TPHA 200 РПГА 200 Кат. №72501 TPHA Screening 500 РПГА

TPHA 200 РПГА 200
Кат. №72501
TPHA Screening 500 РПГА Скрининг 500 Кат. №72502
Набор для качественного и полуколичественного определения антител
к Treponema pallidum в человеческой сыворотке или плазме методом
пассивной гемагглютинации.
IVD
Все произведенные и реализованные продукты участвуют в системе контроля
качества, начиная от приемки исходных материалов для создания тест-системы до
реализации готового продукта. Каждая партия проходит контроль качества и
реализуется только в случае подтверждения соответствия критериям качества. Записи
о продуктах и контроле каждой партии сохраняются в компании.
Клиническое значение
Сифилис – хроническое заболевание, которое в своем развитии проходит через различные
стадии инфекции: первичный, вторичный, третичный и четвертичный сифилис. Эти стадии
характеризуются различными клиническими симптомами, с первично появляющимся шанкром,
затем сифилитическая сыпь, за которой следует длительный латентный период без каких-либо
видимых клинических проявлений и может в конечном итоге привести к кардиоваскулярным
проблемам и нейросифилису.
Инфекция вызывается спирохетой Treponema pallidum, обычно передается половым путем, но
также болезнь может быть передаваться при переливании инфицированной крови. Инфекция
так же может встречаться при внутриутробном развитие. Показано, что организм практически
не культивируется в искусственной среде и диагноз наличия инфекции обычно зависит от
проявления антител в крови, которые появляются вскоре после возникновения инфекции и
может сохраняться годами.
Тесты для диагностики сифилиса делятся на 4 категории: прямое микроскопическое
исследование, трепонемные антительные тесты, нетрепонемные антительные тесты и прямое
исследование антигена. В связи с наличием длительного латентного периода и
неспецифичекой природой нетрепонемных тестов, методы, которые выявляют специфические
антитрепонемные антитела в образцах пациентов, все больше становятся популярными в
качестве скриннинговых. Одним из таких тестов является TPHA.
Использование по назначению
Данные наборы предназначены для использования подготовленным и квалифицированным
персоналом для детекции антител T pallidum в сыворотке или плазме человека.
Принцип теста.
В тесте TPHA 200 и TPHA Screening 500 используются птичьи эритроциты, покрытые
антигенами T. pallidum (штамм Николса) для связывания со специфическими антителами,
присутствующими в сыворотке или плазме. Клетки находятся в растворе, содержащем
специальные компоненты для элиминации неспецифических реакций. Положительные реакции
характеризуются гемагглютинацией, при отрицательной реакции клетки образуют на дне лунки
кольцо.
Хотя первичным назначением теста является качественная оценка, его также можно
использовать и как количественный тест с определением уровня антител методом
последовательного разведения.
Результаты теста могут оцениваться визуально, либо с помощью фотометра для
микропланшет.
Состав набора
Название
R1
Сенсибилизированные клетки
R2
Контрольные клетки
R3
Раствор для разведения
R4
Положительный контроль
R5
Отрицательный контроль
Реагент
эритроциты
курицы,
покрытые
антигенами T.
pallidum
эритроциты
курицы
интактные
буферный
раствор,
содержащий
абсорбенты
сыворотка
человека
Титр 640 - 1280
сыворотка
человека
Титр < 80
РПГА 200
РПГА
Скрининг
500
2 х 7,8 мл
2 х 20 мл
2 х 7,8 мл
20 мл
2 х 20 мл
125 мл
0,5 мл
0,5 мл
0,5 мл
0,5 мл
Предупреждения
Только для in vitro диагностики.
Все реагенты содержат меньше, чем 0.1% азид натрия. Отходы, получающиеся при
исползовании тест-системы следует разводить в большом количестве воды, чтобы избежать
накопления потенциально взрывоопасных веществ.
Поставляемые в составе набора контрольные материалы содержат человеческую сыворотку.
Все они были протестированы на стадии взятия крови у доноров и определены как негативные
на HBs антиген, анти-ВГС и ВИЧ1/2 антитела. Однако, с этими компонентами следует
обращаться, как с потенциально способными передавать инфекцию.
С компонентами, содержащими
микробиологически опасными.
человеческую
сыворотку,
следует
обращаться
как
с
Не использовать набор по окончанию срока годности.
Не следует смешивать или использовать в одной постановке компоненты их разных наборов в
одной постановке.
