Перспективы совершенствования молекулярной диагностики

Перспективы
совершенствования
молекулярной диагностики
сибирской язвы на
современном этапе
РАСПРОСТРАНЕНИЕ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ В МИРЕ (данные ВОЗ)
СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ
И ИДЕНТИФИКАЦИИ BACILLUS ANTHRACIS
- ПЦР- тест системы в режиме реального времени
- анализ последовательности генов 16S/23S рДНК
- технология сравнительной гибридизации генома (CGH)
- использование ДНК-чипов
- технология «ArrayTube»
- использование метода проточной цитофлуорометрии
-использование для быстрой идентификации
микроорганизмов времяпролетной масс-спектрометрии
(MALDI TOF MS)
Перспективные направления молекулярной диагностики
Bacillus anthracis:
- Разработка и внедрение в практику лабораторной диагностики
мультиплексной тест-системы для обнаружения обеих плазмид
вирулентности и хромосомы Bacillus anthracis
- Поиск и анализ возможности использования новых специфических
маркеров хромосомной и плазмидной локализации
- Разработка и внедрение в практику работы Референс-центра по
мониторингу за возбудителем сибирской язвы амплификационной тестсистемы формата NASBA-Real-Time для выявления живых клеток
возбудителя сибирской язвы
- Совершенствование метода пробоподготовки при работе с разными
видами материала, поступающего на исследование
- Применение метода генетического типирования штаммов B. anthracis с
использованием маркеров, обладающих разной дискриминирующей
способностью (VNTR, SNR, SNP)
Обнаружение ДНК B. anthracis
методом мультиплексной ПЦР
Название тест-системы
Производитель
Мишени
«ГенСиб»
ФГУЗ РосНИПЧИ
«Микроб»
pagА (pXO1)
Тест-система для
идентификации бактерий вида
Bacillus anthracis методом ПЦР
ООО «Ветбиохим»
«Ban»
ООО «Лаборатория
ИЗОГЕН»
ФГУЗ СтавНИПЧИ
(экспериментальная)
capB (pXO2)
pagА (pXO1)
cya (pXO1)
Тип детекции
электрофорез
электрофорез
электрофорез
электрофорез
capB (pXO2)
Sap (ch)
(E4, PlcR A)
«ООМ скрининг» набор
ЗАО «Синтол»
Нет данных
FRT
«АмплиСенс Bacillus
anthracis-FRT»
ФГУН ЦНИИЭ
Роспотребнадзора
pagА (pXO1)
FRT
реактивов для обнаружения
ДНК возбудителя B. anthracis
capA (pXO2)
«Bacillus anthracis multiplex 3 FRT»
№
п/п
1.
Ген
Локализация
Канал
детекции
Комбинация флуорофора
и гасителя
cya
рХО1
GREEN
(FAM) - (BHQ1)
RED
(Cy5) - (BHQ3)
YELLOW
(VIC) - (BHQ2)
ORANGE
(ROX) - (BHQ2)
2.
cap
3.
sap
4.
VKO 127
pХО2
chr
контроль
Штаммы микроорганизмов, использованные для проверки
специфичности разработанной тест-системы:
Вид
микроорганизма
Плазмидный
состав (для B.
anthracis)
Количество
штаммов
B. anthracis
pXO1+ pXO2+
42
pXO1+ pXO2-
24
pXO1- pXO2+
3
pXO1- pXO2-
2
B. cereus
18
B. thuringiensis
14
B. species (spp.)
19
B. subtilis
17
B. megaterium
4
Гетерологичные
микроорганизмы
27
Оценка результатов исследуемых проб
№
1.
2.
3.
Значения Сt (пороговый цикл) по детектируемым фыяяя
Fam/Green
(cya)
Red/Cy5
(capC)
Th (пороговая
линия) = 0,01
Th (пороговая
линия)= 0,015
Нет значений
< 32
Нет значений
Нет значений
Joe/Yellow
(sap)
Th (пороговая
линия)= 0,05
Нет значений
Результат анализа
Rox/orang
e
(ВК)
Th
(порогова
я линия) =
0,07
≤32
ДНК Bacillus anthracis
не обнаружена
< 31
≤ 32
≤ 32 (или
нет)
Обнаружена
ДНК Bacillus anthracis
pXO1+ pXO2+
< 31
≤ 32
≤ 32 (или
нет)
Обнаружена
ДНК Bacillus anthracis
pXO1- pXO2+
4.
< 32
Нет значений
≤ 32
≤ 32 (или
нет)
Обнаружена
ДНК Bacillus anthracis
pXO1+pXO2-
5.
Нет значений
Нет значений
≤ 32
≤32 (или
нет)
Обнаружена
ДНК Bacillus anthracis
pXO1-pXO2-
Нет или
>32
Анализ повторить с
этапа выделения ДНК
6.
Нет значений
Нет значений
Нет значений
Сравнение эффективности пробоподготовки материала, контаминированного
возбудителем сибирской язвы
№ п/п
Вид
материала
ГИТЦ 15 мин при
65 оС
Ct
Пробоподготовка по
МУ 1.3.2569-09
Ct
G
Y
O
G
Y
O
Кровь ПЦР 1
-
-
21,56
-
-
22,01
Кровь ПЦР 2
-
-
20,77
-
-
21,78
Кровь ПЦР 3
-
-
20,85
-
-
23,33
Кровь ПЦР 4
-
-
22,14
-
-
21,45
Кровь ПЦР 5
-
-
21.,48
-
-
22,14
Струп 1
25,12
26,43
21,09
-
-
21,96
Струп 2
15,53
17,29
-
21,3
21,46
25,20
Струп 4
18,61
20,43
-
24,81
23,06
23,56
Струп 5
24,62
24,76
21,93
-
23,48
-
-
30,45
23,03
-
-
22,29
8,90
10,38
-
15,04
15,38
-
Содержимое
язвы 3
Мясо
ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ПРОВЕДЕНИЯ ДЕЗИНФЕКЦИОННЫХ
МЕРОПРИЯТИЙ
?
NASBA
REAL - TIME
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ !