2 469 322(13) C1

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
(19)
RU
(11)
2 469 322
(13)
C1
(51) МПК
G01N 33/48 (2006.01)
G01N 33/50 (2006.01)
C12Q 1/68 (2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
(12) ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21)(22) Заявка: 2011142014/15, 17.10.2011
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
17.10.2011
(45) Опубликовано: 10.12.2012 Бюл. № 34
C 1
2 4 6 9 3 2 2
R U
C 1
Адрес для переписки:
610027, г.Киров, ул. Красноармейская, 72,
ФГУ "КНИИГиПК ФМБА России", С.А.
Козлову
(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ИНГИБИТОРНОЙ ФОРМЫ
ГЕМОФИЛИИ А
(57) Реферат:
Изобретение
относится
к
области
медицины, а именно к гематологии. Сущность
способа прогнозирования риска развития
ингибиторной
формы
гемофилии
А
заключается в том, что у больного берут 5 мл
крови, стабилизированной гепарином или
ЭДТА, выделяют взвесь лимфоцитов на
градиенте плотности фиколл-верографин и
определяют HLA-фенотип пациента (локусы А
и В) в микролимфоцитотоксическом тесте с
набором гистотипирующих сывороток. При
обнаружении
в
фенотипе
больного
антигена HLA-A28 прогнозируют повышенный
риск продукции ингибиторов к препаратам
фактора VIII. При обнаружении у пациента
антигена HLA-B8 прогнозируют сниженный
риск развития осложнения заместительной
терапии. Использование заявленного способа
позволяет
повысить
эффективность
прогнозирования
риска
развития
ингибиторной формы гемофилии А. 3 пр., 1
табл.
(56) (продолжение):
to FVIII in hemophilia A: an overview of risk factors. Clin Rev Allergy Immunol. 2009 Oct; 37(2), p.58-66.
Найдено в PubMed, статья. BRIL W.S. et al HLA class II genotype and factor VIII inhibitors in mild
haemophilia A patients with an Arg593 to Cys mutation. Haemophilia. 2004 Sep; 10(5), p.509-14, реферат. EP
1511859 A1, 09.03.2005.
Ñòð.: 1
ru
2 4 6 9 3 2 2
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: PAVLOVA A. et al HLA genotype in patients
with acquired haemophilia A. Haemophilia. 2010
May; 16(102), p.107-12. Найдено в PubMed,
статья. BAGNALL R.D. Recurrent inversion
breaking intron 1 of the factor VIII gene is a
frequent cause of severe hemophilia A. Blood.
2002 Jan 1; 99(1), p.168-74. Найдено в PubMed,
статья. CHOSH К. et al Immune response (см.
прод.)
(73) Патентообладатель(и):
Федеральное государственное учреждение
"Кировский научно-исследовательский
институт гематологии и переливания крови
Федерального медико-биологического
агентства" (RU)
R U
Приоритет(ы):
(22) Дата подачи заявки: 17.10.2011
(72) Автор(ы):
Зайцева Галина Алексеевна (RU),
Ивашкина Елена Поликарповна (RU),
Ситников Сергей Алексеевич (RU),
Ворожцова Светлана Ивановна (RU)
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
2 469 322
(13)
C1
(51) Int. Cl.
G01N 33/48 (2006.01)
G01N 33/50 (2006.01)
C12Q 1/68 (2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY
(12) ABSTRACT
OF INVENTION
(72) Inventor(s):
Zajtseva Galina Alekseevna (RU),
Ivashkina Elena Polikarpovna (RU),
Sitnikov Sergej Alekseevich (RU),
Vorozhtsova Svetlana Ivanovna (RU)
(21)(22) Application: 2011142014/15, 17.10.2011
(24) Effective date for property rights:
17.10.2011
(45) Date of publication: 10.12.2012 Bull. 34
(57) Abstract:
FIELD: medicine.
SUBSTANCE: blood 5 ml stabilised by heparin
or EDTA is taken from a patient; a ficoll-verografin
density lymphocyte suspension is recovered, and
patient's HLA-phenotype (A and B loci) is described
by microlymphotoxic test with a kit of histotyping
serums. If the antigen HLA-A28 is found in the
patient's phenotype, a higher risk of production of
R U
2 4 6 9 3 2 2
factor VIII preparation inhibitors is predicted. If
the antigen HLA-B8 is found in the patient, a lower
risk of developing complication of replacement
therapy is predicted.
EFFECT: use of the declared method enables
higher effectiveness of prediction of a risk of
developing inhibitory form of haemophilia A.
