влияние солей тяжелых металлов на клетки пресноводных

АКАДЕМИЯ НАУК СССР
ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ
ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ
На правах рукописи
МУХАМАДИЯРОВ Ринат Авхадиевич
ВЛИЯНИЕ СОЛЕЙ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ
НА КЛЕТКИ ПРЕСНОВОДНЫХ РАСТЕНИЙ
03.00.02 — биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Красноярск— 1991
Работа выполнена в лаборатории биофизики мембран
Научно-исследовательского института биологии и биофизики
при Томском государственном университете им. В. В. Куй­
бышева.
Научные руководители: доктор биологических наук, про­
фессор 1 В. Л. Пегель |
кандидат биологических наук А. И, Микалашевич.
Научный
В. А. Новак.
консультант:
старший
научный
сотрудник
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
В. М. Гольд, кандидат биологических наук А. Я. Болсуновский.
Ведущая организация: Иркутский государственный уни­
верситет.
Защита состоится «
»
:1991 года
в__
_часов на заседании специализированного сонета
Д 003.45.01 при Институте биофизики СО АН СССР по адре­
су: 660036, Красноярск, Академгородок, Институт биофизики.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ин­
ститута биофизики СО АН СССР.
Автореферат разослан «.
Ученый секретарь
специализированного совгта
канд. фнз.-мат. наук
»
1991 года.
Л. Г. КОСОЛАПОВА.
ОБЩАЯ XAPARTEPHCTPIKA РАБОТЫ
Актуальность темы. Растущее использование тяжелых металлов
(ТЮ и их производных в
возрастающее
внимание
хозяйственной
общества к
деятельности,
также
состоянию окружающей среды,
сделали актуальными исследования влияния
объекты. Повышенные
а
ТМ на
биологические
концентрации ТМ в среде способны оказывать
неблагоприятное воздействие на биосистемы различного уровня ор­
ганизации (Бурдин,
1985;
Коржакова, Дмитриева, 1989). Поэтому
оценка последствий загрязнения среды ТМ, изучение механизмов их
действия, развития растениями металл-резистентности приобретает
важное значение (Лархер,
особенностей
и
1978;
механизмов
Мур.
Рамаыурти, 1987). Знание
действия ТМ может оказаться весьма
полезным при поиске и выборе адекватных
методов
биологической
индикации их повышенного содержания в среде (Бурдин,1985).
С другой стороны,
многие ТМ являются необходимыми состав­
ляющими клеток и известны как микроэлементы (Мецлер,
виндзкер, 1985;
1980; Ле-
Москалев, 1985) и их недостаток,также как и из-
5ЫТ0К,приводит к снижению жизнеспособности организмов.
В соот­
ветствии с этим выяснение влияния ТМ на жизнедеятельность орга­
низмов
имеет
важное значение для подбора оптимального состава
питегельных сред при биотехнологических методах их выращивания.
Обработка
растений растворами ТМ может служить также эффектив­
ным инструментом воздействия для получения объектов с заданными
звойствами (ЛоБКОва и др. 1984; Veeh e t . a l . ' , 1984).
В литературе имеется большое количество данных, отражающих
«югостороннее действие ТМ на растения. 1Ьказано, что они вызы­
вают нарушение жизнедеятельности растений
в
целом,
отдельных
органов и клеток, ингиОируют av.THBHocTb многих ферментов.
Вместе с тем,
достаточно.
многие аспекты действия ТМ изучены еще
не­
ОтсутстЕуют ясные представления о механизмах дейс-
твия ты на плазмалемму, хотя именно эти эффекты определяют пос­
ледовательность событий, формирующих ответные реакции клеток i
тканей в целом.
Слабо изучено влияние ТМ на водные макрофиты,
являющиеся потенциальными тест-объектами для оценки вагрязненш
водных сред.
В соответствии с этим,целью работы было выяснение роли цитоплазматической мембраны в механизмах действия солей тятэлыз
металлов на клетки пресноводных растений.
Были поставлены сле­
дующие задачи:
1. Изучить влияние тяжелых металлов на барьерную функци}
плазмалеммы клеток водных растений.
2.- Исследовать связь инду­
цируемых тяжелыми металлами изменений электрогенной
и транс­
портной функций плазмалеммы с нарушением клеточного метаболиз­
ма.
3. Исследовать роль мембранотропных эффектов в токсичееко!
действии тяжелых металлов на клетки пресноводных растений.
Научная новизна.
В работе впервые, путем комплексной ре­
гистрации ряда параметров (мембранный потенциал, светоиндуцированная биоэлектрическая реакция, вольт-амперные характеристик)
плазмалеммы, индукционные переходы флуоресценции хлорофилла,
выход электролитов из клеток),
исследованы механизмы токсичес­
кого действия ТМ на мембранные и клеточные процессы водных рас­
тений. Показано, что снилвние мембранного потенциала, аглтлитуд
светоиндуцированной биоэлектрической реакции и электрическоп
сопротивления плаамалеммы,
свидетельствующие о нарушении барЬ'
ерной и транспортной функции плазмалеммы, всегда оперезкаюг &
времени изменение клеточного метаболизма, оцениваемого по изме'
нениям индукционных переходов флуоресценции и, скорости циклИ'
ческого двизкения хлоропластов з клетках.
