Комплекты реагентов для ПЦР-амплификации ДНК возбудителя

117587, Москва, Варшавское ш., д.125ж, к.6
Тел./факс +7 (495) 980-45-55
Е-mail: [email protected]
www.dna-technology.ru
Комплекты реагентов для ПЦР-амплификации ДНК
возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis
Bacillus anthracis pagA
Bacillus anthracis capC
Информация о комплектах
Назначение:
Комплекты реагентов Bacillus anthracis pagA и Bacillus anthracis capC предназначены для выявления ДНК
возбудителя сибирской язвы (Bacillus anthracis) в биологическом материале человека, в материале от падших и
больных животных, в смывах с предметов окружающей среды и др. методом полимеразной цепной реакции
(ПЦР).
Комплект реагентов Bacillus anthracis pagA предназначен для выявления фрагмента гена pagA (плазмида pXO1).
Комплект реагентов Bacillus anthracis capC предназначен для выявления фрагмента гена capC (плазмида pXO2).
Необходимость применения двух комплектов реагентов обусловлена существованием штаммов B.anthracis
(например, вакцинных штаммов), содержащих только один из указанных генов.
Метод:
Полимеразная цепная реакция с детекцией результатов в режиме реального времени; качественный анализ.
Материал для исследования:
Отделяемое из язв, кровь, фекалии, биоптаты; материал от падших и больных животных, смывы с предметов
окружающей среды и др.
Выделение ДНК:
Рекомендуется комплект реагентов для выделения ДНК ПРОБА-ГС (ООО «НПО ДНК-Технология»).
Особенности комплектов:
Внутренний контрольный образец (ВК) – присутствует в каждой пробирке с амплификационной смесью,
необходим для контроля прохождения полимеразной цепной реакции.
В зависимости от способа детекции результатов амплификации комплекты реагентов для ПЦР-амплификации
выпускаются в двух форматах:
«Flash» – предназначен для детекции результатов ПЦР после окончания амплификации с использованием
детектора флуоресцентного.
«Real-time» – предназначен для детекции результатов ПЦР во время амплификации с помощью амплификаторов
детектирующих.
Приборное обеспечение:
Формат «Flash»
Термостат программируемый для проведения ПЦР анализа четырехканальный «Терцик» (ООО «НПО ДНКТехнология»);
Детектор флуоресцентный «Джин» (ООО «НПО ДНК-Технология»); версия программного обеспечения не ниже
3.3., рекомендуемая версия 4.4.0.10
или «Джин-4» (ООО «НПО ДНК-Технология»); версия программного обеспечения не ниже 4.4.0.8, рекомендуемая
версия 4.4.0.10.
Формат«Real-time»
Амплификаторы детектирующие (ООО «НПО ДНК-Технология») ДТ-322, ДТлайт1, ДTпрайм2 и ДТ-96; версия
программного обеспечения не ниже 7.3, рекомендуемая версия 7.3.5.843
или амплификатор iCycler iQ (Bio-Rad Laboratories).
1
– только модели 4S1; 4S2; 5S1; 5S2; 6S1; 6S2.
– только модели 4M1; 4M3; 4M6; 5M1; 5M3; 5M6; 6M1; 6M3; 6M6.
– по мере обновления программного обеспечения рекомендуемая версия ПО может измениться. Последнюю
рекомендуемую версию ПО можно скачать на сайте компании «ДНК-Технология»:http://www.dnatechnology.ru/support/
2
3
Внимание!
компании.
Возможность
использования
других
амплификаторов
необходимо
уточнить
у
представителя
Количество определений:
48*/50**
Состав комплектов
Реактив
Состав комплекта Bacillus anthracis pagA

Смесь для амплификации «Bacillus anthracis pagA»,
запечатанная парафином
20 мкл

ПЦР-буфер**
200 мкл

Раствор Taq-полимеразы
500 мкл

Минеральное масло
1,0 мл

Положительный контрольный образец («К+»)«Bacillus
anthracis pagA»
75 мкл
Состав комплекта Bacillus anthracis capC