3 ex, 1 tbl
Ñòð.: 2
en
C 1
C 1
(54) METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF DEVELOPING INHIBITORY FORM OF HAEMOPHILIA A
2 4 6 9 3 2 2
Mail address:
610027, g.Kirov, ul. Krasnoarmejskaja, 72, FGU
"KNIIGiPK FMBA Rossii", S.A. Kozlovu
(73) Proprietor(s):
Federal'noe gosudarstvennoe uchrezhdenie
"Kirovskij nauchno-issledovatel'skij institut
gematologii i perelivanija krovi Federal'nogo
mediko-biologicheskogo agentstva" (RU)
R U
Priority:
(22) Date of filing: 17.10.2011
RU 2 469 322 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Изобретение относится к области медицины, а именно к гематологии, и касается
определения факторов риска выработки ингибиторов у больных гемофилией А,
получающих заместительную терапию препаратами фактора VIII.
Гемофилия - это наследственное заболевание системы гемостаза,
характеризующееся дефицитом фактора VIII (гемофилия А) или IX (гемофилия В).
Распространенность гемофилии А составляет 1:10000, гемофилии В - 1:30000-50000 лиц
мужского пола. К настоящему времени картированы гены, контролирующие синтез
факторов VIII и IX и отвечающие за развитие гемофилии. Тяжесть клинического
течения заболевания зависит от уровня фактора. Около 70% больных страдают
тяжелыми и среднетяжелыми формами течения гемофилии.
Диагноз гемофилии устанавливается на основании соответствующих клинических
проявлений, генеалогических данных, результатов исследования показателей
гемостаза: активированного частичного (парциального) тромбопластинового
времени и активности факторов VIII и IX. Оказание помощи больным гемофилией
осуществляется врачами-гематологами. Заместительная терапия проводится путем
внутривенного введения факторов свертывания. К числу наиболее тяжелых
осложнений заместительной терапии относится появление ингибиторов (антител) к
факторам свертывания. Антитела к фактору VIII вырабатываются значительно чаще
(у 10-35% больных), чем к фактору IX (у 3-5%). Появление антител сопровождается
быстрой инактивацией экзогенного фактора, в результате эффективность лечения
снижается и кровотечение может приобрести неконтролируемый характер. Фактором
риска развития ингибирования считают тяжесть заболевания, других факторов риска
не установлено.
Большим авторским коллективом разработан протокол ведения больных
гемофилией, в котором представлены требования к диагностике, профилактике,
организации медицинской помощи данной категории пациентов [1]. Однако в
протоколе отсутствуют какие-либо критерии для определения предрасположенности
больных к продукции ингибиторов. Между тем, знание таких критериев позволило бы
выделить среди пациентов лиц с повышенным риском ингибирования, которые
нуждаются в систематическом мониторинге появления антител и своевременной их
элиминации.
Целью изобретения является разработка способа прогнозирования развития
ингибиторной формы гемофилии А у больных, получающих заместительную терапию
препаратами фактора VIII.
Согласно существующим на сегодняшний день данным, развитие каскада
иммунного ответа проходит ряд этапов: презентацию антигена (процессинг),
амплификацию Т-хелперов с различной функциональной активностью, выделение
цитокинов различного назначения, передачу сигналов на эффекторные клетки,
которые завершают иммунный ответ или антителообразованием, или
цитотоксическим лизисом. Чаще всего оба эти процесса сочетаются, но один тип
ответа является доминирующим, другой - вспомогательным. При этом на всех этапах
иммунного каскада обязательным является участие продуктов системы HLA [2-5]. В
связи с этим логично предположить, что такая особенность иммунного ответа, как
выработка антител к факторам свертывания у больных гемофилией, может
ассоциироваться с конкретными антигенами HLA-комплекса. Исходя из этого
предположения, изучили характер распределения HLA-антигенов у 107 больных
гемофилией А, из которых у 49 была диагностирована ингибиторная форма
заболевания. Тестирование HLA-антигенов I класса (локусы А и В) осуществляли с
Ñòð.: 3
DE
RU 2 469 322 C1
5
10
15
20
25
30
35
помощью стандартного лимфоцитоксического теста с набором типирующих
сывороток, производимых ЗАО «Гисанс» (С.Петербург), регистрационное
удостоверение №ФСР 2008/02431 от 9 апреля 2008 г.). Идентифицировали 8 антигенов
локуса А и 16 антигенов локуса В. Лимфоциты для постановки теста выделяли из
венозной гепаринизированной крови больных методом градиентного
центрифугирования с применением раствора фиколл-верографина; тест выполняли в
микропланшетах Терасаки.