Установлено, что ток
сический эффект ТМ на плазмалемму зависит от
энергетическоп
статуса клеток в целом и функциональной активности электроген
и транспортньк систем плаамалеммы.
щт,
В частности, свет и фу-
активируюшле транспорт и электрогенез, усиливай^ ток-
зкий эф^кт
ТЫ
Показана
аналогия
эффектов
гагентов на клеточные и мембранные процессы.
низм действия ГМ на клетки пресноводных
ТМ
и
Обсуждается
растений, согласно
рому модификация SH-rpynn белков плазмалешш и связанная с
активация перекисного окисления липидов являются причиной
последующих нарушений плаамалемных и клеточных процессов.
Практическая ценность раОоты.
Полученные данные могут ио- ,
зоваться при выработке методических подходов и методов биоирования и биоиндикации наличия в среде повышенных концент;й ТМ. Исходя из мембранотропного действия ТМ для этих целей
олее приемлимы методы основанные на регистрации napat^eipoB,
лсающх состояние плазмале>лл1 клеток.
результатов
На основании получен-
предложен и апробован метод биотестирования
;ых сред на наличие ТМ и некоторых других токсичных веществ,
|ванный на одновременной регистрации светоиндуцированной би1Ктрической реакции и индукционных
юфилла листьев водных растений.
переходов
флуоресценции
Этот метод внедрен в прак-
' научных исследований на кафедре коммунальной гигиены Кеме:кого мединститута.
Материалы диссертации используются при
ш и лекций и проведении практических занятий в Кемеровском
шституте.
Апробация работы.
Штериалы диссертации были доложены на
[ернциях молодых ученых в гг Томске (1980,
1983),
Кемерове,
52, 1983, 1984), Пущино (1987), 3 Взесоюзном совещнии рабогруппы по влиянию факторов окружающей среды на здоровье на;ния (Кемерово, 1985), Кемеровском отделении обществе анато, гистологов и эмбриологов (1984, 1990), Кемеровском отделеВсесошного
хишческого
общества им.
Д. И.
Менделеева
(1988), Кемеровском областном обществе токсикологов (1990).
Г^бликации. Ifo результатам диссертации опубликовано 10
чатных работ, список которых приведен в конце автореферата.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из i
дения, четырех глав и выводов.
Список литературы включает
источников, в том числе иностранных -139. Работа изложена
173 страницах
машинописного текста, содержит 37 рисунков
таблицы.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования служили листья высших водных рас
НИИ - элодеи (Elodea canadensis Rich.),
валиснерии (Valisne
spiralis L),'наяды (Najas mlcrodon) и клетки меящоуалий xe
вой водоросли - нигеллы (Nitella flexilis L ) . Растения выра
вали в аквариуме на водопроводной воде при искусственном
щении
и барботажБ воздухом.
Поскольку у всех исследовавши
объектов получены качественно сходные результаты,
наглядности,
ос
ввиду луч
в работе, в основном, приведены данные получен
с использованием элодеи.
Состояние плазмалёммы
при действии ТМ оценивали по р;
параметров: а) выходу электролитов (ВЭ), б) величине мембран!
го потенциала (МИ), в) светоиндущрованной биоэлектрической ]
акции (СВР),
являющейся дифференциальной формой Ш ,
вольт-амперных характеристик (ВАХ) плазмалёммы,
г) кри
д) редокс-j
тивности плазмалёммы. Физиологическое состояние клеток оценю
ли по: а) изменениям индукционных переходов флуоресценции (И
хлорофилла, б) скорости циклического движения хлоропластов,
морфологичес!аш изменениям клеток и субклеточных органелл.
Регистрацию МП проводили внутриклеточным способом стекля
ными микроэлетродами (Еовак, Иванкина, 1975). ИПФ и СВР регис
рировали
одновременно от листа находящегося, в специальной ПЕ
шой камере (Новак, Иванкина, 1978), Регистрацию вольт-ашер: характеристик
(ВАХ)
проводили методом фиксации тока через
[ение листа с шкроэлектродной регистрацией МП (Швак
!5). Редокс-активность
плазмалеммы определяли по
и др.,
скорости
!Становления феррицианида (Новак, Микдашевич, 1985).
Качественную и количественную оценку выхода электролитов
3) из клеток проводили по изменению концентрации электролитов
)мывающей среде и содержанию а ней ионов натрия и калия. Дан; нормировали на единицу сырой массы листьев.