Условия хранения
Все реагенты стабильны при температуре 2-8оС до окончания срока годности, указанного на
этикетках реагентов. Храните флаконы в вертикальном положении. Не замораживайте.
Необходимое оборудование
Поверенные откалиброванные пипетки на объемы 10, 25, 75 и 190 микролитров.
Микропланшеты на 96 лунок с U-образным дном – код 83378 (5 планшет), 83357 (100 планшет)
Образцы
Исследуемые образцы сыворотки или плазмы необходимо предполагать как инфицированные,
в них не должно быть эритроцитов. Они могут храниться перед использованием до 7 дней при
температуре 2 – 8 ºС. Образцы, требующие более длительного хранения, следует
замораживать при - 20 оС или более низкой температуре. Для использования в этом случае
образцы необходимо разморозить и размешать.
Порядок выполнения теста (ручная технология)
Перед использованием дайте реагентам нагреться до комнатной температуры. Используйте
свежую сыворотку.
Примечание: Положительный и отрицательный контроль необходимо ставить в
каждой постановке.
Качественный тест
Для каждого образца необходимо использовать три лунки.
NB Набор РПГА Скрининг 500 (Каталожный номер 72502) предназначен для исследования
большого количества образцов и содержит небольшой объем Контрольных клеток. Это
связано с тем, что при проведении скрининговых исследований используют только
Сенсибилизированные клетки, в случае получения положительного результата повторный тест
ставится с использованием Сенсибилизированных и Контрольных клеток
1. Разведение образцов (1 к 20).
Внесите в лунку микропланшета 190 мкл разводящего раствора РПГА.
В эту же лунку добавьте 10 мкл образца.
Тщательно перемешайте.
Примечание: Положительный и отрицательный контроли, входящие в набор должны быть
обработаны, как и тестируемые сыворотки (т.е. разведенные 1/20)
2. Выполнение теста
Внесите по 25 мкл разведенных образцов (приготовленных как описано в пункте 1) в две лунки:
для исследования с сенсибилизированными и контрольными клетками.
Перемешайте Сенсибилизированные и Контрольные клетки, встряхивая, обеспечив полное
перемешивание.
Добавьте 75 мкл Сенисибилизированных клеток в 1-ую лунку.
Добавьте 75 мкл Контрольных клеток во 2-ую лунку. (Конечное разведение после добавления
клеток составляет 1/80).
Тщательно перемешайте.
о
Инкубируйте при комнатной температуре (15 – 30 С) на поверхности, не находящейся под
воздействием вибрации, в течение по крайней мере 45 минут.
Считайте и проинтерпретируйте результаты – см. Главу Интерпретация. Картина агглютинации
остается неизменной, по крайней мере, в течение 3 часов.
Количественный тест
На каждый образец необходимо 9 лунок
Примечание: Положительный и отрицательный контроли должны быть
использованы для каждой серии тестов.
1
Разведение образцов (1/20).
Внесите в лунку микропланшета 190 мкл разводящего раствора РПГА.
В эту же лунку добавьте 10 мкл образца.
Тщательно перемешайте.
Примечание: Положительный и отрицательный контроли, входящие в набор должны быть
обработаны, как и тестируемые сыворотки (т.е. разведены 1/20).
2
Выполнение титрования
Оставьте 1-ую лунку пустой и внесите последовательно по 25 мкл разводящего раствора в
оставшиеся 7 лунок 8-ми луночного ряда.
Добавьте 25 мкл разведенного образца (как описано в шаге 1) в 1-ую лунку.
Добавьте 25 мкл разведенного образца (как описано в шаге 1) во 2-ую лунку, тщательно
перемешайте, и из нее сделайте серийные разведения, из последней лунки удалите лишние 25
мкл.
3
Выполнение теста
Мягко перемешайте Сенсибилизированные клетки, обеспечив полное перемешивание.
Добавьте по 75 мкл Сенисибилизированных клеток во все лунки, тщательно перемешайте.
(Конечные разведения после добавления клеток составляют от 1/80-1/10,240).
Инкубируйте при комнатной температуре (15 – 30 оС) на поверхности, не находящейся под
воздействием вибрации, в течение по крайней мере 45 минут.
Считайте и проинтерпретируйте результаты – см. Главу Интерпретация.
Интерпретация и подтверждение правильности выполнения теста
Внутренний контроль качества
При правильном выполнении теста отрицательный контроль должен давать отрицательный
результат (см. рисунок) и положительный контроль должен давать титр 640 – 2560
Каждая лунка в которой агглютинация меньше, чем показанная на рисунке как «+/-» должна
считаться отрицательной.