Частоту встречаемости изучавшихся антигенов определяли как процентное
отношение индивидов, несущих антиген, к общему числу обследованных в группе. Для
установления существенных различий в характере распределения антигенов в
сравниваемых группах рассчитывали критерий согласия X 2.
Для выявления особенностей в характере распределения HLA-антигенов у
обследованных больных провели сопоставление частоты их встречаемости с
аналогичными параметрами в группе сравнения, которая состояла из 795 здоровых
лиц (доноры крови и ее компонентов, прошедшие медицинское освидетельствование).
Результаты представлены в таблице.
Количественную оценку ассоциации между HLA-антигенами и развитием
ингибиторной формы гемофилии устанавливали путем расчета показателя
относительного риска (RR) по формуле [2, 6]:
где fn - число носителей конкретного антигена среди больных,
fk - число носителей того же антигена в группе здоровых;
fn и fk выражаются в десятичных дробях.
При RR>2,0 констатируется положительная ассоциация между антигеном и
заболеванием (предрасположенность), если RR<1,0, то данный антиген
рассматривается как протекторный генетический признак.
Как видно из представленных в таблице данных, достоверные отличия в частоте
встречаемости HLA-антигенов выявлены для двух специфичностей: А28 чаще
идентифицирован в общей группе больных (X 2=4,5; RR=2,3) и у пациентов с
ингибиторной формой (X 2=6,5; RR=3,3). Антиген В8 существенно реже тестировался в
лимфоцитах больных с наличием ингибиторов (X 2=4,1; RR=0,14). Следует отметить,
что повышение частоты встречаемости антигена А28 в общей группе обследованных
больных объясняется наличием среди них 49 пациентов с ингибиторной формой.
40
Таблица
Частота встречаемости HLA - антигенов класса I у больных гемофилией
Частота выявления, %
HLAантигены
45
50
Здоровые
n=795
Больные гемофилией
общая группа
n=107
с наличием ингибиторов
n=49
без ингибиторов
n=58
А1
22,9
24,3
18,4
29,3
А2
47,0
50,5
53,1
48,3
34,5
A3
33,7
32,7
30,6
А9
27,2
19,6
26,5
13,8
А10
16,3
23,3
24,5
22,4
A11
13,6
10,3
8,2
12,1
А19
13,1
14,0
10,2
17,2
А28
4,8
10,3*
14,3**
6,9
В5
11,6
12,1
14,3
10,3
Ñòð.: 4
RU 2 469 322 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
В7
26,2
28,9
30,6
В8
12,8
8,4
2,0*
27,6
13,8
В12
15,2
17,7
13,4
17,2
В13
10,3
11,2
14,3
8,6
В14
4,8
4,7
8,2
1,7
В15
11,5
11,2
12,2
10,3
В16
7,7
12,1
16,3
8,6
В17
7,0
10,3
10,2
10,3
В18
11,3
14,0
10,2
17,2
В21
4,0
6,5
8,2
5,2
В22
5,4
1,9
0,0
3,4
В27
11,0
13,1
12,2
13,8
В35
24,8
22,4
26,5
19,0
В40
12,2
9,3
6,1
12,1
В41
2,4
3,7
6,1
1,7
Примечание: * различия достоверны при p<0,05; ** - p<0,01.
Таким образом, согласно полученным результатам, риск появления ингибиторов
ассоциируется с наличием в фенотипе больного антигена HLA-А28: он в 3,3 раза выше,
чем при его отсутствии. Протективное значение показал антиген HLA-B8, который
снижает указанный риск (RR=0,14).
На основании представленных данных сделан вывод о том, что маркером
генетической предрасположенности к выработке ингибиторов у больных гемофилией
являются антигены HLA-A28 и HLA-B8, первый из которых повышает риск развития
этого осложнения, тогда как второй снижает его.
Разработанный способ определения предрасположенности больных гемофилией А
к выработке ингибиторов позволяет выделить группу пациентов с повышенным
риском развития этого тяжелого осложнения, нуждающихся в систематическом
мониторинге появления антител для своевременного проведения необходимых
лечебных мероприятий (плазмаферез, экстракорпоральная иммуносорбция, индукция
иммунной толерантности и др.). Способ найдет применение в клиникодиагностических лабораториях специализированных лечебных учреждений,
оказывающих медицинскую помощь больным гемофилией; предлагаемый метод
исследования технически и экономически доступен.