Скорости двизкения
хлоропластов оценивали с помощью свето-
'0 микроскопа, измеряя время прохоадения хлоропластами отрездлинной 35 мкм.
Для электронно-микроскопических исследований листья фиксизаш глутаровым альдегидом и тетраокисью осмия и заливали
зн с использованием общепринятых методик (Уикли,
,
в
1975). Сре-
окрашенные уранил ацетатом и цитратом свинца' просматривали
электронный >шкроскоп ЭМВ-100В.,
Содержание малонового диальдегида в тканях определяли фолетрическим методом по реакции
с тиобарбитурой
кислотой
гальная; Гаршпвиди, 1977), общее содержание меди по модифициванной методике
с
диэтилдитиокарбаулатом свинца
(Лазарев,
30).
При регистрации ВЭ растворы солей Ш готовили на дистилливанной воде,
в остальных случаях на искусственной
прудовой
це (ИПВ), содержащей 2 М NaCl, 0,4 мМ КС1 и 0.1 ыШ CaClj.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Шход электролитов из клеток листьев элодеи при
действии катионов тяжелых металлов
На рис. 1 показано влияние ТМ (хлорид кадмия, сульфат меди
нитрат серебра) на БЭ из клеток.
Кинетические кривые БЭ для
ВЭ, мкмоль/г
60 1-
40 -
60
90
Время, мин,
Рис. 1. Выход электролитов (БЭ) из клеток листьев элодеи
при действии AgNOsd, 25 мкМ), Си30^,(2, 100 мкМ), Сс1С1^(3, 100
мкЮ. 4 - контроль (дистиллированная вода).
меди и кадмия характеризуются наличием ярко вьфаженной
30-ш
нутной лаг-фазы, в то время как для ионов серебра такой фазы i
наблюдается. Характерно, что для всех изучавшихся катионов нас
людалось установление устойчивого стационарного уровня, которь
для меди и серебра наступал примерно через один час, у кадмл
через два часа инкубации. По результатам исследования применяв
шиеся ТМ можно расположить
в следующий ряд
эффективности
Hg > Ag > Си > Cd (1).
В зависимости от вида и концентрации тяжелого металла ВЭ сое
тавлял от 30 до 70% от исходного содержания электролитов :
клетках.
В дальнейшем исследования проводили с использование:
одного металла - меди.
Выбор меди был обусловлен его
6
промежу
1,1КМ0ЛЬ/г
^CSOt, мкМ
О
20
40
SO
80
100
Рис. 2. Зависимость выхода электролитов (1, 2) и светоинфованной биоэлектрической реакции (СВР, 3) листьев элодеи
юнцентрации сульфата меди в среде.
1. 2 - выход электролитов на свету и в тетоте. соответс- .
гао. Бреш инкубации 60 минут. Объем раствора 2 мл, масса
;ьев 50 }1г, исходное содержание электролитов в листьях - 83t
смоль/г сырой массы.
СВР - проточная система, нилшяя шкала концентрации.
чным положением
в ряду эффективности и относительно широком
гпространении в водном и воздутзном бассейнах.
концентрации
Зависимость ВЭ
меди имеет вид кривой с насыщением (рис. 2).
рактерно, что ВЭ был всегда в ш е на свету, чем в темноте. Боэ подробно зависимость ВЭ от света и концентрационная зависисть СБР будет рассмотрена ппхв.
Одновременная регистрация ВЭ и поглощения меди из раствора
показали,
что поглощение меди значительно опережает во врем
начало ЕЭ. Так при исходной концентнавди CuSO^ 100 мкм в тече
первых 20 минут поглощалось 77,8±1,ЗХ меди, в то время как
метный выход электролитов начинался после 60 минут.
Это поз:
лило предположить, что первоначально ионы меди взаимодейств;
не с плазмалеммой клеток, а с функционально малоактивными гр;
пировками в клеточной стенке.
Для проверки этого предположе)
исследовали влияние ионов кальция на медь-индуцированный
ЕЭ
клеток. При этом ожидалось, что кальций будет эффективно
KOHI
рировать с ионами меди за обменные участки в клеточной стенкЕ
способствовать усилению их токсического эффекта за счет уско{
ния миграции металла к плазмалемме.
Эксперименты показали, '
в этих условиях действительно происходит сокращение длительнс
ти лаг-фазы и более интенсивный БЭ, чем в отсутствии
кальщ
1фи концентрации хлорида кальция в среде 5 мЫ в течение nepi
60 минут отмечалось 2-3 кратное
усиление
ыедь-индуцированнс
ВЭ.
В связи с тем, что ТЫ связываются с клеточным материалов
таким образом удаляются из среды, можно ожидать, что их эффе
определяется не просто концентрацией тяжелого металла в сред
а
его дозой или количеством металла, приходящегося на едини
массы ткани. На рис. 3 показаны данные о зависимости ВЭ от об
ема среды инкубации при постоянной
дозе сульфата меди.
концентрации
и
постоянн
При одинаковой концентрации меди в ере
(20 мкМ) увеличение объема омывающего раствора с 2 до 20 м
приводило к 8-10 кратному повышению ВЭ (кривая 1). Однако
случае одинаковой дозы меди (4 мкмоль/г сырой массы) при анал
гичном
изменении
объема раствора
увеличение
ВЭ
составля
1,5-1,6 раза (кривая 2),
Таким образом, доза, по сравнению с концентрацией, являе
8
шмоль/г
J—J
I
J I
U
J
Рис. 3., Зависимость медь-индуцированного выхода электро• ЛИТОЕ ИЗ клеток листьев зло­
деи от объема среды инкуба­
ции,
1 - вариант с изменением
об-ьема среды при постоянной
концентрация CuS0^(20 мкЫ);
2 - вариант при постоянной
дозе меди (4 мкмоль/г сырой
массы листьев).
Масса листьев - 50 мг. Вре­
мя инкубации с CuSOi^-16 ча­
сов, исходное
содержание
электролитов в листьях - 12,7±
3 мкмоль/г.
t
10
20
Объем среды, ws.
казателем более адекватно характеризующим токсический эфТМ на клетки растений.
Этот вывод имеет важное значение
и с тем, что для экологического нормирования
загрязнения
ТМ, а так же в лабораторной практике, пользуются показал , основанными на концентрации.
Такой подход, без учета
эй зависимости эффекта ТМ, может вести к неверным выводам.
*(у в настоящей работе, при описании условий экспериментов
шкнутых систем,
г с концентрацией,
указывается доза тяжелого металла, либо,
указьвается объем среды и масса листь-
;вет является фактором переводящим фотосинтезирующие клет!тений в более энергизованное состояние.
Используя свето-
;ловия для модификации энергетического статуса клеток исс-
ТабЛЩ;
Влияние света и фузикокцина (ФК, 20 мкМ) на медь-инд
ванный выход электролитов из клеток листьев зо-одеи.
Концентрация CuSO.- 100 мкМ. Масса листьев злодеи исходное содержание электролитов в листьях - 132+6 мкмоль,
рой массы. Время првдинкуОации с ФК - 60 минут в темноте.
Фактор
Выход электролитов
GuSO, .темнота (контроль) 100% (47+3 мкмоль/г
CuSO, ,свет
177+т
CuSO,+ ФК, темнота
162+8%
GUSO.+ ФК, свет
190+6%
ледовали медь-индуцированный БЭ на свету и в темноте. Об)
но, что в течение первого часа ВЭ на свету в два и боле!
выше, чем в темноте (рис. 2 ) .
Наиболее вероятной причиной усиления токсического ;
ионов меди на свету является его связь с фотосинтетичесга
цессами. Ингибиторование фотосинтеза диуроном (2 мкЫ) по
что в этих условиях на свету действительно происходит у)
ние медь-индуцированного Ю практически
до темнового :
Качественных измений киненегических кривых ВЭ полученных
сутствие диурона, по сравнению с контролем,
подтверадает
участие фотосинтетических
не отмечеш
процессов в are
светом медь-индуцированного ВЭ.
Усиление токсического
аффекта меди ла свету мож
связано как с изменением общего энергетического статуса i
так "энергизацией" плазмалеммы, обусловленной фотосинтеи
метаболизмом. Известно, что фузнкокцин, обладающий гормо!
ным действием на растительные клетки,
процессы
в плазмалемме
активирует транс!
без изменения общего энергет№
статуса клеток в целом (Магге, 1979). Обработка листьев
10
юле),
однако,изменения Фет начинались позднее, чем изменения
й^акс. Время перехода от Шакс к Фет увеличивалось в аависимост от концентрации ТМ в 3-10 раз.
юпольаовавтихся
Нарушения Ш Ф и СЕР для всех
ТМ (Hg, Ag, Си, Cd, Mn) имели качественно
сходный характер и отличались, в основном, по силе действия.
Идя характеристики изменений Змакс и Фет, при действии повреждаощих факторов, удобно выделять амплитуды фаз нарастания (А1
Ю)
и
и снижения (А2 и А4) флуоресценции относительно исходного
юнтрольного уровня (см. на рис. 5). Изменение этих показателей
при действии тяжелых металлов приведено в табл.
2.
Данные по
действию других факторов, приведенные в этой таблице
будут
рассмотрены при обсудцении механизмов действия ТМ в разделе 3.
По влиянию на ИПФ и СБР исследовавшиеся ТМ можно расположить в
следующий ряд эффективности:
Hg, Ag >Cu > Си > Ып (2).
Зависимость СБР от концентрации сульфата меди в среде,
также как и для БЭ. имеет вид кривой с насыщением (рис. 2, кри­
вая 3). Однако чувствительность СБР к ТМ была значительно выше.
Так,полунасыщающая концентрация меди для СБР составляла около
10 мкМ, в то время как для БЭ около 50 wiL
Это различие, по-ви­
димому, связано с различием в условиях экспериментов - проточная
система при регистрации СБР и замкнутая при регистрации ВЭ.
Уч1ИЫБая рассмотренную выше дозовую вависимость эффектов меди и
ди}я«'ированное содержание ТМ в условиях замкнутой системы, ста­
новится понятным более интенсивный эффект в проточной системе.
Тяжелые металы ингибируют циклическое движение хдоропдастов в клетках.
40 минут
Так при действии 50 мкМ
CUSO^B
течение
первых
происходило замедление скорости движения хлоропластов
с 8,25+0,87 до 2,67+0,22 мкм/сек и через 90 минут происходит их
полная останов1са. Одновременно отмечаются морфологические изме-
15
ния протопласта. Наблюдается его сжатие и отставание от клето
ных стенок, что визуально напоминает плазмолиз. Через 100 мин
воздействия 100 мкМ Си30^"плаамолиз" отмечен у 68+3% клеток.
Применявшиеся ТМ вызьшали также ультраструктурные наруш
ния. Наиболее выраженными были изменения тонкой структуры
ропластов.
хл
Наблюдалось их сжатие, нарушение организации лам'
лярных структур, появление в строме электронноплотного матери
ла. Возрастала электронная плотность клеточной стенки. В пери
лааматическом пространстве клеток отмечалось
численных мембранных везикул.
появление мног<
В отдельных клетках наблюдало(
нарушение целостности плаэмалеммы.
Таким образом, ТМ вызывают нарушения функциональной актш
кость плаэмалеммы и клеточных
процессов, а также индуцирук
структурные изменения органелл. Индукция тяжелыми металлами К
характер изменений МП. БАХ свидетельствует.о нарушении барьер
проницаемост плаамалеммы.
Нарушение характеристик,
отражающи
состояние плазмалеммы всегда опрежает изменения клеточных прс
цессов. Дальнейшие исследования были посвящены изучению возмо*
ных механизмов действия металлов.
физического
При поиощ
химического
ил
воздействия пытались промоделировать и затем моди
фицировать эффекты ТМ.
3. Возможные механизмы действия тяжелых металов на клетк
пресноводных растений
Высокая биологическая активность ТМ определяется несколь­
кими свойствами:
а) способностью связываться
с
органическим!
соединениями клеток изменяя их структуру и хишческие свойства;
б) способностью катализировать свободнорадикальные реакции раз­
ложения гидроперекисей липидов; в) способностью учавствовать ]
окислительно-восстановительных
электроны.
16
реакциях, принимая
и отдавш
, мкмоль/г
60
а)
100
Бремя, миа,
Рис. б. Выход электролитов из клеток листьев элодеи при
йствии п-хлормеркурибензоата (1, 50 мк10 и н-этилмaлeи}j!идa
, 1мМ).
3 - контроль, дистилированная вода Объем раствора 4 мл,
сса листьев 100 мг.
Известно, UTO ТМ могут взаимодействовать с paзличны^!и хи[ческими группировками биомолекул, но наиболее прочные комлек[ образуют с SH-группами. С использсвачием сульфгидрильных реентов - п-хлормеркурибензоата (ПХМБ) и н-зтилмалеимида (НЭМ)
елана попытка смоделировать этот аспект действия Т Е
Кинети-
ские кривые ВЭ при действии ПХМБ и КЭМ (рис. 6> сходны по хактеру с кривыми полученными при действии ТМ (см.
рис. 1).
иные,приведенные в табл.' 2,показывают, что Ш Ш Б вызывал изме­
нив Ш Ф
и СВР клеток элодеи аналогичные таковым для тяжелых
галлов.
Кроме того, -ЗН-агенты, также как и ТЫ, индуцировали
!•?
Таблица 3.
Содержание малонового диальдегида (ЫДА) в растительных тк.
нях в зависимости от времени воздействия сульфата меди.
Объем раствора IQQQ мл, масса листьев 1 г .
Содержание ГДЦА, нм/г сыр. массы
Время инкубации с CuSO^ (100 кпсМ)
Объект
элодея
валиснерия
1
1
0I 30 лшн. 1 60 мин. 1 90 МИН.1
4-,49+2,961 17,95+2,091 22,27+3,611 22,21+4,621
3,75+1,011 15,08+3,531 22,72+2,961 21,14+2.061
сходные ультраструктурные изменения хлоропластов.
Таким образом, сульфгидрильные реагенты оказывают на во;
ные растения качественно подобный с ТЫ эффект, что свидетельс]
вует о возмошом участии SH-rpynn в механизме их действия.
Активация процессов
перекисного
окисления
липидов (nOJ
является одной из неспецифических реакций клеток
на неблаго!
риятные воздействия. Особенностью тяжелых металлов является тс
что они, кроме неспецифических механизмов активации ПОЛ, спс
собны активировать эти реакции, катализируя разложение гидропг
рекисей липидов.
привести к утрате
фвази
Усиление процессов ПОЛ в плазмалемме способ!
ею барьерной функции
(Владимиров, 198?:
с этим исследовали влияние ТМ на ПОЛ в клетках.
В к
честве показателя использовали содеркение в клетках малоново:
диальдегида (МДА), явлющегося одним из конечных продуктов pea
ций. Данные, представленные в таблице 3>показывают, что воздей
твие
меди приводит к увеличению содержания ЫДА в тканях водн
растений,
что свидетельствует об усилении свободнорадикадьно
окисления липидов входядах в состав клеток.
Согласно литературным данным (De Filippis,
имеется
принципиальная
Palaghy, 197
возможность востановления ТМ фермент
тиБными системами растительных клеток,
18
и этот
процесс мол
ь вовлечен
в механизм токсического действия ТМ на клетки.
зрения-окислительно-восстановительного
шости
клеток листьев
лотенцинала
элодеи показали,
на по-
что действительно
подается восстановление двухвалентных ионов меди.
Это про-
; аналогичен
известному феномену феррицианидредуктааной ак-
юсти (Новак,
Ш1клашевич, 1985) и, подобно ей, активируется
ЮМ и при обработке листьев фуаикокцияом.
Для выяснения роли восстановления ТМ в механизме их токсиюго действия сравнивали эффекты одно- и двух-валентной
ме-
Нами не обнаруяено качественных отш1чий ВЭ при обработке
'ьев элодеи CujCljClOO №<ii) и CuS0/j(100 мкМ).
Мы не обнару-
I также принципиальных отличий в кинетических кривых ВЭ при
1ТВИИ одновалентной и двухвалентной меди в условиях
электрогенных
[кокцином.
актива-
и транспортных систем ллазмалеммы светом и
Таким образом, результаты экспериментов не подт-
;или важности восстановления ионов ТЫ на поверхности клеток
ханизме их то}ссического действия.
В связи с тем,
что
экспериментально
подтверждаются
два
южных механизма нарушения барьера проницаемости плаамалеммы
«3 нарушение структуры белков и через активацию в мембране
, возникает вопрос о соотношении этих двух процессов.
Известно, что глутаровый альдегид, взаимодействует преимувенно с белковыми молекудахш (Гаер,
1974),
в то время как
анец является эффективным катализатором разложения гидропесей липидов.
Активность марганца в этих реакциях в 15
, чем у ионов меди (Карножицкий,
1977),
раз
но по отношению к
руппам белков он обладает меньшей реакционной способностью
чинкий,
анца,
1977).
меди,
Результаты сравнительно
глутарового
ставленны в таблице 2.
альдегида
Видно,
19
анализа
эффектов
и ГКМБ на ИПФ и СЕР,
что марганец в концентрации
1 мЫ мало влияет на ИПФ и СЕР, в то время как медь,
начиная
концентрации 10 ыкЫ вызывает быстрые изменения обоих показа!
лей.
Глутаровый альдепвд, в отличии от марганца, оказывает С
лее сильный эффект и практически
меди.
полностью
моделирует эффе
ПХЫБ, так же как и медь, подавляет СВР и ИПФ. Следо!
тельно, есть основания считать, что взаимодействие ТЫ с cyj
фгидрильными
группами белков плазмалеммы играют ведущую род1
нарушении ее барьерной функции
по сравнению с ПОЛ.
Учитывая наши данные об активации медью
ПОЛ (табл. 5
можно полагать, что нарушение белок-липидных комплексов мемб]
при действии ТЫ на белковые молекулы опосредует активацию сз
бонорадикальных процессов в плазмалемме, которая, в свою с
редь, индуцирует структурные нарушения мембраны.
Для проверки
цессов
предположения,
что нарушение клеточных щ
при действии ТЫ на клетки опосредовано
нарушен]
свойств мембраны, были проведены эксперименты по модедирова!
аффектов ТМ воздействиями увеличивающими проницаемость плаз:
леммы.
В качестве таких воздействий применяли обработку нис
тиковым антибиотиком амфотерицином Б (АТБ) и механическое П(
ревдение клеток.
Как показано
в табл.
2 воздействие А'
подобно ТЫ, приводило к снижению СВР, но в отличии от них Д]
незначительному изменению Фмакс и Зет (табл.
2). 1&ханичес]
повреждение клеток вызывало изменение уровней
ИПФ аналогич
возникающим при действии ТЫ (табл. 2).
Таким образом, ато может рассматриваться как свидетеле
того, что образование в плазмалемме каналов, обладающих изби
тельной проницаемостью,
путем обработки АТБ, лишь частично
делирует эффекты ТЫ. При механическом повревдении клеток наб,
дается
считать,
более полная
аналогия
с эффектом ТМ.
