Фактор-параллелизм, как скрининговая методика

Фактор-параллелизм, как скрининговая методика
для диагностики дефицита факторов и присутствия
специфических ингибиторов к факторам
свертывания.
И. В. Пальгова, к.б.н.,
ЗАО «Фирма Гален», г. Москва
Тесты на определение активности факторов
• Факторы XII, XI, IX и VIII анализируются с использованием
АЧТВ
• Факторы II, V, VII и X анализируются с использованием ПВ
АЧТВ реагент
Тест АЧТВ
XII
XIIa
XI
 Комплексная оценка активности «внутренних» факторов
XIa
IXa
IX
 Удлинено при дефиците факторов
 Удлинено при наличии ингибиторов
X
VIIIa
Xa
Протромбин
(II)
Va
Фибриноген
Тромбин
(IIa)
Фибриновый
сгусток
= 30 с
Идеальная система для тестирования на факторы
• Калибровка
– Покрывает весь рабочий диапазон: 0,3% - 150%
– Математические модели для обеспечения точных результатов в
низких и высоких диапазонов
• Стабильный реагент
• Дефицитная плазма
– Стабильность
– Остаточный фактор
• Калибратор, восходящий к стандартам ВОЗ
Идеальная система для тестирования на факторы
• Калибровка
– диапазон
– математические модели
• Стабильный реагент
ELITE: 6 точек. Высокая и низкая кривые. 1-150%.
TOP: 7-8 точек. Высокая и низкая кривые
перекрываются. Полиномиальная модель. 0,3150%.
АЧТВ: 3-10 дней на борту
ПВ: 10 дней на борту
• Дефицитная плазма
– Стабильность
– Остаточный фактор
• Калибратор, восходящий к
стандартам ВОЗ
02/150
24 ч в холодильнике
24 ч. на борту TOP
8 ч. на бортуElite
<1% остаточных
факторов
FVIII деф. плазма с
нормальным уровнем фВ
Q4 2012
Определение активности факторов.
Режим одиночного или множественного разбавления ?
• Режим одиночного разбавления – получаем одно значение
активности фактора.
• Режим множественных разбавлений (100%, 50%, 25%) - получаем
несколько результатов, сравниваем их.
– Множественные разведения повышают точность тестирования
(NEQAS)
– Кривая тестируемой плазмы сравнивается с калибровочной кривой
(линейность, параллельность с калибровочной кривой и тд.)
Определение активности факторов; Одобренное руководство NCCLS H48-A Апрель
1997
Ингибиторы
«Патологические субстанции», которые:
1. Специфически нейтрализуют прокоагулянтную активность соответствующего
фактора свертывания.
2. Влияют в общем на каскад свертывания крови.
Обычно присутствие ингибитора коррелирует с повышенным риском геморрагических
осложнений.
 FVIII приобретенный ингибитор (Аllo и аuto антитела)
 vWF, FV, FIX, FII, FVII, FX, FXI приобретенные ингибиторы
 Гепарин подобные антикоагулянты
 ВА подобные антикоагулянты коррелируют тромботическими осложнениями
Специфические ингибиторы факторов
Частота встречаемости
• Приобретенные антитела (Пациенты без врожденной гемофилии)
– Беременность, пожилой возраст, аутоиммунные заболевания, рак, подбор
препаратов
Редко, 1 на млн.
• Пациенты принимающие концентраты факторов
• 30% для гемофилии A
• 3-5% для гемофилии B
Ингибиторы FVIII
•
Allo-антитела
Auto-антитела
(Первичная гемофилия)
(Приобретенная гемофилия)
Антитела к различным участкам
молекулы FVIII
•
Антитела к одному участку
молекулы FVIII
•
•
Ингибиторы Типа II к FVIII
Ингибиторы Типа I к FVIII
Скорость инактивации фактора FVIII
Ингибиторы.
Режим одиночного или множественного разбавления ?
Одиночное разбавление –
один результат активности фактора
Режим множественных
разбавлений (100%, 50%, 25%) –
несколько значений активности фактора
Ингибитор не выявить
Возможно выявить ингибитор
?
Если тестируемая плазма содержит ингибитор,
то при ее разбавлении мы снимаем «маску»
от ингибитора и видим увеличение активности плазмы.
Зачем нужен фактор параллелизм?
1. Получение более точного результата определения активности
факторов
2. Детекция возможной интерференции, которая незаметна в
тесте с одним разведением
•
•
•
ВА
Гепарин
Специфические ингибиторы факторов
Методика Фактор-параллелизм. Основные положения
1. Образец разводится фактором дилюентом в 2, 4, 8 раз.
2. Активность фактора в тестируемой плазме оценивается без разведения + во
всех разведениях.
3. По результатам строится кривая зависимости % активности от сек.
4. Кривая образца сравнивается с калибровочной кривой: насколько кривые
параллельны.
При разведении образца активность фактора должна снижаться, как в калибровочной плазме.
