На правах рукописи Тарандовский Иван Дмитриевич
реклама
На правах рукописи Тарандовский Иван Дмитриевич ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ОБРАЗОВАНИЯ ДВУХ ПИКОВ НА КРИВОЙ ГЕНЕРАЦИИ ТРОМБИНА И ВОЗМОЖНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ЭТОГО ЭФФЕКТА ДЛЯ ПРЕДСКАЗАНИЯ ГЕМОРРАГИЧЕСКИХ ОСЛОЖНЕНИЙ 03.01.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» Российской академии наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Атауллаханов Фазоил Иноятович Официальные оппоненты: Кондрашова Мария Николаевна, доктор биологических наук, ФГБУ «Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН», главный научный сотрудник лаборатории Энергетики биологических систем Дрозд Наталья Николаевна, доктор билологических наук, ФГБУ «Гематологический научный центр МЗ» Минздрава России, ведущий научный сотрудник лаборатории Патологии и фармакологии гемостаза Bедущая организация: Научно-исследовательский институт физикохимической биологии имени А. Н. Белозерского Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова Защита диссертации состоится « 17 » декабря 2013 года в _11__часов на заседании Диссертационного совета Д.002.252.01 при ФГБУН «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАН по адресу: г.Москва, ул. Саморы Машела, д.1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАН. Автореферат разослан « 13 » ноября 2013 года Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Николаева Ирина Сергеевна 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Система гемостаза является одной из важнейших систем организма, служащей для предотвращения кровопотери при нарушении целостности сосуда. Результатом работы этой системы является тромб, локализованный в месте повреждения сосуда и препятствующий выходу крови из него. Изучение этой системы является важной задачей для понимания принципов ее работы и предупреждения тромбозов и кровотечений в клинике. В настоящее время существует множество методов исследования свертывания. Тромбоцитарную часть системы гемостаза изучают, в основном, с помощью агрегометрии, микроскопии и проточной цитометрии. Для диагностики плазменного звена помимо исследования активности отдельных плазменных белков существуют так называемые интегральные тесты. Они призваны оценивать работу системы свертывания в целом. Самыми простыми из таких тестов являются времена свертывания, однако, на сегодняшний момент стало ясно, что они не дают достаточной информации о функционировании системы. В связи с этим развиваются новые интегральные тесты, более чувствительные к патологиям плазменного звена. Кроме того, активно исследуются возможности проводить эти тесты с участием тромбоцитов. К современным интегральным тестам можно отнести тромбоэластографию, тест тромбодинамики и тест генерации тромбина (ТГТ), которому, в основном, и посвящена данная работа. Идея метода заключается в измерении кинетики производства и расходования тромбина в сворачивающейся крови или плазме крови с помощью предварительно добавленного в образец флюорогенного субстрата, специфичного к тромбину [Regnault, V., et al. 2004]. Как правило, в результате получают кривую зависимости концентрации тромбина от времени с одним максимумом. В данной работе впервые было показано, что при свертывании богатой тромбоцитами плазмы ингибиторы активации тромбоцитов способствуют образованию двух максимумов на кривой генерации тромбина. Был определен механизм этого явления и предложена новая модификация теста генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме, содержащей небольшую концентрацию ингибитора активации тромбоцитов. Цель работы. Исследовать механизм образования двух максимумов на кривой генерации тромбина и оценить возможность применения этого эффекта для предсказания кровотечений у пациентов с тяжелой формой гемофилии А. Задачи исследования. 1. Исследовать влияние малых концентраций ингибиторов активации тромбоцитов на генерацию тромбина в богатой тромбоцитами плазме, показав возможность образования двух максимумов на кривой генерации тромбина. 2. Исследовать влияние этих ингибиторов на секрецию α-гранул и экспрессию фосфатидилсерина тромбоцитами с помощью проточного цитометра. 3. Разработать метод оценки параметров кривой генерации тромбина с двумя пиками. 3 4. Исследовать статус системы свертывания у пациентов с легким и тяжелым течениями тяжелой формы гемофилии А с помощью теста генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме и в присутствии небольшой концентрации ингибитора тромбоцитов, позволяющей получить два пика на кривой. Сравнить полученные результаты с данными других современных интегральных тестов. Научная новизна. Впервые показано, что при добавлении в богатую тромбоцитами плазму веществ, ингибирующих активацию тромбоцитов, на кривой генерации тромбина образуются два пика. Определен механизм образования двух максимумов на этой кривой. При добавлении ингибиторов активации тромбоцитов скорость экспрессии фосфатидилсерина на них снижается. Вследствие этого фосфолипидная поверхность, предоставляемая активированными тромбоцитами, появляется в плазме позже, и пик производства тромбина разделяется на два. Первый пик формируется, главным образом, за счет реакций свертывания на фосфолипидах плазмы и секреции α-гранулярных белков, на которые исследованные ингибиторы в выбранных концентрациях влияния не оказывали. Второй пик на кривой генерации тромбина формируется только за счет замедленного экспонирования фосфатидилсерина тромбоцитами. Далее был разработан метод анализа параметров двух пиков, базирующийся на аппроксимации кривой экстремальным распределением первого типа (распределением Гумбеля). Предложена возможность создания новой модификации теста генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме, в основу которой положено явление образования двух пиков на кривой генерации тромбина при добавлении диметилсульфоксида. Было показано, что амплитуда второго пика и эндогенный тромбиновый потенциал в тесте генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме являются единственными параметрами, достоверно отличающимися между группами пациентов с разной тенденцией к кровоточивости. Научно-практическое значение. В данной работе ингибиторы тромбоцитов использовали в концентрациях, близких к применяемым в лабораторнодиагностической и клинической практике. Появление двух пиков на кривой генерации тромбина может свидетельствовать о том, что тромбоциты донора демонстрируют замедленную скорость экспонирования фосфатидилсерина. Эта информация может быть полезной при выборе доз антиагрегантов и антикоагулянтов. Также в данной работе предложен новый метод, позволяющий отражать клиническое состояние больных тяжелой формой гемофилии А. Полученные результаты позволяют предполагать, что коррекция свертывания при легком течении тяжелой формы гемофилии связана, главным образом, с тромбоцитами, экспрессирующими фосфатидилсерин в процессе их активации. Положения, выносимые на защиту: 1. Показано, что ингибиторы активации тромбоцитов вызывают формирование двух пиков на кривой генерации тромбина путем снижения скорости экспонирования фосфатидилсерина на мембранах тромбоцитов. 2. Разработан метод оценки параметров кривой генерации тромбина с двумя максимумами. 4 3. Предложена возможность создания новой модификации теста генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме, содержащей ингибитор активации тромбоцитов в малой концентрации. 4. Показано, что амплитуда второго пика на кривой генерации тромбина и эндогенный тромбиновый потенциал в богатой тромобцитами плазме являются единственными параметрами коагуляционных тестов, различающимися у людей с легким и тяжелым фенотипами гемофилии А. Апробация работы состоялась 26 марта 2012 года на заседании межлабораторного семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН. Результаты диссертационной работы были представлены на 5-й Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии», Москва, 3-5 февраля, 2011; 36th FEBS Congress, Torino, Italy, 25-30 июня 2011, XXIII Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Kyoto, Japan, 23-28 июля 2011, 58th Annual Meeting of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Liverpool, UK, 27 – 30 июня, 2012, XXIV Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Amsterdam, the Netherlands, 29 июня – 4 июля, 2013. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ. Статей в рецензируемых журналах – 2; публикаций в трудах конференций и съездов – 10. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 93 страницах машинописного текста, состоит из введения, списка сокращений, четырех глав (главы 1 – обзора литературы, главы 2 – описания материалов и методов, главы 3 – описания экспериментальных результатов, главы 4 – обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 253 источника. Работа выполнена на базе Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН в лаборатории молекулярных механизмов гемостаза (зав. лабораторией проф. д. ф.-м. н. Пантелеев М. А.) и Гематологического научного центра Министерства здравоохранения РФ в лаборатории физической биохимии (зав. лабораторией проф. д. б. н. Атауллаханов Ф. И.). ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении показана актуальность исследуемой темы, сформулированы цели и задачи исследования, дана общая характеристика работы. Глава 1 посвящена обзору литературы. Приведены основные сведения о плазменном и тромбоцитарном звеньях системы свертывания крови. Описаны ключевые прокоагулянтные функции тромбоцитов. Далее приведены данные о ключевых реакциях плазменной части системы гемостаза, о путях ее активации, ингибиторах свертывания и петлях положительной и отрицательной обратной связи. Описаны современные интегральные тесты для анализа системы гемостаза – тромбоэластография, тест тромбодинамики и тест генерации тромбина. Рассмотрена проблема качественного различия формы кривой генерации тромбина, получаемой в присутствии и в отсутствии тромбоцитов. Выдвинута гипотеза о существовании двух режимов генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме. Кроме того, описана 5 проблема гетерогенности клинических фенотипов тяжелой формы гемофилии А. Продемонстрировано, что природа формирования легкого клинического течения этого заболевания не выяснена и что на данный момент не существует интегрального коагулологического теста, позволяющего однозначно определять фенотип гемофилии. В главе 2 описаны материалы и методы, используемые в работе. Помимо специфических методов, кратко изложенных ниже, приведены все реактивы, использовавшиеся при проведении экспериментов, методика выделения плазмы и тромбоцитов из крови доноров с помощью центрифугирования и гель-фильтрации. Приведены критерии выбора пациентов, страдающих тяжелой формой гемофилии А, для участия в исследовании. Описаны принципы проточной цитометрии для работы с тромбоцитами, методики проведения тестов генерации тромбина и тромбодинамики. Кроме того, приведены все способы обработки результатов экспериментов. Основные растворы Буфер А (150 мM NaCl, 2.7 мM KCl, 1 мM MgCl2, 0.4 мM NaH2PO4, 2мM HEPES, 5 мM глюкозы, 0,5% альбумина бычьей сыворотки, pH 7,4) использовался для хранения свежевыделенных тромбоцитов перед экспериментом. Для контроля рН плазмы перед экспериментом в нее добавляли буфер Б, содержащий 145 мM NaCl, 750 мM HEPES, pH 7.4. Буфер В для проведения теста генерации тромбина содержал 20 мM HEPES, 145 мM NaCl, pH 7.5. Буфер Г представлял собой буфер В, содержащий дополнительно 100 мМ CaCl2. Все упомянутые реагенты, а также, CaCl2 были производства фирмы Sigma-Aldrich (США). Свертывание в ТГТ запускали раствором TФ в буфере Г. Для ТГТ в РРР использовали тромбопластин (смесь ТФ и фосфолипидов, выделенную из мозга кролика) фирмы Ренам (Россия). Для ТГТ в PRP использовали рекомбинантный человеческий ТФ (Инновин) фирмы Dade Behring (Германия). Для определения активности ТФ использовали систему Actichrome TF chromogenic activity assay (American Diagnostica, США). Флюорогенный субстрат Z-Gly-Gly-Arg-AMC фирмы Bachem (Швейцария) был растворен в ДМСО в концентрации 100 мМ и 25 мМ и хранился при температуре 200С. Перед экспериментом субстрат разбавляли до концентрации 2,5 мМ буфером В. Пациенты и здоровые доноры крови Для исследований генерации тромбина в PRP использовали кровь здоровых доноров возрастом от 20 до 35 лет обоего пола, не принимавших никаких лекарств в течение двух недель перед днем забора крови и не имевших запротоколированных случаев спонтанных кровотечений или тромбозов. Все доноры дали письменное информированное согласие на участие в исследованиях. Для исследования фенотипов гемофилии были выбраны 11 пациентов с клинически «легким» течением тяжелой формы гемофилии А и 10 пациентов с «тяжелым» течением гемофилии. Ни у одного из пациентов не было обнаружено антител к фVIII, способных образовываться в организме пациента из-за частых инфузий концентратов фVIII [Penner, J. A. 2001, Rizza, C. R., et al. 1983]. Опыты по выявлению этих антител проводили сотрудники Центра Гемофилии ГНЦ МЗ, 6 используя систему Nijmegen modification of the Bethesda assay for factor VIII:C inhibitors [Verbruggen, B., et al. 1995]. Клиническую тяжесть заболевания оценивали по следующим критериям: - частота спонтанных кровоизлияний; - количество кровоизлияний; потребляемого фVIII, необходимого для купирования - общее функциональное состояние опорно-двигательной системы. С каждым пациентом была проведена беседа и получено согласие на участие в исследованиях. Период без лечения составлял не менее 4-х суток. Если больному срочно требовалась заместительная терапия в этот период, он получал ее и выводился из исследования. Учитывая, что полноценное лечение факторами свертывания крови стало проводиться только с 2007-2008 гг., многие больные с легким клиническим фенотипом имели деструктивные изменения суставов. Выделение плазмы крови и приготовление суспензии тромбоцитов Для выделения РРР кровь центрифугировали 15 мин при 1600 g. PRP выделяли с помощью