Клинические примеры
1. Больной А.Д.В., 1979 г.р.
Диагноз: Гемофилия А, среднетяжелая форма; рецидивирующий гемартроз левого
плечевого сустава; множественная артропатия.
Дата поступления: 02.11.2009 г.
Дата выписки: 19.11.2009 г.
Показатели коагуляционного гемостаза от 03.11.2009 г.: фибриноген 2,75 г/л;
протромбиновый индекс 97%; индекс АПТВ 2,82; ф.VIII 2%; тромбиновое время 16 с.;
РФМК 35 мкг/мл; фибринолитическая активность (по Коваржик) 11 мин;
антитромбин III 100%; ингибиторы к ф.VIII 1,15 ед./мл.
Лечение: Immunate 1000 ед., преднизолон по схеме, плазмаферез (1 процедура).
Даны рекомендации: профилактически переливать по 2000 ед. фактора VIII 3 раза в
неделю.
HLA - фенотип: А26, 28; В 14, 15.
2. Больной П.П.Н., 1988 г.р.
Диагноз: гемофилия А, среднетяжелая форма; десневое кровотечение.
Дата поступления 02.08.2010 г.
Ñòð.: 5
RU 2 469 322 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Дата выписки: 06.08.2010 г.
Показатели коагуляционного гемостаза: фибриноген 3,5 г/л; ф.VIII 2%;
протромбиновый индекс 82%; индекс АПТВ 2,21; тромбиновое время 17 с; РФМК 50
мкг/мл; фибринолитическая активность 9 мин, антитромбин III 125%; ингибиторы к
ф.VIII 1,6 ед./мл.
Лечение: концентрат ф.VIII 6000 ед.
Даны рекомендации: профилактически переливать по 2000 ед. фактора VIII 3 раза в
неделю.
HLA-фенотип: А11, 28; В15, 35; С4
3. Больной М.А.Н., 1956 г.р.
Диагноз: гемофилия А, среднетяжелая форма, гематома забрюшинная справа,
постгеморрагическая анемия.
Дата поступления: 10.09.2008 г.
Дата выписки: 13.10.2008 г.
Показатели коагуляционного гемостаза: фибриноген 3,5 г/л; ф.VIII 2%;
протромбиновый индекс 100%; индекс АПТВ 1,8; тромбиновое время 17 с.; РФМК 75
мкг/мл; антитромбин III 100%; фибринолитическая активность 20 мин, ингибиторы к
ф.VIII не обнаружены.
Лечение: концентрат ф.VIII 48500 ед., плазмаферез (4 процедуры).
Даны рекомендации: профилактически переливать по 2000 ед. фактора VIII 3 раза в
неделю.
HLA - фенотип: A1, 3; B8, 35; C4.
Таким образом, у больных с наличием в HLA-фенотипе антигена А28 (примеры 1
и 2) развилась ингибиторная форма гемофилии А, а у больного, имевшего в фенотипе
антиген В 8, несмотря на высокую лечебную дозу концентрата фактора VIII,
ингибиторы не появились.
Литература
1. Андреев Ю.Н., Баркаган З.С., Буевич Е.И. и др. Болезнь Виллебранда.
Гемофилия // Протоколы ведения больных. М., 2009. - 197 с.
2. Зарецкая Ю.М. Клиническая иммуногенетика. - М., 1983. 208 с.
3. Хаитов P.M., Алексеев Л.П. Физиологическая роль главного комплекса
гистосовместимости человека // Иммунология. - 2001. - №3. - С.4-12.
4. Хаитов P.M., Алексеев Л.П. Геномика HLA: новые возможности молекулярной
генетики человека в диагностике и терапии. - Молек. медицина. - 2003. - №1. - С.17-31.
5. Dausset Y., Contu L. The MNC and immune response in man // Immunol. - 80.4 th Int.
Congr. Immunol., Paris, Yuli, 1980. - P.513-529.
6. Sveygaard A., Ryder L. P. HLA and disease associations: detecting the strongest
associations // Tissue Antigens. - 1994. - V.43. - P.18-27.
Формула изобретения
Способ прогнозирования риска развития ингибиторной формы гемофилии А,
включающий, наряду с исследованием показателей гемостаза, типирование
антигенов HLA класса I и при наличии в фенотипе больного антигена HLA-А28
прогнозируют повышенный риск появления ингибиторов к препаратам фактора VIII,
а у носителей антигена HLA-B8 риск развития этого осложнения заместительной
терапии снижен.
Ñòð.: 6
CL