Образец ведет себя также, как калибровочная плазма.
5. Результаты активности фактора в разведениях оцениваются на
воспроизводимость.
Результаты активности при пересчете на степень разведения должны быть равны друг другу.
Если в образце нет ингибитора, то при разведении он «ведет» себя также как
калибровочная плазма .
Результаты активности при пересчете на степень разведения могут различаться
незначительно.
Фактор-параллелизм
Критерии оценки «параллельности» графиков
Кривая образца сравнивается с калибровочной кривой: насколько
кривые параллельны.
- Визуальная оценка.
- Математическая. Наклон кривой (Parallelism slope).
Кривые считаются параллельными, если наклон кривой параллелизма отличается от
наклона калибровочной кривой не более чем на 15% (предустановлено).
Если Parallelism slope 15% - ошибка в параллелизме
Каждая лаборатория должна определить свое допустимое значение Parallelism slope
Фактор-параллелизм
Критерии оценки воспроизводимости результатов
1. Оценка R2 (Parallelism R2).
Показывает насколько точки близко расположены к графику.
Допускается значение R2 0.98 (предустановлено).
2. Оценка Скорректированных результатов (Corrected result).
Скорректированные результаты - % активности в пересчете на степень разведения.
Должны быть примерно равны.
3 Оценка % Коэффициента вариации между скорректированными
результатами (%CV-CR).
Показывает насколько скорректированные результаты отличаются друг от друга.
Допустимая разница % CV-CR не более 20% (предустановлено)
Результаты активности фактора во всех разведениях
должны попадать в рабочий диапазон измерений теста.
Каждая лаборатория должна определить свои допустимые значения
Parallelism R2, % CV-CR
Параллелизм на ACL TOP
Критерии
Каждая лаборатория должна определить свои допустимые значения критериев
фактора-параллелизма
1. Количество разведений образца.
2. % Разведения. (например: 100%, 50%, 25%, 15%)
3. Значение R2 (Parallelism R2)
4. Значение % Коэффициента вариации между скорректированными результатами
(%CV-CR).
Фактор-параллелизм. Ограничения методики
1. Чувствителен к специфическим и неспецифическим ингибиторам .
2. Информативен в пределах рабочего диапазона теста ( ACL TOP 0.3-150%).
3. Если результаты активности во всех разведениях близки к нулю – оценку
проводить не следует.
Клинический случай №1:
Ингибитор фактора VIII
Пример Ингибитора фактора VIII II типа:
Скрининг :
диапазон:
ПВ : 95%
>70%
АЧТВ : 132 с
нормальный
нормальный диапазон : 24-38
TВ: 23 с
нормальный диапазон : 18-24
с
с
Смешивание :
1 часть ПП + 1 часть НП
АЧТВ: 112 с
Специфичность ингибиторов:
factor VIII
< 0.5% Был подтвержден ингибитор
фактора VIII
factor IX
30%
factor XI
25%
factor XII
21%
Пример Ингибитора фактора VIII II типа:
Скрининг :
ПВ : 95%
нормальный диапазон: >70%
АЧТВ : 132 с нормальный диапазон : 24-38 с
TВ: 23 с
нормальный диапазон : 18-24 с
Смешивание :
1 часть ПП + 1 часть НП
АЧТВ: 112 с
Специфичность ингибиторов:
factor VIII
< 0.5%
factor IX
30%
почему ингибитор фактора VIII ингибирует
остальные факторы?
factor XI
25%
factor XII
21%
FIX тест
АЧТВ (внутренний)
Контактная активация:
PK/ВМК/FXII
поверхности
-FIX дефицитная плазма
-разведеннная ПП или НП
-АЧТВ:
При добавлении FIX пропорционально
укорачивается
Быстрота действия или высокий титр ингибитора
FVIII нейтрализует FVIII присутствующий в FIX
дефицитной плазме, удлинит АЧТВ и понизит
уровень FIX.
FXIIa
FXI
FIX
Fg
FXIa
FIXa + FVIIIa +Ca2+
FIXa
FX
FXa + FVa + Ca2+
FXa
FII
FIIa
Fibrin
Клинический случай №2:
Контаминация гепарином
Пример: нефракц. гепарин 1.25 ед/мл
Фактор VIII параллелизм
Conc
Prim.
value
Corr
Result
100%
4.2 %
4.2 %
50%
12.3 %
24.6 %
25%
13.0 %
52 %
10%
8.2 %
82.5 %
Ошибки параллелизма
Parallelism slope – за допустимыми пределами
r2 вне диапазона
% CV-CR 20%
Клинический случай №3:
пациент на Кумадине
Пример: анти-витамин К
Фактор Х параллелизм
Conc
Prim.
value
Corr
Result
100%
11.3 %
11.3 %
50%
5.7 %
11.5 %
25%
2.9 %
11.6 %
10%
1.4 %
13.8 %
Ошибки параллелизма
Нет ошибок
Спасибо за внимание!