центрифугирования крови 5 мин при 100g. После центрифугирования забирали 2/3 надосадка. Концентрацию тромбоцитов в полученной PRP измеряли с помошью гематологического анализатора Micros OT (Horiba Ltd, Япония). Для достижения требуемой концентрации тромбоцитов в PRP добавляли РРР, выделенную из крови того же донора. PFP получали путем дополнительного центрифугирования РРР 5 мин при 10000g. Для выделения тромбоцитов из крови, немедленно после забора в кровь добавляли простагландин Е1 (ПГЕ1, конечная концентрация 1 мкM, MP Biomedicals, США) и апиразу (конечная концентрация 0.1 ед./мл, Sigma-Aldrich, США) для предотвращения преждевременной активации тромбоцитов. После этого из крови выделяли PRP и добавляли дополнительный объем цитратного буфера (рН 5.5, соотношение цитрат:плазма 1:3) для предотвращения агрегации тромбоцитов в процессе центрифугирования. PRP центрифугировали в течение 5 минут при 400 g, надосадок удаляли, тромбоциты ресуспензировали в 300 мкл буфера А. После этого тромбоциты подвергали гель-фильтрации на колонке с гелем Сефароза CL-2B (Sigma-Aldrich, США), уравновешенной буфером А. Для определения концентрации тромбоцитов полученную суспензию анализировали на гематологическом анализаторе аналогично PRP. Приготовление суспензии фосфолипидных везикул Коммерческий метод регистрации генерации тромбина, использующийся большинством исследователей, предполагает добавление в РРР суспензии фосфолипидных везикул для увеличения сигнала флюоресценции и меньшей вариабельности теста [Hemker, H. C., et al. 2002]. Поэтому в данной работе использовали ТГТ в РРР с добавленными в нее фосфолипидами. Кроме того, была проверена возможность исследования гемофилии методом ТД в PFP в присутствии или отсутствии этой суспензии. Для исследования ТД в PFP и ТГТ в РРР использовали суспензию, содержащую 80% фосфатидилхолина (ФХ) и 20% ФС. 7 Общая концентрация фосфолипидов в исходной суспензии была равной 1 мМ. Изначально растворы ФХ и ФС (Avanti Chemicals, Австралия) в хлороформе хранили при температуре -200С (концентрация ФС была 31 мМ, ФХ – 33 мМ). Для приготовления смеси фосфолипидов для экспериментов в круглодонной колбе смешивали 24 мкл ФХ и 6.5 мкл ФС. После этого смесь высушивали 30 мин под струей азота, чтобы не допустить окисления. Затем фосфолипиды разбавляли 1 мл буфера В и инкубировали 30 минут на шейкере при температуре 570С. Полученную эмульсию замораживали при -200С и снова размораживали, после чего смесь пропускали 10 раз через специальный экструдер (фирмы Avanti Polar Lipids Inc., США) с диаметром пор 100 мкм. Полученную суспензию фосфолипидных везикул разливали на порции малого объема, замораживали при -200С и хранили вплоть до использования в экспериментах. Проведение теста генерации тромбина ТГТ проводили по методике, близкой к описанной в работе [Sinauridze, E. I., et al. 2007]. В РРР или PRP добавляли флюорогенный субстрат, как описано в п. 2.6. Далее в смесь добавляли буфер Б для поддержания нормального рН в пропорции 40 мкл буфера Б на 1000 мкл плазмы, содержащейся в смеси. После этого смесь разливали по лункам плоскодонного 96-луночного планшета для микротитрования по 100 мкл на лунку. Далее в лунку добавляли активатор свертывания (20 мкл буфера Г, содержащего ТФ. В случае РРР, выделенной из крови пациента, в активатор добавляли суспензию фосфолипидных везикул в пропорции 2 мкл суспензии (1 мМ) на 90 мкл активатора. В случае PRP в части экспериментов в плазму добавляли ПГЕ1, дополнительное количество ДМСО или MЕТ-АMФ фирмы Biolog, США. Флюоресценцию АМС непрерывно измеряли на спектрофлюориметре Appliskan (Thermo Scientific, Финляндия, λвозбуждения=355 нм, λиспускания=460 нм). Для каждого образца плазмы ставили 2 параллельные пробы. Полученные результаты были усреднены. Чтобы перевести условные единицы флюоресценции, в абсолютные концентрации АМС, для каждого образца проводили калибровку сигнала. Для этого в отдельных лунках планшета для каждого образца исследованной плазмы ставили по 2 фоновые и 2 калибровочные пробы. Фоновые пробы содержали 100 мкл смеси плазма+субстрат и 20 мкл буфера В. Калибровочные пробы отличались от фоновых тем, что вместо 20 мкл буфера В содержали 2 мкл раствора AMC в ДМСО (исходная концентрация 480 мкМ) и 18 мкл буфера В. Величина калибровочного сигнала, была рассчитана путем вычитания фоновых сигналов из сигналов флюоресценции в калибровочных пробах и деления получившихся разностей на известную концентрацию АМС, присутствующего в калибровочных пробах. При обработке экспериментов все величины флюоресценции АМС в условных единицах были переведены в абсолютные концентрации АМС. При этом учитывали нелинейную зависимость сигнала флюоресценции от концентрации АМС (эффект внутреннего фильтра [Hemker, H. C., et al. 2002]). Обработку экспериментов проводили в программе Origin версии 6.0 или 8.0 (OriginLab Corporation, США). В результате были построены зависимости концентрации АМС в каждой пробе от времени. Затем они были продифференцированы. Из полученных скоростей производства АМС можно было рассчитать концентрации тромбина в каждый момент времени с учетом расхода флюорогенного субстрата (в предположении, что реакция гидролиза субстрата тромбином подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен). Для вычисления концентрации тромбина были 8 использованы предварительно измеренные константы реакции расщепления субстрата тромбином: kcat = 48 мин-1, Km = 156 мкМ. Полученные графики представляли собой зависимости от времени для суммарных концентраций тромбина и комплекса тромбин-α2М, т. к. α2М не соединяется с активным центром тромбина, и комплекс тромбин-α2М тоже может расщеплять флюорогенный субстрат [Hemker, H. C., et al. 2003, Hemker, H. C., et al. 2002, Hemker, H. C., et al. 2000]. Для получения зависимости концентрации свободного тромбина от времени необходимо было вычесть из полученных кривых вклады, связанные с активностью комплекса тромбина с α2макроглобулином. Это вычитание осуществляли с помощью специально созданного алгоритма, реализованного в программе Origin 6.0. Этот алгоритм использовался в работе [Sinauridze, E. I., et al. 2007]. Принцип его работы основывался на следующих предположениях. Если суммарная концентрация тромбина, наблюдаемая в эксперименте, состоит из свободного тромбина и тромбина, связанного с α2-М, то можно записать выражение: (1) [ IIa IIa 2 M ] [ IIa F ] [ IIa 2 M ] , где [IIa+IIaα2M] – суммарная концентрация тромбина, связанного с субстратом, наблюдаемая в эксперименте, [IIaF] – искомая концентрация тромбина, связанного с субстратом, но не связанного с α2макроглобулином, [IIaα2M] – концентрация комплекса тромбин-α2-макроглобулин, связанного с субстратом. Если принять во внимание, что (2) d [ IIa 2 M ] k [ IIa F ] [ 2 M ] , где k – константа скорости образования dt комплекса IIaα2M, а [α2M] – концентрация дифференцировании (1) можно получить: α2-макроглобулина, то при d [ IIa IIa 2 M ] d [ IIa F ] k [ IIa F ] [ 2 M ] . Учитывая, что производная (3) dt dt F (t t ) F (t ) функции F в точке t+Δt при малых Δt приблизительно равна , можно t записать для любого момента времени t: [ IIa IIa 2 M ]( t t ) [ IIa IIa 2 M ]( t ) [ IIa F ]( t t ) [ IIa F ]( t ) K [ IIa F ]( t ) , t t где K k [ 2 M ] в предположении, что изменением концентрации α2M можно (4) пренебречь. Из (4) можно легко получить рекуррентную формулу для вычисления [IIaF](t+ Δt): (5) [ IIa ]( t t ) [ IIa F ]( t ) [ IIa IIa 2 M ]( t t ) [ IIa IIa 2 M ]( t ) t K [ IIa F ]( t ) F Эта формула легла в основу метода вычитания сигнала комплекса тромбин-α2макроглобулин из общего сигнала. Концентрация свободного тромбина в момент начала эксперимента полагалась равной нулю. Константу К подбирали исходя из того, чтобы на получившейся КГТ концентрация тромбина на стационарной области кривой (области, где скорость накопления АМС перестает изменяться) лежала в области нуля. На рис. 1 приведена схематичная иллюстрация этапов получения КГТ. 9 Рис. 1. Обработка эксперимента по генерации тромбина. Сначала сигнал флюоресценции пересчитывается в концентрацию АМС. Затем производится удаление шумов с помощью усреднения по 7 точкам и кривая производства АМС численно дифференцируется. После этого с помощью специальной программы из полученной кривой вычитается вклад концентрация тромбина, связанного с α2М. Для запуска свертывания по внутреннему пути в качестве активатора использовали взвесь каолина (Ренам, Россия) для теста АЧТВ, разбавленную в 30 раз в буфере Г, содержащем 20 мкМ фосфолипидов. Конечная концентрация фосфолипидов была 4 мкМ. Проточная цитометрия для исследования активации суспензии тромбоцитов Для исследования активации тромбоцитов использовали проточный цитометр FacsCalibur (BD Biosciences, США). Перед проведением опыта в 100 мкл суспензии тромбоцитов (100000 тромбоцитов на 1 мкл суспензии) добавляли 1 мкл раствора, содержащего антитела к Р-селектину, меченые красителем флуоресцеинизотиоцианатом (антиCD62Р-ФИТЦ, BD Biosciences, США), 1 мкл раствора, содержащего аннексин-V, меченный фикоэритрином (аннексин-V-ФЭ, Invitrogen, США) и 5 мкл буфера Г для присутствия в суспензии ионов Са 2+, необходимых для активации тромбоцитов. После этого суспензию разбавляли вдвое раствором человеческого α-тромбина в буфере А (конечная концентрация 35 нМ, Haematologic Technologies, США). В отдельных экспериментах в суспензию предварительно добавляли ДМСО, ПГЕ1 или антагонист рецептора Р2Y12 2метилтиоаденозин-5’-О-монофосфат (MET-AMФ, [Brammer, J. P., et al. 1984], Biolog Inc., США). Для измерения экспрессии Р-селектина и ФС в разные моменты времени из суспензии отбирали пробы объемом 30 мкл и помещали в 300 мкл буфера А, содержащего 2,5 мМ CaCl2. После этого производили измерение на цитометре. При обработке получившихся результатов использовали программу Flowing Software (Финляндия). Сначала на точечной диаграмме светорассеяния выделяли регион тромбоцитов (рис. , А). 10 После этого в этом регионе определяли регион Р-селектин-положительных тромбоцитов, в канале FL-1 (канал красителя ФИТЦ) (рис. 2, Б). В конечном итоге получали зависимость процентного содержания Р-селектин-экспрессирующих тромбоцитов в суспензии от времени. Эксперессию ФС оценивали по средней интенсивности флуоресценции фикоэритрина (канал FL-2). Цитометрические измерения проводили до и через 5; 10; 15 и 25 минут после активации. Тромбоэластография в цельной крови 340 мкл цельной цитратной крови, не содержащей КТИ, помещали к кювету тромбоэластографа TEG®. Далее в кровь добавляли 20 мкл раствора, содержащего 76 пМ ТФ (Ренам) и 200 мМ CaCl2 и запускали эксперимент. Измеряли параметры R, K, α и MA. Рис. 2. Обработка цитометрического измерения суспензии активированных тромбоцитов. А – определение региона тромбоцитов на точечной диаграмме светорассеяния (в координатах интенсивности прямого (ось Х) и бокового (ось Y) светорассяения). Б – точечные диаграммы интенсивности флюоресценции выбранного региона тромбцитов в каналах цитометра FL-1 (ФИТЦ) и FL-2 (ФЭ). В – гистограммы интенсивности флюоресценции в каналах цитометра, по которым определяли среднюю флуоресценцию ФЭ и процентное содержание Рселектин-положительных тромбоцитов. В диаграммах Б и В по оси Х отложена интенсивность флюоресценции соответствующего флюорофора, по оси Y – интенсивность бокового светорассеяния. Проведение теста тромбодинамики Принципиальная схема экспериментальной установки изображена на рис. 3. Свет от осветителей, отраженный сгустком, растущим в кювете, проходит через светофильтр и попадает в объектив цифровой камеры, которая преобразует сигнал и передает его для дальнейшего анализа на компьютер. Камера производит снимки каждые 15 секунд. В результате эксперимента получаются профили светорассеяния от растущего сгустка для каждого момента времени и по ним вычисляется размер сгустка в каждый момент времени [Ovanesov, M. V., et al. 2002]. 11 Рис. 3. Принципиальная схема установки для проведения теста ТД. Воспроизведено из [Сошитова, Н. П. 2012]. Тесты ТД проводили в свободной от тромбоцитов плазме (PFP). Для проведения теста ТД в отсутствии фосфолипидов в 300 мкл РFP добавляли 12 мкл буфера Б и инкубировали при 370С 10 мин. После этого в плазму добавляли 6 мкл CaCl2 (1 М), помещали в экспериментальную кювету и приводили в контакт с активатором. Активатор представлял собой пластиковую пластину, на торцевую поверхность которой нанесен ТФ путем обработки пластины тромбопластином (Ренам, Россия). Также тест ТД проводили в присутствии фосфолипидов (3 мкл размороженной суспензии фосфолипидов на 300 мкл плазмы) и тромбомодулина (ТМ), выделенного из легких кролика (6 мкл ТМ на 300 мкл плазмы, Haematologic Technologies, США). Финальная концентрация ТМ составляла 3 нМ. Эксперименты с ТМ проводили только в присутствии фосфолипидов по причине того, что без них добавление ТМ в исследуемых концентрациях не оказывало влияния на рост сгустка. Глава 3 содержит результаты работы. Исследование влияния ингибиторов активации тромбоцитов на генерацию тромбина в PRP Добавление 83 нМ ПГЕ1, 80 мкМ MЕТ-АМФ и увеличение концентрации ДМСО до 1,6% способствовало появлению двух пиков концентрации на кривой генерации тромбина (Рис.4). Если механизм влияния ПГЕ1 и MЕТ-АМP на тромбоциты известен, то про ДМСО такого сказать нельзя. Однако, существуют данные, что ДМСО может ингибировать секрецию α-гранул, адгезию и агрегацию тромбоцитов [Asmis, L., et al. 2010, Holtz, G. C., et al. 1972]. Рис. 4. Влияние ингибиторов активации тромбоцитов на генерацию тромбина. В PRP здорового донора с концентрацией тромбоцитов 100*103 мкл-1 добавляли раствор ТФ (Инновин) в буфере Г. Конечная концентрация ТФ составляла 2 пМ. Представлен типичный результат из серии экспериментов (n=3) 12 Влияние ПГЕ1 на образование второго пика на кривой генерации тромбина в PRP В опытах, описанных в этом разделе, было исследовано влияние ПГЕ1 на образование второго пика в PRP, содержащей повышенное количество ДМСО (1,6%), добавленного для образования двух пиков на КГТ. Полученные результаты представлены на рис. 