ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Тема лекции:
ГЕННАЯ
ИНЖЕНЕРИЯ,
ее задачи.
Получение генетического материала.
Введение генетического материала.
Включение новых генов в
генетический аппарат клетки.
Биотехнология, ее значение для
медицины.
1
Ге%нная инжене%рия —
совокупность приёмов,
методов и технологий
получения рекомбинантных
РНК и ДНК,
выделения генов из организма (клеток),
осуществления манипуляций с генами и
введения их в другие организмы.
Генная инженерия служит для получения
желаемых качеств изменяемого организма.
2
1972 ПОЛ БЕРГ (США)
In vitro получил рекомбинатную (гибридной) ДНК,
состоящую из фрагментов
разных молекул ДНК: вирусной, бактериальной и фаговой.
Генетическая (генная) инженерия
Отрасль мол. биологии и
генетики,
целью которой является
получение с помощью
лабораторных приемов
организмов с новыми, не
встречающимися в природе
комбинациями генов
Конструирование in vitro
функционально активных
генетических структур,
создание
искусственных
генетических программ
3
В 1973 году ученые впервые
трансплантируют ДНК от одного живого
организма другому:
Стэнли Коэн и Энни Чанг из
Стэнфордского университета
и Герберт Бойер
соединяют ДНК вируса и бактерии и
“создают” кольцо с двойной
устойчивостью к антибиотикам:
так рождается генная инженерия. …..
4
ЗАДАЧИ ГИ
1.Создание рекомбинантных
ДНК, пригодных для переноса
в другие клетки
2.Разработка методов введения
рекомбинантной ДНК в клетку
3.Создание условий для
нормальной экспрессии генов,
введенных в клетку
5
Генная инженерия
служит для получения
желаемых качеств
изменяемого
организма.
6
Ограничения
селекции
7
Возможности ГИ
8
Теоретические предпосылки генной инженерии
2.
9
Внехромосомные факторы наследственности
1958
Леденберг
1970 Келли, Смит
Теоретические предпосылки генной инженерии
10
Этапы методов генной инженерии
1.Получение
генетического
материала
11
Этапы методов генной инженерии
2. В ДНК, способную
реплицироваться
автономно (вектор)
ферментативно
встраивают фрагменты
ДНК
из любого источника
12
Этапы методов генной инженерии
3. Получаемые при этом молекулы
гибридной ДНК вводят в E.coli
13
Этапы методов генной инженерии
4. в E.coli рекомбинантные
молекулы ДНК
реплицируются,
размножая в своем составе
клонируемый фрагмент ДНК
14
Этапы методов генной инженерии
5. Полученные гибридные
ДНК подвергают
дальнейшим
перестройкам и затем вводят
в реципиентные клетки,
изменяя их генотип и фенотип
15
Этапы методов генной инженерии
1. Получение генетического материала
2. В ДНК, способную реплицироваться автономно (вектор)
ферментативно встраивают фрагменты ДНК
из любого источника
3. Получаемые при этом молекулы гибридной ДНК
вводят в E.coli
4. в E.coli рекомбинантные молекулы ДНК реплицируются,
размножая в своем составе клонируемый фрагмент ДНК
5. Полученные гибридные ДНК подвергают дальнейшим
перестройкам и затем вводят в реципиентные клетки,
изменяя их генотип и фенотип
16
1Э.Получение генетического материала
1. Выделение природных генов с помощью РЕСТРИКТАЗ,
которые вызывают гидролиз ДНК с образованием «липких концов»
Выделены из бактерий,
названы так, потому что
их роль- разрушение чужеродной
вирусной ДНК, значит:
ограничение (рестрикция)
развития вирусной инфекции у бактерий
Рестриктазы действуют на ДНК
любых организмов, если в ней есть
РАСПОЗНАВАЕМЫЕ САЙТЫ
(4-6 пар нуклеотидов)===
ПАЛИНДРОМНЫЕ УЧАСТКИ
сейчас в ГИ более 500 рестриктаз, способных разрезать ДНК в 120 местах
17
НЕДОСТАТКИ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕНА С ПОМОЩЬЮ РЕСТРИКТАЗ:
1. Не всегда удается подобрать рестриктазы,
позволяющие вырезать из ДНК
именно тот участок, в котором содержится интересующий ген.
