Краткий курс Next Generation Sequencing (NGS) В. Зубов Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН Пущино Содержание Введение Часть I. Технологии 454-секвенирование Флуоресцентные Полупроводниковые Часть II. Приборы Roche (GS 20 – FLX – Titanium – FLX+ - Junior) Illumina (HiSeq 1000 – 2000 – 2500 – MiSeq) Life Technologies (5500 – xl – W) – Ion Torrent (PGM – Ion Proton) Конкуренты Часть III. Наборы Реагенты Приготовление библиотек/матриц Специальные и вспомогательные наборы Часть IV. Биоинформатика и генетика Часть V. Альтернативы и перспективы NNGS clone Torrent Заключение Введение в NGS Начало постгеномной эры Завершение проекта «Геном человека» Национализация Международного Дня ДНК Инвестиции в инновации Геномные гонки Основные участники Лидеры и аутсайдеры NNGS Индивидуальная геномика День Генома Рост производительности NGS Краткая история NGS Большой приз Геномных гонок – 100 млрд.$ Постгеномная эра Проект «Геном человека» 1990 – 2003 годы, 3 млрд.$ Национальный День ДНК (США) – с 25 апреля 2003 г. Revolutionary DNA Sequencing Technologies Бюджетное фининсирование: I пятилетка – 100 000$ и 1000$ за геном 2004 г. – 39 млн.$ 2005 г. – 31 млн.$ 2006 г. – 13 млн.$ 2007 г. – 16 млн.$ 2008 г. – 20 млн.$ II пятилетка – 1000$ за геном 2009 г. – 19 млн.$ 2010 г. – 18 млн.$ 2011 г. – 14 млн.$ Внебюджетное финансирование: > 100 млн.$ - Краткая история NGS • • • • Дореволюционный период завершение проекта «Геном человека» (3 млрд.$); резолюция Конгресса США о Национальном Дне ДНК (25.04.2003); снижение стоимости секвенирования генома человека до 200 млн.$; исчерпание потенциала Сенгеровской технологии секвенирования. Революция 2005 года – появление NGS I пятилетка (2005…2009 годы) • • • • • 2005 г. - появление первого секвенатора нового поколения; 2006 г. - геном за 20 млн.$ (GS 20, 10…20 млн.п.о. за цикл); 2007 г. - геном за 1 млн.$ (GS FLX, ~ 100 млн.п.о. за цикл); 2008 г. - GA II (Illumina, ~ 3 млрд.п.о.) и SOLiD 2.0 (ABI, ~ 6 млрд.п.о); 2009 г. - цена генома опустилась ниже 100 тыс.$. II пятилетка (2010…2014 годы) 2010 г. - HiSeq 2000 (Illumina, 200 млрд.п.о. за цикл); - геном за 10 тыс.$; - 5500xl (Life Tech., 180 млрд.п.о. за цикл). 2011 г. - геном за 5 тыс.$ ?; - PGM (Ion Torrent, 200 млн. п.о. за цикл). 2012 г. - чип Ion 318 к PGM (1 млрд.п.о. за цикл) - HiSeq 2500; 5500xl W; Ion Proton 2013 г. - геном за 1000$ Успехи и неудачи + +/- - NNGS (наносеквенирование) “НАНО” без “НО” не бывает День Генома Dr. James Watson, co-discoverer of the DNA helix and father of the Human Genome Project, became the first human to receive the data encompassing his personal genome sequence at Baylor College of Medicine in Houston in May 31, 2007. James Watson (left) receives a digital copy of his genome sequence from Jonathan Rothberg in May 2007. Уотсон в России (июль 2008 г.) Динамика роста производительности флуоресцентных секвенаторов GA IIx SOLiD Jeremy Preston, PhD (Illumina, Marketing Manager, июль 2009 г.) - http://www.solexa.com/seminars/archive/presentations/200907_JPreston.pdf http://www3.appliedbiosystems.com/AB_Home/applicationstechnologies/SOLiDSystemSequencing/overviewofsolidsystem/index.htm Стоимость секвенирования генома человека • • • • • • 2007 г. – 2008 г. – 2010 г. – 2011 г. – 2012 г. – 2013 г. – 1 млн.