что модификация клеточных процессов при
20
Это позвол
действии
шзана со структурными нарушениями плазмале}яд>1.
Резюмируя рассмотренные данные,можно представить действие
I на клетки пресноводных растений
в виде' последовательности
[едующих процессов: взаимодействие с катионобменными участками
клеточной стенке — > взаимодействие с сульфгидрильныгд! групАш белков плазмалешш — > наруиение липид-белковых котлексов
[еточной мембраны — > активация в плазмалемле процессов пересного окисления липидов ~ > утрата стабильности мембраны и
разование в ней гидрофильных каналов --> утечка через образовшеся поры низмомолекулярных веществ из цитоплаз!-ш и изменее ее химического состава — > нарушения клеточных
процессов в
зультате изменений состава цитоплазмы и последующие, более
убокие, структурные и функциональные нарушения.
Резулйты исследования действия ТМ на клетки водных растей позволяют сделать вывод, что эти объекты могут быть исЛольваны для биотестировании водных сред на наличие
нцентраций ТМ.
токсичных
Среди исследовавшихся растительных объектов
иболее чувствительным является элодея.
В ряду исследованных
раметров наиболее пригодными для оценки загрязнения среды ТМ
пяются интегральные показатели, отра:кающе состояние и функщзльную активновть плазмалеммы клеток, в частности БЭ,
Ш,
Р, ВАХ Из них особенно удобным ок^ался метод основанный на
"истрации СБР. Метод обладает высокой чувствительностью, дос­
рочно прост и не связан с повреждением клеток. Одновременная
:'истрация ИПФ позволяет получать дополнительную информацию о
;тоянии клеток. Универсальность метода позволяет использовать
) также и для определения гербецидов и некоторых других токшых веществ, находящихся в сточных водах химических предпри1й (МухамадияроБ, 1985; 1^ухамадияров. Барков, 1988).
21
БЫЮДЫ
1. Тяжелые металлы оказывают токсической действие на кле'
ки пресноводных растений, нарушая их жизнедеятельность, индуц
руют: а) выход электролитов
из клеток в среду, б) снижен:
мембранного потенциала и сопротивления плазмалеммы,
в) измен
ние индукционных переходов флуоресценции, г) активацию переки
кого окисления липидов, д) тороможение циклического движен:
хлоропластов и аналогичное плазмолизу изменение клеток, е) н
копление электронноплотного материала в матриксе хлоропластов
образование разрывов в плазмалемме.
Ряд эффективности тяжел
металлов имеет вид: Hg > Ag > Си > Cd > Мп.
2. В условиях замкнутой системы выход электролитов завис
не просто от концентрации тяжелого металла,, а от его дозы. Н
личие 40-60 минутной
лаг-фазы
на кинетических кривых выхо
электролитов, длительность которой сокрапрется до 15-30 минут
присутствие хлорида кальция (5 мМ), а такзке то, что выход эле
толитов наблвдается после того как значительное количество ме
поглощается из раствора показывает, что клеточная стенка обл
дает по отношению к тяжелым металлам буферным действием и сп
собна снижать их токсический эффект.
3. Первым этапом действия тяжелых металлов на клетки явл
ется нарушение барьерной функции плазмалеты, характеризующие
снигкением мембранного потенциала и электрического сопротивлен
плазмалеммы и выходом электрол-ггов из клеток.
фологические нарушения
клеточных
Наблюдаемые мо
структур, а также изменен
метаболической активности клеток опосредовано
эффектами
плазмалемме.
4. Показано, что свет, как фактор энергизации клеток в ц
лом и плазмалеммы в частности, и фуаикокцин, активирующий пда
малемные процессы, усиливают индуцированный медью выход электр
22
литов.
Это свидетельствует
о зависимости
металлов от функциональной активности
другой стороны установлено,
акций плазмалеммы,
эффектов тяжелых
плаэмалемных
систем.
С
что медь не модифицирует редок-ре­
как показателя ее электрогенной активности.
Это позволяет полагай», что наиболее вероятной причиной деполя­
ризации мембранного потенциала и снижения электрического сопро­
тивления плазмалеммы является увеличение ее проницаемости.
5. Показано, что сульфгидрильные реагенты (п-хлормеркурибензоат
и н-этилмалеимид)
и глутаровый альдегид оказывают на
индукционные переходы флуоресценции и светоиндуцированную'биоэ­
лектрическую
реакцию эффекты, качественно сходные с действием
тязкелых металлов.
белковых
Это сходство
свидетельствует
о
вовлечении
SH-групп плазмалеммы в механизм токсического действия
тяжелых металлов на клетки.
