Методы анализа генов

12
МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОВ
Гены являются молекулярным субстратом наследственности. Структура и локализация генов в геноме определяет свойства организма. При функционировании генома
и в результате взаимодействия генома с факторами среды в
ДНК возникают мутации. Мутации могут нарушать клеточный и тканевой метаболизм, что приводит к возникновению генетического заболевания. Методы рекомбинантной
ДНК создали предпосылку для разроботки новых методов
молекулярной диагностики с большей разрешающей способностью и, следовательно, более точных и информативных. Об абсолютном преимуществе молекулярного подхода
говорит тот факт, что в отличие от других методов диагностики, ограниченных выявлением исключительно фенотипических аспектов, анализ ДНК, направленный непосредственно на изучение генотипа, является единственным методом, изучающим первичные нарушения (мутации), то
есть именно первопричину возникновения болезней.
Технологии рекомбинантных ДНК позволяют определить нормальные гены и/или мутантные их варианты,
установить носителей мутантного гена, диагностировать
генетическую патологию до рождения или в предсимптоматической стадии, а в ближайшем будущем осуществлять
генную терапию.
Молекулярное изучение генов может осуществляться
многими путями в зависимости от поставленной цели:
196
1. секвенирование ДНК для определения первичной
структуры гена;
2. метод Саузерн-блот для определения позиции гена в
геноме;
3. метод Нозерн-блот для определения экспрессии генов
(анализ мРНК);
4. Метод Вестерн-блот для определения белкового продукта гена;
5. Метод ПЦР для определения нормального или мутантного гена;
В лабораториях молекулярной биологии используются
различные варианты перечисленных методов.
В большинстве методов применяется электрофорез макромолекул
в агарозном или полиакриламидном геле. При электрофорезе молекулы мигрируют в электрическом поле. Будучи отрицательно заряжены,
фрагменты молекул нуклеиновых кислот в электрическом поле перемещаются с разной скоростью в зависимости от молекулярной массы.
Более короткие фрагменты перемещаются быстрее, в то время как более длинные - медленнее. Для определения размеров фрагментов в геле, одновременно с интересующими фрагментами помещаются на соседние дорожки и фрагменты - маркеры длины. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть обнаружены в геле при окраске флуоресцентным красителем, или по радиоактивной метке. В случае радиоактивного мечения, фрагменты определяются с помощью авторадиографии,
которая заключается в накладывании на гель светочувствительной
пленки.
Секвенирование ДНК
Анализ последовательностей нуклеотидов первичной
структуры ДНК может быть осуществлен двумя путями:
1) химическим (метод Максама - Гильберта), при котором используются химические реакции последовательного расщепления фрагмента ДНК на отдельные нуклеотиды (рис. 12.1), однако метод трудоемкий, сложный и в
последнее время не используется; 2) ферментативным
(метод Сэнгера), при котором фрагменты ДНК синтези197
руются in vitro таким образом, что реакция завершается в
положении, соответствующем определенному основанию.
Для определения последовательности нуклеотидов любым из этих методов, ДНК подвергается серии из 4-ех отдельных реакций, каждая из которых является специфической для одного из 4 видов нуклеотидов. При одновременном электрофорезе продукты реакции на 4 соседних
дорожках будут мигрировать по ним с разной скоростью.
Размер синтезированных фрагментов можно определить,
а, следовательно, может быть определен и порядок
нуклеотидов в ДНК (рис 12.2).
Рис. 12.1. Секвенирование ДНК путем химического расщепления
(Maxam-Gilbert)
Метод Сэнгера (дидезокси)
Метод использует ферментативный синтез одной цепи, комплементарной клонированной матрице. Синтез ДНК
останавливается добавлением одного из дидезоксинуклео198
зидтрифосфата, аналога нуклеотидов. Дидезоксинуклеозидтрифосфат содержит в позиции 3' не ОН-группу а Нгруппу, которая препятствует полимеризации нуклеотидов.
Используя четыре разных аналога дидезокси в процессе
синтеза новой цепи ДНК, можно определить каждый нуклеотид матричной цепи. Электрофорез полученных фрагментов позволяет определить порядок нуклеотидов ДНК
(Рис. 12.2).
Рис. 12.2. Секвенирование ДНК методом дидеокси (метод Singer)
В последние годы, применяются методы автоматического секвенирования, основанные на методе дидезокси.
С целью диагностики носителей мутантного гена результат секвенирования сравнивают с первичной структурой гена. К сожалению, не для всех генов человека к настоящему моменту известны последовательности нуклеотидов,
поэтому применяются и непрямые методы диагностики:
сцепление с близлежащими ДНК-маркерами (определение
199
гипервариабельных мини- и микросателлитных повторов),
определение характерных для данного гена полиморфных
сайтов рестрикции, гибридизация со специфическими зондами и др.
Метод Саузерн-блот
Для анализа генов необходимо определить локализацию сайтов рестрикции. Эта информация используется для
сравнения гомологичных генов разных видов, для анализа
организации интронов, для выбора фрагмента, подвергающегося клонированию. Расположение сайтов рестрикции в
изучаемом гене можно определить без клонирования гена,
используя молекулярные зонды (меченные радиоактивно
или флуоресцентным красителем), комплементарные изучаемой последовательности.