$ 100 тыс.$ 10 тыс.$ 5 тыс.$ 9,5 тыс.$ 1 тыс.$ ??? Основные задачи NGS Медицинская генетика Фармакогенетика Этногенетика Эпигенетика Диагностика Трансплантология Криминалистика Биобезопасность Селекционная работа Теория эволюции Происхождение человека Происхождение жизни … … Большой приз Геномных гонок Снижение стоимости секвенирования генома человека до 1000$ за геном приведёт к увеличению объёма рынка секвенирования с 1 до 100 миллиардов долларов Часть I Технологии NGS Общие принципы NGS Пробоподготовка основана на получении клонов ДНК Клоны размещаются на стенке проточной ячейки Через ячейку пропускаются растворы реагентов Реагенты участвуют в синтезе ДНК Информация считывается мегапиксельными сенсорами Ячейка промывается Основные технологии NGS Фирмы Технология секвенирования Производительность (Gb) Продолжительность рабочего цикла (суток) Биолюминесцентная 1 ~ 0,9 Флуоресцентная ДНК-полимеразная 600 10…14 Флуоресцентная ДНК-лигазная 200 10…14 1 ~ 0,2 (пиросеквенирование) Полупроводниковая Пиросеквенирование Краткая история пиросеквенирования Шведский период • 1985 год – шведские учёные Pål Nyren и Arne Lundin разработали чувствительный люминометрический метод определения пирофосфата; • 1987 год – P. Nyren разработал пирофосфатный метод анализа ДНК-полимеразной активности; • 1988 год – E. Hyman предложил использовать этот метод для секвенирования ДНК; • 1990 год – получен патент на пирофосфатный метод секвенирования ДНК; • 1997 год – создана компания «Pyrosequencing» (c 2008 г. - “Biotage AB”). Американский период • 2000 год – в США учреждена компания «454 Life Sciences»; • 2004 год – «454 Life Sciences» получает от NIH гранты на совершенствование метода геномного секвенирования (2,4 млн.$) и на разработку ультрамикрометода секвенирования геномов (5 млн.$); • • • • • 2005 год – появление коммерчески доступных пиросеквенаторов GS 20; 2007 год – выпуск модели GS FLX; 2009 год – GS FLX Titanium; 2010 год – GS Junior; 2011 год – FLX+. Основы пиросеквенирования Технология пиросеквенирования Реагенты для пиросеквенирования ДНК-полимераза Особо чистые дезоксинуклеозидтрифосфаты (T, G и C) α-тио-дезоксиаденозинтрифосфат (A) Сульфурилаза + аденозинфосфосульфат Люцифераза + люциферин Апираза Флуоресцентное секвенирование Пробоподготовка http://seq.molbiol.ru/sch_lib_fr.html Получение клонов ДНК Wildfire technology Технология Complete Genomics In Sequense. September 20, 2011. By Monica Heger … Currently, Complete Genomics is operating 24 machines in its Mountain View, Calif., which can each produce one genome per day. … SBS / SBL (sequencing by synthesis / sequencing by ligation) Полимеразный синтез ДНК Лигазный синтез ДНК N 3 Cy3 Cy3 - XXXX - S ~ P - NNNNN - OH P - NNNNN- P US Pat.