6. Обработка клеток амфотеррицином Б, образующим в плазмалемме каналлы с избирательной проницаемостью, лишь частично мо­
делирует эффекты тяжелых-металлов на индукционные переходы флу­
оресценции
плазмалеммы
и
мембранный
позволяет
потенциал.
получить
Механическое
практически полную
действия тяжелых металлов на эти характеристики.
дает,
нарушение
аналопоо
Это подтверж­
что нарушение клеточного метаболизма, при действии тяже­
лых метажв, связано с увеличением проницаемости плазмалеммы.
7. Физиологический зф(|ект тяжелых металлов на клетга прес­
новодных растений может быть представлен
следующей последова­
тельностью событий: взаимодействие с клеточной стенкой -> взаи­
модействие с SH-группами белков плазмалеммы -> активация
в ней
перекисного окисления липидов -> утрата стабильности мембраны и
образование в ней гидрофильных каналов -> утечка из цитоплазмы
ионов и других низкомолекулярных веществ и, как следствие, мо23
дификация функциональной активности
метаболических систем и
дальнейшие, более глубокие структурные и функциональные наруше­
ния клеточных процессов.
8. Бэказано, что в ряду изученных растений наболев подхо­
дящим кандидатом на роль тест-объекта для оценки загрязнения
водной среды ТЯЖЕЛЫМИ металлами является элодея ввиду нибольшей
ее чувствительности.
Для этого объекта изменения индукционных
переходов флуоресценции и светоиндуцированной биоэлектрической
реакции наблюдались при концентрации меди и ртути в среде менее
1 мкМ.
Метод регистрации светоиндцированной
биоэлектрической
реакции и индукционных переходов флуоресценции, обладающий экс­
прессивностью, высокой чувствительностью, экономичностью и уни­
версальностью
обнаруживает хорошие перспективы для использова­
ния в системах биомониторинга состояния водной среды.
Список публикаций по теме диссертации
1. Иванкина Е Г., Мухамадияров Р. А., Веселова Г. Г. Токси­
ческое действие солей•тяжелых металлов на • растительную клетку.
В
кн. Материалы третьей региональной конференции молодых уче­
ных. -Томск: Изд-БО Томск, ун-та, 1980.-С. 113-114.
2. Мухамадияров Р. А.
Влияние катионов тяжелых металлов на
светоиндуцированную биоэлектрическую реакцию растений и морфо­
логию клеток пресноводных растений.
В кн. Тез. докл. областной
научной конф. молодых ученых. Кемерово, 1982. С. 24-26
3. Мухамадияров
Р. А.
Изменение
ультраструктуры клеток
листьев элодеи при воздействии солей тялселых металлов.
Б кн.
Материалы 3 научной конф. молодых ученых г. Кемерово. -Кемерово,
1984. С. 65-66
4. Ь1ухамадияров Р. А.
Подавление светоиндуцированной биоэ­
лектрической реакции и индукционных переходов флуоресценции со-
24
лями тяжелых металлов. В кн. Материалы 3 научной конф. молоды.х
ученых г. Кемерово.—Кемерово, 1984. С. 66—68.
5. Мухамадияров Р. А. Применение биоэлектрических методов в виде
критерия оценки качества затряанения окружающей среды.— В кн. Ма­
териалы 3 Всесоюзного совещания рабочей группы по изучению влияния
факторов окружающей среды на здоровье населения.— Кемерово, 1985.—
С. 103-105.
6. Мухамадняро» Р. А. Кинетика выхода ионаа из клеток водных
растений при действии различных концентраций ионов меди.— В кн.
Материалы 4 научной конф. молодых ученых г, Кемерово.— Кемерово,
1985.—С. 59—60.
7. Мухамадияров Р. А., Полуэктопа' С. Б. Влияние тяжелых метал­
лов на клетки пресноводных растений. Ред. ж. Биол. лауки. М., 1,988.—
Деп. ВИНИТИ 12,01.88, № 140—В88. 17 с.
8. Мухамадияров Р. А,, Новак В. А. Повреждающее действие тяже­
лых металлов на плазмалемму клеток элодеи. Ред. ж. Биол, науки. М.,
1988.—Деп. ВИНИТИ 15.07.88, № 6638 — В88.— 17 с.
9. Мухамадияров Р. А., Ба.рков Л,. В. Опыт применения биотестирова­
ния для оценки токсичности сточных вод одного из химических предпри­
ятий г. Кемерово. В кн. Тезисы докладов научно-практического 'совеща­
ния «Применение современных методов аналитической химик на пред­
приятиях Кузбасса».— Кемерово, 1988.— С. 67.
10. Мухамадияров Р. А., Зи}1чук С. Ф. Влияние .ионов мед» на содер­
жание малонового диальдегида в клетках листьев высших водных рас­
тений.-М., 1990. Представле;.<а НИИ гигиены им. Эрисмана.—Деп.
ВНИИ.ММТИ 17.05.90, № Д-19016.— I :С.