КК
-
+
+
+
+
КК
1:80
1:160
1:320
1:640
- результат с контрольными клетками
+
+/-
-
1:1280 1:2560 1:5120
Интерпретация результата РПГА Скрининг 500
Любой образец, где агглютинация больше, чем отмеченная на рисунке как «+/-», должен быть
оценен как условно положительный, и процедура тестирования должна быть повторена как
описано выше, но в двух лунках, в одну из которых необходимо добавить контрольные клетки, а
в другую сенсибилизированные
Интерпретация результата РПГА 200
Положительный:
Сильно
Слабо
Неопределенный
Отрицательный
Неспецифическая
реакция *
Сенсибилизированные клетки
Контрольные клетки
Клетки полностью покрывают
дно лунки
Клетки покрывают около 1/3 дна
лунки
В расположении клеток виден
открытый центр
Клетки собираются в
компактную пуговичку на дне
лунки
Положительная реакция
Отрицательная лунка
Отрицательная лунка
Отрицательная лунка
Отрицательная лунка
Положительная реакция
Абсорбция неспецифических реакций (процедура выполняется если агглютинация
появляется в обеих лунках с Сенсибилизированными и Контрольными клетками одновременно)
1. Добавьте 10 мкл образца к 190 мкл ресуспензированных контрольных клеток, хорошо
перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течении 30 мин.
2. Отцентрифугируйте для осаждения клеток при минимум 1500 g в течении 3 мин.
3. Добавьте по 25 мкл супернатанта, полученного как описано в п. 2 в две лунки.
4. Тщательно перемешайте Сенсибилизированные и Контрольные клетки.
Добавьте 75 мкл Сенисибилизированных клеток в 1-ую лунку.
Добавьте 75 мкл Сенсибилизированных клеток во 2-ую лунку.
Тщательно перемешайте. Инкубируйте при комнатной температуре на поверхности, не
находящейся под воздействием вибрации, в течение по крайней мере 45 минут.
Считайте и проинтерпретируйте результаты – см. Главу Интерпретация.
Характеристики теста
Специфичность – два независимых исследования показали, что на 2900 сыворотках доноров
результаты показали 100% совпадение результатов с существующими методами. Первично
реактивные результаты составляли 0.1%, повторно реактивные результаты 0%.
Независимое исследование на 200 образцах новорожденных показало 100% специфичность
тестов. (95% в доверительном интервале 98,04 – 100%)
Чувствительность – внутреннее исследование показало, что на 110 подтвержденных
положительных образцах наблюдалась 100% позитивная реакция. (95% в доверительном
интервале 98,04 – 100%)
Это исследование включало 2 образца, которые были определены как отрицательные другими
коммерческими РПГА тестами, но подтвержденными положительными с помощью РИФ и IgM
ИФА.
Клинические образцы. В клинической лаборатории были исследованы 467 образцов, взятые у
пациентов с подозрением на сифилис
Кол-во
положительных
результатов в другом
наборе РПГА
217
Кол-во
положительных
результатов РПГА
Скрининг 500 и РПГА
200
216
250
0
0
Первичный диагноз
Количество
Сифилис
положительный
Сифилис
отрицательный
214
Чувствительность
99,5 % (95% в доверительном интервале 97,54 – 100%)
Специфичность
100 % (95% в доверительном интервале 98,04 – 100%)
Специфичность в образцах с потенцильным наличием перекрестных реакций
Первичный диагноз
Ревматоидный фактор + ve
Инфекционный мононуклеоз
(ЭБВ)
Вакцинация против гепатита В
SLE
Генитальный герпес
Боррелиоз (болезнь Лайма)
Лептоспироз
Количество
исследований
10
10
Кол-во
положительных
результатов РПГА
Скрининг 500 и РПГА
200
0
0
Кол-во
отрицательных
результатов РПГА
Скрининг 500 и РПГА
200
10
10
10
10
10
10
10
0
0
0
0
1
10
10
10
10
9
Аналитическая чувствительность
Как было показано, предельная определяемая тест-системой концентрация составляет 0,05
МЕ/мл анти-трепонемных антител. Результат получен путем исследования серийных
разведений стандарта (NIBSC, London, UK)
Точность и правильность
Для 10-ти исследований позитивного образца %CV = 8.1% (Вариация)
Правильность = 2.5%
Библиография
Смотрите в оригинальной англоязычной инструкции.