2. В составе вырезанного
фрагмента ДНК могут
оказаться интроны,
и
рекомбинантные ДНК
не смогут
экспрессироваться
в прокариотической кл-ке,
из-за отсутствия способности
к процессингу и сплайсингу.
18
Получение генетического материала
2. химико-ферментативный синтез генов
Секвенирование- расшифровка нуклеотидной
последовательности.
Синтезируют короткие (8-16) одноцепочные фрагменты
ДНК,
затем
их соединяют (с помощью ЛИГАЗ) и
отжигают (дают возможность образоваться 2-хнитевым молекулам ДНК)
19
Получение генетического материала
3. ферментативный синтез генов
Выделяют иРНК, и на ней, с помощью РЕВЕРТАЗЫ
синтезируют нить ДНК
Гены, синтезированные с помощью ревертазы, не имеют
регуляторной части и промотора
Не могут f-ть в клетках
При переносе в бактерию, к структурным генам +
промотор оперона ===
Ген (транскриптон) начинает работать
20
Этапы методов генной инженерии
1. Получение генетического материала
2. В ДНК, способную реплицироваться автономно (вектор)
ферментативно встраивают фрагменты ДНК
из любого источника
3. Получаемые при этом молекулы гибридной ДНК
вводят в E.coli
4. в E.coli рекомбинантные молекулы ДНК реплицируются,
размножая в своем составе клонируемый фрагмент ДНК
5. Полученные гибридные ДНК подвергают дальнейшим
перестройкам и затем вводят в реципиентные клетки,
изменяя их генотип и фенотип
21
2 Э. векторы – кольцевые молекулы ДНК
-молекула-переносчик.
Свойства векторных молекул:
1. Способны к саморепликации
(содержат ori репликации=Origin-точка начала
репликации)
2. Содержат сайты рестрикции.
По одному из этих сайтов вектор расщепляется
и смешивается с изучаемым фрагментом ДНК
3. Содержат маркеры, по которым можно
вести отбор клеток (отсутствуют в клетках
хозяина)
4. Легко извлекаются из клеток хозяина
22
2 Э. векторы – кольцевые молекулы ДНК
-молекула-переносчик.
Первые векторы созданы на основе плазмид.
Первый вектор- плазмида pSC101
(размер: 9100 п.н., 6 копий на нуклеотид),
Детерминирует устойчивость к тетрациклину,
есть 1 сайт расщепления для рестриктазы EcoRl
23
Липкие концы ДНК
Рекомбинация in vitro
плазмида
Маркер устойчивости к антибиотику
Рекомбинантная
плазмида
Введение в бактериальные клетки
Отбор клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК,
по способности расти в присутствии антибиотика
Рис. Клонирование фрагмента ДНК в плазмиде (Лещинская И.Б., 1996)
24
Для клонирования крупных фрагментов ДНК используют
ФАГОВЫЕ ВЕКТОРЫ, КОСМИДЫ, ФАЗМИДЫ.
ФАГОВЫЕ
ВЕКТОРЫ
КОСМИДЫ
ФАЗМИДЫ
фаг лямбда = 2 цепоч.
ДНК (48500 п.н.
упакована в головку в
виде линейной
молекулы с 1 нитевыми
комплементарными
концами (липкие концы).
После проникновения
в клетку липкие концы
взаимно спариваются,
молекула замыкается в
кольцо и сшивается
лигазой.
Клонируют 15 тыс.п.н.
Плазмиды,
содержащие липкие
концы ДНК (cosучастки) фага лямбда.
М.б. введены в клетку
путем обычной
инфекции.
Клонируют
фрагменты ДНК
размером 33-39 тыс.
п.н. ==\ предназначены
для встраивания
крупных генов и
создания клонотек
генов эукариот
Гибридные векторы,
способные
развиваться и как
фаг, и как плазмида,
т.к. содержат все
гены, необходимые
для литического
цикла, а также,
нужные для
репликации
плазмиды.
емкостьФ.<К=ФВ
25
Для клонирования крупных фрагментов ДНК используют
ФАГОВЫЕ ВЕКТОРЫ
фаг лямбда = 2 цепоч. ДНК
(48500 п.н. упакована в головку в
виде линейной молекулы с 1
нитевыми комплементарными
концами (липкие концы)).
После проникновения в клетку
липкие концы взаимно спариваются,
молекула замыкается в кольцо и
сшивается лигазой.
Клонируют 15 тыс.п.н.
26
КОСМИДЫ
Плазмиды, содержащие липкие
концы ДНК (cos-участки) фага
лямбда.
М.б. введены в клетку путем
обычной инфекции.
Клонируют фрагменты ДНК
размером 33-39 тыс. п.н. ==\
предназначены для встраивания
крупных генов и создания клонотек
генов эукариот
27
ФАЗМИДЫ
Гибридные векторы,
способные развиваться и
как фаг, и как плазмида, т.к.
содержат все гены,
необходимые для
литического цикла, а
также, нужные для
репликации плазмиды.
емкостьФ.<К=ФВ
28
Этапы методов генной инженерии
1. Получение генетического материала
2. В ДНК, способную реплицироваться автономно (вектор)
ферментативно встраивают фрагменты ДНК
из любого источника
3. Получаемые при этом молекулы гибридной ДНК
вводят в E.coli
4. в E.coli рекомбинантные молекулы ДНК реплицируются,
размножая в своем составе клонируемый фрагмент ДНК
5. Полученные гибридные ДНК подвергают дальнейшим
перестройкам и затем вводят в реципиентные клетки,
изменяя их генотип и фенотип
29
3Э. Введение рекомбинантных ДНК в клетку-реципиент
и включение ее в хромосомный аппарат
Конъюгация-передача генетического материала у
бактерий
при прямом межклеточном контакте.
Передача фактора F (плазмида размером 60 тыс.
п.н.) из одной клетки в другую
трансдукция-передача ДНК от клетки донора
клетке реципиенту
при участии бактериофагов
Трансфекция- инфекция фагами лямбда, Т4,
соответствующая трансформации
30
3Э. Введение рекомбинантных ДНК в клетку-реципиент
и включение ее в хромосомный аппарат
Микроинъекциивведение в ядро клетки животных с помощью
тонких стеклянных микротрубочек (д=0,1-0,5 мкм)
Упаковка в липосомы (сферические образования,
оболочки которых состоят из фосфолипидов).
Заключенные в Л. ДНК защищены от нуклеаз,
легко проникают к клетки в рез-те слияния
липосом и кл. мембраной
или при поглощении их фагоцитозом
31
3Э. Введение рекомбинантных ДНК в клетку-реципиент
и включение ее в хромосомный аппарат
Электропорация.
Импульсы высокого
напряжения
обратимо увеличивают
проницаемость мембран.
На клетку действуют
Высоковольтным
импульсом
(350 В, 54 мс.).
Через образующиеся
на короткое время поры
ДНК проникает в клетку.
32
3Э. Введение рекомбинантных ДНК в клетку-реципиент
и включение ее в хромосомный аппарат
Бомбардировка
(баллистическая трансформация)
Р.К. Саляев
1) ДНК с целевыми генами,
адсорбируется на поверхности
микрочастиц (0,6-6 мкм) из инертных
металлов
- золота или вольфрама.
2) Частицам сообщается
кинетическая энергия,
достаточная для прохождения ч/з кл. стенки.
3) Оказавшись внутри клетки,
ДНК с частиц освобождается в цитоплазму
и, если оказывается в ядре,
встраивается в ядерный геном.
33
Биотехнология растений. Трансгенные растения.
Цель- новые формы растений, устойчивые
к гербицидам,
патогенным грибам, вредным насекомым,
с ускоренным ростом,
большой продолжительностью хранения,
улучшением качества,
увеличением количества
34
Использование вируса,
поражающего
фитопатогенную бактерию
Agrobacterium tumefaciens.
Плазмида этой бактерии
переносит часть своей
ДНК в растительную
клетку.
Именно в эту ДНК
встраивают «полезный»
ген
1993 СШАкартофель,
устойчивый к колорадскому жуку;
Кукуруза,
хлопок (волокно уже окрашенное),
Рапс (измененный состав растительного масла:
лауриновая кислота для производства
стиральных порошков), соя и тд.
35
Рис. Два основных метода создания трансгенных растений
об отлаженной
системе контроля
за движением
ГМ-продуктов в
России говорить
рано.
Первое опытное трансгенное растение было
получено в 1983 году в Институте
растениеводства в Кёльне.
Через 9 лет в Китае начали выращивать
трансгенный табак, который не портили
насекомые-вредители.
А в 1994 году появился и первый
официально разрешенный к продаже
генетически модифицированный томат
FlavrSavr, не портящийся при транспортировке
и долго сохраняющий товарный вид.
сегодня ими создан помидор, в ДНК
которого встроен ген арктической камбалы,
что позволяет растению легко переносить
холода,
ведутся исследования по созданию
овощей кубической формы, которые будет
легко упаковывать в ящики.
36
Использование генно-инженерных продуктов в медицине
Более 350 препаратов и вакцин, разработанных ГИ, используются в медицине
инсулин
Клонированные гены чел инсулина были введены с плазмидой в
бактериальную клетку, где начался синтез гормона, кот
природные штаммы никогда не синтезировали. 1000 л бак
культуры=200 г инсулина= из 1600кг поджелудочной железы
животных (иммунологическое поражение организмаов
диабетиков животным инсулином). Мировой рынок 2500 кг
инсулина
интерферон
Препятствует размножению вирусов, используют при ЗНО
соматотропин
При лечении карликовости
антикоагуляторы
Активируют плазмин, рассасывают тромбы. Эффективны при
лечении инфаркта миокарда
VII фактор крови
Ускоряет образование тромбов; лечение гемофилии А
Моноклональные
антитела
В диагностических целях, + адресная доставка лекарств,
токсинов, радиоактивных соединений к tumor
Энкефалины,
эндорфины
Лечение психических заболеваний, улучшение настроения,
37
памяти
Генная терапия- область биомедицины,
основанная на введении в организм больного
рекомбинантных генетических конструкций с лечебной целью.
Заболевания-объекты ГТ
38
Принципиальное отличие генной терапии
от любой другой в том,
что она направлена на устранение
не симптомов заболевания, а его первопричины
Количественное распределение пациентов по типам заболеваний
39
типы генно-терапевтического воздействия
IN VIVO
ген вводят в организм
пациента
в составе векторной
молекулы.
EX VIVO
подход индивидуализирован:
манипуляции сначала
проводят
с клетками пациента in vitro
потом уже эти генетически
обработанные
клетки попадают обратно в
организм
40
два типа генно-терапевтического воздействия:
ex vivo и in vivo
подход индивидуализирован:
манипуляции сначала проводят
с клетками пациента in vitro
потом уже эти генетически обработанные
клетки попадают обратно в организм
ген вводят в организм
пациента
в составе векторной
молекулы.
•1990. США. Дефект гена, кодирующего аденозиндезаминазу==/
Комбинированный иммунодефицит.
Извлекли Т-лимфоциты, культивировали, с помощью ретровирусного вектора
вводили неповрежденный ген, возвращали клетки больному
Втрое сократить лекарственное лечение,
стоимость которого составляла 60 тыс. долл. в год.
•Больным вводят их же опухолевые клетки
с генами ФНО, или с генами интерлейкинов,
активирующих лимфоциты и макрофаги
41
ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ- область
биомедицины, основанная на
введении в организм больного
рекомбинантных генетических
конструкций с лечебной целью
ДАТА РОЖДЕНИЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ
14 сент. 1990г- Ашанти Де Сильва (3 года)
вылечена от дефицита
аденозиндезаминазы
42
Использование антисмысловых олигонуклеотидов (АСОГ)
АСОГ- короткие
последовательности
нуклеотидов,
комплементарные отрезкам иРНК
или ДНК.
Связываясь с мишенью
(промотором или иРНК),
АСОГ блокируют синтез
патологического белка
43
ГЕНОБЛОКИРУЮЩАЯ ТЕРАПИЯдефективный генный продукт должен быть
каким-то образом инактивирован
ДНК
рибосома
белок
АНТИСМЫСЛОВАЯ ТЕРАПИЯ
ядро
иРНК
антисмысловой
олигонуклеотид
ДНК
иРНК
транскрипция
клетка
белки
трансляция
антисмысловой
олигонуклеотид
традиционное лекарство
б
о
л
е
з
н
ь
Антисмысловой
олигонуклеотид
связывается с иРНК,
блокируя её
трансляцию в
патологический белок
44
ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ ПРИОБРЕТЁННЫХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ
ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ СПИДА
ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ РАКА
ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ РАКА
45
Онкогены - это клеточные или вирусные (вносимые вирусом в клетку) гены,
экспрессия которых может привести к развитию новообразования. Ras)
>100
Опухолевые
супрессоры
антионкогены,
рецессивные
опухолевые
гены
~20
Протоонкогены - нормальные клеточные гены, усиление или модификация
функции которых превращает их в онкогены.
46
р53
если мы инфицируем вирусным вектором целый организм,
то и нормальные клетки заражаются вирусом,
который будет всегда либо синтезировать нормальный белок р53,
либо инактивировать экспрессию гена ras.
И то и другое может иметь негативные последствия для нормальной клетки.
Значит, повысить эффективность воздействия и
снизить негативные эффекты может только направленная
или адресная доставка терапевтического средства.
Работы в данном направлении интенсивно ведутся,
но каких-либо существенных достижений пока не опубликовано.
47
ГТ наших дней:
3496 пациентов в мире
имеют в своем
организме
генетически
модифицированные
клетки.
Из них- 69%
пациентов- ГТ ЗНО,
8% -моногенные
наследственные
болезни
12%- инфекционные
заболевания
ГТ наших дней:
США-60%
Канада-4%
Великобритания-7%
Франция-3%
Германия-2%
Швейцария-1%
Италия-1%
Нидерланды-2%
Др-9%
48
Первый трагический случай:
Парацельс: “Яд - это всего лишь вопрос дозы”
Смерть в 1999 (США) пациента после
третьей инъекции аденовирусного вектора
последнего поколения,
экспрессирующего ген орнитинкарбамоилтрансферазы.
Вскрытие показало атрофию внутренних органов по
механизму апоптоза
///
в мире от предоперационного наркоза ежегодно
гибнут
или остаются полными инвалидами
примерно 40 тыс. человек
49
второй ТРАГИЧЕСКИЙ СЛУЧАЙ
17 сент. 2000 г. умер Джесси
Гелзингер, которого пытались
вылечить путём генной терапии от
наследственного заболевания печени.
Причиной смерти стала гиперреакция
иммунной системы на ввод в печень
генно-инженерного аденовируса
50
Парацельс: “Яд - это всего лишь вопрос дозы”
основной проблемой остается доставка действующего
начала
в нужное место и с высокой эффективностью.
Лекарственный препарат, попадающий в организм,
как правило,
традиционным путем, действует почти на все клетки,
а надо подействовать или на определенную группу клеток,
или даже на участок генома, специфичный для
определенной группы клеток.
С другой стороны, транспортируемое вещество необходимо
“защитить” от повреждений.
Сегодня самая большая проблема медицины,
которую пытаются решить десятки биотехнологических
компаний,
- направленная, т.е. векторная доставка и ее
эффективность.
51
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проводится много исследований в
области генной терапии, но критики часто
указывают на то, что ещё ни один
человек не был полностью вылечен с
помощью генной терапии.
Действительно, хотя были улучшены
иммунные функции у многих больных
с дефицитом аденозиндезаминазы, а у
больных с семейной
гиперхолестеринемией был снижен
уровень холестерина, этим больным всё
равно приходилось продолжать
медикаментозную терапию.
52
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ
53
Лекция составлена на основе источников:
1. Генетика. Учебник для вузов/под ред. Академика РАМН В.И.
Иванова М.:2006.-638 с.
2. Жимулев И.Ф.Общая и молекулярная генетика.
Новосибирск:2002.-459 с.
3. Клаг Уильям С., Каммингс Майкл Р. Основы генетики. М.:
Техносфера, 2007.- 896 с.
4. Фаллер Д., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки.
Руководство для врачей. М.:Изд-во БИНОМ»- 2006.- 256 с.
5. Медицинская биология.- под ред. В.П. Пишака, Ю.И.
Бажоры. Учебник. Винница: Нова Книга, 2004.-656 с.
6. Advanced Biology/M.Roberts, M. Reiss, G. Monger. UK.
Nelson.-2009.-800 p.
7. Интернет-ресурсы
54