние экосистем (по состо> янию биоты) может быть оценено как чрезвычайное (соответствуя 2 баллу при> нятой трехбалльной шкалы). Итак, при использовании подхода, связанного с общей характеристикой состояния биоты и экосистем, выявляются лишь общие изменения, связанные с антропогенным прессом. Для более тонкой оценки ситуации, с выявлением на фоне общей антро> погенной нагрузки дополнительного воздействия отдельных источников заг> рязнения, использовался подход, связанный с оценкой здоровья экосистемы по состоянию представленных здесь видов живых существ. • По наземным экосистемам отклонения от нормы в районе двух основных предприятий города наблюдаются на уровне четвертого балла (причем бо> лее серьезная ситуация сложилась в районе ЧЗХУ), достигая пятого крити> ческого балла в центре города (что связано как с высокой общей антропо> генной нагрузкой, так и с воздействием заводов). В условно>контрольных точках (окрестности дер. Ясная Поляна и оз. Ильмень) ситуация соответ> ствует фоновому состоянию (первый балл). • По водным экосистемам ситуация крайне неблагоприятна во всем иссле> дуемом районе. Даже выше города по течению реки наблюдаются откло> нения от нормы (2>3 балл), которые в районе предприятия и в месте сброса сточных вод в реку достигает критического пятого балла. Серьезна ситуация и ниже по течению (4 балл). Ситуация в оз. Ильмень соответствует 3 баллу. • При необходимости улучшения биологической очистки, вода с БОС ока> зывается относительно неплохого качества, но после смешения с условно чистыми стоками, обладает крайне высокой токсичностью и мутагеннос> тью, что представляет опасность как для города, так и для исследуемого района в целом. В заключение, необходимо отметить, что при неблагополучности ситуации в целом, положение более серьезно по водным экосистемам. Это, видимо, обусловлено как неудовлетворительным качеством современных стоков, так и накоплением, в результате не только прямых сбросов, но и смыва большого количества загрязняющих веществ за предшествующий период. Ситуация с 167 наземными экосистемами несколько лучше, вероятно, в связи со снижением объемов атмосферных выбросов, вследствие перепрофилирования и непол> ной загрузкой производственных мощностей предприятий города в настоя> щее время. Достоверность полученных оценок подтверждается скоррелированностью ответа разных видов. Сходство результатов, полученных для разных видов растений, рыб и млекопитающих, свидетельствует о надежности полученных выводов и позволяет полагать, что и при расширении набора исследуемых видов результат принципиально не изменится. Как свидетельствуют получен> ные данные, определенную реакцию на воздействие обнаруживают все ис> следованные виды, несмотря на существенные различия между ними. В боль> шинстве случаев практически все тесты (включая мофрогенетические, цитоге> нетические, иммунологические и другие показатели состояния организма) по> казывают согласованные изменения, свидетельствующие об ухудшении со> стояния организма при возрастании степени антропогенного воздействия. Причем эти изменения оказываются сходными не только по направлению, но и по степени. Системы балльной оценки, разработанные для каждого из ис> пользованных подходов, позволяют охарактеризовать ситуацию по пятибал> льной шкале оценки степени отклонения от нормы. Для наземных экосистем оценка проводилась по растениям и млекопитающим: • Оценка состояния растений проводилась по стабильности развития — ба> зовому интегральному показателю состояния живого организма и актив> ности фотосинтеза, как принципиально важному показателю состояния ра> стительности и ее продуктивности. Анализ проводился на двух модельных видах: березе повислой (для характеристики состояния древесных расте> ний) и клевере (для характеристики состояния травянистых растений) в 5 точках. • Оценка состояния млекопитающих проводилась по комплексу методов, разносторонне характеризующих состояние организма (стабильность раз> вития, цитогенетический гомеостаз, физиологические показатели ритми> ки роста, иммунный статус). Анализ проводился на двух фоновых видах: рыжей полевке и малой мыши в 5 точках. По водным экосистемам проводилась интегральная оценка состояния рыб и земноводных: • По рыбам она включала комплекс следующих характеристик: оценка ста> бильности развития; анализ состояния репродуктивной системы; оценка мутагенной активности. Анализ проводился в 5 точках по 2 фоновым ви> дам: плотве и лещу. По земноводным (широко используемым в качестве чувствительного интегрального индикатора для оценки состояния как вод> ных, так и наземных экосистем) анализ проводился по 4 точкам по озер> ной лягушке. Оценка состояния проводилась по стабильности развития; цитогенетическому гомеостазу и иммунному статусу. • Для оценки качества воды было проведено биотестирование с использо> ванием двух тестов: общий тест на токсичность, наиболее широко распро> 168 страненный в настоящее время, тест на ракообразных, и тест на мутаген> ную активность — тест на сестринские хроматидные обмены на рыбах. Оба теста дали сходные результаты. При наличии токсического эффекта всех использованных проб, повышенной токсичностью включая и мутагенность (2>3 балл) обладает вода, полученная со станции обезжелезивания и вода, сбрасываемая в реку (4 балл). Значимость проекта для развития подхода, связанного с оценкой здо> ровья среды. • В данном случае оценка проводилась для предоставления данных для государственной экологической экспертизы и объявления исследуемой территории как зоны экологического бедствим. Проведенная работа по> казала значимость и перспективность такой оценки как для характерис> тики состояния среды, так и для оценки ее благоприятности для здоро> вья человека. • Важно отметить, что многие из выявленных серьезных изменений в со> стоянии организма наблюдаются на фоне высокого биоразнообразия. Это же можно отметить и в отношении видов>индикаторов > на терри> ториях наиболее сильного воздействия на фоне критических измене> ний состояния живых организмов была отмечена высокая численность раков и лягушек, которые часто рассматриваются в качестве чувстви> тельных видов>индикаторов разных видов загрязнения. Это свидетель> ствует о том, что отчеты по оценке состояния среды должны включать не только результаты учетов, сколько и каких видов представлено на исследуемой территории, но и данные о здоровье этих видов и экоси> стем в целом. • Серьезные изменения состояния организма в местах наибольшего воз> действия, причем согласованные по разным показателям и видам, были выявлены лишь по основным подходам к оценке здоровья среды по гомеостазу развития (включая морфогенетические, цитогенетические, иммунологические и физиологические). В то время как другие показа> тели (такие как тесты на мутагенность и патолого>гистологические ме> тоды) позволяют либо охарактеризовать всю исследуемую зону как не> благополучную, либо выделить лишь отдельные точки локального заг> рязнения. 169