5. Показано, что ПГЕ1 дозозависимо снижает амплитуду второго пика, и в больших концентрациях полностью ингибирует его образование. Также, ПГЕ1 снижал амплитуду первого пика, но до конца никогда ее не ингибировал. Это может говорить о том, что второй пик образуется только за счет активации тромбоцитов. Рис. 5. Влияние ПГЕ1 на образование второго пика на КГТ в PRP. Различные концентрации ПГЕ1 добавляли в PRP (100*103 тромбоцитов на 1 мкл PRP), содержащую 1,6% ДМСО. Затем генерация тромбина была запущена добавлением ТФ (конечная концентрация 2 пМ). Представлен типичный результат из серии экспериментов (n=3). Исследование активации суспензии тромбоцитов Результаты исследования активации суспензии тромбоцитов тромбином в присутствии ДМСО, ПГЕ1 и МЕТ-АМФ показывают, что эти вещества действительно снижают скорость экспрессии тромбоцитами ФС (рис. 6 А, В, Д). В то же время, экспрессия Р-селектина не снижается под действием этих ингибиторов (рис. 6 Б, Г, Е). Это говорит о том, что второй пик на КГТ образован за счет активированных тромбоцитов, экспрессирующих ФС. 13 Рис. 6. Влияние ПГЕ1 (A, Б), ДМСО (В, Г) и МЕТ-АМФ (Д, Е) на активацию суспензии тромбоцитов тромбином. Представлены зависимости средней флуоресценции аннексина-V-ФИТЦ (А, В, Д) и процентного содержания Рселектин-положительных тромбоцитов (Б, Г, Е) от времени, прошедшего после добавления в суспензию тромбина. Представлен типичный результат из серии экспериментов (n=3). Влияние количества тромбоцитов на формирование двух пиков на кривой генерации тромбина в PRP В предыдущих разделах было показано, что ингибирование активации тромбоцитов приводит к появлению второго пика на КГТ. В литературе часто встречаются работы, где используется тест генерации тромбина в PRP, но при этом концентрация тромбоцитов не является фиксированной. Эти работы ссылаются на данные, согласно которым количество тромбоцитов не влияет на ЭТП. Однако, показано, что концентрация тромбоцитов может сильно влиять на формы КГТ [Vanschoonbeek, K., et al. 2004]. В связи с этими данными, необходимо было проверить, как влияет количество тромбоцитов на появление второго пика. На рис. 7 показано, что при увеличении концентрации тромбоцитов уменьшается время достижения второго пика, и при высоких концентрациях тромбоцитов два пика могут слиться в один, т.е. тромбоциты активируются быстрее. Это может объясняться несколькими причинами. Во-первых, известно, что активация тромбоцитов проходит тем быстрее, чем выше их концентрация. Также при увеличении концентрации тромбоцитов количество ингибитора, приходящееся на один тромбоцит, уменьшается, и эффект от этого вещества может снижаться. Количество пиков в переходных ситуациях, где концентрация тромбоцитов высокая, определялось по алгоритму, изложенному в следующем разделе. 14 Рис. 7. Влияние количества тромбоцитов на образование двух пиков. РРР и PRP с разной концентрацией тромбоцитов, активировали раствором ТФ (Инновин, конечная концентрация 2 пМ). Все плазмы содержали 1,6% ДМСО. Представлен типичный результат из серии экспериментов (n=4) Было показано, что концентрация тромбоцитов очень слабо влияет на ЭТП (рис. 8). Заметная разница наблюдалась только между РРР и PRP. Таким образом, в данном исследовании подтверждается, что концентрация тромбоцитов не влияет на ЭТП, но качественно влияет на форму КГТ. Рис. 8. Зависимость ЭТП от концентрации тромбоцитов. PPP и PRP четырех здоровых доноров (ИТ, ВП, АП, НП). Активацию свертывания проводили ТФ (2 пМ) в присутствии 1.6% ДМСО в плазме. Метод оценки параметров двухпиковых кривых генерации тромбина По мере увеличения количества данных встала необходимость разработки метода анализа параметров двухпиковых КГТ. Кроме того, на части получаемых кривых визуально определить, количество пиков на кривой было невозможно. Пример такой кривой изображен на рис. 9, В. Сначала была подобрана функция, которая хорошо аппроксимирует обыкновенную однопиковую кривую. Это функция экстремального распределения первого типа (функция Гумбеля [Gumbel, E. J. 1954]): 15 (6) G1 (t , A1 , t 0 , w) A exp(1 exp( t t0 t t0 ) ) , где t – время, A – амплитуда w w пика, t0 – время достижения пика, w – полуширина пика. Аппроксимацию проводили до момента времени, пока концентрации тромбина не становились сравнимы с погрешностями его измерения. Как показано в табл. 1, коэффициент корреляции R1 при аппроксимации функцией G1 заведомо однопиковых КГТ, лежал в диапазоне от 0,912 до 0,994. После этого для аппроксимации двухпиковых кривых была выбрана суперпозиция двух функций G1: (7) G2 (t , A1 , t1 , w1 , A2 , t 2 , w2 ) G1 (t , A1 , t1 , w1 ) G1 (t , A2 , t 2 , w2 ) , где t – время, Ai – амплитуда i-го пика, ti – время достижения i-го пика, wi – полуширина i-го пика. В табл. 1 показано, что коэффициенты корреляции аппроксимации R2 были также высоки. Однако проблема определения того, сколько пиков на кривой, подобно изображенной на рис. 9, В, оставалась. Дело в том, что двухпиковая функция G2 всегда описывает эксперимент с большим коэффициентом корреляции, чем однопиковая, за счет большего количества параметров, как это видно из табл. 1. Чтобы решить проблему определения количества пиков на КГТ, было решено выбрать две группы заведомо однопиковых и двухпиковых кривых, на которых можно было визуально определить количество пиков. Для всех кривых были посчитаны отношения коэффициентов корреляции этих кривых двухпиковой и однопиковой аппроксимаций R2/R1. Для однопиковых кривых эта величина лежала в области от 1,001 до 1,056. Для двухпиковых – от 1,072 до 1,680 (табл. 1) Опираясь на полученные результаты, было решено считать, что если R2/R1<1,06, то на кривой один пик, а если R2/R1>1,07, то два. Если 1,06<R2/R1<1,07, то считали, что количество пиков на кривой неопределяемо. Рис. 9. Аппроксимация КГТ с помощью функции экстремального распределения G1 и функцией G2, являющейся суперпозицией двух функций G1. А – КГТ получена на PRP с добавлением ПГЕ1. Б, В – кривые получены на PRP. Концентрация ДМСО во всех плазмах 1,6%, активация свертывания осуществлялась 2 пМ ТФ (Инновин). 16 Таблица 1. Диапазоны значений R1, R2 и R2/R1 для однопиковых и двухпиковых КГТ. Статистика параметров первого и второго пиков. Возможность создания новой модификации теста генерации тромбина На рис. 10 приведены параметры первого пика для КГТ, полученных на PRP (100*103 тромбоцитов на 1 мкл, 18 кривых, 17 доноров), на PRP в присутствии 830 нМ ПГЕ1 (8 кривых, 7 доноров) а также на РРР (6 кривых, 6 доноров). Концентрация ДМСО везде составляла 1,6%. Приведены только параметры первого пика, потому что все кривые, полученные в присутствии ПГЕ1 и в РРР, содержали только один пик. Как видно из диаграмм, амплитуда и интеграл первого пика в PRP достоверно больше, чем в РРР и в PRP с ПГЕ1. Также полуширина и время достижения первого пика достоверно различаются в PRP и в PRP c ПГЕ1. КГТ, полученные на РРР и PRP+ПГЕ1 достоверно не различаются. Большие отличия первого пика между PRP и остальными кривыми можно объяснить несколькими причинами. При выделении и приготовлении PRP небольшая часть тромбоцитов могла активироваться и внести вклад в первый пик. Кроме того, секреция α-гранул, происходящая сильно раньше экспонирования ФС, также может увеличивать амплитуду и интеграл первого пика. Рис. 10. Средние значения параметров первого пика в PRP (100*103 тромбоцитов*мкл-1, 18 кривых, 17 доноров), PRP c 830 нМ ПГЕ1 (8 кривых, 7 доноров) и РРР (6 кривых, 6 доноров) и стандартные ошибки среднего для этих значений (SE) при активации 2 пМ ТФ, концентрация ДМСО 1,6%. Для определения достоверности различий использовался односторонний дисперсионный анализ (one-way ANOVA с уровнями значимости Р, равными 0,01 и 0,05). 