Лекция 2. Генетика прокариот

Лекция 2.
ГЕНЕТИКА ПРОКАРИОТ
раздел ГЕНЕТИКА КЛЕТОЧНЫХ ОРГАНЕЛЛ
дисциплина СТРУКТУРНАЯ ГЕНОМИКА
Рекомендуемая литература
Пиневич, А.Б. Микробиология. Биология прокариотов:
учебник. Т. 3. – СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2009.
457 с
Словарик
Kb – kilobase 1000 п.н.
Mb – megabase 1 000 000 п.н.
Мегаплазмида – размер 100-1700 Kb
Интеграция и эксцизия плазмиды – способность плазмид
встраиваться и вырезаться из прокариотической хромосомы
Интероны – последовательности Ori V плазмид,
взаимодействующие с инициаторным rep-белком
Партитность генома – физическое существование генома
прокариот в виде какого-либо числа неидентичных групп
сцепления
Сведения общего характера
ПРОКАРИОТЫ :
•
•
•
•
•
•
клетки-организмы
размножаются вегетативным способом
обладают гаплоидным геномом
мембрана не изолирует хромосому от цитоплазмы
бактериальные хромосомы организованы в нуклеоиды
LP-хроматин (low-protein) – низкое содержание белка в
хромосомах по сравнению с эукариотами
• ДНК нуклеоида, характеризуется негативной
суперспирализацией
• суперспирализация является формой запасания
энергии для разделения цепей
Историческая справка
1943 г.
М. Дельбрук и С. Лурия
заложили основу генетики бактерий
Макс Дельбрук
Сальвадор
Лурия
Генетика клеточных органелл.
Лекция 2. Генетика прокариот
СТРОЕНИЕ ГЕНОМА БАКТЕРИЙ
Историческая справка
1958 г.
Э. Келленберг – бактерии не имеют ядра и
митоза, а нуклеоид представляет свободно
расположенную в цитоплазме хромосому
Эдуард
1950-е гг.
Келленберг
открыты плазмиды
(термин Дж. Ледерберга, 1958 г.)
Джошуа
Ледерберг
Историческая справка
Джон Кэрнс
1963 г.
Дж. Кэрнс – доказал, что хромосома
E.coli кольцевая ДНК
1980-е гг.
Р. Рид выявил негомологичную
рекомбинацию (транспозоны)
Рендалл
Рид
ГЕНОМ ПРОКАРИОТ
Нуклеоид
Плазмиды
Мобильные
генетические элементы
Генетика клеточных органелл.
Лекция 2. Генетика прокариот
БАКТЕРИАЛЬНАЯ ХРОМОСОМА
Нуклеоид
компактное тело, расположенное в центре клетке и
ориентированное вдоль ее продольной оси
237 мкм
нуклеоид
Исключение гигантская бактерия
Epulopiscium fishelsoni, ее хроматин
образует узкий ободок по периферии
клетки
ДНК нуклеоида
2 цепочечная
правозакрученная ДНК
(бактериальная хромосома),
несущая генетическую
информацию для процессов,
обеспечивающих
жизнедеятельности клетки
Бактериальная хромосома
Размерность: около 20% от цитоплазмы
Диаметр – 0,5-1,5 мкм
Длина – около 1 мм
Константа седиментации – 1500-3000 S
Число копий – зависит от вида и фазы развития (от 1 до 80 и
больше)
Форма ДНК – кольцевая, но! возможна и линейная (хромосомы,
плазмиды)
2 хромосомы
Borrelia burgdorferi
Agrobacterium tumefaciens
Линейная
ДНК
Мегаплазмиды 100-500 kb
Bacillus cereus
Сложный «кариотип» – геном распределен
между несколькими хромосомами и
внехромосомными элементами
Бактериальная хромосома
E.coli
Размер: 4,7 х 106 нп
около 4300 генов:
белок-кодирующих – 88%
РНК-кодирующих – 1%
регуляторных
последовательностей – 11%
Компактизация бактериальной
хромосомы
Компактизация бактериальной
хромосомы УРОВЕНЬ 1
Обеспечивается HLP-белками (histone-like protein)
HU, H-NS, SMС, FIS, INF
1 уровень
HU (histone U) – гетеродимер, обеспечивает
негативную суперспирализацию ДНК, формирует
изгиб ДНК
H-NS (histone-like nucleoid structuring protein) –
индуцирует изгибы
Функция: участие в процессах репликации, сайтспецифическая рекомбинации, транскрипции
Компактизация бактериальной
хромосомы УРОВЕНЬ 2
2 уровень
SMС (structural maintenance of chromosomes) –
гомо- и гетеродимеры, создают структуру в виде
супервитков
Функция: компактизация ДНК, регуляция
репарации, рекомбинации
Компактизация бактериальной
хромосомы УРОВЕНЬ 3
3 уровень (от 50 до 200 доменов)
Негативная суперсперализация при участии
топоизомераз и белков SMС
Репликация бактериальной
хромосомы
Происходит с помощью реплисомы
– мультиферментного комплекса,
распознающего Ori-участок,
расплетающего ДНК,
формирующего репликативную
вилку, обеспечивающего
инициацию, элонгацию и
терминацию репликации
Репликация
бактериальной
хромосомы
Инициация (E.coli):
DNA A
DNA B + (DNA C)
DNA G
ДНК-полимераза III
ДНК-гираза
Элонгация
ДНК-полимераза I
ДНК-лигаза
Терминация
Топоизомераза IV
Общая схема репликация E.coli
ГИСТОНОПОДОБНЫЕ БЕЛКИ:
HU (histone U), IHF (integration host factor),
FIS (factor for inversion stimulation)
НЕ – HOLE-фермент
Расхождение кольцевых ДНК после
репликации
ДЕКАТЕНИЗАЦИЯ – при участии топоизомеразы IV (резольвазы),
которая вносит двухцепочечный разрез в одно из колец, а затем
восстанавливает связи
Бактериальные структурные гены
конститутивные
• включены постоянно, продукты
генов отвечают за поддержание
основных функций клетки
индуцибельные
• включаются в определенных
условиях, продукты обеспечивают
выживание клетки
Экспрессия бактериальных генов
Экспрессия бактериальных генов
ИНИЦИАЦИЯ
Экспрессия бактериальных генов
ЭЛОНГАЦИЯ. ТЕРМИНАЦИЯ
ТРАНСЛЯЦИЯ
Генетика клеточных органелл.
Лекция 2. Генетика прокариот
ПЛАЗМИДЫ БАКТЕРИЙ
Общая характеристика плазмид
Нехромосомная ДНК бактерий, геном-сателлит,
цитоплазматический молекулярный симбионт
• Структурно изолированные и/ или способные
интегрироваться в хромосому
• Перенос по вертикали и по горизонтали
Отличие хромосом и плазмид
прокариот
характеристика
хромосома
плазмида
Наличие
незаменимых генов
Да
информационные,
гены домашнего
хозяйства
Нет
эгоистичные и
селективнополезные гены
Репликация
ДНК
1 раз
за клеточный цикл
Многократно или
не реплицируется
Размер
от 0.5 до 10 Mb
от 1,5 kb до 1,5 Mb
Функциональные гены цианобактерии
секвенированы 1997 г. T.Kaneko, S.Tabata
Селективно-полезные гены
гены биодеградации, вирулентности. лекарственной
устойчивости
Строение плазмид
Внутреннее кольцо - физические
координаты в тпн
Следующее кольцо - локализация ISэлементов.
Две дуги - области гомологии с
плазмидами ColV2-K94, R1 и R6-5.
Наружное кольцо показывает
расположение генетических локусов,
контролирующих ингибирование фага
(phi), несовместимость (inc),
репликацию (rep) и начало репликации
при переносе (ori).
Стрелками отмечены места ISэлементов, которые рекомбинируют с
бактериальной хромосомой
Генетическая карта
полового фактора F Е. coli
Классификации плазмид
ПО РАЗМЕРУ
• МЕЛКИЕ (2-50 kb)
• СРЕДНИЕ (50-100 kb)
• КРУПНЫЕ (более 100 kb)
ПО ФУНКЦИЯМ
• Обеспечение свойств
хозяину
• Способ горизонтального
переноса
• Совместимость плазмид
Классификация плазмид по
свойствам, сообщаемым хозяину
F-плазмиды
(fertility factor)
Col-плазмиды
(colicinogenic factor)
• определяет способность бактерий
к переносу генов при конъюгации
• кодируют колицин
(конкурентоспособность)
R-плазмиды
(resistance factor)
Плазмидыфаги
• кодируют капсомеры вирусной
частицы
F-плазмиды
Кольцевая ДНК (94,5 т.п.н.),несут гены, кодирующие половые
фимбрии (пили)
tra-область (24 гена, 3 оперона)
отвечает за конъюгативные свойства
rep-гены – отвечают за автономную
репликацию
par-гены – отвечают за распределение
молекул плазмидной ДНК по дочерним
клеткам
ген pif – исключает развитие в клетке
фагов ТЗ и Т7
элементы IS2, IS3A, IS3B и Tn1000 –
структурные компоненты,
обеспечивающими интеграцию Fплазмиды в бактериальную хромосому
Механизм интеграции плазмиды в
бактериальную хромосому
Сайт-специфическая
рекомбинация
на плазмиде и хромосоме
есть участки гомологии (сайты
интеграции),по ним возникает
локальный гетеродупликс,
плазмидная интеграза
формирует разрывы,
осуществляется реципрокный
кроссинговер
Col-плазмиды
ген col - детерминирует синтез
секретируемого белка колицина
ген imm - синтез фактора иммунитета
ген rel - синтез фактора, разрешающего
перенос плазмиды при конъюгации.