Анализ состоит из последовательности следующих
этапов:
(1) выделение высокомолекулярной геномной ДНК из
клетки;
(2) ферментативное расщепление ДНК разными рестриктазами с образованием фрагментов разного
размера;
(3) разделение рестрикционных фрагментов в агарозном
геле;
(4) денатурация фрагментов ДНК щелочным раствором;
(5) нейтрализация геля буферным раствором;
(6) капиллярный перенос фрагментов на нейлоновый
или нитроцеллюлезный фильтр
(7) гибридизация с одноцепочечными радиоактивными
зондами;
(8) авторадиография для выявления гибридов: исследуемая ДНК / зонд.
200
Перенос фрагментов на нитроцеллюлезный фильтрблоттинг - предложил Эдвард Саузерн (рис. 12.3).
Рис. 12.3. Принципы переноса нуклеиновых кислот на фильтры и гибридизация с радиоактивными зондами
(Саузерн-блот – для ДНК и Норзерн-блот – для РНК)
В результате анализа полученного материала можно
определить наличие или отсутствие некоторых сайтов рестрикции, характерных для изучаемого гена, которые ассоциируются с определенными мутациями. Различные варианты расположения сайтов рестрикции в ДНК у двух разных людей называют Полиморфизмом Длины Рестрикционных Фрагментов (ПДРФ). Этот полиморфизм используется как генетический маркер в изучении генотипа.
Метод Норзерн-блот
Метод состоит в переносе разделенных молекул РНК
на нейлоновые или нитроцеллюлезные фильтры с последу201
ющей гибридизацией с мечеными зондами. Метод схож с
методом Саузерн-блот, за исключением того, что выделенные и очищенные мРНК не подвергают рестрикции, а электрофорез происходит в денатурирующих условиях.
Метод Норзерн-блот позволяет определить транскрипты анализируемых генов, кДНК, размеры генов.
Метод Вестерн-блот
Этот метод заключается в определении специфического белка
из смеси клеточных белков. Для этого белки разделяют электрофорезом
в денатурирующих условиях, в присутствии додецилсульфата Nа. Белки, разделенные по молекулярной массе, переносятся на плотный
фильтр и обрабатываются специфическими мечеными антителами. Этот
метод позволяет определить наличие или отсутствие белка, его размер,
скорость экспрессии гена.
Техника ПЦР в анализе генов
Метод ПЦР используется для выборочного размножения определенной последовательности гена. В результате
получают гомогенные популяции фрагментов, которые используются в исследованиях по молекулярной генетике или
диагностике (рис. 12.4, 12.5). Для осуществления амплификации определенной последовательности необходимо знать
первичную структуру нормального или мутантного гена и
синтезировать специфические праймеры, комплементарные
концам интересующих фрагментов. Праймеры представляют собой искусственно синтезированные одноцепочечные
олигонуклеотиды (20-30 нуклеотидов). ПЦР основана на
гибридизации исследуемой последовательности ДНК праймер и полуконсервативной репликации ДНК (см. главу
11).
Преимущества метода ПЦР следующие: могут использоваться минимальные количества ДНК, за несколько
часов получают более миллиона копий одинаковых фрагментов, благодаря специфичности праймера амплифициру202
ется только нужный фрагмент, который затем используется
как зонд в других методах.
Рис. 12.4. Использование техники ПЦР для обнаружения делеций
203
Рис. 12.5. Использование техники ПЦР для обнаружения точечных мутаций
при помощи специфичных для нормального гена праймеров
Практическое применение метода ПЦР:
- выявление известных мутаций у больных или носителей;
- пренатальная и пресимптоматическая диагностика
генетических болезней;
- определение генов предрасположенности к распространенным болезням взрослого населения (коронаропатии, гипертония, психические расстройства и др.);
- ранняя диагностика и помощь в прогнозе онкологических заболеваний;
- пренатальное определение пола;
- обнаружение присутствия патогенных возбудителей
(вирусов, бактерий);
- опознание личности методом геномной дактилоскопии;
- установление отцовства, материнства;
204
-
типирование тканевых антигенов HLA.
Гибридизация in situ
Гибридизация in situ представляет собой молекулярный метод, при котором специфический меченый зонд
может гибридизоваться прямо на цитологическом препарате, выявляя:
- определенный тип мРНК в какой-то клетке или ткани;
- ген на хромосоме или фрагменты хромосомы;
- изменение количества мРНК (а значит и активности гена) в зависимости от периода онтогенеза или типа ткани.
- наличие в клетке вирусной ДНК;
- субмикроскопические делеции;
- наличие генов, отвечающих за развитие рака, их локализацию и уровень их экспрессии.
В последние годы используется метод FISH
(Fluorescent In Situ Hybridization), при котором зонды метятся различными флуоресцентными красителями. Метод FISH
очень прост, используется и на архивных препаратах,
быстрый, не вызывает разрушения клеток (рис. 12.6).
Рис. 12.6.205
Метод FISH
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Контроль знаний:
Дайте определение: секвенирование ДНК, гибридизация
нуклеиновых кислот, Саузерн-блот, Нозерн-блот, гибридизация in situ, авторадиография, праймер, молекулярные зонды.
Какие молекулярные методы используются для исследования нуклеиновых кислот?
Каково практическое применение этих методов?
В чем состоят принципы секвенирования ДНК?
Каковы этапы метода Саузерн-блот?
В чем преимущества и недостатки метода Саузерн-блот?
В чем состоят практические преимущества техники
ПЦР?
206