Пальгова И. В.: "Фактор-параллелизм как

Фактор-параллелизм, как скрининговая методика
для диагностики дефицита факторов и присутствия
специфических ингибиторов к факторам
свертывания.
И. В. Пальгова, к.б.н.,
ЗАО «ФИРМА Гален», г. Москва
Тесты на определение активности факторов
• Факторы XII, XI, IX и VIII анализируются с использованием
реагента АЧТВ
• Факторы II, V, VII и X анализируются с использованием
реагента ПВ
Тест АЧТВ
АЧТВ реагент
XII
XIIa
XI
 Комплексная оценка активности «внутренних» факторов
XIa
IXa
IX
 Удлинено при дефиците факторов
 Удлинено при наличии ингибиторов
X
VIIIa
Xa
Протромбин
(II)
Va
Фибриноген
Тромбин
(IIa)
Фибриновый
сгусток
= 30 с
Анализ активности факторов
Образец с
дефицитом FIX
IX
+ дефицитная плазма по FIX
XII
XI
IX
VIII
Фибриновый
сгусток
АЧТВ реагент
IX
IXa
…
Результаты в сек.
калибровка
Результаты в %
Чувствительнен к присутствию ингибиторов
Идеальная система для определения факторов
• Калибровка
– Покрывает весь рабочий диапазон: 0,0% - 150%
– Математические модели для обеспечения точных результатов в
низких и высоких диапазонах
• Стабильный реагент
• Дефицитная плазма
– Стабильность
– Остаточный фактор
• Калибратор, восходящий к стандартам ВОЗ
Идеальная система для тестирования на факторы
• Калибровка
– диапазон
– математические модели
– первая точка калибровки
без добавления
калибратора
ELITE: 6 точек. Высокая и низкая кривые. 1-150%.
TOP: 7-8 точек. Высокая и низкая кривые
перекрываются. Полиномиальная модель. 0,0150%.
АЧТВ: 3-10 дней на борту
ПВ: 10 дней на борту
• Стабильный реагент
• Дефицитная плазма
– Стабильность
– Остаточный фактор
• Калибратор, восходящий к
стандартам ВОЗ
02/150
24 ч в холодильнике
24 ч. на борту TOP
8 ч. на бортуElite
<1% остаточного
факторора
FVIII деф. плазма с
нормальным уровнем фВ
Определение активности факторов.
Режим одиночного или множественного разбавления ?
• Режим одиночного разбавления – получаем одно значение
активности фактора.
• Режим множественных разбавлений (100%, 50%, 25%) - получаем
несколько результатов, сравниваем их.
– Множественные разведения повышают точность тестирования
(NEQAS)
– Кривая тестируемой плазмы сравнивается с калибровочной кривой
(линейность, параллельность с калибровочной кривой и тд.)
Определение активности факторов; Одобренное руководство NCCLS H48-A Апрель
1997
Ингибиторы
«Патологические субстанции», которые:
1. Специфически нейтрализуют прокоагулянтную активность соответствующего
фактора свертывания.
 FVIII приобретенный ингибитор (Аllo и аuto антитела)
 vWF, FV, FIX, FII, FVII, FX, FXI приобретенные ингибиторы
2.
Влияют в общем на каскад свертывания крови.
Гепарин подобные антикоагулянты
 ВА подобные антикоагулянты коррелируют с тромботическими осложнениями
Специфические ингибиторы факторов
Частота встречаемости
• Приобретенные антитела (Пациенты без врожденной гемофилии)
– Беременность, пожилой возраст, аутоиммунные заболевания, рак, подбор
препаратов
Редко, 1 на млн.
• Пациенты принимающие концентраты факторов
• 30% для гемофилии A
• 3-5% для гемофилии B
Определение активности факторов
Режим одиночного или множественного разбавления ?
Одиночное разбавление –
один результат активности фактора
Ингибитор не выявить
Режим множественных
разбавлений (100%, 50%, 25%) –
несколько значений активности фактора
Повышает точность результатов,
возможно выявить ингибитор
?
Если тестируемая плазма содержит ингибитор,
то при ее разбавлении снижается влияние
ингибитора и наблюдается увеличение активности фактора.
Методика фактор-параллелизм
Зачем нужен фактор параллелизм?
1. Получение более точного результата определения активности
факторов.
Особенно при низких значениях активности фактора
2. Детекция возможной интерференции, которая незаметна в
тесте с одним разведением
 Специфические ингибиторы факторов
Методика Фактор-параллелизм. Основные положения
1. Образец разводится фактором дилюентом в 2, 4, 8 раз.
2. Активность фактора в тестируемой плазме оценивается без разведения + во
всех разведениях.
3. По результатам строится кривая зависимости % активности фактора от сек.
4. Кривая образца сравнивается с калибровочной кривой: насколько кривые
параллельны.
При разведении образца активность фактора должна снижаться, как в калибровочной плазме.
Образец ведет себя также, как калибровочная плазма.
5. Результаты активности фактора в разведениях оцениваются на
воспроизводимость.
Результаты активности при пересчете на степень разведения должны быть равны друг другу.
Если в образце нет ингибитора, то при разведении он «ведет» себя также как
калибровочная плазма .
Результаты активности при пересчете на степень разведения могут различаться
незначительно.
Фактор-параллелизм
Критерии оценки «параллельности» графиков
Кривая образца сравнивается с калибровочной кривой: насколько
кривые параллельны.
- Визуальная оценка.
- Математическая. Наклон кривой (Parallelism slope).
Кривые считаются параллельными, если наклон кривой параллелизма отличается от
наклона калибровочной кривой не более чем на 15% (предустановлено).
Если Parallelism slope  15% - ошибка в параллелизме
Каждая лаборатория должна определить свое допустимое значение Parallelism slope
Фактор-параллелизм
Критерии оценки воспроизводимости результатов
1. Оценка R2 (Parallelism R2).
Показывает насколько точки близко расположены к графику.
Допускается значение R2 0.98 (предустановлено).
2. Оценка Скорректированных результатов (Corrected result).
Скорректированные результаты - % активности в пересчете на степень разведения.
Должны быть примерно равны.
3 Оценка % Коэффициента вариации между скорректированными
результатами (%CV-CR).
Показывает насколько скорректированные результаты отличаются друг от друга.
Допустимая разница % CV-CR не более 20% (предустановлено)
Результаты активности фактора во всех разведениях
должны попадать в рабочий диапазон измерений теста.
Каждая лаборатория должна определить свои допустимые значения
Parallelism R2, % CV-CR
Параллелизм на ACL TOP
Критерии
Каждая лаборатория должна определить свои допустимые значения критериев
фактора-параллелизма
1. Количество разведений образца.
2. % Разведения. (например: 100%, 50%, 25%, 15%)
3. Значение R2 (Parallelism R2)
4. Значение % Коэффициента вариации между скорректированными результатами
(%CV-CR).
Фактор-параллелизм. Ограничения методики
1. Чувствителен к специфическим и неспецифическим ингибиторам .
2. Информативен в пределах рабочего диапазона теста ( ACL TOP 0.0-150%).
3. Если результаты активности во всех разведениях близки к нулю –
неинформативен.
Спасибо за внимание!