17 На рис. 11 представлены диаграммы усредненных значений параметров пиков, экспериментальных КГТ, полученных на PRP (100*103 тромбоцитов*мкл-1) здоровых доноров при активации 2 пМ TФ (инновин). Концентрация ДМСО была 1,6%. Параметры определяли с помощью метода, описанного выше. Под интегралом i-го пика подразумевается площадь под кривой G1(t,Ai,ti,wi). Из 20 проведенных экспериментов на крови 18 здоровых доноров, одна КГТ имела один пик, одна – неопределяемое количество пиков. Остальные кривые (18 кривых, 17 доноров) имели 2 пика. Из диаграмм на рис. 11 видно, что в среднем первый и второй пик не отличаются друг от друга. Достоверно различаются только времена достижения первого и второго пика. Но это связано с тем, что под первым пиком всегда подразумевается пик, который достигается раньше. Результаты, аналогичные приведенным на рис. 10 и 11 были получены также при использовании для активации свертывания 0,5 рМ и 4 рМ ТФ (Инновин). Исходя из полученной статистики можно утверждать, что при концентрации ДМСО 1,6% наблюдается стабильный эффект образования двух пиков, и параметры КГТ не отличаются большей вариабельностью, чем описано в литературе. Т.к. 1,6% ДМСО не оказывает сильного влияния на ЭТП, можно предположить, что увеличение концентрации этого вещества не ухудшит диагностический потенциал ТГТ в PRP. Однако, появляется новый параметр, отражающий вклад ФС-положительных тромбоцитов в генерацию тромбина, что может быть полезно в клинической практике. В следующих разделах исследования было решено проверить диагностический потенциал новой модификации ТГТ в PRP (в присутствии 1,6% ДМСО) для предсказания тенденции к кровоточивости у больных гемофилией А. Рис. 11. Средние значения параметров пиков в PRP (100*103 тромбоцитов на 1 мкл PRP) при активации 2 пМ TФ, концентрация ДМСО 1,6%. На диаграммах приведены усредненные данные 18 экспериментов на крови 17 здоровых доноров и стандартные ошибки среднего (SE). Для определения достоверности различий использовали односторонний дисперсионный анализ (one-way ANOVA с уровнями значимости Р, равными 0,01 и 0,05). 18 Исследование статуса свертывания у больных гемофилией Уровень фVIII и АЧТВ Всего в исследовании участвовал 21 пациент с тяжелой формой гемофилии А, из которых 11 пациентов имели легкий, а 10 - тяжелый фенотип течения болезни. Активность фVIII (фVIII:C) у пациентов с легким и тяжелым фенотипами гемофилии А в большинстве случаев оказывалась недетектируемой. У трех пациентов из «легкой» группы и у трех из тяжелой она превышала 1% от нормы. Также, у двух пациентов с легким фенотипом и у двух с тяжелым, уровень фVIII составлял более 2% от нормы. Величина АЧТВ достоверно не различалась между двумя группами. Тромбоэластография Параметры тромбоэластографии в цельной крови больный гемофилией А при активации свертывания 4 пМ TФ (Ренам) достоверно не отличались между группами с легким и тяжелым фенотипами течения болезни (рис. 12). Рис. 12. Параметры ТЭГ у пациентов с легким и тяжелым фенотипами тяжелой формы гемофилии. А Б, В – диаграммы со значениями параметров ТЭГ (R, угол α и МА) для каждого пациента, средними значениями этих параметров в разных группах и стандартными ошибками среднего. НД означает недостоверное различие. Для исследования достоверности использовали односторонний дисперсионный анализ (one-way ANOVA с уровнями значимости Р, равными 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 и 0,05). Тромбодинамика Параметры всех вариаций теста тромбодинамики достоверно не различались между группами пациентов с легким и тяжелым фенотипами течения тяжелой формы гемофилии А. Добавление фосфолипидов в PFP перед активацией не оказывало сильного влияния на рост сгустка. Добавление в плазму 3 нМ ТМ (конечная концентрация) приводило к существенному снижению стационарной скорости без сильного влияния на начальную скорость (рис. 13), что согласуется с предыдущими данными [Panteleev, M. A., et al. 2006]. Фактически, сгусток переставал расти после начальной фазы. Поэтому, вторым основным параметром этой вариации теста была выбрана не стационарная скорость, а размер сгустка через 40 мин. после начала эксперимента. 19 Рис. 13. Примеры кривых зависимости размера сгустка от времени в разных вариантах теста ТД у больного тяжелой формой гемофилии А. Результаты всех проведенных экспериментов суммированы на рис. 14. Рис. 14. Параметры ТД у пациентов с легким и тяжелым фенотипами течения тяжелой формы гемофилии А. Показаны диаграммы со значениями параметров ТД для каждого пациента, средними значениями и стандартными ошибками среднего в каждой группе. НД означает недостоверное различие. Для исследования достоверности использовали односторонний дисперсионный анализ (one-way ANOVA с уровнями значимости Р, равными 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 и 0,05). Генерация тромбина При проведении теста генерации тромбина стандартным способом в РРР или в PRP в новой модификации (в присутствии 1.6% ДМСО) наблюдались различные формы КГТ (рис. 15). Во всех вариациях теста генерации тромбина, проводящихся в РРР достоверной разницы между легким и тяжелым течением гемофилии не выявлено. При активации каолином в большинстве образцов генерация тромбина либо не наблюдалась, либо 20 она была слабой. То же самое происходило при пониженной концентрации ТФ, при этом в большинстве случаев удавалось получить кривую генерации тромбина. В тесте генерации тромбина в PRP в новой модификации, амплитуда второго пика и ЭТП различались между группами с тяжелым и легким течением тяжелой формы гемофилии А достоверно (Р<0.02) (рис. 17). Только у трех пациентов с тяжелым фенотипом амплитуда второго пика была выше 30 нМ – нижней границы этого параметра для группы пациентов с легким фенотипом. Это дает возможность предположить, что активация тромбоцитов играет ключевую роль в формировании легкого фенотипа течения тяжелой формы гемофилии А. Рис. 15. Характерные примеры КГТ у пациентов с разным фенотипом течения гемофилии А. А- КГТ в РРР у одного пациента с легким фенотипом течения тяжелой формы гемофилии А (пациент 3). Б – КГТ в PRP в присутствии 1.6% ДМСО у двух пациентов с разным фенотипом течения гемофилии А. Рис. 16. Параметры генерации тромбина в PРP у пациентов с легким и тяжелым фенотипами тяжелой формы гемофилии А. Показаны диаграммы со значениями параметров ТГТ для каждого пациента, средними значениями и стандартными ошибками среднего в каждой из групп. НД означает недостоверное различие. Для исследования достоверности использовали односторонний дисперсионный анализ (one-way ANOVA с уровнями значимости Р, равными 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 и 0,05). 