№ 7795424 ~ S - XXXX - Cy3 N 3 TCEP tris(2-carboxy-ethyl)phosphine AgNO3 Phosphatase 5’ 3’ 3’ 5’ Cluster-SBS Technology Кластеры ДНК SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection) 2 Base Pair Encoding Особенности технологий параллельного секвенирования ДНК Полупроводниковое секвенирование Основные этапы технологии An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing / J.M. Rothberg et al. // Nature. – 2011. – Vol.475. – P.348–352. Реагенты для полупроводникового секвенирования ДНК-полимераза Особо чистые дезоксинуклеозидтрифосфаты Война клонов Технология Диаметр клонов Количество молекул ДНК 10…30 мкм 1…10 млн. 1…2 мкм 1…2 тыс. 1…2 мкм 2…3 тыс. 1…3 мкм 2…3 тыс. 0,2…0,3 мкм 200…600 Часть II Секвенаторы Пиросеквенаторы FLX и Junior GS FLX Titanium (2009 г.) Количество лунок увеличено до 3,6 млн. (у GS 20 и FLX - 1,6 млн.) Количество циклов увеличено в 2 раза (у GS 20 и FLX – 100 циклов) Длина чтения - >400 п.о. (GS 20 - >100 п.о., FLX - >200 п.о.) Производительность - >0,5 млрд. п.о. (за 10 часов). Проточные ячейки пиросеквенаторов Флуоресцентные секвенаторы (флуоресцентные микроскопы) Темнопольный Эпифлуоресцентный Форматы проточных ячеек 2х8 2х1 2х4 2х8 Геномные модели HiSeq 1000 HiSeq 2000 HiSeq 2500 5500 5500xl 5500 W Клинические модели MiSeq Mini-20 Производительность секвенаторов 1 Tbp 100 Gbp 10 Gbp 1 Gbp Наномонстры HeliScope™ PacBio RS Полупроводниковые секвенаторы PGM Ion Proton PGM Внешний вид и общее устройство PGM An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing / J.M. Rothberg et al. // Nature. – 2011. – Vol.475. – P.348–352. Принципиальная схема полупроводникового секвенатора An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing / J.M. Rothberg et al. // Nature. – 2011. – Vol.475. – P.348–352. Экспансия PGM PGM в Индии PGM в Чили Сенсорные чипы и проточные ячейки Структура pH-сенсорных чипов Ion 314 Ion 318 Ion 316 Ion Proton I Контактная площадка PGM Виды на PGM Виды на Ion Proton Чип Ion Proton I (165 Mp) Ion Proton Sequencer and Jonathan Rothberg Jonathan Rothberg – основатель компании 454 Life Sciences Dr. Rothberg was born in 1963 in New Haven, M.S., M.Phil, and Ph.D. in biology from Yale University. Dr. Rothberg is the founder of 454 Life Sciences, Clarifi Corporation, CuraGen Corporation, The Rothberg Institute for Childhood Diseases, and the co-founder and Chairman of RainDance Technologies. Jonathan M. Rothberg (вождь NGS) http://www.profimedia.si/picture/personalized-medicine-jonathan-m-rothberg/0089893207/ Основные модели секвенаторов 2005 GS 20 2006 2007 2008 GS FLX GA 1G 2009 2010 Titanium GS Junior GA II……x………e HiSeq 2000 SOLiD 2.0 SOLiD 3 2011 FLX+ HiSeq 1000 MiSeq SOLiD 4 5500xl 5500 PGM PacBio RS MaxSeq Смена поколений Цены (тыс. $, май 2011 г.) FLX / Junior 500 / 108 + 30 / 16 HiSeq 2000 / 1000 690 / 560 + 55 / 55 5500xl / 5500 595 / 349 + 54 / 54 PGM 49,5 + 18 http://www.molecularecologist.com/next-gen-table-3a/ Раздел сфер влияния Флуоресцентное секвенирование Полупроводниковое секвенирование Практика Наука Ре секвенирование геномов Медицинская генетика Фармакогенетика Этногенетика Эпигенетика Диагностика Трансплантология Криминалистика Биобезопасность Селекционная работа Секвенирование геномов de novo Теория эволюции Происхождение человека Происхождение жизни NNGS Экспрессная генодигностика инфекционных болезней (?) Благодарю за внимание