продукт гена kil вызывает летальность,
индуцированную митомицином С, и
освобождение колицина.
гены kil и col (сеа) образуют оперон.
Стрелка - направление транскрипции
генов imm и col
Физическая и генетическая карта
плазмиды ColEI
(размер плазмиды - около 6,4 тпн)
R-плазмиды
mer, sul, str, fus, cml, tet устойчивость к ионам ртути,
сульфамидам, стрептомицину,
фузидиевой кислоте, хлорамфениколу
и тетрациклину
finO, finP - ингибирование
фертильности
stb - стабильность плазмиды внутри
хозяина.
Темные прямоугольники - IS-элементы.
Буквы вокруг карты - фрагменты
рестрикции EcoRI.
Генетическая карта плазмиды R
Репликация плазмид
Используется репликазный комплекс хозяина
Процесс начинается по тетта-типу (θ-тип), а затем переходит в
сигма-тип (σ-тип, кольцо в линию или катящееся кольцо)
Схема репликации по механизму
катящегося кольца (новая молекула ДНК
показана пунктиром):
1-3'-конец ДНК; 2-5'-конец ДНК.
Тетта-механизм
Распространен у плазмид грамм-отрицательных бактерий
Инициирует процесс rep-белок, закодированный в плазмиде
При вегетативной репликации используется Ori V
Репликазный комплекс:
DNA A, HU, IHF, DNA B, DNA G,
ДНК-гираза, ДНК-полимераза III
прямые повторы ≈20 п.н.
Тетта-механизм
Движение репликативной вилки однонаправленное
Сигма-тип
Особенности процесса:
Модель (сначала реплицируется одна цепь, а только затем
вторая)
Структура rep-белка и репликаторного локуса
dso – двухцепочечный ориджин
sso – одноцепочечный
ориджин
«–» – антисмысловая цепь
Сигма-тип
rep-белок
Rep-белок связывается с dso, локус изгибается, образует шпильку, repбелок вносит в ДНК одноцепочечный разрез в 5’-антисмысловую цепь,
обеспечивает связывание SSB, DNA B (хеликазы), DNA G (праймазы) и
ДНК-полимеразы III, идет репликация цепи
Сигма-тип
РНК-полимераза распознает sso,
синтезирует праймер (17-18 н.),
ДНК-полимераза III элонгирует цепь,
ДНК-полимераза I досинтезирует
участок после удаления праймера,
ДНК-лигаза сшивает фрагменты,
ДНК-гираза обеспечивает
суперспирализацию
Регуляция репликации плазмид
НЕГАТИВНОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ
РЕПЛИКАЦИИ
в плазмидном репликоне есть локус inc
(100-300 т.п.н.), регулирующий
копийность плазмид в клетке
чем больше копий, тем медленнее
инициация
Генетическая карта плазмиды R
Генетика клеточных органелл.
Лекция 2. Генетика прокариот
ПОДВИЖНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ
ЭЛЕМЕНТЫ
Мобильные генетические элементы
Участки ДНК, кодирующие ферменты, обеспечивающие
транспозицию, т.е. к перемещению из одного сайта
хромосомы / плазмиды в другой (негомологичный)
IS-элементы
TN-элементы
ОСОБЕННОСТИ
отсутствие Ori
наличие 1-2 ORF (открытые рамки
считывания), кодируют гены белков
ответственных за транспозицию
IS-элементы
Вставочные (инсерционные) последовательности
Размер 200-2500 п.н.
Содержат IR
(инвертированными
повторами) 10-40 п.н.
Фланкированы DR (прямыми
повторами) 2-14 п.н.
Кодирующая область несет
ген tmpA (транспозаза) и/ или
tnpR (резольваза)
Внутри инвертированных
повторов: промотор tmpA,
сайт 2-3 п.н. для связывания
транспозазы и нанесения оц
разреза
TN-элементы
Размер 0,75-50 т.п.н.
Содержит:
Центральную часть, кодирующую продукт
Плечи (инсерционные последовательности или ISэлементы), обеспечивающих транспозицию (кодируют
транспозазу и содержат сигналы для интеграции)
Составные (композитные)
TN-элементы
Tn10 – 9.3 kb транспозон. Содержит ген устойчивости к тетрациклину (внутри
6.5 kb центрального участка) и 1.4 kb инвертированные IS элементы
Простые
TN-элементы
Tn3 – 4,957 kb. Содержит ген устойчивости к β-лактамным анибиотикам и IS
элементы, которые могут существовать только в составе транспозона, так как
элементы для переноса кодируются внутри транспозона
Механизмы транспозиции
Рекомбинационная реакция, осуществляемая транспозосомой
(транспозаза, концы мобильного элемента, ДНК)
Транспозаза – белок, N-конец обладает ДНК-связывающей
активностью, С-конец – каталитической.
Рис. Транспозаза разрывает одну из
цепей, создавая свободный 3’-OH конец
на границе транспозона
Консервативный механизм
транспозиции
МГЭ в ходе транспозиции не копируется
CUT + PASTE transposition (разрежь и
вклей)
мобильный элемент вырезается из донорного сайта и без
копирования вставляется в акцепторный
I. Транспозаза делает дц-разрезы в по концам МГЭ
II. Транспозаза делает оц-разрезы в сайте-мишени
реципиента, оставляю выступающие 3’-концы
III. Реакция трансэтерификации (5’-концы реципиента
соединяются с 3’0концами донора)
IV. Оц-участки ДНК реципиента досинтезируются, 3’-концы
выступают в качестве праймеров, формируются прямые
повторы
Репликативный механизм
транспозиции
МГЭ в ходе транспозиции копируется
CUT + HASTE transposition (разрежь и
не зевай)
мобильный элемент не вырезается из донорного
сайта, копируется и вставляется в акцепторный
I. Транспозаза вносит оц-разрывы по 3’-концам
МГЭ
II. Транспозаза вносит оц-разрывы в сайте-мишени
реципиента с образованием 5’-выступов
III. Реакция трансэтерификации, формирование Хобразного «интрермедиата Шапиро»,
репликация ГМЭ (репликат. вилки)
IV. Две одинаково ориентированные копии МГЭ
V. Разделение коинтеграта (ревальваза)
Механизмы транспозиции
Значение МГЭ. Геномные перестройки
Вставка МГЭ
Вырезание МГЭ
Делеция участка
геномной ДНК
Инверсия участка
геномной ДНК
Дупликация
ДНК
Образование
составного транспозона
Генетика клеточных органелл. Лекция 2. Нехромосомные
элементы прокариот
ИНТЕГРОНЫ
Интегроны. Строение
система горизонтального переноса, посредством
сайтспецифической рекомбинации
Интегроны способны захватывать, интегрировать и
экспрессировать генные кассеты
генная кассета
Строение интегронной платформы:
attI - сайт рекомбинации интегрона
intI - ген, кодирующий интегразу
P - промотор
Интегроны состоят из двух
частей:
Интегронной платформы и,
так называемых, генных
кассет
Генные кассеты – мелких
мобильных элементов,
состоящих лишь из
открытой рамки считывания,
лишенной собственного
промотора, и сайта
рекомбинации attC
Интегроны. Формы кассеты
Кассета может существовать в двух формах:
1.
2.
линейной, когда кассета интегрирована в ДНК
кольцевой двухцепочечной ДНК.
Кассеты имеют размеры от 260 до 1500 н.п.
Содержат ген антибиотикорезистентности и сайт рекомбинации,
состоящий из 59 н.п., расположенный на З'-конце.
Интегрон. Механизм встраивания.
Интеграза осуществляет сайт-специфическую рекомбинацию, что
приводит к инсерции генной кассеты в интегронную платформу за
промотором P, формируя структуры подобную оперону после чего
интегрированная кассета может экспрессироваться