21 Рис. 17. Параметры генерации тромбина в PRP в присутствии 1,6% ДМСО у пациентов с легким и тяжелым фенотипами тяжелой формы гемофилии А. Показаны диаграммы со значениями параметров ТГТ для каждого пациента, средними значениями и стандартными ошибками среднего в каждой из групп. НД означает недостоверное различие. Для исследования достоверности использовали односторонний дисперсионный анализ (one-way ANOVA с уровнями значимости Р, равными 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 и 0,05). Глава 4 посвящена обсуждению. В данной работе показано, что в условиях слабого ингибирования активации тромбоцитов может образовываться второй пик на КГТ в PRP, и разработан метод анализа его параметров. Опыты по изучению активации суспензии тромбоцитов показали, что образование второго пика обеспечивается экспонированием тромбоцитами ФС на своих мембранах. Слабое ингибирование активации тромбоцитов приводит к задержке их активации, как показано в работе [Butenas, S., et al. 2001] для ПГЕ1. Впервые четко показано, что процесс генерации тромбина в PRP разделен на две стадии. Первая стадия обеспечивается частично тромбоцитами и реакциями, проходящими без участия тромбоцитов на фосфолипидах плазмы. Вклад тромбоцитов в первый пик генерации тромбина может быть осуществлен выбросом α-гранул и наличием малого количества активированных тромбоцитов в PRP до активации тканевым фактором. На рис. 18 схематично показано, какие процессы могут играть ключевую роль в образовании каждого пика на КГТ. В предыдущих работах также получали кривые генерации тромбина в PRP, указывающие на факт существования двух фаз в процессе генерации тромбина в PRP. Авторы получали на КГТ точку перегиба в области «взрывной» генерации тромбина, которая разделяла эту фазу на две. Однако они не обращали на это внимания и не ставили вопрос о том, чем это обусловлено. [van der Meijden, P. E., et al. 2005, Vanschoonbeek, K., et al. 2004]. Между тем, тромбоциты могут влиять на генерацию тромбина как минимум двумя основными путями – экспрессией α-гранул, содержащих прокоагулянтные ферменты каскада свертывания, и предоставлением фосфолипидной поверхности для образования комплексов протромбиназы и внутренней теназы [Monroe, D. M., et al. 2002]. Характерные времена различных ответов тромбоцитов на активацию различаются. 22 Рис. 18. Схематичная интерпретация вклада фосфолипидов плазмы, предактивированных тромбоцитов, секреции α-гранул и экспрессии ФС в первый и второй пик КГТ. В настоящей работе показано, что при активации тромбоцитов 35 нМ тромбина αгранулы секретируются значительно раньше, чем ФС на мембранах. Опираясь на все вышесказанное, можно предположить, что на разных этапах генерации тромбина ключевую роль в его производстве могут играть абсолютно различные процессы, происходящие с тромбоцитами. Из-за этого скорость генерации тромбина во время его активной наработки может меняться. Результаты, полученные в данной работе, подтверждают эти предположения. Показано, что «поздняя» стадия активной генерации тромбина обеспечивается экспонированием ФС на мембранах тромбоцитов. Образование двух пиков может свидетельствовать об ингибировании активации тромбоцитов в исследуемом образце плазмы. В основном, при использовании ТГТ в PRP в клинической практике принимают во внимание только один параметр – ЭТП. Однако небольшие дозы ингибиторов не влияют на этот параметр, как показано в данной работе. Т. е. если учитывать только ЭТП, можно не отследить то, что активация тромбоцитов у пациента снижена. Это можно заметить, только исследуя форму КГТ. Если на ней 2 пика, то это может указывать на задержанную активацию тромбоцитов в плазме пациента. ДМСО, ПГЕ1 и MЕТ-АМФ формируют второй пик на кривой генерации тромбина в PRP. Эти вещества тем или иным образом имеют непосредственное отношение к клинической практике. ДМСО используют как противовоспалительное и обезболивающие средство [Jacob, S. W., et al. 2009]. Кроме того, это вещество является криопротектором для стволовых клеток, и его используют при их трансплантации [Chen-Plotkin, A. S., et al. 2007, Martin-Henao, G. A., et al. 2010, Mueller, L. P., et al. 2007]. Концентрация ДМСО в крови пациента может составлять 0,2-0,4% [Chen-Plotkin, A. S., et al. 2007, Mueller, L. P., et al. 2007], однако может достигать 0,56% [Martin-Henao, G. A., et al. 2010], и даже 1,2 % [Chen-Plotkin, A. S., et al. 2007, Hoang, B. X., et al. 2011]. Другой исследованный ингибитор, ПГЕ1, в клинической практике используют для предотвращения тромбозов [Ozaki, M., et al. 2005]. В данной работе ПГЕ1 добавляли в концентрациях, близких к дозам, применяемым в клинической практике [Cawello, W., et al. 1995, Kozek-Langenecker, 23 S. A., et al. 1998]. В этих концентрациях ПГЕ1 способен ингибировать агрегацию тромбоцитов [Kreutz, R. P., et al. 2013, Roberts, W., et al. 2010]. MEТ-АМФ используют только в тестах in vitro [Andre, P., et al. 2003, Neubauer, H., et al. 2008], однако другой антагонист Р2Y12, клопидогрель (плавикс) имеет широкое применение в клинике [Neubauer, H., et al. 2008]. Таким образом, в настоящей работе впервые изучено влияние на процесс генерации тромбина ДМСО, MЕТ-АМФ и ПГЕ1 в концентрациях, соответствующих применяемым в клинической практике. В работе использовали оригинальную постановку ТГТ в PRP, при которой КГТ содержала два пика. В данном варианте ТГТ для появления второго пика использовался искусственный ингибитор активации тромбоцитов, ДМСО, механизмы действия которого точно неизвестны. Однако в данном исследовании показано, что это вещество в тесте генерации тромбина оказывает такое же воздействие на генерацию тромбина, как и другие, более изученные ингибиторы. Очевидная нефизиологичность данной постановки может компенсироваться дополнительными параметрами, которыми в ней обладает КГТ при том, что на ЭТП ДМСО в выбранной концентрации оказывает незначительное влияние. Вместе с тем, физиологичность остальных постановок и тестов, даже современных, также можно подвергнуть сомнению. Например, использование ингибитора контактной активации КТИ в тестах генерации тромбина и тромбодинамики. Этот белок в норме не присутствует в организме человека. Кроме того, недавние работы демонстрируют результаты указывающие на критическую важность контактного пути в развитии тромбозов [Caen, J., et al. 2010, Kleinschnitz, C., et al. 2006, Muller, F., et al. 2011, Renne, T., et al. 2006]. Вторым примером нефизиологичности современных тестов является использование флюорогенного субстрата в тесте генерации тромбина, который, кстати сказать, изначально растворен в ДМСО. Субстрат – это синтетическое вещество, с которым в ТГТ связана большая часть