Смесь для амплификации «Bacillus anthracis сapC»,
запечатанная парафином
20 мкл

ПЦР-буфер**
200 мкл

Раствор Taq-полимеразы
500мкл

Минеральное масло
1,0 мл

Положительный контрольный образец («К+»)«Bacillus
anthracis сapC»
75 мкл
* – в комплектах в формате «Real-time»
** – в комплектах в формате «Flash»
Количество
48/50 пробирок
1 пробирка
1 пробирка
1 пробирка
1 пробирка
48/50 пробирок
1 пробирка
1 пробирка
1 пробирка
1 пробирка
Каналы детекции продуктов амплификации
FAM
HEX
Rox
Cy5
Cy5.5
Bacillus anthracis pagA
ВК
-
-
-
Bacillus anthracis сapC
ВК
-
-
-
Инструкция по применению
1.
Выделение ДНК
В результате предобработки образцов необходимо получить 0,2-0,5 мл суспензии бактериальных клеток
в пробирке пластиковой объёмом 1,5 мл.
Полученный материал можно использовать для выделения ДНК.
2.
Подготовка и проведение полимеразной цепной реакции
ВНИМАНИЕ! Для исследования на наличие искомых фрагментов гена pagA или гена capC Bacillus
anthracis необходимо применять соответствующий комплект для ПЦР-амплификации ДНК «Bacillus
anthracis pagA» или «Bacillus anthracis capC».
2.1.
Промаркируйте необходимое количество пробирок с запечатанной парафином смесью для
амплификации с учетом пробирок для отрицательного контрольного образца – «K–» и для
положительного контрольного образца – «K+». При использовании ПЦР-детектора для учёта
результатов амплификации (формат «FLASH») промаркируйте дополнительно две пробирки («ФОН») для
контроля фона флуоресценции.
Например, необходимо проанализировать 2 образца. Нужно промаркировать 4 пробирки для
исследуемых образцов, 2 пробирки для «K-» и 2 пробирки для «К+». Общее количество пробирок – 8.
Для комплектов в формате «FLASH» нужно промаркировать дополнительно 4 пробирки «ФОН»; общее
количество пробирок — 12 (Таблица 1).
2.2.
Встряхните пробирку с раствором Taq-полимеразы в течение 3–5 сек и центрифугируйте в течение 1–
3 сек. на микроцентрифуге/вортексе
2.3.
Во все промаркированные пробирки (кроме пробирок «ФОН»), не повреждая слой парафина, добавьте
по 10 мкл раствора Taq-полимеразы. В пробирки, промаркированные «ФОН», добавьте по 10 мкл ПЦРбуфера.
2.4.
В каждую пробирку добавьте по 1 капле минерального масла (примерно 20 мкл), плотно закройте
пробирки.
2.5.
Для предотвращения контаминации следует перед внесением образцов открывать крышку только той
пробирки, в которую будет вноситься данный образец, и закрывать ее перед внесением следующего.
Препараты ДНК следует вносить наконечниками с аэрозольным барьером.
Внесите, не повреждая слой парафина, по 5,0 мкл выделенного из образцов препарата ДНК в
соответствующие пробирки для исследуемых образцов (кроме пробирок «К–», «K+», «ФОН»).
Таблица 1
Пример маркировки пробирок для проведения ПЦР
Смесь для амплификации
Смесь для амплификации «Bacillus
«Bacillus anthracis pagA»
anthracis capC»
Образец 1
√
√
Образец 2
√
√
«К–»
√
√
«К+» «Bacillus anthracis pagA»
√
-
«К+» «Bacillus anthracis capC»
-
√
«ФОН» пробирка 1*
√
√
«ФОН» пробирка 2*
√
√
* - только в формате «Flash»
2.6.
Внесите, не повреждая слой парафина, 5,0 мкл отрицательного контрольного образца, прошедшего
этап выделения ДНК, в пробирки, маркированные «K–» и «ФОН». Внесите, не повреждая слой
парафина, 5,0 мкл положительного контрольного образца в пробирку, маркированную «K+».
2.7.
2.8.
2.9.
Центрифугируйте пробирки при 1000 об/мин (или на микроцентрифуге/вортексе) в течение 1–3 сек.
Установите все пробирки в амплификатор или термостат программируемый.
Формат «FLASH»
Проведите ПЦР с учётом объёма реакционной смеси, равного 35 мкл (Таблица 2).
Формат «Real-time»
Для приборов ДТ-322, ДТлайт, ДТпрайм и ДТ-96:
Запустите программное обеспечение RealTime_PCR в режиме «Работа с прибором». При первом
проведении ПЦР создайте и сохраните новый тест. При последующих постановках добавьте в протокол
сохраненный тест, укажите количество и идентификаторы образцов, в том числе отрицательных и
положительных контрольных образцов, отметьте расположение пробирок на матрице термоблока в
соответствии с их установкой (п.2.8) и проведите ПЦР (Таблица 3).
Для прибора iQ:
Включите прибор и блок питания оптической части прибора, оставьте для прогрева на 30 минут.
Запустите программное обеспечение iCycler. При первой постановке создайте и сохраните новый
протокол. При последующих постановках выберите сохраненный протокол, настройте конфигурацию
плашки (файл с данными о характеристике образцов и их расположении в плашке) и проведите ПЦР с
учётом объёма реакционной смеси, равного 35 мкл (Таблица 4).
2.10.
Таблица 2. Формат «Flash»
Программа амплификации для амплификатора «Терцик»
Алгоритм регулирования: «точный»
№ п.п.
1
Для амплификаторов с активным
регулированием
Время
Температура, °С
мин
сек
94,0
1
00
Количество
циклов
1
2
94,0
62,0
67,0
0
0
0
20
5
5
5
3
94,0
62,0
67,0
0
0
0
1
5
5
40
4
10,0
…
…
Хранение
Таблица 3. Формат «Real-time»
Программа амплификации для амплификаторов детектирующих ДТ-322, ДТлайт, ДTпрайм и ДТ-96
№ блока
Температура, °С
мин
сек
Число циклов
1
80,0
94,0
0
1
30
30
1
2
94,0
62,0
0
0
30
15
5
3
94,0
62,0
0
0
10
15
45
4
10,0
…
…
Хранение
Режим
оптических
измерений
Тип блока
Цикл
√
√
Цикл
Цикл
Хранение
Таблица 4. Формат «Real-time»
Режим амплификации для детектирующего амплификатора iCycler iQ
Cycle
1
2
3
4
5
PCR/Melt Data
Acquisition
Программа для считывания динамических факторов лунок dynamicwf.tmo
1
1
60 sec
80,0
2
1 min 30 sec
94,0
5
1
30 sec
94,0
2
45 sec
62,0
2
1
30 sec
80,0
Real Time
Программа амплификации
45
1
10 sec
94,0
2
45 sec
62,0
Real Time
…
…
10,0
storage
Repeats
Step
Dwell Time
Setpoint, Co
Примечание. При работе с комплектами в формате «Flash» готовые нормировочные пробирки «ФОН»
допускается использовать многократно при каждой детекции результатов ПЦР с реакционными пробирками из
той же серии комплекта реагентов для ПЦР-амплификации. Нормировочные пробирки следует хранить при 2-8 °С
в течение 1 месяца в тёмном месте. При проведении детекции пробирки должны иметь комнатную температуру
(18-25 °С), поэтому за 1 час до проведения детекции их необходимо достать из холодильника.
3.
Проведение детекции и учет результатов ПЦР
Формат «Flash»: регистрация и учёт результатов ПЦР проводятся с помощью детектора флуоресцентного «Джин»
или «Джин-4» согласно инструкции к прибору (пороговые значения для специфичного продукта составляют
1,75–2,10, для внутреннего контроля – 2,50).
Формат «Real-time»: регистрация и учёт результатов проводятся на приборах ДТ-322, ДТлайт, ДTпрайм и ДТ-96
или iCycler iQ в соответствии с инструкциями к приборам.
Условия хранения
Комплекты реагентов для ПЦР-амплификации следует хранить при температуре 2-8 °С в течение всего
срока годности.
Срок годности комплектов - 9 месяцев с даты изготовления.
По вопросам, касающимся качества комплектов реагентов для ПЦР-амплификации ДНК возбудителя сибирской
язвы Bacillus anthracis (Bacillus anthracis pagA, Bacillus anthracis capC), следует обращаться к официальному
представителю производителя по адресу:
ООО «ДНК-Технология», 117587, Москва, Варшавское шоссе, д.125ж, к.6
Тел./факс +7 (495) 980-45-55
E-mail: [email protected], www.dna-technology.ru
Анкета для осуществления обратной связи находится на сайте компании «ДНК-Технология»:
http://www.dna-technology.ru/support/
Номер 248
07.03.13