существующего в системе свободного тромбина, что может экранировать тромбин от взаимодействий с другими ферментами свертывания [Butenas, S., et al. 2007]. При исследовании различными методами статуса системы свертывания у больных с тяжелой формой гемофилии А, ТГТ, проводимый в PRP в присутствии добавленного ДМСО, был единственным тестом, способным различить среди этих больных группы с различным фенотипом течения болезни. В результате проведения настоящей работы было показано, что амплитуда второго пика КГТ в PRP достоверно больше у пациентов с легким фенотипом течения болезни. В предыдущих разделах было показано, что амплитуда второго пика может отражать вклад экспрессии тромбоцитами ФС в генерацию тромбина. У всех пациентов с легким фенотипом амплитуда второго пика была выше или равной 30 нМ. В то же время большинство пациентов с тяжелым фенотипом имело значения этого параметра ниже 30 нМ. Т. е., можно утверждать, что у большинства пациентов с легким течением гемофилии повышена прокоагулянтная активность тромбоцитов. Это может быть тем компенсаторным механизмом, который позволяет пациентам с тяжелой формой гемофилии А (при содержании фVIII <1%) иметь меньшее количество кровотечений, чем у других пациентов с таким же содержанием фVIII, прокоагулянтная активность тромбоцитов которых не повышена (группа с тяжелым фенотипом течения гемофилии). 24 Выводы 1. Слабое ингибирование активации тромбоцитов приводит к формированию двух пиков на кривой генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме. 2. Второй пик на кривой генерации тромбина формируется за счет реакций плазменного свертывания, происходящих на мембранах тромбоцитов, экспонирующих фосфатидилсерин. 3. Разработан метод анализа формы кривых генерации тромбина, позволяющий определять количество пиков на кривой и параметры каждого пика с помощью аппроксимации кривой суперпозицией двух функций экстремального распределения первого типа (функций Гумбеля). 4. Предложена новая модификация теста генерации тромбина в PRP, состоящая в проведении исследования в присутствии добавленного ДМСО (1.6%). На примере пациентов с тяжелой формой гемофилии А показано, что данный тест имеет повышенную чувствительность к прокоагулянтной активности тромбоцитов. 5. Результаты применения новой модификации теста генерации тромбина у пациентов с тяжелой формой гемофилии А позволяют предположить, что формирование легкого фенотипа течения болезни у части этих пациентов связано с повышенной прокоагулянтной активностью тромбоцитов, экспрессирующих на своей мембране фосфатидилсерин. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Атауллаханов Ф.И., Баландина А.Н., Пантелеев М.А., Емельяненко В.М., Галстян Г.М., Копылов К.Г., Кумскова М.А., Карамзин С.С., Фадеева О.А., Сошитова Н.П., Липец Е.Н., Тарандовский И.Д., Щербина И.А., Пространственный рост фибринового сгустка как новый метод диагностики кровоточивости и тромбозов. Материалы 5-й Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии», 3-5 февраля 2011, Москва, с. 43-44. 2. Баланлина А.Н., Урнова Е.С., Марголин О.В., Сошитова Н.П., Липец Е.Н., Тарандовский И.Д., Щербина И.А., Карамзин С.С., Фадеева О.А., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Оценка системы гемостаза у пациентов с онкогематологическими заболеваниями на основа нового диагностического метода регистрации пространственного роста сгустка. Материалы 5-й Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии», 3-5 февраля 2011, Москва, с. 49-50. 3. Щербина И.А., Баландина А.Н., Емельяненко В.М., Соловьева А.А., Леонтьева Т.Н., Карамзин С.С., Фадеева О.А., Сошитова Н.П., Липец Е.Н., Тарандовский И.Д., Полохов Д.М., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Исследование пространственного роста фибринового сгустка как новый метод мониторинга состояния пациентов с ишемической болезнью сердца. Материалы 5-й Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии», 3-5 февраля 2011, Москва, с. 577-578. 4. Tarandovskiy I. D., Panteleev M. A., Sinauridze E. I., Topalov N. N., Artemenko E. O., Podoplelova N. A., Ataullakhanov F. I. Appearance of the second thrombin peak on 25 thrombin generation curve in platelet rich plasma depends on phoshpatidylserine expression during platelet activation. Poster presentations, FEBS J, 2011, 278 (Suppl 1): 292 p. 5. Panteleev M. A., Balandina A. N., Emelianenko V. M., Fadeeva O. A., Galstian G. M., Karamzin S. S., Lipets E. N., Soshitova N. P., Tarandovskii I. D., Ataullakhanov F. I. Imaging spatial dynamics of fibrin clot formation: possibilities for detection of prothrombotic and bleeding tendencies. J Thromb Haemost, 2011; 9 (Suppl 2): 495 p. 6. Tarandovskiy I. D., Panteleev M. A., Sinauridze E. I., Topalov N. N., Artemenko E. O., Podoplelova N. A., Ataullakhanov F. I. Formation of the second peak in platelet-rich plasma thrombin generation curve is linked with phoshpatidylserine expression during platelet activation. J. Thromb. Haemost, 2011; 9 (Suppl 2): 589 p. 7. Tarandovskiy I. D., Balandina A. N., Kumskova M. A., Kopylov K. G., Panteleev M. A., Ataullakhanov F.I. Thrombin generation, thrombodynamics and thromboelastography in the patients with different bleeding phenotype of severe hemophilia A. 58th Annual Meeting of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Liverpool, UK, June 27-30, 2012, abstract HDC15. 8. Balandina A. N., Lipets E. N., Soshitova N. P., Tarandovskiy I. D., Shcherbina I. A., Polokhov D. M., Poletaev A. V., Panteleev M. A., Ataullakhanov F.I. The effect of preanalytical and analytical variables on spatial fibrin clot formation (the thrombodynamics assay) in healthy subjects. 58th Annual Meeting of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Liverpool, UK, June 27-30, 2012, abstract LSPE30. 9. Tarandovskiy I. D., Artemenko E. O., Panteleev M. A., Sinauridze E. I., Ataullakhanov F.I. Antiplatelet agents can promote two-peaked thrombin generation in platelet rich plasma: mechanism and possible applications. PLoS ONE, 2013;8:e55688. 10. Tarandovskiy I. D., Balandina A. N., Kopylov K. G., Konyashina N. I., Kumskova M. A., Panteleev M. A., Ataullakhanov F. I. Investigation of the phenotype heterogeneity in severe hemophilia A using thromboelastography, thrombin generation, and thrombodynamics, Thromb Res, 2013, 131(6):е274-280. 11. Tarandovskiy I. D., Artemenko E. O., Kopylov K. G., Kumskova M. A., Panteleev M. A., Sinauridze E. I., Ataullakhanov F. I. The appearance of the second peak in platelet rich plasma thrombin generation curve can be provided by antiplatelet compounds: Mechanism and possible applications. J Thromb Haemost, 2013; 11 (Suppl 2): 316 p. 12. Gracheva M. A., Urnova E. S., Mendeleeva L. P., Sinauridze E. I., Balandina A. N., Tarandovskiy I. D., Vasiliev S. A., Parovichnikova E. N., Savchenko V. G., Ataullakhanov F. I. Conventional and new global haemostasis laboratorytest reveal hypercoagulation in primary multiple myeloma patients. J Thromb Haemost, 2013; 11 (Suppl 2): 706 p. 26
